專利名稱：鎂離子調(diào)控下的表達噬菌體裂解基因破壁方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體是涉及一種鎂離子調(diào)控下的表達噬菌體裂解基因破壁方法。
背景技術(shù)：
大腸桿菌的原核表達系統(tǒng)是目前基因工程研究中應(yīng)用最為廣泛的一種蛋白表達手段，它具有基因操作簡單，宿主菌株和質(zhì)粒選擇面廣，細菌易于生長和控制等特點。表達產(chǎn)物難純化是原核表達系統(tǒng)的一大難點。原核表達通常為胞內(nèi)表達，需要通過機械破壁或使用強表面活性劑來釋放表達產(chǎn)物，費時費力且存在破壞目的產(chǎn)物的可能性。一些報道采用表達細菌噬菌體的裂解基因的方法來裂解宿主菌。Resch等使用熱控制表達PhiX174噬菌體裂解基因，Hori等采用木糖調(diào)控表達芽孢桿菌的噬菌體裂解基因。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種新的噬菌體裂解基因表達方法來裂解宿主菌，即采用鎂離子調(diào)控表達噬菌體裂解基因的宿主菌破壁方法。
本發(fā)明的目的通過以下技術(shù)方案得以實現(xiàn)一種鎂離子調(diào)控下的表達噬菌體裂解基因破壁方法，其特征是，將噬菌體裂解基因克隆進受鎂離子調(diào)控的表達載體pYS，再轉(zhuǎn)化進宿主菌，然后通過控制Mg2+的濃度使裂解基因在宿主菌內(nèi)表達。
所說的噬菌體裂解基因，優(yōu)選λ噬菌體野生型裂解基因(SRRZ)和λ噬菌體Sam7突變型裂解基因(S-RRZ)。
本發(fā)明中所說的受鎂離子調(diào)控的表達載體pYS，如圖1所示，它含有鎂離子(Mg2+)運輸?shù)鞍谆騧gtC/B的啟動子序列(Pmgt)。
本發(fā)明在成功構(gòu)建Mg2+調(diào)控型原核表達載體的基礎(chǔ)上，將λ噬菌體野生型裂解基因(SRRZ)和Sam7突變型裂解基因(S-RRZ)分別置于Pmgt控制下，成功構(gòu)建了重組載體pYS-SRRZ及pYS-S-RRZ，上述重組載體能在Mg2+調(diào)節(jié)下表達裂解基因使重組菌自動裂解。
λ噬菌體的裂解基因在λ噬菌體生長周期的后期表達，裂解宿主菌導(dǎo)致λ噬菌體的釋放。λ噬菌體的裂解基因成簇，長1236bp，由4個基因組成，其中Rz1位于Rz內(nèi)，而S、R和Rz相互嵌合(圖2a)，S編碼穿孔素(holin)，攻擊內(nèi)膜蛋白；R編碼裂解素(endolysin)，水解細胞壁；而Rz1和Rz編碼輔助裂解因子。Sam7突變?yōu)镾基因的161核苷酸由G突變?yōu)锳，造成翻譯的提前終止，含有Sam7突變型裂解基因的λ噬菌體出現(xiàn)裂解缺陷。本發(fā)明構(gòu)建的載體pYS-SRRZ及pYS-S-RRZ經(jīng)實驗驗證表明λ噬菌體野生型裂解基因在誘導(dǎo)表達后可直接迅速裂解大腸桿菌，而Sam7突變型裂解基因的表達產(chǎn)物有裂解缺陷，高度累積后可對大腸桿菌產(chǎn)生輕度的裂解，在含EDTA緩沖液的作用下可獲得有效裂解(圖3b)，成功地解決了破壁問題。
能實現(xiàn)本發(fā)明目的的噬菌體裂解基因包括但不限于λ噬菌體野生型裂解基因(SRRZ)和Sam7突變型裂解基因(S-RRZ)。
本發(fā)明的有益效果體現(xiàn)在將噬菌體裂解基因克隆進受鎂離子調(diào)控的表達載體pYS，通過控制Mg2+的濃度可使裂解基因在大腸桿菌內(nèi)表達，獲得了在溫和條件下宿主菌的有效自我裂解。


下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明進一步說明。
圖1是鎂離子調(diào)控型原核表達質(zhì)粒圖譜；圖2是攜帶λ噬菌體裂解基因的大腸桿菌在LB培養(yǎng)基中的生長試驗；圖3是λ噬菌體裂解基因在N基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的誘導(dǎo)表達。
具體實施例方式
在本發(fā)明中所使用的術(shù)語，除非有另外說明，一般具有本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解的含義。
下面結(jié)合具體的制備實施例和應(yīng)用實施例，并參照數(shù)據(jù)進一步詳細地描述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例只是為了舉例說明本發(fā)明，而非以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
在以下的實施例中，未詳細描述的各種過程和方法是本領(lǐng)域中公知的常規(guī)方法。所用試劑的來源、商品名以及有必要列出其組成成分者，均在首次出現(xiàn)時標明，其后所用相同試劑如無特殊說明，均與首次標明的內(nèi)容相同。
質(zhì)粒和菌株質(zhì)粒pDsRed-Express購自美國BD Biosciences Clontech公司，pET-30a(+)和pGEM-T載體分別購自Novagen和Promega公司，λ噬菌體野生型裂解基因的質(zhì)粒pS107+由美國Texas A&M大學(xué)Dr.Young惠贈，構(gòu)建方法參見JGarrett JM，Yong RY.Lethal Action of Bacteriophage X SGene.Journal of Viorlogy，Dec.1982，p.886-892。鼠傷寒沙門氏菌X4550(Cya-Crp-Asd-R+M+)為美國Washington大學(xué)Dr.Roy Curtiss惠贈，本室保存，并保證向公眾發(fā)布超過20年。大腸桿菌DH5α購自深圳晶美生物公司。
試劑和儀器Pfu DNA聚合酶，dNTP，卡那霉素(美國Promega公司)；T4 DNA連接酶和凝膠DNA回收試劑盒(美國Roche公司)，Wizard Plus DNA抽提試劑盒(美國Promega公司)。用超純水配制成LB液體培養(yǎng)基(每升含tryptone 10g，yeast extract 5g，NaCl 10g，pH 7.2)和N基礎(chǔ)培養(yǎng)基(每升含Tris HCl 13.14g，Tris Base 0.2g，KH2PO40.136g，KCl 0.37g，(NH4)2SO41.0g，葡萄糖0.4％，0.1％酪蛋白，pH 7.2)。Tris-EDTA緩沖液(2mmol/L，pH 8.0)。AAS 300原子吸收光譜分析儀(美國Perkin Elmer公司)，UV240型紫外可見分光光度計(日本島津公司)，流式細胞儀FACSCalibur(美國Becton-Dickson公司)。
實施例1大腸桿菌誘導(dǎo)裂解試驗裂解基因的克隆和質(zhì)粒的構(gòu)建pYS的構(gòu)建可參考申請?zhí)枮?00710020573.0的在先中國發(fā)明專利申請《鎂離子調(diào)控的表達載體》采用引物P1、P2從鼠傷寒沙門氏菌X4550基因組中擴增出長約600bp的片段，連入pGEM-T載體，測序證實與GenBank中鼠傷寒沙門氏菌的Pmgt[序列號M57715]完全相同。然后用限制性內(nèi)切酶Bst1107 I和Xba I切下Pmgt裝入相同酶切的pET-30a(+)載體，新質(zhì)粒命名為pYS(圖1)，它去除了原先載體中的lacI基因和T7啟動子序列。
(P15’-GTATACTCCGGAGCAAACGCCTGAACTCCC-3’[Bst1107 I]，P25’-AGATCTGGAAGAATAAGTACGTGCTATATTTAG-3’[Xba I])采用引物P3、P4從質(zhì)粒pS107+中擴增出λ噬菌體野生型裂解基因SRRz，PCR產(chǎn)物先連入pGEM-T載體，經(jīng)測序證實其序列與GenBank的裂解基因序列[序列號NC_001416]完全一致，然后用Nde I和Sal I切下裂解基因，裝入pYS的相應(yīng)位點構(gòu)建pYS-SRRz；同法從λ噬菌體cI 857λSam7 DNA(Promega)中PCR擴增出含S基因突變型解基因S-RRz，構(gòu)建pYS-S-RRz。
(P35’-CCGCATATGCCAGAAAAACATGACCTG-3’[Nde I]，P45’-TTAGTCGACGCAACTCTATCTGCACTGCTC-3’[Sal I])LB液體培養(yǎng)基中的生長試驗將pYS、pYS-SRRz和pYS-S-RRz分別轉(zhuǎn)化進大腸桿菌DH5α，將DH5α(pYS)，DH5α(pYS-S-RRz)和DH5α(pYS-SRRz)分別接種LB液體培養(yǎng)基，不同的時間點檢測菌液600nm處的吸光度來觀察細菌的生長狀況。
結(jié)果顯示DH5α(pYS)在LB液體培養(yǎng)基中生長良好，而DH5α(pYS-S-RRz)生長速度減慢，生長曲線呈現(xiàn)緩慢的上升(圖2b)。與此形成對比的是，DH5α(pYS-SRRz)在LB液體培養(yǎng)基中生長不良，在培養(yǎng)早期DH5α(pYS-SRRz)可生長至一定的密度(2小時OD600可達0.20)，隨后吸光度降低，提示細菌發(fā)生裂解(圖2b)。試管中肉眼也可觀察到裂解物團聚而形成的絲狀物。λ噬菌體野生型和Sam7突變型裂解基因在DH5α內(nèi)的表達受培養(yǎng)基Mg2+的控制，當(dāng)外源添加10mmol/L MgCl2后，DH5α(pYS-S-RRz)和DH5α(pYS-SRRz)的生長曲線與DH5α(pYS)相似(圖2c)。
N基礎(chǔ)培養(yǎng)基裂解誘導(dǎo)試驗對于N基礎(chǔ)培養(yǎng)基裂解誘導(dǎo)試驗，重組菌先接種10mmol/L的MgCl2LB液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)至對數(shù)早期(OD6000.4-0.5)后收集細菌，PBS和N基礎(chǔ)培養(yǎng)基各洗滌兩次后，再重懸于N基礎(chǔ)培養(yǎng)基(含50μg/mL卡那霉素)37℃ 220r/min震搖培養(yǎng)。
LB培養(yǎng)基的組分含有機體提取物，即使用超純水配制仍有低濃度的殘留Mg2+存在。為進一步證實Pmgt控制下λ噬菌體裂解基因的表達，我們將生長至指數(shù)早期重組菌洗滌后懸浮于成分確定的N基礎(chǔ)培養(yǎng)基。從圖3a可看出DH5α(pYS-SRRz)管在30分鐘內(nèi)迅速裂解，1小時即達到最大裂解，試管內(nèi)的菌液變得澄清，裂解后的菌體形成絮狀漂浮物。即可檢測到紅色熒光蛋白(RFP)的表達，5小時表達量達到最大。DH5α(pYS-S-RRz)管的吸光度在誘導(dǎo)后1小時無變化，隨后出現(xiàn)緩慢的降低，說明λ噬菌體突變型裂解基因表達產(chǎn)物在大腸桿菌體內(nèi)積累后也對宿主菌產(chǎn)生了一定程度的裂解(圖3a)。為探討突變型裂解基因表達產(chǎn)物能否在外在因素作用下進一步裂解宿主菌，我們將圖3a中誘導(dǎo)后的DH5α(pYS-S-RRz)重新懸浮于Tris-EDTA緩沖液中，圖3b顯示DH5α(pYS-S-RRz)在該緩沖液中迅速裂解。在LB培養(yǎng)基中生長至生長后期的DH5α(pYS-S-RRz)(圖2b)重懸于Tris-EDTA緩沖液后也出現(xiàn)類似的裂解結(jié)果。
本發(fā)明不限于這些公開的實施方案，本發(fā)明將覆蓋在專利書中所描述的范圍，以及權(quán)利要求范圍的各種變型和等效變化。
權(quán)利要求
1.一種鎂離子調(diào)控下的表達噬菌體裂解基因的破壁方法，其特征是，將噬菌體裂解基因克隆進受鎂離子調(diào)控的表達載體pYS，再轉(zhuǎn)化進宿主菌，然后通過控制Mg2+的濃度使裂解基因在宿主菌內(nèi)表達。
2.如權(quán)利要求1所說的破壁方法，其特征是，所說的噬菌體裂解基因，是λ噬菌體野生型裂解基因SRRZ。
3.如權(quán)利要求1所說的破壁方法，其特征是，所說的噬菌體裂解基因，是λ噬菌體Sam7突變型裂解基因S-RRZ。
全文摘要
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體是涉及一種鎂離子調(diào)控下的表達噬菌體裂解基因破壁方法。所說的鎂離子調(diào)控下的表達噬菌體裂解基因的破壁方法，其特征是，將噬菌體裂解基因克隆進受鎂離子調(diào)控的表達載體pYS，再轉(zhuǎn)化進宿主菌，然后通過控制Mg
文檔編號C12N15/33GK101067123SQ200710021820
公開日2007年11月7日 申請日期2007年4月30日 優(yōu)先權(quán)日2007年4月30日
發(fā)明者焦新安, 張曉明, 潘志明, 黃金林, 孫林, 殷月蘭, 唐麗華, 劉秀梵 申請人:揚州大學(xué)