專利名稱：泛酸激酶藥物篩選模型及其應(yīng)用的制作方法
泛酸激酶藥物篩選模型及其應(yīng)用
所屬領(lǐng)域
本發(fā)明涉及大腸桿菌泛酸激酶藥物篩選模型，特別是涉及以不同的外源性泛酸激酶取代 大腸桿菌自身泛酸激酶的模型，以及利用該模型篩選泛酸激酶靶向藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
輔酶A (CoA)是所有生物有機體維持生命活動的一個重要輔助因子，在生命代謝中主 要參與?；磻?yīng)。具體地說，輔酶A參與體內(nèi)糖分解、脂肪酸氧化與合成、氨基酸分解、 丙酮酸降解及檸檬酸循環(huán)等一百多種合成與降解的代謝反應(yīng)。在大腸桿菌(￡. co//)內(nèi)的輔酶 A的生物合成途徑中,泛酸激酶(PanK)催化的泛酸磷酸化步驟是整個合成途徑的限速步驟。
在?；D(zhuǎn)移過程中，輔酶A可循環(huán)使用，但新分化的細(xì)胞則需要有新的輔酶A參與。因此， 如果抑制了輔酶A的合成途徑，便可能阻礙細(xì)胞分化、抑制新細(xì)胞生成，或者完全阻止細(xì)胞 生長，并導(dǎo)致細(xì)胞死亡。因此，這一特性為開發(fā)針對某種生物體的特異性抑制性藥物提供了 可能性。
泛酸(也稱為維生素Bs)是一種自然界廣泛存在的B族維生素。泛酸在發(fā)酵、呼吸、糖 原儲存等代謝中也起重要作用(Williams R J, Mosher W A and Rohrmann E. ， The Importance of Pantothenic Acid in Fermentation, Respiration and Glycogen Storage. Biochem丄1936,30:2036-9)。
據(jù)目前所知，幾乎所有的生物體都能夠利用泛酸來合成輔酶A。從泛酸到輔酶A的合成途徑是 普遍存在的，而在這一途徑中，泛酸激酶催化的反應(yīng)是關(guān)鍵性調(diào)控歩驟。
目前已克隆、鑒定并純化了許多物種的泛酸激酶基因。已知泛酸激酶基因的突變或缺失
將使生物體遭受嚴(yán)重后果，例如大腸桿菌ts9的突變菌株可使細(xì)胞對溫度敏感而停止生長 (Vallari D S and Rock C O. Isolation and characterization of temperature-sensitive pantothenate kinase (coaA) mutants of Escherichia coli. J. Bacteriol, 1987, 169: 5795-800);小鼠pank2基因的 敲除可引起視網(wǎng)膜的退化和精子缺乏(Brand L A and Strauss E. Characterization of anew pantothenate kinase isoform from Helicobacter pylori. J. Biol. Chem. 2005, 280: 20185-8 );人的 pank2基因突變可弓l發(fā)神經(jīng)退行性疾病(Pantothenate kinase-associated neurodegeneration ， PKAN) (Zhou B, Westaway S K, Levinson B, et al. A novel pantothenate kinase gene (PANK2) is defectiveinHallervorden陽Spatzsyndrome.Nat. Genet. 2001,28: 345-9)。在生物體內(nèi)，輔酶A合 成途徑的通暢是能量持續(xù)供應(yīng)的保證。如果切斷了這條途徑，生物體就會停止增生甚至死亡。 體外研究發(fā)現(xiàn)，輔酶A類似物能夠有效地抑制那些需要輔酶A參與反應(yīng)的酶的活性。但這 些類似物往往不能夠被跨膜轉(zhuǎn)運吸收，因此不能被用做抑制類藥物。泛酸激酶是輔酶A合成途徑中的第一個酶，也是對該途徑的調(diào)控酶，它的底物泛酸分子量很小，而且很容易被跨膜 吸收。另外，泛酸激酶在進化上功能保守，而且序列高度分化，原核和真核的基因序列幾乎 沒有同源性。因此，泛酸激酶有可能作為一個潛在的藥物靶點。我們有可能利用泛酸的結(jié)構(gòu) 類似物與泛酸激酶直接作用(競爭性或非競爭性)，抑制其催化活性，從而直接阻斷輔酶A 合成途徑；也可以篩選那些進入輔酶A合成途徑后生成輔酶A的類似物的化合物，使它們抑制 輔酶A參與的各種代謝反應(yīng)，進而達到抑制細(xì)胞生長的目的。
因此，泛酸激酶是一個很好的藥物靶點，有可能用來開發(fā)某些抑制不同細(xì)胞或生物體生 長的藥物，例如，可以篩選抑制微生物，寄生蟲，有害昆蟲的藥物。另外，由于泛酸會被跨 膜轉(zhuǎn)運吸收，所以也有可能方便地利用泛酸的結(jié)構(gòu)類似物(如N-戊基泛酸胺等)參與輔酶A 合成反應(yīng)，生成輔酶A的衍生物，競爭性地抑制輔酶A的合成。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及大腸桿菌藥物篩選模型，特別是涉及不同物種的外源泛酸激酶表達模型，以 及該模型在藥物篩選泛酸激酶靶向藥物中的應(yīng)用。
發(fā)明的一個目的是提供一個方便有效的藥物篩選模型，從而為大規(guī)模的尋找特異性泛酸 激酶抑制劑或抗代謝物(antimetabolite)提供可能性。
本發(fā)明中所指特異性泛酸激酶抑制劑包括泛酸激酶抑制劑以及泛酸激酶抗代謝物。
大腸桿菌是我們建立快速篩選模型的首選模式生物。為了制備本發(fā)明的模型，我們利 用遺傳學(xué)的方法，構(gòu)建攜帶不同物種泛酸激酶基因的質(zhì)粒，轉(zhuǎn)入大腸桿菌宿主中以互補替代 大腸桿菌中有缺陷的泛酸激酶基因(coa4/)。這樣我們就可以使它們成為具有相同背景(都 來自于大腸桿菌，并分別攜帶來源于不同物種的泛酸激酶基因)的一系列菌株。用所得到的 這些模型菌株篩選化合物，那么篩選到的有特異性的抑制性化合物便是泛酸激酶靶向的，即 作用于輔酶A合成途徑的。
由于泛酸激酶是一個不可缺少的代謝關(guān)鍵酶，因此該基因的敲除將是致死的。在大腸 桿菌中，有一類突變型菌株，它們在30'C下能正常生長，但在37'C或者42"C下表現(xiàn)為溫度敏 感(Temperature Sensitive)而不能生長。1987年，Vallari等人測定了溫度敏感型突變菌株 DV53(coaA15)的細(xì)胞粗提物中泛酸激酶的活性，并且與帶有正常coaA基因的菌株DV5進 行了比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在30'C下，DV53 (coaA15)的粗提物與正常的DV5粗提物相比，只 有少于20%的泛酸激酶活性，但這些活性仍然可以使DV53 (coaA15)正常生長；當(dāng)溫度升 至42。C時，DV53 (coaA15)的粗提物的泛酸激酶活性只有不到l % (Vallari D S and Rock C O. Isolation and characterization of temperature-sensitive pantothenate kinase (coaA) mutants of Escherichia coli. J. Bacteriol, 1987, 169: 5795-800)。由此我們得到了一個啟示可以在溫度敏感型的大腸桿菌突變株中轉(zhuǎn)入攜帶外源泛酸激 酶的質(zhì)粒，然后在37。C或42。C下進行化合物的篩選。這樣我們就可以免去敲除以及驗證的步 驟，達到快速篩選有用化合物的目的。
在我們的實驗中，將用已知的泛酸激酶基因，通過序列比對，尋找一些有研究價值的潛 在的泛酸激酶。將這些已知的或未知的泛酸激酶基因一起，應(yīng)用于我們的模型。
一方面，我 們可以通過基因的功能互補證明我們所找到的潛在的泛酸激酶是真的泛酸激酶；另一方面， 也可以檢測大腸桿菌快速篩選模型設(shè)想的可行性以及實用性。
大腸桿菌的泛酸激酶是目前研究最多的，它的結(jié)構(gòu)和功能也都已知。我們用它的蛋白
序列(GenBank Accession No. NP—418405，為方便起見，我們將其命名為&PanK )在NCBI 數(shù)據(jù)庫中進行BLAST檢索，以尋找同源泛酸激酶。BLAST得到的結(jié)果大部分是原核生物的 泛酸激酶，我們從中選取流感嗜血桿菌的泛酸激酶(///PanK)和結(jié)核分枝桿菌的泛酸激酶 (MfPanK)兩種泛酸激酶進行下一步的研究，它們與&PanK分別具有77%和70%的相似性。 在所得的結(jié)果中，我們沒有發(fā)現(xiàn)面包酵母(S. "^WW"e )泛酸激酶。這說明原核生物
和真核生物的泛酸激酶氨基酸序列差別很大。于是，我們用已知的真核生物泛酸激酶蛋白序 歹ij，即人的泛酸激酶hPANK2 (GenBank Accession No. DAA00004)在NCBI的數(shù)據(jù)庫中檢索， 發(fā)現(xiàn)面包酵母的YDR531Wp(GenBank Accession No. NPJ)10820，命名為5"cPanK )與hPANK2 有很高的同源性。之后，我們用&PanK的序列進行BLAST，找到了果蠅(D. we/a"ogarfw) 的泛酸激酶AmWe (GenBank Accession No. NP—620550，我們命名為dPanK)。另外在瘧原蟲 尸/a雄o&畫/a/c/pan/w3D7基因組數(shù)據(jù)庫中做BLAST，進一步發(fā)現(xiàn)了惡性瘧原蟲(尸. /a/c^anw7)中的潛在泛酸激酶(GenBank Accession No. AAN36812,命名為戶yPanK)。
我們對大腸桿菌(￡. co//)，流感嗜血桿菌(H /"/7we"加e)，結(jié)核分枝桿菌(M ft/6en:w/a '>s )，面包酵母(5". cwev^/ae )，惡性癥原蟲(尸./a/";paraw)、果蟲雖(M Aosopfe7flf) 以及人(//. w/"'ew )等七種物種的泛酸激酶進行了進化關(guān)系和同源性分析(參見圖1和2)。
結(jié)果可見，原核生物泛酸激酶在進化上相對比較接近，而真核生物泛酸激酶進化上則相 差較遠。另外，真核生物之間也是高度分化的。這一特性為我們尋找特異性抑制劑提供了可 能性。例如，某化合物能夠特異性地抑制某原核有害生物的生長，而對真核生物尤其是人無 害，那么它就有希望成為一種新的針對某原核生物體的抗生素。另外，如果某種化合物能夠 抑制或殺死某生物體內(nèi)的真菌，那么它就有可能成為該生物體的殺真菌藥物。
此外，我們還進行了多序列的同源比較(圖2)。序列同源性百分比表示為黑色100%，
深灰色80%，淺灰色60X。首先用CLUSTALXv1.83程序進行計算，然后導(dǎo)入GeneDoc v2.6.02
進行編輯調(diào)整。因此，經(jīng)過以上的序列分析，我們選取了五個不同生物體的有代表性的泛酸
激酶，用于進一步的研究。它們是
五cPanK (已經(jīng)被深入研究，可作為陽性對照)；歷PanK和MWanK (這兩者都是致病菌，比較有研究價值)； ScPanK (可作為真核生物泛酸激酶的代表)；
PyPanK (這是一個有爭議的基因，惡性瘧原蟲作為一種寄生蟲，是否帶有泛酸激酶至 今還沒有定論)。
如前所述，使用基因敲除的方法來建立模型會很繁瑣的，但我們發(fā)現(xiàn)有某些溫度敏感型 突變菌株的存在，并且它們的溫度敏感型在豐富培養(yǎng)基的條件下是由EcPanK (coa4)的突變 引起的。這樣就為我們當(dāng)初設(shè)想的通過基因互補建立模型提供了現(xiàn)成的菌株。檢測細(xì)胞粗提 物中的泛酸激酶的方法可參見Vallari et al., Isolation and characterization of temperature-sensitive pantothenate kinase (coaA) mutants of Escherichia coli. J. Bacteriol. 1987, 169: 5795-800。
我們將選出的五個泛酸激酶基因分別構(gòu)建到大腸桿菌的表達載體中。所有構(gòu)建的質(zhì)粒均 經(jīng)過酶切驗證，證明所有克隆的質(zhì)粒都是正確的，并且均不帶有突變位點。至此，我們成功 構(gòu)建了5個質(zhì)粒，分別命名為;xEcPanK， ； ///PanK， pM;fPanK， /AScPanK禾口;xP/PanK。
本發(fā)明中所使用的即是大腸桿菌溫度敏感型突變株ts9(/eW6yTwf toc}7 to-/ g/"r"^S」 ga/-6^4M-/^G7(7^」wgG6 r戸丄9 wa/77fZawi ; ;c_yW7w"S7 coaJ7 //w-7)(由耶魯大學(xué)的 大腸桿菌遺傳貯藏中心(E.co/;'Genetic Stock Center, Yale University)提供)。在豐富培養(yǎng)基的 條件下，ts9能夠在3(TC下正常生長，但在37'C時則不能生長。測序結(jié)果發(fā)現(xiàn)，其突變是由coa4 基因內(nèi)的一個點突變引起的(C706T)，該基因突變它引起的蛋白序列變化是L236F (ChenX, Shen D and Zhou B. Analysis of the temperature-sensitive mutation of Escherichia coli pantothenate kinase reveals YbjN as a possible protein stabilizer. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2006)。該等位基因被稱為coa47。
我們將如上構(gòu)建的質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)入ts9突變株中，使外源泛酸激酶在ts9中表達，功能互補有 缺陷的okl47，使其在37'C下能夠正常生長。由于ts9本身的co"7有缺陷，故所表達的蛋白質(zhì) 在37'C時活性很差(體外實驗證明在39'C時已完全沒有活性)，因此，我們可以認(rèn)為在37。C 時起作用的絕大部分是外源表達的泛酸激酶。
五cPanK，所PanK， MfPanK和&PanK能夠功能互補ts9的缺陷型coa47，使其在37。C下能 夠正常生長，說明我們所克隆的基因確實是泛酸激酶基因。
對流感嗜血桿菌泛酸激酶，實驗中發(fā)現(xiàn)，ts9中轉(zhuǎn)入p/Z/PanK后，菌株生長較差。這可能 有兩種情況 一是流感嗜血桿菌的泛酸激酶和大腸桿菌的泛酸激酶互補不完全；二是與流感 嗜血桿菌泛酸激酶蛋白在ts9中產(chǎn)生毒性有關(guān)。
本發(fā)明人成功克隆了5個泛酸激酶基因,即p五cPanK、 p歷PanK， pA^PanK， p&PanK禾口 p尸yPanK。將它們轉(zhuǎn)入大腸桿菌突變株ts9后，前四者能夠功能互補ts9的缺陷基因co^47 ，使 它能在37'C正常生長；但pPyPanK不能功能互補。經(jīng)過進一步的研究證明，這可能和/yPanK 含有大量大腸桿菌的稀有密碼子，在轉(zhuǎn)入ts9后不能順利表達有關(guān)。
為了證明本發(fā)明建立的模型是否成功，我們觀察了大腸桿菌轉(zhuǎn)入不同的外源泛酸激酶基因后，對不同的化合物產(chǎn)生的不同反應(yīng)。結(jié)果證明，使用本發(fā)明的大腸桿菌模型，確實可 以通過分析某些對泛酸激酶途徑具有不同作用的天然或合成化合物的活性，來尋找和篩選特 異性抑制藥物。
建立模型后，我們研究了六種化合物(泛酸的類似物)對相應(yīng)物種(大腸桿菌、流感 嗜血桿菌和面包酵母)模型的抑制情況。兩組數(shù)據(jù)的比較和分析表明，該模型能夠快速正確 地給出各種化合物的相對抑制效果。因此，我們的實驗為今后克隆更多物種的泛酸激酶、合 成大量的化合物、進行大規(guī)模的篩選和研發(fā)有效的泛酸激酶靶藥物提供了可能性。
為了驗證本發(fā)明的泛酸激酶藥物篩選模型的可應(yīng)用性，我們選擇下列泛酸的結(jié)構(gòu)類似 物作為待試化合物D-泛酸(D-pantothenicacid) ， DL-泛磺酰胺(D-pantoyltaurylamide)， D隱泛酰醇(D-panthenol)和DL-泛酰醇(DL-panthenol)(以上化合物均購自Sigma公司)， 以及N-戊基泛酸酰胺(N-pentylpantothenamide， N5-Pan) 、 N-庚基泛酸酰胺
(N-heptylpantothenamide， N7-Pan)禾卩N-壬基泛酸酰月安(N-nonylpantothenamide， N9-Pan )
(以上化合物由本研究室合成)。
我們評價了同一化合物對不同ts9菌株的抑制效果，進行了橫向和縱向比較在橫向比較 中，對同一個菌株，它的一切背景都是均一的，所有的不同都是由化合物的不同引起的。而
在縱向比較中，雖然背景基本相同(都是ts9菌株)，但轉(zhuǎn)入的表達質(zhì)粒會因為攜帶基因的不
同而導(dǎo)致表達量的不同。
我們建立了泛酸激酶靶向藥物快速篩選模型，并且隨機選擇六種化合物應(yīng)用于該模型，
得到了關(guān)于不同化合物對各個ts9菌株的抑制情況的信息。為了進一歩證實從該模型中得到 的數(shù)據(jù)是否能真實地反映原物種的真實情況，我們選取了三個物種大腸桿菌DH5a，流感嗜 血桿菌以及面包酵母BY4742分別進行實驗，測定添加不同濃度化合物后重組體細(xì)胞的生長情 況，并與得自模型的數(shù)據(jù)進行比較。
結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對于大腸桿菌泛酸激酶而言，模型中所得抑制濃度普遍高于大腸桿菌DH5a， 這可能與p五cPanK在細(xì)胞內(nèi)的表達水平較高有關(guān)。但從這兩個獨立的系統(tǒng)中得出的信息是相 同的，即各種化合物對大腸桿菌的抑制效果為N5-Pan> N7-Pan-N9-Pan> pantoyltaurine= D-panthenol= DL-panthenol 。
對于流感嗜血桿菌泛酸激酶，由于N7-Pan和N9-Pan的溶解性比N5-Pan差，因此對 N7-Pan和N9-Pan而言，從模型中(在平板上操作)得到的抑制濃度比相應(yīng)物種中(在液體 培養(yǎng)基中操作)得到的抑制濃度稍高。綜合考慮這些影響因素，我們認(rèn)為模型和相應(yīng)物種得 到的數(shù)據(jù)仍然是吻合的，即各種化合物對流感嗜血桿菌的抑制效果為N5-Par^ N7-Pan-N9-Pan〉 pantoyltaurine=D-panthenol = DL-panthenol 。
對面包酵母的泛酸激酶，雖然從模型和相應(yīng)物種得到的數(shù)據(jù)相對排序相同，即各種化合
物對面包酵母的抑制效果為N5-Pan> N7-Pa論N9-Pan>
D-panthenol-DL-panthenol>pantoyltaurine。但它們的絕對數(shù)值差別很大在模型中，N5-Pan對帶有pQE-Sc/^"/:的ts9菌株抑制是最強的(5pM時完全抑制)。但在相應(yīng)的物種面包酵母 BY4742中，濃度到2.5mM以上才發(fā)揮抑制作用。我們注意到，酵母的最適生長溫度是30'C， 但我們的模型是在37i:下操作的，溫度對酶的活性的影響是很大的，因此我們認(rèn)為，在模型 中，ScPanK足以功能互補ts9中有缺陷的coa47，但由于在37'C是時&PanK處于很不穩(wěn)定的脆 弱狀態(tài)， 一旦遇到抑制劑，活性便很容易被阻抑。
由以上的分析可見，本發(fā)明的模型能夠準(zhǔn)確地分析和檢測各種化合物的相對抑制效果， 并且這些抑制水平上的區(qū)別都是由于所轉(zhuǎn)入的泛酸激酶的不同導(dǎo)致的，這就確保所篩選到的 泛酸激酶抗代謝物或抑制劑，在與泛酸激酶的相互作用后發(fā)揮其抑制細(xì)胞生長的作用。
本發(fā)明的基于泛酸激酶途徑的大腸桿菌模型，作為一種藥物篩選模型，其使用方便、而 且篩選實驗快捷并可靠。特別是，大腸桿菌生長快速，操作簡單，使用ts9之后也免除了基 因敲除的步驟。在化合物篩選的過程中，我們往往更關(guān)注一些有害病原菌被抑制的情況，比 如我們實驗中提到的結(jié)核分枝桿菌和惡性瘧原蟲。作為體外篩選實驗，本發(fā)明的體內(nèi)比體外 模型更接近實際情況，所得的數(shù)據(jù)更加可靠。
因此，如果我們有條件合成大規(guī)模的化合物(比如一次合成96種或更多種化合物)，就 可以在96孔板上進行初篩，選用一個濃度(比如5mM )，在這個濃度下能夠抑制細(xì)胞生長 的候選化合物。例如我們想要尋找抗結(jié)核藥物，就可以用攜帶p^^PanK的ts9菌株進行篩選， 測定培養(yǎng)后的細(xì)胞OD值，對抑制活最強的化合物進行結(jié)核分枝桿菌抑制實驗，同時檢測這些 化合物對哺乳動物的毒副作用。如果某種化合物能夠特異性的抑制結(jié)核分枝桿菌，而對哺乳 動物沒有任何傷害，那么該化合物便可能成為抗結(jié)核菌的候選藥物。


圖l顯示圖七種泛酸激酶蛋白的系統(tǒng)進化樹。 圖2顯示七種泛酸激酶序列的同源性比較。
圖3顯示四種泛酸激酶在大腸桿菌中的表達。A: EcPanK; B:州PanK; C: MfPanK; D: 5bPanK 。其中泳道l:分子量標(biāo)記，泳道2:誘導(dǎo)前，泳道3:誘導(dǎo)后。 圖4顯示外源泛酸激酶基因轉(zhuǎn)入ts9突變株后的功能互補試驗。 圖5顯示實驗中所用化合物的結(jié)構(gòu)示意圖。
圖6顯示不同化合物對帶有不同外源泛酸激酶的ts9菌株的抑制效果。 圖7顯示所試驗的各種化合物對大腸桿菌DH5ot的抑制水平。其中各化合物的代表符號為 DL-pantoyltaurine (☆)， D-panthenol ( )， DL-panthenol(o)， N5-Pan (□)， N7-Pan (T)， andN9-Pan
(▽)。
圖8顯示所試驗的各種化合物對流感嗜血桿菌的抑制水平。其中各化合物的代表號為DL-pantoyltaurine (☆)， D-panthenol ( )， DL-panthenol(o)， N5-Pan(口)， N7-Pan(T)'和N9-Pan
(▽)。
圖9顯示所試驗的各種化合物對面包酵母BY4742的抑制水平。其中各化合物的代表符號 為DL-pantoyltaurine (眾)，D-panthenol ( )， DL-panthenol(o)， N5-Pan(口)， N7-Pan(V)， and N9-Pan(V)。
具體實施例方式
下面實施例用于進一歩說明本發(fā)明，但不是對本發(fā)明保護范圍的限制。
實施例l: PanK載體的構(gòu)建
T叫聚合酶購自Promega公司，內(nèi)切酶和T4連接酶均購自Takara公司，引物由北京三博 生物技術(shù)公司合成。其它化學(xué)試劑均是分析純以上級別。
所有的泛酸激酶基因均從相應(yīng)物種的基因組DNA中PCR擴增獲得，其中&PanK擴增自 大腸桿菌K-12菌株DH5a的基因組DNA;用于擴增/Z/PanK的基因組DNA來自于北京協(xié)和醫(yī)院 分離的流感嗜血桿菌//. /"/7wenzae Rd KW20;
因結(jié)核分枝桿菌具有感染性， 一般的實驗室條件無法操作，但由于M/PanK的基因序列 和用于疫苗的卡介苗(BCG，最初來源于牛型分枝桿菌M ^v"AF2122/97)的泛酸激酶基因 序列相同，因此該基因是從BCG的基因組DNA中擴增得到的。BCG菌株是由北京大學(xué)昌 增益老師實驗室饋贈的；&PanK是從面包酵母S. rev/w'"e BY4742 (M4rct WW-A7/ew2-A0 />^-A0wra3-A0)(美國Invitrogen公司)的基因組DNA中獲得；尸yPanK擴增自惡性瘧原蟲 (尸./a/c^ ram) 3D7cDNA (美國加大P. Rosenthal實驗室)。
設(shè)計引物
(1) 對p五cPanK，我們用BamHI和HindIII兩個位點，引物序列為"coaAF-80L": 5'-CGGGATCCagtataaaagagcaaacgttaatg-3' (SEQIDNO: 1)禾口"coaAR陽80L": 5'-CGCCCAAGCTTctcccctgcaaattatttgcg-3' (SEQIDNO: 2)。
(2) 對p歷PanK，我們用BamHI和PstI兩個位點。引物序列為"HIpankF-80L": 5'-CGGGATCCgaattttcaactcagcaaacacc-3' (SEQIDNO: 3)禾口"HIpankN-80L": 5'-AAAACTGCAGacgtgcgaatttttatt加ttaatt-3' (SEQ ID NO: 4)。實驗時發(fā)現(xiàn)直接從H /"y we"zae 的DNA做PCR很困難，在瓊脂糖凝膠上幾乎看不到產(chǎn)物，我們利用了巢式PCR(nestingPCR) 才最終把該基因PCR出來。
(3) 對pM,PanK，我們用BamHI和HindIII兩個位點。引物序列為"BCGcoaAF-BamHI-80L": 5'-CGGGATCCtcgcggcttagcgagccga-3' (SEQIDNO: 5)禾口"BCGcoaAR-HindlII-80L": 5'-CGCCCAAGCTTaccgccaattacagcttgcgc-3' (SEQIDNO: 6)。
(4) 對p&PanK，我們也用了BamHI和HindIII兩個位點。引物序列為"yPankF-80L-Bamffl":
95'-CGGGATCCccgcgaattactcaagagatat-3' (SEQIDNO: 7)和"yPankR-80L-HindlII": 5'-CGCCCAAGCTTgtgaaatctatctacgtacttg-3， (SEQIDNO: 8)。
(5)對pi^PanK，我們?nèi)匀挥昧薆amHI和HindIII兩個位點。引物序列為"pfPANKF-80L": 5'-CGGGATCCagaaagtataaaaacgaattaaacatt-3' (SEQIDNO: 9)和"pfPANKR-80L，， 5'-CGCCCAAGCTTcttgagatctacctttttacattg-3， (SEQIDNO: 10)。
由于pQE-80L帶有起始密碼子ATG，為了在N端加上His6-tag，所有的F端引物均不含 有起始密碼子，并且與His6-tag的序列融合。構(gòu)建質(zhì)粒的方法按照分子克隆常規(guī)方法。
所有構(gòu)建的質(zhì)粒均經(jīng)過酶切驗證，測序如果證明，所有克隆的質(zhì)粒都是正確的，沒有突 變位點。至此，我們成功構(gòu)建了5個質(zhì)粒，它們分別是p五cPanK， p///PanK， pMtPanK， p&PanK 和p尸yPanK。
實施例2:泛酸激酶的表達和功能互補實驗
1、 細(xì)胞轉(zhuǎn)化
將如上構(gòu)建的質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)入ts9突變株中，使外源的泛酸激酶在ts9中表達，功能互補有 缺陷的co"J7，使其在37'C下能夠正常生長。由于ts9本身的o)^4/有缺陷，表達的蛋白在37'C 時活性很差(體外實驗證明在39'C時己完全沒有活性[32])，因此，我們可以認(rèn)為在37i:時 起作用的絕大部分是外源表達的泛酸激酶。
我們使用常規(guī)電轉(zhuǎn)移方法進行質(zhì)粒轉(zhuǎn)移。將ts9細(xì)胞培養(yǎng)至對數(shù)中期，OD值為0.5以上， 然后冰浴。4°C， 1000g離心15分鐘，倒去培養(yǎng)液，用預(yù)冷的無菌去離子水和10%甘油各洗一 次，以降低細(xì)胞懸液的離子強度。最后重懸在適量的10%甘油中，使最終的細(xì)胞濃度約為2
一3xl0"'細(xì)胞/ml，并分裝成100pl/管。用于后續(xù)的轉(zhuǎn)化。
使用電轉(zhuǎn)儀(Eppendorf公司)，0.2cm電轉(zhuǎn)杯，脈沖電壓1250V。脈沖結(jié)束后，迅速加 入500pl培養(yǎng)基，并將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至1.5ml聚乙烯管中，放入3(TC搖床，輕柔振蕩l小時。然 后將細(xì)胞涂在含氨芐抗生素(100pg/ml )的LB平板上，放入3(TC溫箱過夜培養(yǎng)。
共轉(zhuǎn)化了7個質(zhì)粒，它們分別是p五cPanK， p歷PanK， pMrPanK， pScPanK， pPyPanK， pQE-80L和1 ng pUC 18 ，其中1 ng pUC 18是用來測定轉(zhuǎn)化效率的。
2. 功能互補實驗
挑取單個菌落，將其重懸在200pl無菌去離子水中，渦懸混勻后10倍稀釋，(續(xù)四個稀 釋度)。6種菌株(pEcPanK， p歷PanK， pMfPanK， p&PanK， p尸^PanK和pQE-80L )中每 種菌株挑取6個菌落，進行相同操作，以防假陽性。然后每個稀釋度分別取2)al在LB十氨芐 抗生素的平板上，每個稀釋度點兩個平板， 一個放在30'C溫箱培養(yǎng)，作為對照；另一個放在 37'C溫箱培養(yǎng)，以檢測轉(zhuǎn)入的外源泛酸激酶能否功能互補ts9的coa47，使ts9能在37'C下正常生長(結(jié)果參見圖4)。
如圖4所示，空質(zhì)粒pQE-80L轉(zhuǎn)入ts9菌株后不能使其在37'C下生長。而轉(zhuǎn)入p五cPanK， p州PanK， pMrPanK和p&PanK均可以使ts9在37。C下」下常生長。五cPanK， ///PanK， MrPanK 和&PanK能夠功能互補ts9的缺陷型coa47，使其在37。C下能夠正常生長，說明我們所克隆 的基因確實是泛酸激酶基因。
對流感嗜血桿菌泛酸激酶，實驗中我們發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)入pF/PanK后，ts9細(xì)胞生長相對較差。 這可能有兩種情況 一是流感嗜血桿菌的泛酸激酶和大腸桿菌的泛酸激酶雖然同源性很高， 但它們在執(zhí)行催化功能時有很大區(qū)別，導(dǎo)致功能互補不完全；二是流感嗜血桿菌泛酸激酶蛋 白在ts9中具有毒性，使得它生長緩慢。
至此，我們成功克隆了5個泛酸激酶基因,即p五cPanK， p歷PanK， piWifPanK， p&PanK和 p尸/PanK。將它們轉(zhuǎn)入大腸桿菌突變株ts9后，前四者能夠功能互補ts9的缺陷基因coo4J，使 它能在37'C正常生長；但pi!/PanK不能功能互補。經(jīng)過進一歩的研究證明，這可能和/yPanK 含有大量大腸桿菌的稀有密碼子，在轉(zhuǎn)入ts9后不能表達有關(guān)。由此，我們建立了四種可用 于泛酸激酶靶向的化合物篩選模型，為下一歩的研究做好了準(zhǔn)備。
實施例3:候選化合物的合成及模型的應(yīng)用
如上得到的模型均具有相同的背景(ts9菌株)，所不同的是它們含有不同的外源泛酸 激酶(分別是五cPanK，歷PanK， M,PanK和&P肌K)。本實施例中，我們將試驗幾種己有的 或新合成的化合物，觀察它們是否能夠抑制各種ts9菌株的生長，并且希望它們對不同的ts9 菌株有不同的抑制濃度。這樣， 一方面說明我們建立的模型是成功的，轉(zhuǎn)入不同的外源泛酸 激酶后會對不同的化合物產(chǎn)生不同的反應(yīng)。 一方面，可以證明泛酸激酶確實是一種重要的和 高度分化的酶，另一方面，不同的抑制濃度為我們尋找特異性抑制藥物提供了可能性。
為此，選擇七中從市場上購買或自行合成某些泛酸結(jié)構(gòu)類似物，使其分別在進入細(xì)胞后 能夠作為泛酸激酶的底物并進入輔酶A合成途徑，或者直接與泛酸激酶作用，以觀察其阻礙 泛酸激酶的活性。
這些化合物包括購自Sigma公司的D-泛酸(D-pantothenic acid) 、 DL-泛磺酰胺 (D-pantoyltaurylamide) ， D-泛酰醇(D-panthenol)和DL-泛酰醇(DL-panthenol)，以及自 己合成的N-戊基泛酸酰胺(N-pentylpantothenamide， N5-Pan) 、 N-庚基泛酸酰胺 (N-heptylpantothenamide， N7隱Pan)禾QN-壬基泛酸酰月安(N-nonylpantothenamide， N9-Pan)
(參見圖6)。
60ml泛酸水溶液旋蒸干燥后得到6g泛酸，呈粘性，淡黃色，將其溶于15ml干燥的DMF
中，平均分成三份，每份溶液加入10ml干燥的DMF，在100ml燒瓶中進行反應(yīng)。在其中一
份溶液中加入1.16ml正戊胺和2.24ml DPPA,用于合成N5-Pan ;另外一份溶液中加入1.48ml
正庚胺和2.24ml DPPA，用于合成N7-Pan ;最后一份溶液中加入1.83ml正壬胺和2.24mlDPPA,用于合成N9-Pan 。反應(yīng)物冷卻到0。C后分別加入1.39ml三乙胺，在0。C攪拌2小時后 在室溫下攪拌過夜，得到的產(chǎn)物旋蒸除去DMF，用硅膠柱純化，洗脫液為120:8:1的二氯甲
烷甲醇氨水。收集含有所需產(chǎn)物的部分并濃縮，得到的白色粉末即為所需產(chǎn)物。
至此，我們共有7種化合物，它們的結(jié)構(gòu)如圖5所示。為了統(tǒng)一起見，我們都用5%的 DMSO溶解這些化合物。所選定的篩選濃度梯度為5^M， 50pM， lOOOpM和5000nM。
l配制平板對一種化合物，共需5塊平板，為LB十氨芐抗生素(10(^g/ml) +不同濃度的化 合物(0pM， 5|aM， 50|aM， lOOOpM和5000^M)。鑒于0pM濃度的平板對六種化合物可以 共用，并另外再加一個3(TC培養(yǎng)的對照，因此六種化合物一共需26塊平板(2塊0)nM濃度 化合物的平板+4塊含不同濃度化合物的平板x6種化合物=26塊平板)。 化合物篩選對每種ts9菌株，挑取單個菌落，將其重懸在200nl無菌去離子水中，渦懸混勻。 然后十倍稀釋，連續(xù)四個稀釋度。每組稀釋度各取2pl點在平板上，點成一排，共點26個平 板。除了0pM化合物的一塊平板放在30'C溫箱過夜培養(yǎng)外，其余均放入37C溫箱過夜培養(yǎng)。 結(jié)果如圖6。
從圖6可以看出，D-pantoyltaurine對所有的菌株均無抑制作用。這恰好與己報道的 D-pantoyltaurine不能被泛酸通透酶跨膜轉(zhuǎn)運相符合(Vallari D S and Rock CO. Pantothenate transport in Escherichia coli. J. Bacteriol, 1985, 162: 1156-61)。
由此，我們認(rèn)為泛酸酰胺類化合物是可以跨膜轉(zhuǎn)運的。另外一個證據(jù)就是，如果泛酸酰 胺類化合物是通過它們的垸基側(cè)鏈作用于膜上，來抑制細(xì)胞生長，那么它們的作用效果應(yīng)該 是N9-Pan〉N7-Pan〉N5-Pan ，但實驗的結(jié)果恰恰相反，是N5-Pan〉N7-Pan〉N9-Pan 。這也通過 反證排除了作用于膜的可能性。
由圖6可見，D-和DL-panthenol區(qū)別不大，它們對帶有五cPanK，歷PanK和M,PanK的 ts9菌株都不抑制，但在lmM時能夠抑制帶有&PanK的ts9菌株。這就體現(xiàn)了化合物對不 同泛酸激酶的特異性抑制。
N5-， N7-和N9-Pan對四種ts9菌株的抑制效果都很好，沒有太多的選擇性。從藥物開 發(fā)的角度來說，這樣的化合物并不適用。
以上，我們評價了同一種藥物對不同ts9菌株的抑制效果，進行了縱向比較。我們還可以 進行橫向比較，即評價不同的藥物對同一種ts9菌株的抑制效果，這樣的評價更加可信。因為 對同一個菌株，它的一切背景都是均一的，所有的不同都是由化合物的不同引起的。而且， 橫向比較的結(jié)果更加可靠。
從圖4可以看到，EcPanK的表達量非常高，這可能和它本身就是大腸桿菌的蛋白有關(guān)。 州PanK和MWanK的表達量次之，ScPanK稍差(參見圖3)。這種蛋白表達量的不同，恰 是化合物的抑制濃度不同的根本原因。實施例4:對本發(fā)明模型的評估實驗
我們建立了泛酸激酶靶向的快速篩選大腸桿菌模型，并且選用了六種化合物來應(yīng)用這個 模型，得到了關(guān)于不同化合物對各個ts9菌株的抑制情況的信息。為了證實本發(fā)明模型所得 數(shù)據(jù)是否能真實地反映原本物種的客觀情況，我們選取了大腸桿菌DH5a，流感嗜血桿菌以及 面包酵母BY4742等三種物種。測定它們在添加不同化合物濃度的情況下的生長狀態(tài)，并與從 模型中得到的數(shù)據(jù)進行了比較，以對本發(fā)明模型的實際可應(yīng)用性進行評估。
1、 化合物對大腸桿菌DH5oc的抑制效果 選用液體稀釋法測定化合物對大腸桿菌DH5a的抑制效果。
挑取大腸桿菌DH5ct的單菌落，37'C過夜培養(yǎng)。測OD值，估算細(xì)胞數(shù)，然后將細(xì)胞稀釋 成3-4xl04細(xì)胞/ml。
配制不同濃度的化合物。采用梯度稀釋法我們的化合物儲液濃度是100mM，溶在5% DMSO中。取無菌1.5ml聚乙烯管14個，排成一排，第l管加入984pl溶劑(即5XDMSO)， 最后一管(第14管)加入400W溶劑(這一管作為不加化合物的生長對照)，其余12管分 別加入500W溶劑。在第l管中加入100mM的化合物原液16nl (濃度為1600pM)，混勻， 然后吸取500pl至第2管，混勻后再吸取500pl至第3管，如此連續(xù)倍比稀釋至第7管(濃 度為25pM)，然后從第7管吸取524.6pl至第8管(濃度為12.8pM)，之后，從第8管吸取 50(^1至第9管，混勻后再吸取500pl至第IO管，如此一直到第13管。
此時，各管的化合物濃度分別為1600、 800、 400、 200、 100、 50、 25、 12.8、 6.4、 3.2、 1.6、 0.8、 0.4、 O(iM。
一開始我們用LB培養(yǎng)基，但發(fā)現(xiàn)DH5a很難被抑制，可能是LB中營養(yǎng)過于豐富，或 者含有高濃度的泛酸。后來根據(jù)參考文獻，改用Tryptone Broth (TB)培養(yǎng)基。
接菌時，在14支試管中，每支加入500plTB培養(yǎng)基，lOOpl稀釋后的菌液(約有3000 一4000個細(xì)胞)以及相應(yīng)濃度的化合物400ial?？偣彩莑ml 。最終化合物的濃度分別為640、 320、 160、 80、 40、 20、 10、 5.12、 2.56、 1.28、 0.64、 0.32、 0.16、 O(iM 。
將接種好的試管置于37'C搖床中振蕩48小時后收菌，測OD600的值。結(jié)果如圖7。此結(jié) 果是三次重復(fù)實驗的平均值(絕大部分誤差小于5%)。
2、 化合物對流感嗜血桿菌的抑制效果
此處使用的流感嗜血桿菌是由浙江大學(xué)附屬兒章醫(yī)院臨床分離所得的。流感嗜血桿菌的 培養(yǎng)需要添加血液中的X因子， 一般使用巧克力平板。但巧克力平板相對不透明，不方便計 數(shù)；而且不能配成液體培養(yǎng)基。我們在本實驗中使用XV培養(yǎng)基，購于天津金章新技術(shù)研究 所，它是以腦心浸液為基礎(chǔ)，加入XV因子及抗生素成分配置而成的，可根據(jù)需要配制成液 體或固體培養(yǎng)基，而且顏色類似LB培養(yǎng)基，基本透明，可計數(shù)。最初想直接液體搖菌，然后通過測量OD值檢測。后來發(fā)現(xiàn)，對流感嗜血桿菌，OD值很 不準(zhǔn)確，而且有些化合物(比如N9-Pan)在剛開始是溶解的，等培養(yǎng)結(jié)束后，會析出一些不 溶物，影響了OD值的測量。于是改用先液體搖菌，然后涂板記活菌數(shù)的方法。
挑取單菌落接菌，37。C過夜培養(yǎng)，至OD6G()二0.4-0.5，稀釋200倍。
不同濃度化合物的配制。為了更方便地和模型所得數(shù)據(jù)比較，我們選取了和模型中差不 多的濃度梯度5000、 1000、 500、 50、 5、 0|iM。 i于最終是將40pl化合物加入到總體積120pl 中，因此先配成濃度為15000、 3000、 1500、 150、 15、 OpM 。取無菌PCR管6個，排成一 排，第l管加入26.22nl溶劑(即5XDMS0)，第2管加入49.76pl溶劑，第3管加入22.2pl溶 劑，第4管加入39.6pl溶劑，第5管加入36)Ltl溶劑，最后一管加入40nl溶劑(這一管作為不 加化合物的生長對照)。在第l管中加入30mM的化合物原液26.22pl (濃度為15mM),混勻， 然后吸取12.44nl至第2管(濃度為3mM)，混勻后再吸取22.2^1至第3管(濃度為1.5mM)，混 勻后吸取4.4pl至第4管(濃度為150pM)，混勻后吸取4pl至第5管(濃度為15^iM)。
然后在每管中加入70inlXV液體培養(yǎng)基，最后加入稀釋后的細(xì)胞10pl?？傮w積是120(al。 將它們放入37'C搖床，低速振蕩，過夜培養(yǎng)，18小時后取出。再將培養(yǎng)后的菌液稀釋1000倍， 取80pl涂XV平板。將平板放入C02燭缸中，置37。C溫箱培養(yǎng)，最后計數(shù)。
結(jié)果如圖8所示。與大腸桿菌DH5a的結(jié)果一樣，此結(jié)果是三次重復(fù)的平均值(絕大部 分誤差小于5%)。
3、化合物對面包酵母BY4742的抑制效果
實驗方法和化合物對大腸桿菌DH5ot的抑制效果類似，只是所需的濃度比我們預(yù)想的要 高，經(jīng)過預(yù)實驗，我們最終設(shè)定濃度梯度為2560、 1280、 640、 320、 160、 80、 40、 20、 10、 5、 OpM。
接菌方法在無菌試管中加入500nlYPD培養(yǎng)基+100pl細(xì)胞(大約含5000個細(xì)胞) 相應(yīng)濃度的化合物?？傮w積lml。放入30。C搖培育15小時后，取出，湖(jOD值，確定 生長情況。
結(jié)果如圖9。與前述結(jié)果一樣，此結(jié)果是三次重復(fù)的平均值(絕大部分誤差小于5%)。 由上述結(jié)果可以看出，對大腸桿菌泛酸激酶而言，模型中所得抑制濃度普遍高于大腸桿 菌DH5a，這可能和pQE-5cPanK在細(xì)胞內(nèi)的表達量比較高有關(guān)。但從這兩個獨立的系統(tǒng)中得 出的信息是相同的，即各種化合物對大腸桿菌的抑制效果為N5-Pan>N7-Pan-N9-Pan> pantoyltaurine=D-panthenol= DL-panthenol 。
對流感嗜血桿菌泛酸激酶，由于N7-Pan和N9-Pan的溶解性比N5-Pan要差，在液體中 可能情況要比固體中好，因此對N7-Pan和N9-Pan而言，從模型中(在平板上操作)得到的 抑制濃度比相應(yīng)物種中(在液體培養(yǎng)基中操作)得到的抑制濃度要稍高。綜合考慮這些影響 因素，我們認(rèn)為模型和相應(yīng)物種得到的數(shù)據(jù)仍然是吻合的，即各種化合物對流感嗜血桿菌的 抑制效果為N5-Pan$N7-Pan-N9-Pan> pantoyltaurine二D-panthenol二 DL-panthenol 。對面包酵母的泛酸激酶，雖然從模型和相應(yīng)物種得到的數(shù)據(jù)相對排序相同，即各種化合 物對面包酵母的抑制效果為N5-Pan>N7-Pa論N9-Pan>
D-panthenol-DL-panthenol>pantoyltaurine。但它們的絕對數(shù)值差別很大在模型中，N5-Pan對 帶有pQE-Sqw"《的ts9菌株抑制是最強的，在5pM時即完全抑制，但在相應(yīng)的物種面包酵 母BY4742中， 一直要到2.5mM以上才呈現(xiàn)抑制作用。我們注意到，酵母的最適生長溫度是 3(TC，但我們的模型是在37'C下操作的，溫度對酶的活性的影響是很大的，因此我們認(rèn)為， 在模型中，&PanK足夠功能互補ts9中有缺陷的CoaAl ，但由于在37。C， ScPanK處于很不 穩(wěn)定的脆弱狀態(tài)， 一旦遇到抑制劑，活性就很容易被阻抑。
因此，以上實驗結(jié)果表明，本發(fā)明的模型能夠準(zhǔn)確的反映各種化合物之間的相對抑制效 果，并且這些抑制強度的區(qū)別都是由轉(zhuǎn)入的泛酸激酶不同引起的，這就確保了所篩得的抑制 劑都是以泛酸激酶為靶點的。序列表
〈110〉江蘇先聲藥物研究有限公司 〈120〉藥物篩選模型及其應(yīng)用 〈140〉 〈141〉 〈160〉 10 〈170〉 WORD98
〈210〉 1 〈211〉 32 〈212〉 DNA 〈213〉人工序列 〈220〉 〈400〉 1
CGGGATCCAG TATAAAAGAG CAAACGTTAA TG
〈210〉 2 〈211〉 32 〈212〉 DNA 〈213〉人工序列 〈220〉
〈400〉 2 、 CGCCCAAGCT TCTCCC.CTGC AAA丁TATTTG CG
〈210〉 3
〈211〉 31
〈212〉 DNA 〈213〉人工序列 〈220〉
〈400〉 3
CGGGATCCGA ATTTTCAACT CAGCAAACAC C
〈210〉 4
〈211〉 36
〈212〉 DNA 〈213〉人工序列 〈220〉
〈400〉 4
AAAACTGCAG ACGTGCGAAT TTTTATTTTC TTAATT
〈210〉 5 〈211〉 27 〈212〉 DNA 〈213〉人工序列 〈220〉〈400〉 3
CGGGATCCTC GCGGCTTAGC GAGCCGA
〈210〉 6 〈211〉 32 〈212〉 DNA 〈213〉人工序列 〈220〉 〈400〉 4
CGCCCAAGCT TACCGCCAAT TACAGCTTGC GC
〈210〉 7
〈211〉 30
〈212〉 DNA 〈213〉人工序列 〈220〉
〈400〉 3
CGGGATCCCC GCGAATTACT CAAGAGATAT
〈210〉 8
〈211〉 33
〈212〉 DNA 〈213〉人工序列 〈220〉
〈400〉 4
CGCCCAAGCT TGTGAAATCT ATCTACGTAC TTG
〈210〉 9 〈211〉 35 〈212〉 DNA 〈213〉人工序列 〈220〉 〈400〉 3
CGGGATCCAG AAAGTATAA A AACGAATTAA ACATT
〈210〉 10 〈211〉 35 〈212〉 DNA 〈213〉人工序列 〈220〉 〈400〉 4
CGCCCAAGCT TCTTGAGATC TACCTTTTTA CATTG
權(quán)利要求
1、一種大腸桿菌藥物篩選模型，特征在于該模型是以泛酸激酶為靶向的。
2、 權(quán)利要求1的藥物篩選模型在篩選與泛酸激酶相互作用化合物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及大腸桿菌泛酸激酶藥物篩選模型，特別是涉及不同外源泛酸激酶取代大腸桿菌自身泛酸激酶的模型，以及利用該模型篩選泛酸激酶靶向藥物中的應(yīng)用。
文檔編號C12Q1/48GK101294194SQ200710021770
公開日2008年10月29日 申請日期2007年4月28日 優(yōu)先權(quán)日2007年4月28日
發(fā)明者兵 周, 丹 沈 申請人:江蘇先聲藥物研究有限公司