專利名稱：：一種檢測中肋骨條藻生長率的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種浮游硅藻的檢測方法，特別涉及一種實時熒光定量PcR檢測肋骨條藻生長率的方法。
背景技術(shù)：
：中肋骨條藻是廣溫廣鹽的典型代表，分布極廣，從北極到赤道，從外海高鹽水到沿海低鹽水團(tuán)，甚至半咸水中皆有，但以沿岸最多。中肋骨條藻多在夏末秋初形成優(yōu)勢種，并引發(fā)赤潮，發(fā)生赤潮時，細(xì)胞密度為4.3x103~7.2乂105個1111/1(Wangetal"薩)。長江口處于赤潮臨界狀態(tài)的中肋骨條藻密度為7x106個m-3,約占浮游植物總量的96%(Hongetal.，1992)。我國的南海珠江口，閩南九龍江口，閩東閩江口，咸淡水匯合處，一般其它硅藻生長不良，本種特別繁茂，每升水中可達(dá)24百萬個細(xì)胞。Swift等(1972)建立了細(xì)胞周期法，即通過計數(shù)處于特定細(xì)胞周期的細(xì)胞分?jǐn)?shù)來估算生長率，該方法的理論基礎(chǔ)是細(xì)胞種群動力學(xué)原理。McDuff&Chisholm(1982),Carpenter等(1988)對其進(jìn)行了改進(jìn)，Vaulot修正了其計算式，使之更適用于現(xiàn)場測定。由于這一方法在一個光照循環(huán)中在現(xiàn)場間隔一定時間(常為2小時)采樣，分析染色體，計算處于分裂周期的細(xì)胞分?jǐn)?shù)，從而徹底擺脫了培養(yǎng)造成的各種偏差，同時也避免了捕食產(chǎn)生的誤差，其結(jié)果更接近于真實情況。但區(qū)分不同細(xì)胞周期對操作者有著很高的技術(shù)要求。前述這些方法均不能估算特定種類的浮游植物的生長率，傳統(tǒng)方法獲得特定種類的浮游植物生長率有兩個途徑一是在稀釋培養(yǎng)法或細(xì)胞周期法中進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)時進(jìn)行種類鑒定；另一種方法是將現(xiàn)場分離的單一種進(jìn)行實驗室培養(yǎng)，計算其指數(shù)生長期的生長率。前者費時費力，并且受光鏡分辨率的限制，難以對某些種類的進(jìn)行鑒定；后者則由于脫離了現(xiàn)場條件，因而其結(jié)果代表性差。林森杰(Linetal.1994;Linetal.1995)才是出的增殖細(xì)刀包核抗原(ProliferatingCellNuclearAntigen,PCNA)方法顯示了其在浮游植物生長率研究中的巨大潛在應(yīng)用價值。該方法是從細(xì)胞周期法衍生而得，這種方法是基于分析如PCNA—類的細(xì)胞周期標(biāo)志物(Linetal.1995)來確定處于不同細(xì)胞周期的細(xì)胞分?jǐn)?shù)(f:含有PCNA的細(xì)胞/細(xì)胞總數(shù))。以PCNA為細(xì)胞周期標(biāo)志物測定生長率的方法由于其直接與S期相關(guān)，以f-含有PCNA的細(xì)胞/細(xì)胞總數(shù)來計算而不是采用細(xì)胞濃度，使得生長率的估算精度不受細(xì)胞死亡和破裂的影響(Changetal.1993),有著"直接、可靠，，的優(yōu)越性(Celisetal.1985;Bravoetal.1987;Sasakietal.1994)。這一方法不需要培養(yǎng)，避免了"培養(yǎng)瓶效應(yīng)"。更重要的是，該方法可以結(jié)合定量聚合酶鏈反應(yīng)(PolymeraseChainReaction,PCR)技術(shù)，對PCNA基因表達(dá)的信使RNA(messengerRNA,mRNA)反轉(zhuǎn)錄為cDNA后進(jìn)行定量PCR檢測，直接獲得細(xì)胞分?jǐn)?shù)，實現(xiàn)高通量的4企測。該方法可以有兩種方式應(yīng)用(1)采用抗PCNA抗體，用熒光標(biāo)記的PCNA抗體對浮游植物樣品進(jìn)行全細(xì)胞免疫熒光法(immunofluorescence,IF)染色，由于PCNA在細(xì)胞周期的S期大量表達(dá)，處于S期的細(xì)胞被染色(圖1右上角)，通過熒光顯微鏡即可對含有PCNA的細(xì)胞計數(shù)。1994年林森杰等用Rat-PCNA抗體在四類孩t藻中檢測到analogousproteins,并觀察了PCNA-likeprotein含量在培養(yǎng)過程不同生長時期的變化。對于杜氏鹽藻Dunaliellatertiolecta免疫熒光研究發(fā)現(xiàn)PCNA是表征生長狀態(tài)的合適標(biāo)志物，可以用來估算生長率(Linetal.,1995)。1995年Lin等首次用PCNA免疫熒光技術(shù)研究海洋浮游植物自然種群的細(xì)胞周期，聯(lián)合特征DNA序列分析了北大西洋西南部和加勒比海域Ethmodiscusrex細(xì)胞周期中生命活動的過程，并且粗略估算了生長率。受研究方法的限制，目前研究者較少使用現(xiàn)場生產(chǎn)率這一參數(shù)，多使用光合速率常數(shù)及初級生產(chǎn)力來估算生物量。對于浮游植物生長率的研究主要采用稀釋法和培養(yǎng)計數(shù)法對實驗室培養(yǎng)的浮游植物種群對環(huán)境因子的響應(yīng)(林元燒等，1994;張誠等，1997;齊雨藻等，1997;周名江等，1997;顏天等，2002;朱明遠(yuǎn)等，2000)。焦念志等(2002)利用流式細(xì)胞儀測定處于不同分裂期的原綠球藻(Prochlorococcus)的細(xì)胞分?jǐn)?shù)，估算其生長率，取得了較好的結(jié)果。這是國內(nèi)采用細(xì)胞周期法現(xiàn)場測定單一種類浮游植物生長率的首次嘗試。而釆用細(xì)胞周期標(biāo)志物(如PCNA)來區(qū)分細(xì)胞周期進(jìn)而測定現(xiàn)場生產(chǎn)率的研究則未見報道。整體來說，國際上在該領(lǐng)域的研究仍處于起步階段，有待于進(jìn)一步發(fā)展。目前采用細(xì)胞周期標(biāo)志物估算現(xiàn)場生產(chǎn)率的研究中面臨的主要問題有以下幾個方面(1)目前的研究主要是針對費氏殺魚藻Dunaliellatertiolecta的，缺乏對其它浮游植物，特別是海域優(yōu)勢藻和多發(fā)赤潮藻的研究，研究多處于對實驗室培養(yǎng)的純種藻的測定，缺乏更多的現(xiàn)場實驗。(2)前述研究采用的PCNA抗體是借用的針對哺乳動物的商業(yè)抗體(PC10)，由于浮游植物與哺乳動物的PCNA基因差異較大，抗體僅對綠藻等幾種藻有效，效價低，且其種屬特異性較差。(3)在采用定量PCR技術(shù)時，由于已知PCNA基因序列的藻種類較少，難以設(shè)計種間特異性高的引物和探針，從而影響了該方法測定單一藻種生長率的優(yōu)勢。(4)通常作為管家基因的eo-actin、es-Tublin基因在不同種類間具有高度的同源性，在對現(xiàn)場樣品測定時會產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增，影響結(jié)果的準(zhǔn)確性。由此可見，對于中肋骨條藻生長率的研究目前還缺乏一種準(zhǔn)確估算單一種類現(xiàn)場生長率的技術(shù)方法；這嚴(yán)重限制了浮游植物生產(chǎn)率這一參數(shù)的應(yīng)用。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是，提供一種準(zhǔn)確估算中肋骨條藻現(xiàn)場生長率的技術(shù)方法，用于估算浮游藻類生產(chǎn)力、研究浮游藻種群變遷、構(gòu)建生態(tài)動力學(xué)模型乃至赤潮預(yù)測，克服現(xiàn)有技術(shù)中單一品種浮游藻現(xiàn)場生長率等基本生理生態(tài)學(xué)參數(shù)無法測定的缺陷。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種檢測中肋骨條藻生長率的方法，包括以下步驟a.提取中肋骨條藻RNA;b.分離并克隆中肋骨條藻PCNA基因部分序列，通過3'RACE對獲得的中肋骨條藻PCNA序列進(jìn)行3，端延伸，獲得750~850bp的PCNA序列；c.克隆中肋骨條藻Cytb基因部分序列；d.將所述PCNA序列基因、所述Cytb基因部分序列導(dǎo)入質(zhì)粒，并根據(jù)轉(zhuǎn)載所述PCNA序列基因、轉(zhuǎn)載所述Cytb基因部分序列的質(zhì)粒構(gòu)建檢測中肋骨條藻PCNA與Cytb基因的實時熒光定量PCR的標(biāo)準(zhǔn)曲線；e.以PCNA為目的基因、以Cytb為管家基因，根據(jù)中肋骨條藻PCNA基因相對表達(dá)量REQ檢測中肋骨條藻生長率。所述步驟b可以為分離并克隆中肋骨條藻PCNA基因部分序列，通過3'RACE對獲得的中肋骨條藻PCNA序列進(jìn)行3'端延伸，獲得786bp的PCNA序列。所述步驟d可以進(jìn)一步包括通過對已知濃度樣品的檢測，驗證所建立標(biāo)準(zhǔn)曲線的準(zhǔn)確性。所述步驟a提取中肋骨條藻RNA可以進(jìn)一步包括(1)收集藻細(xì)胞，在不斷添加液氮條件下用研缽研磨成細(xì)粉狀；(2)將研磨液加入到lmLTRIZOL試劑中，置室溫下勻化5min;(3)加入200piL氯仿劇烈振蕩15s，室溫下溫育3min;(4)4。C條件下以12000rpm離心15min;(5)獲取界面上層液體加入250pL高濃度鹽溶液，混勻后再加入250pL異丙醇，混勻后于室溫下沉淀10min，再在4。C以12000rpm轉(zhuǎn)速離心10min;(6)移去上清后用lmL75%乙醇漂洗沉淀，4。C以11000rpm轉(zhuǎn)速離心5min;(7)適量DEPC水或去離子曱酰氨溶液溶解，RNA于-80。C保存。所述步驟b中，克隆中肋骨條藻PCNA基因部分序列使用的引物序列可以為5-CAGTCTCGGGTTCAATGCGGC-3,ScPCNArp5-GGATACTCCACCACCACAGGC-3。所述步驟b中，應(yīng)用于3，端RACE的4個引物可以為pcQ)l:AAGGAAGGTGTCCGGTTCTCAGTAdaptordT:GACTCGAGTCGACGAATTCAATTTTTTTTTTTTTTTTTAdaptor:GACTCGAGTCGACGAATTCAAPcfp2:TGAGAAGGAGGAGGAACGTGTTATG。所述步驟b中，可以進(jìn)一步包括下列PCNA序列分析的過程用ClustalXV1.81比對PCNA的核酸序列，通過運行ProtTestV1.3確定最適進(jìn)化模式，使用PHYMLV2.4.3程序構(gòu)建進(jìn)化樹，ProtTest參數(shù)值被應(yīng)用于最大相似度分析和系統(tǒng)樹優(yōu)化。所述步驟b中，可以進(jìn)一步包括使用克隆中肋骨條藻PCNA基因部分序列的引物對與中肋骨條藻分類地位相近的4~20種藻cDNA進(jìn)行擴(kuò)增，并以28SrDNA通用引物為陽性驗證，驗證所述引物對中肋骨條藻的特異性。所述步驟c克隆中肋骨條藻Cytb基因部分序列使用的引物序列可以為TpCbfj):5-ATACGCTTGGAGTTTTGGGTCTTCT-3，TpCbrp5畫ATGAGCCGGAGTTGACATAGGATCT-3。所述步驟d可以進(jìn)一步包括根據(jù)測得的Cytb序列設(shè)計RFQ-PCR引物探針SC-FQ-Cytb;引物SC-FQ-Cytb序列為5-GTGTTGAGCACATTATGCGAGAT-3;rp，5-GAACGCCTGAGCATCAAAGTAA-3;探針SC-FQ-Cytb序列為5-TGCAAATGGTGCTTCAATGTTCTTCA-3。所述步驟e可以進(jìn)一步包括將收集的藻進(jìn)行RNA提取和反轉(zhuǎn)錄后，用熒光定量PCR擴(kuò)增每個樣品的PCNA和Cytb基因，以Cytb基因為管家基因，考察PCNA基因表達(dá)量的變化，以得到的CT值推算單位細(xì)胞中基因的表達(dá)量，按以下公式計算PCNA相對表達(dá)量REQ:REQ=lg[PCNA基因表達(dá)量/Cytb基因表達(dá)量]+K其中K為一個常數(shù)。本發(fā)明建立了有效提取中肋骨條藻RNA的方法，進(jìn)而通過反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)和cDNA末端快速擴(kuò)增技術(shù)(RACE)獲得了其PCNA基因的部分序列，首次得到了714bp的中肋骨條藻細(xì)胞色素b(cytochromeb,Cytb)基因序列，并分別建立了PCNA進(jìn)化樹和Cytb進(jìn)化樹。進(jìn)一步地，根據(jù)得到的PCNA與Cytb基因序列，分別設(shè)計了符合實時熒光定量PCR(RFQ-PCR)檢測要求的引物和TaqMan探針，建立了檢測中肋骨條藻PCNA與Cytb基因的實時熒光定量PCR的標(biāo)準(zhǔn)曲線，其曲線方程分別為對PCNA,y=-3.055x+41.093(R二0.999,其中x為細(xì)胞數(shù)對數(shù)值，y為CT值，R為相關(guān)系數(shù))；對Cytb,y=-4.0x+44.96(R=0.997)。本發(fā)明實時熒光定量PCR檢測中肋骨條藻生長率的方法，可以準(zhǔn)確定量108102個拷貝，且標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸系數(shù)達(dá)0.998,穩(wěn)定性好，且6份樣品的CT值的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.5%,證明了RNA提取與反轉(zhuǎn)錄體系的穩(wěn)定。PCNA基因表達(dá)量在中肋骨條藻培養(yǎng)的不同時期有著明顯變化，培養(yǎng)6天時藻處于指數(shù)增長期，PCNA的表達(dá)量處于較高水平(46.2PCNAcopy/cell),11天時處于生長平穩(wěn)期，PCNA表達(dá)量處于較低水平(0.950PCNAcopy/cell),而18天時已處于衰亡期，PCNA表達(dá)量最低(0.040PCNAcopy/cell)。結(jié)果證明，PCNA具有^r測中肋骨條藻生長潛能的價值。生長潛能估算的最終目的是應(yīng)用于現(xiàn)場的觀測研究中，這就必須解決檢測特異性的問題，以便區(qū)分不同藻類的生長參數(shù)。本發(fā)明通過使用SC-FQ-PCNA引物對16種藻cDNA的擴(kuò)增，并以28SrDNA通用引物為陽性驗證，證實了SC-FQ-PCNA引物對中肋骨條藻的特異性。而Taqman技術(shù)由于在PCR過程中結(jié)合了特異探針雜交，因此在提高特異性方面比熒光染料法更具優(yōu)勢。提供了一種運用分子生物學(xué)技術(shù)實現(xiàn)中肋骨條藻現(xiàn)場生長率估算的方法，為赤潮藻研究提供了有效的觀測和研究手段。在實際海區(qū)中，浮游藻種類繁多，必然要求所建立的檢測方法可以區(qū)分單種(檢測具有種特異性)，因此對于本發(fā)明建立的方法，要求所設(shè)計的目的基因和管家基因的RFQ-PCR引物與探針對于中肋骨條藻是特異的。本發(fā)明已經(jīng)以16種浮游藻作為參照藻，對所設(shè)計PCNA的RFQ-PCR引物的特異性進(jìn)行了驗證，表明其具有特異性。圖1為本發(fā)明實施例所述cDNA的SC-FQ-PCNAPCR擴(kuò)增圖，圖中1:H20;2:新月菱形藻；3:紅色棵甲藻；4:微小原甲藻；5:直鏈藻；6:圓海鏈藻；7:柔弱角毛藻；8:纖細(xì)角毛藻；10:旋鏈角毛藻；11:膜質(zhì)舟形藻；12:米氏棵曱藻；13:尖刺擬菱形藻；14:東海原曱藻；15:錐狀斯克里普藻；16:塔瑪亞歷山大藻；17:球等鞭金藻；18:中肋骨條藻；9,19:DNAMarker;SC-FQ-PCNA引物對cDNA的擴(kuò)增結(jié)果只有中肋骨條藻得到約為160bp的擴(kuò)增條帶，其它藻均未得到擴(kuò)增條帶，表明所設(shè)計的SC-FQ-PCNA引物是對中肋骨條藻特異的；圖2為本發(fā)明實施例所述Cytb基因部分序列擴(kuò)增圖，圖中1:Marker(DL2000);2:擴(kuò)增條帶；圖3為本發(fā)明實施例所述第一組(培養(yǎng)25天)S.costatum細(xì)胞密度隨時間的變化圖，圖中藻類為3L錐形瓶培養(yǎng)，起始濃度為4.0xl02cells/mL;圖4為本發(fā)明實施例所述第二組(培養(yǎng)14天)S.costatum細(xì)胞密度隨時間的變化圖，圖中藻類為3L錐形瓶培養(yǎng)，起始濃度為1.3xl02cells/mL;圖5為本發(fā)明實施例所述培養(yǎng)不同階段藻細(xì)胞內(nèi)PCNA表達(dá)量的變化圖，圖中O代表細(xì)胞密度，A代表生長率，*代表PCNA表達(dá)量，園代表REQ;圖6為本發(fā)明實施例所述培養(yǎng)不同階段藻細(xì)胞內(nèi)PCNA表達(dá)量的變化圖，圖中O代表細(xì)胞密度，A代表生長率，*代表PCNA表達(dá)量，B代表REQ。具體實施方式本發(fā)明實施例中，中肋骨條藻的培養(yǎng)過程為中肋骨條藻(Skeletonemacostatum)在實驗室中用F/2培養(yǎng)基培養(yǎng)至對數(shù)生長期，培養(yǎng)條件光照/黑暗周期為12h/12h，光照強度為4000Lux,培養(yǎng)溫度為22~25°C。收集5份培養(yǎng)一周的中肋骨條藻(細(xì)胞密度為4.1x107cells/mL)約3.8xl0個細(xì)胞(藻濃縮液重量約為150mg)。用下列RNA提取方法提取(1)收集藻細(xì)胞，在不斷添加液氮條件下用研缽研磨成細(xì)粉狀；TRIZOL試劑中，置室溫下勻化5min;(3)加入200jliL氯仿劇烈振蕩15s,室溫下溫育3min;(4)4。C條件下以12000rpm離心15min;(5)獲取界面上層液體加入250juL高濃度鹽溶液，混勻后再加入250nL異丙醇，混勻后于室溫下沉淀10min,再在4。C以12000rpm轉(zhuǎn)速離心10min;(6)移去上清后用lmL75%乙醇漂洗沉淀，4。C以U000rpm轉(zhuǎn)速離心5min;(7)適量DEPC水或去離子曱酰氨溶液溶解，RNA于-80。C保存。提取后的中肋骨條藻PCNA基因cDNA的部分序列擴(kuò)增產(chǎn)物，經(jīng)EB染色的瓊脂糖凝膠電泳顯示，擴(kuò)增出特異性的條帶，產(chǎn)物大小約為520bp。RT-PCR引物為5-CAGTCTCGGGTTCAATGCGGC畫3，ScPCNArp5-GGATACTCCACCACCACAGGC-3。連接反應(yīng)體系10pL，目標(biāo)DNA片段的量約為50ng,按照插入片段與載體的摩爾比為l:3做連接反應(yīng)。反應(yīng)物充分混勻后，于16。C連接過夜。取E.coliDHa-5甘油菌于LB瓊脂平皿上劃線，37。C培養(yǎng)過夜。挑單個菌落接種于50mLLB培養(yǎng)液里，37。C搖床250rpm振蕩培養(yǎng)過夜；細(xì)胞沉淀用10mL水冷的CaCl2溶液重懸，分裝于預(yù)冷的無菌聚丙烯管中，凍存于-8(TC中。將所得的10jiL體系全部轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)胞，輕輕旋動，并于冰上放置30min。然后將試管放入42。C水浴2min進(jìn)行熱休克，快速移至水浴中2分鐘；加入lOOjiiLLB培養(yǎng)液，于37。C搖床250rpm振蕩培養(yǎng)lh,使細(xì)胞復(fù)蘇同時表達(dá)質(zhì)粒編碼的抗生素抗性基因；菌液涂布到含有X-Gal、IPTG、Amp的LB固體培養(yǎng)基(lOOmLLB固體培養(yǎng)基中加入200pL的X-Gal的二曱基曱酰胺溶液(20mg/mL)、100|iiL的IPTG(24mg/mL)和60pL的AmpUOOmg/mL)平板上，于37。C靜置培養(yǎng)12-16h。在過夜LB平板上挑取白色單菌落，置2mLLB培養(yǎng)基(含100|ig/mL氨千青霉素)中，于37。C搖床上過夜培養(yǎng)。取1.5mL菌液，用微量離心機(jī)12000rpm離心一分鐘(剩余菌液保存于4°C)。傾倒去上層清液，控干沉淀加入預(yù)冷的溶液IlOO)iL懸浮細(xì)胞，混勻，即加入溶液II200pL,上下輕柔顛倒數(shù)次混勾，冰浴5分鐘。加溶液III150|iiL，小心混勻，冰浴5-10分鐘。12000rpm離心10分鐘，將上清液移至另一Eppendorf管中。加兩倍體積預(yù)冷的無水乙醇混勻，室溫;故置10分鐘，13500rpm離心10分鐘，棄去上清液，70%乙醇洗滌，超凈臺中干燥。加含有胰RNA酶(20pg/mL)的TE(pH8.0)溶液40-50pL,溶解質(zhì)粒，待完全溶解后取5|liL電泳鑒定。雙酶切反應(yīng)體系為50pL,反應(yīng)的條件為37。C過夜消化。酶切結(jié)果以瓊脂糖凝膠電泳和溴化乙錠染色檢驗。取經(jīng)鑒定的陽性克隆，送交上海生物工程有限公司測序(ABI3730)。測序引物為M13/PUCS叫uencingPrimer(-20)和M13/PUCReverseSequencingPrimer(-48)。提交測序結(jié)果至NCBI的Blast服務(wù)器，驗證克隆片段的PCNA基因同源性。根據(jù)RACE的要求和測得的PCNA部分序列，設(shè)計應(yīng)用于3，端RACE技術(shù)的4個引物如下pcfy1:AAGGAAGGTGTCCGGTTCTCAGTAdaptordT:GACTCGAGTCGACGAATTCAATTTTTTTTTTTTTTTTTAdaptor:GACTCGAGTCGACGAATTCAAPc映TGAGAAGGAGGAGGAACGTGTTATGRNA的提取同前述提取方法cDNA鏈的生成RT-PCR以引物AdaptordT(GACTCGAGTCGACGAATTCAATTTTTTTTTTTTTTTTT)介導(dǎo)生成cDNA鏈。3，RACE第一輪PCR反應(yīng)以生成的cDNA鏈為模板，以表l中的體系和程序進(jìn)行PCR擴(kuò)增。3'RACE第二輪PCR反應(yīng)第二輪PCR以第一輪PCR產(chǎn)物(稀釋50倍)為模版，以表2中的體系和程序進(jìn)行PCR擴(kuò)增。表13'RACE第一輪PCR反應(yīng)反應(yīng)體系及程序<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>分離并克隆中肋骨條藻PCNA基因部分序列，通過3'RACE對獲得的中肋骨條藻PCNA序列進(jìn)行3'端延伸，獲得786bp的PCNA序列。進(jìn)化分析用ClustalXVl.81比對PCNA的核酸序列。通過運行ProtTestV1.3(Abascaletal.2005)確定最適進(jìn)化模式。使用PHYMLV2.4.3程序構(gòu)建進(jìn)化樹，ProtTest參數(shù)值被應(yīng)用于最大相似度分析和系統(tǒng)樹優(yōu)化。使用SC-FQ-PCNA引物對16種藻cDNA的擴(kuò)增，并以28SrDNA通用引物為陽性驗證，證實了SC-FQ-PCNA引物對中肋骨條藻的特異性。表3實驗用藻種名稱及來源<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>如前述獲得轉(zhuǎn)入PCNA基因的陽性克隆，將培養(yǎng)好的帶質(zhì)粒的細(xì)菌收集到1.5mL離心管中，棄去上清，使細(xì)菌沉淀盡量干燥；力口lOO^L預(yù)冷的質(zhì)粒抽提溶液I懸浮細(xì)胞，混勻，即加200pL質(zhì)粒抽提溶液n,上下輕柔顛倒數(shù)次混勻，冰浴5分鐘；力。150pL質(zhì)粒抽提溶液III小心混勻，冰浴5-10分鐘；12000rpm離心10分鐘，將上清移至另一離心管中；加兩倍體積的預(yù)冷的無水乙醇混勻，室溫》丈置IO分鐘，13000rpm離心IO分鐘，棄上清，70%乙醇洗滌，干燥后加40pLTE緩沖液溶解。酶切-驗證，測260nm處的吸光度(Absorbance260，A260)得光密度(opticaldensity,OD)(貝克曼核酸和蛋白質(zhì)分析儀，BackmanDU640)為0.0705，備用。將測定的OD值換算成質(zhì)粒的拷貝，濃度換算公式如下拷貝濃度(copy/mL)=[OD值x50x6.02xi023]/[堿基數(shù)x660],求得濃度為lxl09copy/pL。將重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品原液作梯度稀釋成lx108、lx107、lx106、lx105、lx104、lx103、lxl02copyL,-80。C保存。根據(jù)測得的PCNA序列設(shè)計RFQ-PCR引物與4笨針，所設(shè)計的引物SC-FQ-PCNA序列為(Qd，5-AGGTGTCCGGTTCTCAGTATCAG-3;rp，5-AGTAGCCTTGGTAAAGAAGTTGAGG-3),探針SC-FQ-PCNA序列為(5-GTCCTCGTTCGTCAAAACAGCTCTCA-3),探針5'端用FAM標(biāo)記,3，端用TAMRA標(biāo)記。在ABI7500熒光定量儀上進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)，體系為雙蒸水8.5pL，2xTaqManUniversalPCRMasterMixl2.5pL,SC-FQ-PCNA正反向引物(lO(iM)各lpL，TaqManSC-FQ-PCNA(10mM)lpL,模板lpL;PCR程序52°C2分鐘，95°C10分鐘；95°C15秒，60°Cl分鐘，40個循環(huán)。每個質(zhì)粒稀釋濃度做三個平行樣。以質(zhì)粒濃度對數(shù)值為橫座標(biāo)，以實時熒光定量PCR反應(yīng)中相應(yīng)的CT值為縱座標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。分別提取各藻的RNA,用0ligo(dT18)反轉(zhuǎn)錄成cDNA，用核糖體大亞基通用引物L(fēng)SU5，(5'-CGGAGGAAAAGAAACTAAC-3，)LSU3，(5，-GCGAAAGACTAATCGAAC-3，)擴(kuò)增各藻的cDNA，驗證cDNA的質(zhì)量。用SC-FQ-PCNA引物對分別擴(kuò)增各藻的cDNA.擴(kuò)增。培養(yǎng)中肋骨條藻，接種密度為1.2x103cells/mL，收集處于指數(shù)生長期、穩(wěn)定期、衰亡期的藻樣品各一份，收集藻細(xì)胞，如上所述提取RNA，進(jìn)行RT-PCR，取1nL進(jìn)行RealTimePCR擴(kuò)增。稀釋的質(zhì)粒及primerSC-FQ-PCNA和TaqManSC-FQ-PCNA進(jìn)行熒光定量PCR檢測。每個稀釋度重復(fù)測量3次，用測得的CT值對細(xì)胞密度的對數(shù)值作圖?；貧w曲線方程為y=-3.055x+41.093,其中x為細(xì)胞數(shù)對數(shù)值，y為CT值，其回歸系數(shù)為R=0.999。根據(jù)從GenBank數(shù)據(jù)庫中獲得的與中肋骨條藻同科的偽矮海鏈藻(Thalassiosirapseudonana)的CytochromeB基因序列，設(shè)計中肋骨條藻的引物為TpCb*5-ATACGCTTGGAGTTTTGGGTCTTCT陽3，TpCbrp5-ATGAGCCGGAGTTGACATAGGATCT-3。RNA提取與反轉(zhuǎn)錄如前述方法PCR擴(kuò)增中肋骨條藻Cytb基因的部分cDNA片段反轉(zhuǎn)錄的cDNA分別稀釋10倍、100倍作為擴(kuò)增模板，擴(kuò)增體系與程序見表4。表4Cytb基因擴(kuò)增體系與程序<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>cDNA1.0—ExTaq0,52.5U測得OD值為0.015,利用計算公式質(zhì)粒濃度(copy/mL)=(OD值x50x6.02x1023)/(660x3406)。求得濃度為2xl08copyL。將重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品原液作梯度稀釋成2x107、2xl06、2xl05、2xl04、2xl03、2xl02、2xlO'copyL,貯于-8(TC。根據(jù)測得的Cytb序列設(shè)計RFQ-PCR引物探針SC-FQ-Cytb,引物SC-FQ-Cytb序列為(fp,5陽GTGTTGAGCACATTATGCGAGAT-3;rp,5陽GAACGCCTGAGCATCAAAGTAA-3),探針SC-FQ畫Cytb序列為(5-TGCAAATGGTGCTTCAATGTTCTTCA-3)。Taqman探針5，端用FAM標(biāo)記,3，端用TAMRA標(biāo)記。在ABI7500焚光定量儀上進(jìn)行焚光定量PCR反應(yīng)，體系為雙蒸水8.5pL，2xTa-qManUniversalPCRMasterMixl2.5(iL，SC-FQ-Cytb正反向引物(1OpM)各1，TaqManSC-FQ畫Cytb(10mM)lpL,模板1^L;PCR程序52°C2分鐘，95°C10分鐘；95°C15秒，60°C1分鐘，40個循環(huán)。每個質(zhì)粒稀釋濃度做三個平行樣。以質(zhì)粒濃度對數(shù)值為橫座標(biāo)，以實時熒光定量PCR反應(yīng)中相應(yīng)的CT值為縱座標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。如圖2所示，中肋骨條藻Cytb基因cDNA的部分序列擴(kuò)增產(chǎn)物，經(jīng)EB染色的瓊脂糖凝膠電泳顯示，擴(kuò)增出特異性的條帶，產(chǎn)物大小約為720bp。稀釋的質(zhì)粒及primerSC-FQ-Cytb和TaqManSC-FQ-Cytb進(jìn)行熒光定量PCR檢測。每個稀釋度重復(fù)測量3次，用測得的CT值對質(zhì)粒拷貝的對數(shù)值作圖?；貧w曲線方程為y=-4.0x+44.96,其中x為細(xì)胞數(shù)對數(shù)值，y為CT值，其回歸系數(shù)為R=0.997。將海水經(jīng)0.22pm的濾膜過濾和煮沸法消毒滅菌處理后，用營養(yǎng)自動分析儀測得其NO3—-N濃度為0.96|imol/L，P043—-P濃度為0.28pmol/L。根據(jù)Monod方程，硝酸鹽影響中肋骨條藻生長速率的半飽和常數(shù)KN為4.0nmol/L;磷酸鹽影響中肋骨條藻生長速率的半飽和常數(shù)KP為0.54|imol/L(李鐵等，2000)。調(diào)整N試驗組中的NaN03濃度，使N,、N2、N3、N4組的NOh-N終濃度分別為0.96jimol/L(約為1/4xKN)、2.0jiimol/L(l/2xKN)、4.0pmol/L(lxKN)、8.(Vmol/L(2xKN)，其它條件同前述海藻培養(yǎng)方法；調(diào)整P試驗組中的NaH2P04濃度，使P,、P2、P;組中的P043_-P終濃度分別為0.28nmol/L(約為1/2xKP)、0.54pmol/L(lxKP)、1.08(imol/L(2xKP),其它條件同前述海藻培養(yǎng)方法。用于條件實驗的各實驗組中肋骨條藻的接種密度均為3.0xl03cells/mL。接種的藻液中帶入的N03_-N與P043_-P濃度引起的誤差忽略不計。中肋骨條藻均在3L錐形瓶中培養(yǎng)。每天中午12點計數(shù)各實驗組的藻細(xì)胞密度，繪制各培養(yǎng)條件下的生長曲線。第一組從培養(yǎng)的第三天開始，隔天收集樣品，藻樣均約為2xl0個細(xì)胞，離心去除水分后用液氮凍存。第二組每天收集藻樣，藻樣均為2xl(T個細(xì)胞離心去除水分后用液氮凍存。第三組分別收集在指數(shù)生長期、穩(wěn)定期及衰亡期的藻樣，藻樣均約為2xio個細(xì)胞離心去除水分后用液氮凍存。將收集的藻進(jìn)行RNA提取和反轉(zhuǎn)錄后，用熒光定量PCR擴(kuò)增每個樣品的PCNA和Cytb基因，以Cytb基因為管家基因，考察PCNA基因表達(dá)量的變化。以得到的CT值推算單位細(xì)胞中基因的表達(dá)量，按以下公式計算PCNA相對表達(dá)量REQ:REQ=lg[PCNA基因表達(dá)量/Cytb基因表達(dá)量]+10。通過顯微鏡計數(shù)方法，得到第一組的生長曲線(如圖3所示)，第二組的生長曲線(如圖4所示)。根據(jù)顯微鏡鏡檢得到的細(xì)胞密度計算生長率p，對第一組實驗中收集的樣品進(jìn)行PCNA和Cytb基因的熒光定量PCR檢測，計算單位細(xì)胞中的PCNA拷貝量與REQ值，結(jié)果如表5所示。對培養(yǎng)四周中的中肋骨條藻細(xì)胞密度、藻生長率p以及PCNA基因表達(dá)量的變化趨勢作圖(如圖5所示)，圖5顯示出中肋骨條藻的生長率M、PCNA基因表達(dá)量以及REQ之間有高度一致性，在藻的指數(shù)生長期變化幅度都很大。對生長率n與PCNA基因相對表達(dá)量(REQ)進(jìn)行線性回歸，得到回歸方程為p-0.273REQ-2.02，R=0.9。表54周培養(yǎng)中11個樣品PCNA相對表達(dá)量的變化<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>根據(jù)顯微鏡鏡檢得到的細(xì)胞密度計算生長率li,對第二組實驗中收集的樣品進(jìn)行PCNA和Cytb基因的熒光定量PCR檢測，計算單位細(xì)胞中的PCNA拷貝量與REQ值(表6),對培養(yǎng)兩周中的中肋骨條藻細(xì)胞密度、藻生長率ia以及PCNA基因表達(dá)量的變化趨勢作圖(如圖6所示)，圖6也顯示出中肋骨條藻的生長率p、PCNA基因表達(dá)量以及REQ之間有高度一致性，在藻的指數(shù)生長期變化幅度都^f艮大。對14個樣品的生長率p和REQ進(jìn)行線性回歸，得到回歸方程為p-0.375REQ-2.79，R=0.971。表614天培養(yǎng)過程中PCNA的表達(dá)量變化培養(yǎng)生長率PCNA單位纟田胞中Cytb的單位細(xì)胞中REQ曰期的CTPCNA的拷貝CT值Cytb的拷貝(day)值量(copies/cell)量(copies/cell)10.95622.8518020.622349.8920.96122.6016620.412029.9231.0321.98l卯19.871979.9840.96822.5116120.192089.891.0222,3320120.172289.9460.84122,9610820.082079.7270.78323.448619.922609.5280.81423.129720.052149.6690.33124.542419.232468,99100.16726.19619.351948.48110.030328.940.719.042257.5012-O駕29.970.319.271997.2213-0.01530.130.319.142187.13140.01529.210.619.172117.44氮磷控制組在接種后的4、6、8、10、12日收集樣品，對樣品進(jìn)行RFQ-PCR檢測。根據(jù)得到的PCNA的CT值與Cytb的CT值推算REQ(表7、8),并與生長率p建立相關(guān)關(guān)系，對氮不同濃度與磷不同濃度控制組的REQ與ji進(jìn)行相關(guān)性的擬合，各組生長率M和REQ進(jìn)行線性回歸方程見表5.5。其中Nl組由于藻的密度隨培養(yǎng)時間的增加而減少，樣品的量不足以提取RNA進(jìn)行后續(xù)的檢測，因此未能得到相應(yīng)的生長率p與REQ的相關(guān)關(guān)系。表7N組PCNA的表達(dá)量變化培養(yǎng)時細(xì)胞密度生長率PCNA的Cytb的REQ值(day)(cells/mL)CT值CT值<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>*N1-4表示N1的第四天，以此類;慎；#代表未;〖企出。表8P組PCNA的表達(dá)量變化.<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>表9不同培養(yǎng)條件下生長率p和REQ的線性回歸方程與相關(guān)系數(shù)<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>從圖5可以看出，單位細(xì)胞中PCNA基因表達(dá)量在中肋骨條藻培養(yǎng)的不同階段有著明顯變化，在培養(yǎng)初期(2-5天)藻細(xì)胞密度迅速增加，處于對數(shù)生長期，生長率較高，最高達(dá)到2.79d-l,相應(yīng)的此階段的單位細(xì)胞中PCNA基因表達(dá)量也較高，最高達(dá)到292copies/cell,隨后生長率逐漸變小，PCNA表達(dá)量逐漸降低，在培養(yǎng)的9-12天，生長率再次出現(xiàn)一個小的峰值，PCNA表達(dá)量亦有反映，在培養(yǎng)的后期生長率為O或負(fù)值，PCNA表達(dá)量亦降到很低的范圍(<0.10copies/cell)。從圖6同樣可以看到，在第二組實驗的培養(yǎng)初期(2-5天)藻細(xì)胞密度迅速增加，生長率較高，最高達(dá)到1.03d-l，相應(yīng)的此階段的單位細(xì)胞中PCNA基因表達(dá)量也較高，最高達(dá)到201copies/cell,隨后生長率逐漸變小，PCNA表達(dá)量也逐漸降低。因此，從第一、二組實驗中肋骨條藻培養(yǎng)過程中，PCNA的表達(dá)量與生長率表現(xiàn)出高度的一致性，顯示出其與細(xì)胞分裂的密切關(guān)系。用建立的熒光定量PCR檢測樣品的PCNA和Cytb基因表達(dá)量，以PCNA為目的基因，以Cytb基因為管家基因。一般地，基因的相對表達(dá)量直接以目的基因與管家基因的比值來表示，但在本發(fā)明中，由于PCNA表達(dá)量變化程度很大，對PCNA和Cytb表達(dá)量的比值取對數(shù)可以使表述更為簡便，且通過加上一個常數(shù)使得計算結(jié)果為正值(這里選取常數(shù)10)，因此我們按以下公式計算PCNA相對表達(dá)量PCNA的相對表達(dá)量REQ-lg[PCNA基因表達(dá)量/Cytb基因表達(dá)量]十10。REQ值越大，則在單位細(xì)胞內(nèi)PCNA基因的相對表達(dá)量越多。計算PCNA相對表達(dá)量的方法較單獨計算單位細(xì)胞內(nèi)的PCNA表達(dá)量可以得到更穩(wěn)定的結(jié)果，這是因為計算單位細(xì)胞內(nèi)的PCNA的方法需要計數(shù)細(xì)胞密度，一方面計數(shù)誤差會影響結(jié)果的準(zhǔn)確性(通常情況下計數(shù)誤差是較大的)，另一方面，對于野外樣品，區(qū)分不同的種類是一項需要專業(yè)人員的工作；更重要的是，單獨計算單位細(xì)胞內(nèi)的PCNA的表達(dá)量無法避免RNA提取效率與反轉(zhuǎn)錄效率對于mRNA表達(dá)量檢測的影響。而本發(fā)明建立相對表達(dá)量的方法，由于以同為mRNA的Cytb為管家基因進(jìn)行歸一化，不再需要細(xì)胞計數(shù)，同時校正了RNA提取效率、反轉(zhuǎn)錄效率的影響，從而使得結(jié)果更加穩(wěn)定。圖15與16顯示，REQ值與PCNA的表達(dá)量以及生長率之間高度一致。從各組擬和公式可以看出，PCNA的相對表達(dá)量與生長率有著較好的相關(guān)性(相關(guān)系數(shù)在0.845-0.997)，表明在不同培養(yǎng)條件下獲得的數(shù)據(jù)沒有顯著性的偏移，顯示不同N、P營養(yǎng)鹽水平對PCNA的表達(dá)的影響和對生長率的影響是一致的，PCNA可以較好的作為指示生長率變化的指標(biāo)。用顯微鏡觀察方法計算中肋骨條藻的生長率p(d-l),通過RFQ-PCR方法對細(xì)胞周期中不同生長階段的樣品進(jìn)行PCNA與Cytb基因檢測，發(fā)現(xiàn)單個細(xì)胞中PCNA表達(dá)量與生長率相關(guān)，其表達(dá)量在細(xì)胞周期的不同生長階段變化很大，變化趨勢與生長率表現(xiàn)出高度一致性，表明PCNA表達(dá)量與細(xì)胞分裂密切相關(guān)，體現(xiàn)了其作為細(xì)胞增殖指標(biāo)的潛能；而Cytb基因的表達(dá)量變化很小，表達(dá)穩(wěn)定，可認(rèn)為Cytb基因是個理想的管家基因。進(jìn)而建立了以PCNA為目的基因、Cytb為管家基因的中肋骨條藻PCNA基因相對表達(dá)量(REQ)的實時熒光定量PCR檢測方法，并研究了REQ與中肋骨條藻生長率的關(guān)系。結(jié)果表明，PCNA相對表達(dá)量與生長率n有著較好的相關(guān)性；不同濃度的硝酸鹽、磷酸鹽對于中肋骨條藻生長率和PCNA基因相對表達(dá)量REQ的關(guān)系式?jīng)]有顯著影響。這些都表明，中肋骨條藻PCNA基因相對表達(dá)量可以作為指示其生長率變化的良好指標(biāo)。在此基礎(chǔ)上經(jīng)過進(jìn)一步研究，完全有可能利用PCNA基因相對表達(dá)量來估算實際海區(qū)中肋骨條藻的現(xiàn)場生長率，從而為中肋骨條藻赤潮預(yù)測和研究提供一種全新的方法。在實際海區(qū)中，浮游藻種類繁多，必然要求所建立的^r測方法可以區(qū)分單種(檢測具有種特異性)，因此對于本發(fā)明建立的方法，要求所設(shè)計的目的基因和管家基因的RFQ-PCR引物與4果針對于中肋骨條藻是特異的。本發(fā)明已經(jīng)以16種浮游藻作為參照藻，對所設(shè)計PCNA的RFQ-PCR引物的特異性進(jìn)行了驗證，表明其具有特異性。本發(fā)明通過對中肋骨條藻PCNA基因的克隆測序，獲得了522bp的序列，并進(jìn)行了24種藻的PCNA基因系統(tǒng)進(jìn)化分析。在此基礎(chǔ)上，針對中肋骨條藻PCNA基因序列，設(shè)計了熒光定量為0.999，并通過已知濃度的質(zhì)粒樣品的檢測，驗證了此標(biāo)準(zhǔn)曲線的準(zhǔn)確性。通過對16種藻的28SrDNA通用引物和SC-FQ-PCNA的擴(kuò)增，證實了所設(shè)計的引物對中肋骨條藻的特異性。而進(jìn)一步地，通過對不同生長期的中肋骨條藻的PCNA基因檢測，則表明了PCNA可能作為中肋骨條藻生長率檢測的良好指標(biāo)。本發(fā)明中肋骨條藻PCNA檢測方法，可以準(zhǔn)確定量108~102個拷貝，且標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸系數(shù)達(dá)0.998，穩(wěn)定性好，且6份樣品的CT值的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.5%,也證明了RNA提取與反轉(zhuǎn)錄體系的穩(wěn)定。樣品檢測的數(shù)據(jù)看，PCNA基因表達(dá)量在中肋骨條藻培養(yǎng)的不同時期有著明顯變化，培養(yǎng)6天時藻處于指數(shù)增長期，PCNA的表達(dá)量處于較高水平(46.2PCNAcopy/cell),11天時處于生長平穩(wěn)期，PCNA表達(dá)量處于較低水平(0.950PCNAcopy/cell)，而18天時已處于衰亡期，PCNA表達(dá)量最低(0.040PCNAcopy/cell)。這個結(jié)果也證明，PCNA具有檢測中肋骨條藻生長潛能的價值。本發(fā)明通過管家基因的方法來解決RNA提取和反轉(zhuǎn)錄穩(wěn)定性的問題是更具優(yōu)勢的途徑(Racheletal.，2001;Tsuyoshietal.，2000;Andrewetal.,2000)，通過PCNA與管家基因表達(dá)量的相對比值形式來反映不同時期PCNA的相對表達(dá)量變化，進(jìn)一步建立PCNA相對表達(dá)量與中肋骨條藻生長率之間的關(guān)系，從而為計算中肋骨條藻的生長率，提供新的方法。生長潛能估算的最終目的是應(yīng)用于現(xiàn)場的觀測研究中，這就必須解決檢測特異性的問題，以便區(qū)分不同藻類的生長參數(shù)。本發(fā)明通過用SC-FQ-PCNA引物對16種藻cDNA的擴(kuò)增，并以28SrDNA通用引物為陽性驗證，從而證實了SC-FQ-PCNA引物對中肋骨條藻的特異性。權(quán)利要求1、一種檢測中肋骨條藻生長率的方法，其特征在于，包括以下步驟a.提取中肋骨條藻RNA；b.分離并克隆中肋骨條藻PCNA基因部分序列，通過3’RACE對獲得的中肋骨條藻PCNA序列進(jìn)行3’端延伸，獲得750～850bp的PCNA序列；c.克隆中肋骨條藻Cytb基因部分序列；d.將所述PCNA序列基因、所述Cytb基因部分序列導(dǎo)入質(zhì)粒，并根據(jù)轉(zhuǎn)載所述PCNA序列基因、轉(zhuǎn)載所述Cytb基因部分序列的質(zhì)粒構(gòu)建檢測中肋骨條藻PCNA與Cytb基因的實時熒光定量PCR的標(biāo)準(zhǔn)曲線；e.以PCNA為目的基因、以Cytb為管家基因，根據(jù)中肋骨條藻PCNA基因相對表達(dá)量REQ檢測中肋骨條藻生長率。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述檢測中肋骨條藻生長率的方法，其特征在于，所述步驟b中，分離并克隆中肋骨條藻PCNA基因部分序列，通過3，RACE對獲得的中肋骨條藻PCNA序列進(jìn)行3'端延伸，獲得786bp的PCNA序列。3、根據(jù)權(quán)利要求1所述檢測中肋骨條藻生長率的方法，其特征在于，所述步驟d中進(jìn)一步包括通過對已知濃度樣品的檢測，驗證所建立標(biāo)準(zhǔn)曲線的準(zhǔn)確性。4、根據(jù)權(quán)利要求1所述檢測中肋骨條藻生長率的方法，其特征在于，所述步驟a提取中肋骨條藻RNA進(jìn)一步包括(1)收集藻細(xì)胞，在不斷添加液氮條件下用研缽研磨成細(xì)粉狀；(2)將研磨液加入到lmLTRIZOL試劑中，置室溫下勻化5min;(3)加入200pL氯仿劇烈振蕩Us,室溫下溫育3min;(4)4。C條件下以12000rpm離心15min;(5)獲取界面上層液體加入250jiL高濃度鹽溶液，混勻后再加入250jxL異丙醇，混勻后于室溫下沉淀lOmin,再在4。C以12000rpm轉(zhuǎn)速離心10min;(6)移去上清后用lmL75。/。乙醇漂洗沉淀，4。C以11000rpm轉(zhuǎn)速離心5min;(7)適量DEPC水或去離子曱酰氨溶液溶解，RNA于-8(TC保存。5、根據(jù)權(quán)利要求1所述檢測中肋骨條藻生長率的方法，其特征在于，所述步驟b中，克隆中肋骨條藻PCNA基因部分序列使用的S1物序列為5-CAGTCTCGGGTTCAATGCGGC-3,ScPCNArp5-GGATACTCCACCACCACAGGC-3。6、根據(jù)權(quán)利要求1所述檢測中肋骨條藻生長率的方法，其特征在于，所述步驟b中，應(yīng)用于3，端RACE的4個引物如下pcfyl:AAGGAAGGTGTCCGGTTCTCAGTAdaptordT:GACTCGAGTCGACGAATTCAATTTTTTTTTTTTTTTTTAdaptor:GACTCGAGTCGACGAATTCAAPcfp2:TGAGAAGGAGGAGGAACGTGTTATG。7、根據(jù)權(quán)利要求1所述檢測中肋骨條藻生長率的方法，其特征在于，所述步驟b中，進(jìn)一步包括使用克隆中肋骨條藻PCNA基因部分序列的引物對與中肋骨條藻分類地位相近的420種藻cDNA進(jìn)行擴(kuò)增，并以28SrDNA通用引物為陽性驗證，驗證所述引物對中肋骨條藻的特異性。8、根據(jù)權(quán)利要求1所述檢測中肋骨條藻生長率的方法，其特征在于，所述步驟c克隆中肋骨條藻Cytb基因部分序列使用的《1物序列為TpCb*:5-ATACGCTTGGAGTTTTGGGTCTTCT-3,TpCbrp5-ATGAGCCGGAGTTGACATAGGATCT-3。9、根據(jù)權(quán)利要求1所述檢測中肋骨條藻生長率的方法，其特征在于，所述步驟d進(jìn)一步包括根據(jù)測得的Cytb序列設(shè)計RFQ-PCR引物探針SC-FQ-Cytb;引物SC-FQ-Cytb序列為5-GTGTTGAGCACATTATGCGAGAT-3;rp,5-GAACGCCTGAGCATCAAAGTAA-3;探針SC-FQ-Cytb序列為5-TGCAAATGGTGCTTCAATGTTCTTCA-3。10、根據(jù)權(quán)利要求1所述檢測中肋骨條藻生長率的方法，其特征在于，所述步驟e進(jìn)一步包括將收集的藻進(jìn)行RNA提取和反轉(zhuǎn)錄后，用熒光定量PCR擴(kuò)增每個樣品的PCNA和Cytb基因，以Cytb基因為管家基因，考察PCNA基因表達(dá)量的變化，以得到的CT值推算單位細(xì)胞中基因的表達(dá)量，按以下公式計算PCNA相對表達(dá)量REQ:REQ=lg[PCNA基因表達(dá)量/Cytb基因表達(dá)量]+K其中K為一個常數(shù)。全文摘要本發(fā)明公開了一種檢測中肋骨條藻生長率的方法，包括a.提取中肋骨條藻RNA；b.分離并克隆中肋骨條藻PCNA基因部分序列；c.克隆中肋骨條藻Cytb基因部分序列；d.根據(jù)PCNA與Cytb基因序列，建立檢測中肋骨條藻PCNA與Cytb基因的實時熒光定量PCR的標(biāo)準(zhǔn)曲線；e.以PCNA為目的基因、以Cytb為管家基因，根據(jù)中肋骨條藻PCNA基因相對表達(dá)量REQ檢測中肋骨條藻生長率。本發(fā)明提供了一種準(zhǔn)確估算中肋骨條藻現(xiàn)場生長率的技術(shù)方法，用于估算浮游藻類生產(chǎn)力、研究浮游藻種群變遷、構(gòu)建生態(tài)動力學(xué)模型乃至赤潮預(yù)測等。文檔編號C12Q1/68GK101153337SQ20071012149公開日2008年4月2日申請日期2007年9月7日優(yōu)先權(quán)日2007年9月7日發(fā)明者于志剛,何閃英,靜孫,毓甄,米鐵柱,趙麗媛申請人:中國海洋大學(xué)