專利名稱：一種生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)琥珀酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微生物法生產(chǎn)琥珀酸，其以菊粉植物為原料，通過預(yù)處理等 手段加工成微生物可以利用的發(fā)酵原料，再利用微生物法生產(chǎn)琥珀酸的技 術(shù)。
背景技術(shù)：
琥珀酸是三羧酸循環(huán)的中間產(chǎn)物之一，同時也是許多厭氧微生物的代謝 終產(chǎn)物之一。同時，琥珀酸又是一種用途廣泛的重要基礎(chǔ)化工原料。在食品領(lǐng)域，琥珀酸可以應(yīng)用于食品添加劑和調(diào)味劑；在醫(yī)藥領(lǐng)域，它可以作 為醫(yī)藥制品的輔料；在化工領(lǐng)域，它可以作為發(fā)泡劑、清潔劑及離子螯合 劑等；在石化工業(yè)中，被用作前體化合物生產(chǎn)丁二醇、四氫呋喃、g-丁內(nèi)酯 等重要的化工產(chǎn)品。目前，琥珀酸產(chǎn)品主要由石化產(chǎn)品通過化學(xué)法生產(chǎn)， 由于生產(chǎn)原料為不可再生的石油資源，導(dǎo)致生產(chǎn)成本直接受國際油價的影 響，而且容易造成環(huán)境污染問題。因此利用微生物，轉(zhuǎn)化植物中豐富的碳 水化合物資源生產(chǎn)琥珀酸成為關(guān)注的熱點。自然界中有許多微生物可在厭氧條件下利用葡萄糖、果糖、甘露糖等 糖源發(fā)酵產(chǎn)生少量的琥珀酸。Guettler等人從厭氧菌株A^"o6"cz7/wwcr/"oge"中篩選出抗8g/L氟代乙酸的高產(chǎn)琥珀酸的突變株，以葡萄糖為 底物發(fā)酵，琥珀酸的產(chǎn)量在發(fā)酵罐中的濃度達(dá)到110g/L。美國應(yīng)用碳化學(xué) 公司于2002年，通過對大腸桿菌的丙酮酸甲酸裂解酶基因(;^)，乳酸脫 氫酶基因(/"/0及葡萄糖磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(/^G)三個基因的失活構(gòu)造出 一株工程菌AFPlll，該工程菌通過利用玉米浸漬水為營養(yǎng)源在有氧階段快 速生長，然后進(jìn)入無氧階段轉(zhuǎn)化葡萄糖生產(chǎn)琥珀酸。然而，廉價的初級生物質(zhì)原料是降低發(fā)酵成本的有效途徑之一。纖維 素原料成本低廉，地球上纖維素資源十分豐富，然而目前經(jīng)濟有效的利用 纖維素生物質(zhì)原料是國際性難題之一，普遍采取的方法是采用稀酸處理纖 維素原料，然后再通過能表達(dá)纖維素酶，并能利用葡萄糖和木糖的微生物 催化劑，實現(xiàn)生物煉制。這種方法雖然有效，但由于纖維素處理過程中酸 的使用又不可避免的帶來了環(huán)境問題。玉米淀粉是最簡單易得的葡萄糖基 原料，微生物利用起來也十分的容易。但是，如果以玉米淀粉作為生物煉 制工藝的原料卻不符合我國的國情。由于我國耕地面積有限，我國年產(chǎn)玉 米1.2億噸，產(chǎn)量還不足美國的--半，人均占有不到100公斤，并且養(yǎng)殖消 耗占70-80%,用于工業(yè)的玉米占玉米總產(chǎn)量的10%左右，每年僅1000多 萬噸，因此國內(nèi)的— 玉米淀粉遠(yuǎn)遠(yuǎn)滿足不了大規(guī)投的生物基產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)琥珀酸的方法；其生產(chǎn)成本低， 原料來源廣泛，工藝簡單，技術(shù)路線成熟，可產(chǎn)業(yè)化實施。 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為
一種生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)琥珀酸的方法，以菊粉植物為原料，將菊粉植物富含 菊粉的器官預(yù)處理后經(jīng)滅菌接入微生物，進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)，生產(chǎn)琥珀酸；
產(chǎn)生的琥珀酸可以是有機酸的形式存在，也可以是以有機酸鹽的形式存在
菊粉是指一系列果糖多聚物，末端帶有一個葡萄糖殘基；菊粉植物是指 在塊根、塊莖等器官中富含菊粉的一類植物，如菊芋、菊苣和/或大麗花等 富含菊粉的植物；所述富含菊粉的器官是指菊粉植物的塊根或塊莖；
所述預(yù)處理是指將菊粉植物富含菊粉的器官其通過物理，化學(xué)或生物的 方法加工成菊芋片、菊芋粉、菊粉等便于后續(xù)加工的原料；或進(jìn)一步將上 述原料通過化學(xué)法如稀酸水解法，或生物法如利用菊粉酶將其降解成 為微生物可以利用的富含糖的原料。
生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)包括微生物的厭氧發(fā)酵生產(chǎn)琥珀酸，同時也包括微生物 有氧生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)琥珀酸；所述微生物是指一類可利用葡萄糖、果糖、木 糖、甘露糖等單糖，或蔗糖、麥芽糖、果寡糖等寡糖，或菊粉等多糖碳源， 生產(chǎn)琥珀酸的常用微生物。如野生型微生物J"flera6/w; zW〃wm
wcc/"/")^o^cmy，或通過遺傳工程與基因工程改造的微生物五.co//， 5Wcc/zarawyces ce"Wc/ae, jW"o6a"7/ws wcc/"oge"es， Mww/ze/w/a swcc/m'"jwc^wcera， J加era6/o，W〃w/w swcc/m'cz) ra^cms,々mo/wowos mo6/to或乳酸菌菌株。 具體過程可為，
1) 將菊粉植物的塊莖按常規(guī)方法加工成菊芋粉和/或菊粉后，制成質(zhì)量 濃度2~20%的溶液。
2) 在每升質(zhì)量濃度為2 20%的菊芋粉或菊粉溶液中，加入 1000U 100000U單位的菊粉酶的比例配制菊粉或菊芋粉酶解反應(yīng)液，菊粉 酶酶活定義為每分鐘水解底物產(chǎn)生1微摩爾果糖所需要的酶量，調(diào)pH-4 6， 50 65。C反應(yīng)2 60h，酶反應(yīng)進(jìn)行完全，成為微生物可以利用的富含單糖的 原料，將反應(yīng)液調(diào)至中性，滅菌；
3) 將可利用菊粉的微生物接入滅菌的以菊芋粉或菊粉為主要碳源的培 養(yǎng)基中，菊芋粉或菊粉質(zhì)量濃度為2 20%，培養(yǎng)溫度20~60°C ，培養(yǎng)40 300h， 得琥珀酸。
4) 將可利用單糖碳源生產(chǎn)琥珀酸的常用微生物接入滅菌的菊粉酶解液 中，使培養(yǎng)基中糖濃度達(dá)到2%~20%，培養(yǎng)溫度為20 6(TC，培養(yǎng)40 300h，
得琥珀酸。
本發(fā)明可避免出現(xiàn)工業(yè)生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)與人畜爭糧爭地的局面，利用菊 芋、菊苣、人麗花等富含菊粉的植物，特別是那些可在鹽堿、荒涂地生長的菊粉植物，如菊芋，通過將其預(yù)處理成菊芋片、菊芋粉、菊粉或這些 原料經(jīng)進(jìn)一歩加工，通過稀酸處理或菊粉酶處理，形成可供微生物利用的
發(fā)酉孝底物，通過y4"aeraZ)/o5/^W〃w;w 5^cc/w/一rofi wcera，爿"/"o6ac/〃MS swccz7wge腦，Ma朋/ze/m/a swcdm'一ra(i"cera ，co/z'， (Sacc/zara，cM ce v/5/ae， /，&他，乳酸菌等微生物，生物轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)琥珀酸的技術(shù)。
自然界中存在一大類富含菊粉的植物，而菊粉不僅可供某些微生物直 接利用，還可以通過水解成果糖、葡萄糖等易于微生物利用的糖。同時， 這一類植物中的菊芋等，還具有能在鹽堿地、荒漠地生長，抗蟲抗病的特 點。因此，利用這一類的菊粉植物對我國發(fā)展工業(yè)生物技術(shù)具有重要意義。
具體實施例方式
實施例1菊芋粉的制作
將菊芋塊莖曬干，經(jīng)粉碎機粉碎成粉，制成菊芋粉。 實施例2菊粉的制作
將菊芋塊莖洗凈，浸入90。C的5^NaOH溶液中l(wèi)min，撈出脫皮洗凈， 將脫皮菊芋塊莖，經(jīng)4000W微波爐加熱，每加熱2kg需8min，將加熱的菊 芋塊莖放入榨汁機中榨汁，搾出的汁液經(jīng)板框過濾，再經(jīng)過陽離子交換樹 脂柱陰、離子交換樹脂柱，形成富含菊粉的澄清液體(pH5.0~8.0)，經(jīng)濃縮 噴霧干燥，制成菊粉。
實施例3菊粉酶酶解菊粉或菊芋粉
在每升質(zhì)量濃度為2%的菊芋粉溶液中，加入1000U單位的菊粉酶的比 例配制菊粉或菊芋粉酶解反應(yīng)液，菊粉酶酶活定義為每分鐘水解底物產(chǎn)生1 微摩爾果糖所需要的酶量，調(diào)pH-4.5， 6(TC反應(yīng)26h，酶反應(yīng)進(jìn)行完全， 溶液中葡萄糖質(zhì)量濃度為0.18%，果糖質(zhì)量濃度為1.60%,將反應(yīng)液調(diào)至中 性，滅菌；
實施例4菊粉酶酶解菊粉或菊芋粉
在每升質(zhì)量濃度為2%的菊芋粉溶液中，加入20000U單位的菊粉酶的 比例配制菊粉或菊芋粉酶解反應(yīng)液，菊粉酶酶活定義為每分鐘水解底物產(chǎn) 生1微摩爾果糖所需要的酶量，調(diào)pH-5.0， 55t:反應(yīng)5h，酶反應(yīng)進(jìn)行完全， 溶液中葡萄糖質(zhì)量濃度為0.08%，果糖質(zhì)量濃度為1.58%，將反應(yīng)液調(diào)至中 性，滅菌；
實施例5菊粉酶酶解菊粉或菊芋粉
在每升質(zhì)量濃度為5%的菊芋粉溶液中，加入20000U單位的菊粉酶的 比例配制菊粉或菊芋粉酶解反應(yīng)液，菊粉酶酶活定義為每分鐘水解底物產(chǎn) 生1微摩爾果糖所需要的酶量，調(diào)pH-4.8， 65t:反應(yīng)8h，酶反應(yīng)進(jìn)行完全， 溶液中葡萄糖質(zhì)量濃度為0.29%，果糖質(zhì)量濃度為4.38%，將反應(yīng)液調(diào)至中 性，滅菌；
實施例6菊粉酶酶解菊粉或菊芋粉在每升質(zhì)量濃度為10%的菊芋粉溶液中，加入IOOOOOU單位的菊粉酶
的比例配制菊粉或菊芋粉酶解反應(yīng)液，菊粉酶酶活定義為每分鐘水解底物
產(chǎn)生1微摩爾果糖所需要的酶量，調(diào)pH:5.5， 5(TC反應(yīng)5h，酶反應(yīng)進(jìn)行完 全，溶液中葡萄糖質(zhì)量濃度為0.24%，果糖質(zhì)量濃度為9.12%，將反應(yīng)液調(diào) 至中性，滅菌；
實施例7菊粉酶酶解菊粉或菊芋粉
在每升質(zhì)量濃度為20%的菊芋粉或菊粉溶液中，加入100000U單位的 菊粉酶的比例配制菊粉或菊芋粉酶解反應(yīng)液，菊粉酶酶活定義為每分鐘水 解底物產(chǎn)生1微摩爾果糖所需要的酶量，調(diào)pH二4.0， 6CTC反應(yīng)llh，酶反 應(yīng)進(jìn)行完全，溶液中葡萄糖質(zhì)量濃度為1.41%，果糖質(zhì)量濃度為17.06%， 將反應(yīng)液調(diào)至中性，滅菌；
應(yīng)用例1利用大腸桿菌以菊粉為原料生產(chǎn)琥珀酸
取10ml粗酶液,活力單位380U/ml，加入1L質(zhì)量濃度15%的菊粉溶液 (pH=4)， 65。C反應(yīng)30h，經(jīng)HPLC檢觀U，酶反應(yīng)進(jìn)行完全，產(chǎn)物中葡萄糖質(zhì) 量濃度1.6%，果糖質(zhì)量濃度13.2%。將反應(yīng)液調(diào)至中性，12rC滅菌20min。
將基因工程改造過的大腸桿菌(保藏號KCTC0506BP)在LB培養(yǎng) 基中3(TC培養(yǎng)14h,離心獲得菌體，接入100mlLB中(500ml錐形瓶》中培 養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為3(TC，培養(yǎng)至OD60()吸光度值達(dá)到0.6時，接入含1升LB 培養(yǎng)基的5L發(fā)酵罐中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為3(TC，培養(yǎng)液pH控制在6.0 (通 過lMNaOH， 1MHC1調(diào)節(jié))，并通無菌空氣攪拌培養(yǎng)，至OD咖值為8.5。
然后，通過發(fā)酵罐補料系統(tǒng)，加入滅菌的菊粉酶解液0.5L,使培養(yǎng)基 中糖質(zhì)量濃度達(dá)到5%，同時停止供氧并通入無菌C02,培養(yǎng)溫度為3(TC， 培養(yǎng)80h，得42g琥珀酸。
使用HPLC-UV系統(tǒng)和Hypersil BDS C18反相色譜柱檢測琥珀酸的含 量，使用HPLC-脈沖安培檢測器和陰離子交換柱(HAMILTONRCX-10) 檢測葡萄糖，果糖濃度。
應(yīng)用例2利用大腸桿菌以菊粉為原料生產(chǎn)琥珀酸
取10ml粗酶液,活力單位5000U/ml,加入0.5L質(zhì)量濃度10%的菊粉溶 液(pH=6)， 55。C反應(yīng)5h，經(jīng)HPLC檢測，酶反應(yīng)進(jìn)行完全，產(chǎn)物中葡萄糖 質(zhì)量濃度1.1%,果糖質(zhì)量濃度8.4%。將反應(yīng)液調(diào)至中性，12rC滅菌20min。
將基因工程改造過的大腸桿菌(保藏號KCTC0506BP)在LB培養(yǎng) 基中3(TC培養(yǎng)14h,離心獲得菌體，接入100mlLB中(500ml錐形瓶)中培 養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為3(TC，培養(yǎng)至OD6(K)吸光度值達(dá)到0.8時，接入含1升LB 培養(yǎng)基的5L發(fā)酵罐中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為3(TC，培養(yǎng)液pH控制在6.0 (通 過lMNaOH， 1MHC1調(diào)節(jié))，并通無菌空氣攪拌培養(yǎng)，至OD,值為6.8。
然后，通過發(fā)酵罐補料系統(tǒng)，加入滅菌的菊粉酶解液2L，使培養(yǎng)基中 糖質(zhì)量濃度達(dá)到10%，同時停止供^并通入無菌CCb，培養(yǎng)溫度為4(TC， 培養(yǎng)60h，得56g琥珀酸。使用HPLC-UV系統(tǒng)和Hypersil BDS C18反相色譜柱檢測琥珀酸的含 量，使用HPLC-脈沖安培檢測器和陰離子交換柱(HAMILTONRCX-10) 檢測葡萄糖，果糖濃度。
應(yīng)用例3利用大腸桿菌以菊芋粉為原料生產(chǎn)琥珀酸
取10ml粗酶液,活力單位4900U/ml，加入2L質(zhì)量濃度5%的菊芋粉溶 液(pH=5)， 60'C反應(yīng)3.5h,經(jīng)HPLC檢測，酶反應(yīng)進(jìn)行完全，產(chǎn)物中葡萄 糖質(zhì)量濃度0.3%，果糖質(zhì)量濃度4.6%。將反應(yīng)液調(diào)至中性，12rC滅菌 20min。
將基因工程改造過的大腸桿菌(保藏號KCTC0506BP)在LB培養(yǎng) 基中40。C培養(yǎng)12h，離心獲得菌體，接入100mlLB中(500ml錐形瓶)中培 養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為4(TC，培養(yǎng)至OD6。。吸光度值達(dá)到0，3時，接入含1升LB 培養(yǎng)基的5L發(fā)酵罐中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為40°C ，培養(yǎng)液pH控制在7.0 (通 過lMNaOH， 1MHC1調(diào)節(jié))，并通無菌空氣攪拌培養(yǎng)，至OD,值為IO。
然后，通過發(fā)酵罐補料系統(tǒng)，加入滅菌的菊芋粉酶解液1L，使培養(yǎng)基 中糖質(zhì)量濃度達(dá)到6%，同時停止供氧并通入無菌C02,培養(yǎng)溫度為32'C， 培養(yǎng)40h，得36g琥珀酸。
使用HPLC-UV系統(tǒng)和Hypersil BDS C18反相色譜柱檢測琥珀酸的含 量，使用HPLC-脈沖安培檢測器和陰離子交換柱(HAMILTONRCX-10) 檢測葡萄糖，果糖濃度。
應(yīng)用例3利用大腸桿菌以菊芋粉為原料生產(chǎn)琥珀酸
取10ml粗酶液，活力單位8000U/ml,加入1.5L質(zhì)量濃度20%的菊芋粉 溶液(pH=4)， 5(TC反應(yīng)7h,經(jīng)HPLC檢測，酶反應(yīng)進(jìn)行完全，產(chǎn)物中葡萄 糖質(zhì)量濃度1.2%,果糖質(zhì)量濃度17.7%。將反應(yīng)液調(diào)至中性，121'C滅菌 20min。
將基因工程改造過的大腸桿菌(保藏號KCTC0506BP)在LB培養(yǎng) 基中40。C培養(yǎng)12h，離心獲得菌體，接入100mlLB中(500ml錐形瓶)中培 養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為40°C，培養(yǎng)至OD,吸光度值達(dá)到0.53時，接入含1升LB 培養(yǎng)基的5L發(fā)酵罐中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為40°C ，培養(yǎng)液pH控制在6.5 (通 過lMNaOH， 1MHC1調(diào)節(jié))，并通無菌空氣攪拌培養(yǎng)，至OD鋼值為12.5。
然后，通過發(fā)酵罐補料系統(tǒng)，加入滅菌的菊芋粉酶解液1.5L，使培養(yǎng) 基中糖質(zhì)量濃度達(dá)到8%，同時停止供氧并通入無菌C02,培養(yǎng)溫度為36°C， 培養(yǎng)50h，得38g琥珀酸。
使用HPLC-UV系統(tǒng)和Hypersil BDS C18反相色譜柱檢測琥珀酸的含 量，使用HPLC-脈沖安培檢測器和陰離子交換柱(HAMILTONRCX-10) 檢測葡萄糖，果糖濃度。
權(quán)利要求
1. 一種生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)琥珀酸的方法，其特征在于以菊粉植物為原料，將菊粉植物富含菊粉的器官預(yù)處理后經(jīng)滅菌接入微生物，進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)，生產(chǎn)琥珀酸。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于菊粉是指一系列果糖多 聚物，末端帶有一個葡萄糖殘基；所述菊粉植物是指菊芋、菊苣和/或大麗 花富含菊粉的植物；所述富含菊粉的器官是指菊粉植物的塊根或塊莖。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述預(yù)處理是指將菊粉 植物富含菊粉的器官其通過物理，化學(xué)或生物的方法加工成片、粉、菊粉 便于后續(xù)加工的原料，或進(jìn)一步將上述原料通過化學(xué)法或生物法將其降解成為微生物可以利 用的富含糖的原料。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述微生物是指一類可利用單糖、寡糖或多糖碳源生產(chǎn)琥珀酸的常用微生物。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所述微生物是指野生型 微生物J"aera6/o，W〃wm swcc/M/一ra血cms， swcc/"ogewas或 Maw"/ze/m/a wcc/ra'c^radwcem，歳通過遺傳工程與基因工程改造^微生物 ￡.co//， &cc/7ara，ces cerev/c/"e， yic"'wo6ac/〃ws swcc/"ogewas， Maww/ze/m/a swcc/"/一;-oc/wcms1， 爿Maera6/o，W〃ww si/cc/w'"^ ra^cem1， 々附owowas 附o&to或乳酸菌菌株。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于具體過程可為，1) 將菊粉植物的塊莖按常規(guī)方法加工成菊芋粉和/或菊粉后，制成質(zhì)量濃度2~20%的溶液。2) 在每升質(zhì)量濃度為2~20%的菊芋粉或菊粉溶液中，加入 1000U-100000U單位的菊粉酶的比例配制菊粉或菊芋粉酶解反應(yīng)液，菊粉 酶酶活定義為每分鐘水解底物產(chǎn)生1微摩爾果糖所需要的酶量，調(diào)pt^4 6， 50 65"C反應(yīng)2 60h，酶反應(yīng)進(jìn)行完全，成為微生物可以利用的富含單糖的 原料，將反應(yīng)液調(diào)至中性，滅菌；3) 將可利用菊粉的微生物接入滅菌的以菊芋粉或菊粉為主要碳源的培 養(yǎng)基中，菊芋粉或菊粉質(zhì)量濃度為2 20%，培養(yǎng)溫度20~60°C ，培養(yǎng)40 300h, 得琥珀酸。4) 將可利用單糖碳源生產(chǎn)琥珀酸的常用微生物接入滅菌的菊粉酶解液 中，使培養(yǎng)基中糖濃度達(dá)到2% 20%，培養(yǎng)溫度為20 60°C，培養(yǎng)40 300h，得琥珀酸。
全文摘要
本發(fā)明涉及微生物法生產(chǎn)琥珀酸，一種生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)琥珀酸的方法，以菊粉植物為原料，將菊粉植物富含菊粉的器官預(yù)處理后經(jīng)滅菌接入微生物，進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)，生產(chǎn)琥珀酸。其生產(chǎn)成本低，原料來源廣泛，工藝簡單，技術(shù)路線成熟，可產(chǎn)業(yè)化實施。
文檔編號C12R1/225GK101245358SQ20071001044
公開日2008年8月20日 申請日期2007年2月15日 優(yōu)先權(quán)日2007年2月15日
發(fā)明者曲天明, 曹海龍, 李曙光, 杜昱光 申請人:中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所