專利名稱：木霉菌分生孢子粉塵劑的制備方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于防治溫室葉部病害的生防真菌——木霉菌(Trichoderma viride)分生孢子粉塵劑的生產(chǎn)方法，確切的說(shuō)是一種重寄生真菌的新型生防制劑的制備方法及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
隨著保護(hù)地種植面積的快速發(fā)展，經(jīng)濟(jì)價(jià)值較高的蔬菜如黃瓜、番茄、辣椒等長(zhǎng)年單一種植，病害發(fā)生越來(lái)越重，尤其是灰霉病等，常造成減產(chǎn)20-30％，甚至絕收。保護(hù)地蔬菜病害防治歷來(lái)以化防為主，靠頻繁施藥來(lái)控制病害，不僅成本高，費(fèi)工費(fèi)時(shí)，而且蔬菜中農(nóng)藥殘留量高，即危害人體健康，又影響出口創(chuàng)匯，因此越來(lái)越多的有毒化學(xué)農(nóng)藥逐漸被限制使用。目前，世界各國(guó)都在加大生物農(nóng)藥的研究和開(kāi)發(fā)力度，研制、開(kāi)發(fā)對(duì)人、畜無(wú)毒，對(duì)環(huán)境無(wú)污染的微生物農(nóng)藥已成為熱點(diǎn)。木霉菌作為一類有重要生防價(jià)值的拮抗性真菌，早在20世紀(jì)三十年代就已經(jīng)發(fā)現(xiàn)對(duì)植物病原真菌有拮抗作用，現(xiàn)在已經(jīng)明確其作用機(jī)制，包括產(chǎn)生抗生素、重寄生作用、溶菌作用、競(jìng)爭(zhēng)作用等。木霉菌強(qiáng)烈的競(jìng)爭(zhēng)及生存能力在抑制病原菌的過(guò)程中起著重要作用，是一種很有開(kāi)發(fā)利用價(jià)值的生防菌種。國(guó)際上已開(kāi)發(fā)注冊(cè)有木霉菌產(chǎn)品，我國(guó)也有一些木霉菌的專利，但作為生產(chǎn)上可真正應(yīng)用的制劑卻寥寥無(wú)幾?，F(xiàn)有大多數(shù)木霉菌研究都是用于防治作物土傳病害的，已有關(guān)于木霉菌防治葉部病害的研究，多為分生孢子水劑。實(shí)踐證明，通過(guò)液體深層發(fā)酵很難獲得純的木霉菌分生孢子，往往混和有許多的厚垣孢子和菌絲而使菌劑不能進(jìn)行正常噴霧，即使噴霧可以進(jìn)行，又存在液體發(fā)酵產(chǎn)生的分生孢子抗逆性差，在作物體表不易定植，制成的分生孢子水劑儲(chǔ)存時(shí)間短等問(wèn)題。同時(shí)采用噴霧的方法又增加溫室內(nèi)的濕度，而高濕是溫室葉部病害流行的關(guān)鍵因子，在很大程度上制約了木霉菌在防治植物葉部病害方面的應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種用于防治溫室蔬菜葉部病害(灰霉病、葉霉病等)的木霉菌分生孢子生物防治粉塵劑的制備方法及其應(yīng)用，以克服常規(guī)噴霧法導(dǎo)致溫室內(nèi)濕度增加給防治病害帶來(lái)的不利影響。
本發(fā)明的目的是按如下內(nèi)容實(shí)現(xiàn)的所采用的生防菌取自蔬菜作物葉表的木霉菌，經(jīng)純化后轉(zhuǎn)移至試管斜面內(nèi)作母菌劑，在三角瓶?jī)?nèi)振蕩培養(yǎng)為液體菌種，再經(jīng)固體發(fā)酵使其產(chǎn)生分生孢子，該分生孢子與超細(xì)度載體混合后制成分生孢子粉塵劑。用本方法生產(chǎn)的木霉菌分生孢子小而輕，耐干燥、抗逆境。
所述木霉菌分生孢子粉塵劑按如下技術(shù)加工工藝流程制備而成1)斜面母菌種制備取蔬菜葉片5-10克，加無(wú)菌水50-100毫升，經(jīng)振蕩后加水成1000-10000倍稀釋液；取馬鈴薯150-200克，葡萄糖15-20克，孟加拉紅0.04-0.07克、硫酸鏈霉素0.03-0.05克，瓊脂17-20克，水1000毫升，配制成母菌種培養(yǎng)基；取稀釋液與菌種培養(yǎng)基以1∶9混合后倒入培養(yǎng)皿內(nèi)制成培養(yǎng)基平板，在25-28℃下培養(yǎng)48小時(shí)，經(jīng)分離獲得木霉菌菌株，經(jīng)純化后轉(zhuǎn)移至試管斜面內(nèi)作斜面母菌種；2)二級(jí)菌種制備取馬鈴薯150-200克，葡萄糖或蔗糖15-20克，磷酸二氫鉀1-2克，硫酸鎂0.5-1克，水1000毫升，配制成二級(jí)發(fā)酵培養(yǎng)液，調(diào)pH值為6-8，分裝在250-1000毫升三角瓶中，裝液量為100-300毫升，在121℃下滅菌20-40分鐘，在無(wú)菌室內(nèi)將斜面母菌種轉(zhuǎn)入搖瓶，搖床轉(zhuǎn)速為150-200轉(zhuǎn)/分，發(fā)酵溫度28-31℃，發(fā)酵時(shí)間為3-5天，得到二級(jí)菌種；3)固體發(fā)酵所采用的固體發(fā)酵培養(yǎng)基成分以重量百分比計(jì)算為培養(yǎng)料為麥麩或秸稈粉或玉米渣70-80％、稻殼20-30％，水為培養(yǎng)料的50-100％，制作方法是將培養(yǎng)料與水充分混合后制成固體培養(yǎng)基裝入耐高溫塑料袋或發(fā)酵瓶中，在121℃下滅菌40-60分鐘，接入二級(jí)菌種，接菌量為固體培養(yǎng)基的5-10％，發(fā)酵溫度為25-30℃，接菌后第3-5天翻動(dòng)一次，發(fā)酵時(shí)間7-10天，至培養(yǎng)料變成綠色即木霉菌分生孢子；4)木霉菌分生孢子粉塵劑的生產(chǎn)將滿載木霉菌分生孢子的固體培養(yǎng)料經(jīng)常溫干燥后，用萬(wàn)能粉碎機(jī)粉碎成木霉菌分生孢子母粉，按重量百分比取5-10％分生孢子母粉、5-10％300-350目輕質(zhì)碳酸鈣、80-90％300-350目硅藻土充分混合后制成分生孢子粉塵劑。
將木霉菌分生孢子粉塵劑通過(guò)噴粉器噴施于塑料大棚及各種溫室中防治棚菜葉部病害。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于按照本發(fā)明所提供的技術(shù)參數(shù)獲得的木霉菌分生孢子，小而輕，易飄散，耐干燥，耐儲(chǔ)存。木霉菌分生孢子借助噴粉器向“煙”一樣在大棚空間漂浮，能沉降到植株各層次，并可沉積附著到比較隱蔽部位，棚壁、立柱等各個(gè)地方，比常規(guī)孢子噴霧法施藥次數(shù)少，用量小，防效高，操作方便易行，且噴粉后不影響其它農(nóng)事操作。同時(shí)可降低溫室(塑料棚)內(nèi)的濕度，使花器及葉面不結(jié)水或少結(jié)水，木霉菌孢子借助晨露及溫室內(nèi)早晚的濕度即可萌發(fā)、繁殖，達(dá)到對(duì)病原菌的重寄生目的。以每667m2用藥0.5-1千克，防治溫室蔬菜灰霉病、葉霉病等葉部病害，防治效果達(dá)60％-85％。
本發(fā)明適用于大多數(shù)木霉菌株，方法簡(jiǎn)單，省水省電，適合于不同規(guī)模生產(chǎn)，市場(chǎng)前景廣闊。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1木霉菌分生孢子粉塵劑的制備工藝流程如下1.斜面菌種制備取番茄葉片5克，加無(wú)菌水50毫升，經(jīng)振蕩后加水稀釋成1000倍稀釋液；取馬鈴薯150克，葡萄糖20克，孟加拉紅0.07克，硫酸鏈霉素0.03克，瓊脂17克，水1000毫升，配成母菌種培養(yǎng)基。制作方法為將馬鈴薯去皮后切成1厘米見(jiàn)方的小塊，加1000毫升水煮沸30分鐘，用紗布濾去馬鈴薯塊，加入瓊脂，加水補(bǔ)足1000毫升，然后加入葡萄糖及孟加拉紅并使之完全溶化后裝入三角瓶滅菌，在121℃下30滅菌分鐘，倒平板前加入硫酸鏈霉素。取稀釋液與母菌種培養(yǎng)基以1∶9重量比例混合倒入培養(yǎng)皿內(nèi)制成培養(yǎng)基平板，在25℃下培養(yǎng)48小時(shí)，經(jīng)分離獲得木霉菌菌株，經(jīng)純化后轉(zhuǎn)移至試管斜面內(nèi)作母菌種。其試管斜面培養(yǎng)基為常規(guī)PDA培養(yǎng)基(馬鈴薯200克、葡萄糖20克、瓊脂20克、水1000毫升)。
2.二級(jí)菌種制備取馬鈴薯150克，葡萄糖15克，磷酸二氫鉀1克，硫酸鎂0.5克，水1000毫升，配制成二級(jí)發(fā)酵培養(yǎng)液。制作方法為將馬鈴薯去皮后切成1厘米見(jiàn)方的小塊，加1000毫升水煮沸20分鐘，用紗布濾去馬鈴薯塊，加水補(bǔ)足1000毫升，然后加入葡萄糖或蔗糖并使之完全溶化后，調(diào)pH值為6，分裝在250毫升三角瓶中，裝液量為100毫升，在121℃下滅菌20分鐘。在無(wú)菌室內(nèi)將斜面母菌種轉(zhuǎn)入搖瓶，搖床轉(zhuǎn)速為170轉(zhuǎn)/分，發(fā)酵溫度28℃，發(fā)酵時(shí)間為3天，得到二級(jí)菌種一分生孢子液。
3.固體發(fā)酵所采用的固體發(fā)酵培養(yǎng)基成分以重量百分比計(jì)算為培養(yǎng)料為秸稈粉80％、稻殼20％，水為培養(yǎng)料的100％。制作方法為將培養(yǎng)料與水充分混合后制成固體培養(yǎng)基裝入耐高溫塑料袋中，在121℃下滅菌40分鐘，接入二級(jí)菌種，接菌量為培養(yǎng)基重量的10％，發(fā)酵溫度為25℃，接菌后第3天翻動(dòng)一次，發(fā)酵時(shí)間7天，培養(yǎng)料變成綠色即耐干燥木霉菌分生孢子。
4.木霉菌分生孢子粉塵劑的生產(chǎn)將滿載木霉菌分生孢子的固體培養(yǎng)料經(jīng)常溫干燥后，用萬(wàn)能粉碎機(jī)粉碎成木霉菌分生孢子母粉，按重量百分比取10％分生孢子母粉、10％300目輕質(zhì)碳酸鈣、80％350目硅藻土充分混合后制成分生孢子粉塵劑。
將木霉菌分生孢子粉塵劑用農(nóng)用噴粉器每667m2溫室噴粉1千克，防治番茄灰霉病，在發(fā)病前或發(fā)病初期施用，防治效果達(dá)80％以上。
實(shí)施例21.斜面菌種制備取黃瓜葉片8克，加無(wú)菌水80毫升，經(jīng)振蕩后加水稀釋成8000倍稀釋液；取馬鈴薯180克，葡萄糖18克，孟加拉紅0.05克，硫酸鏈霉素0.04克，瓊脂18克，水1000毫升，配成母菌種培養(yǎng)基。制作方法為將馬鈴薯去皮后切成1厘米見(jiàn)方的小塊，加1000毫升水煮沸30分鐘，用紗布濾去馬鈴薯塊，加入瓊脂，加水補(bǔ)足1000毫升，然后加入葡萄糖及孟加拉紅并使之完全溶化后裝入三角瓶滅菌，在121℃下30滅菌分鐘，倒平板前加入硫酸鏈霉素。取稀釋液與母菌種培養(yǎng)基以重量比例1∶9混合倒入培養(yǎng)皿內(nèi)制成培養(yǎng)基平板，在26℃下培養(yǎng)48小時(shí)，經(jīng)分離獲得木霉菌菌株，經(jīng)純化后轉(zhuǎn)移至試管斜面內(nèi)作母菌種。其試管斜面培養(yǎng)基為常規(guī)PDA培養(yǎng)基(馬鈴薯200克、葡萄糖20克、瓊脂20克、水1000毫升)。
2.二級(jí)菌種制備取馬鈴薯180克，葡萄糖18克，磷酸二氫鉀1.5克，硫酸鎂0.8克，水1000毫升，配制成二級(jí)發(fā)酵培養(yǎng)液。制作方法為將馬鈴薯去皮后切成1厘米見(jiàn)方的小塊，加1000毫升水煮沸20分鐘，用紗布濾去馬鈴薯塊，加水補(bǔ)足1000毫升，然后加入葡萄糖或蔗糖并使之完全溶化后，調(diào)pH值為7，分裝在500毫升三角瓶中，裝液量為200毫升，在121℃下滅菌30分鐘。在無(wú)菌室內(nèi)將斜面母菌種轉(zhuǎn)入搖瓶，搖床轉(zhuǎn)速為180轉(zhuǎn)/分，發(fā)酵溫度29℃，發(fā)酵時(shí)間為4天，得到二級(jí)菌種-.分生孢子液。
3.固體發(fā)酵所采用的固體發(fā)酵培養(yǎng)基成分以重量百分比計(jì)算為培養(yǎng)料為麥麩75％、稻殼25％，水為培養(yǎng)料的80％。制作方法為將培養(yǎng)料與水充分混合后制成固體培養(yǎng)基裝入耐高溫塑料袋中，在121℃下滅菌50分鐘，接入二級(jí)菌種，接菌量為培養(yǎng)基重量的8％，發(fā)酵溫度為28℃，接菌后第4天翻動(dòng)一次，發(fā)酵時(shí)間8天，培養(yǎng)料變成綠色即耐干燥木霉菌分生孢子。
4.木霉菌分生孢子粉塵劑的生產(chǎn)將滿載木霉菌分生孢子的固體培養(yǎng)料經(jīng)常溫干燥后，用萬(wàn)能粉碎機(jī)粉碎成木霉菌分生孢子母粉，按重量百分比取5％分生孢子母粉、10％325目輕質(zhì)碳酸鈣、85％300目硅藻土充分混合后制成分生孢子粉塵劑。
將木霉菌分生孢子粉塵劑用農(nóng)用噴粉器每667m2溫室噴粉0.5千克，防治黃瓜灰霉病，在發(fā)病前或發(fā)病初期施用，防治效果達(dá)75％以上。
實(shí)施例31.斜面菌種制備取番茄葉片10克，加無(wú)菌水100毫升，經(jīng)振蕩后加水稀釋成10000倍稀釋液，取馬鈴薯200克，葡萄糖1 5克，孟加拉紅0.04克，硫酸鏈霉素0.05克，瓊脂20克，水1000毫升，配成母菌種培養(yǎng)基。制作方法為將馬鈴薯去皮后切成1厘米見(jiàn)方的小塊，加1000毫升水煮沸30分鐘，用紗布濾去馬鈴薯塊，加入瓊脂，加水補(bǔ)足1000毫升，然后加入葡萄糖及孟加拉紅并使之完全溶化后裝入三角瓶滅菌，在121℃下30滅菌分鐘，倒平板前加入硫酸鏈霉素。取稀釋液與母菌種培養(yǎng)基以重量比例1∶9混合倒入培養(yǎng)皿內(nèi)制成培養(yǎng)基平板，在28℃下培養(yǎng)48小時(shí)，經(jīng)分離獲得木霉菌菌株，經(jīng)純化后轉(zhuǎn)移至試管斜面內(nèi)作母菌種。其試管斜面培養(yǎng)基為常規(guī)PDA培養(yǎng)基(馬鈴薯200克、葡萄糖20克、瓊脂20克、水1000毫升)。
2.二級(jí)菌種制備取馬鈴薯200克，蔗糖20克，磷酸二氫鉀2克，硫酸鎂1克，水1000毫升，配制成二級(jí)發(fā)酵培養(yǎng)液。制作方法為將馬鈴薯去皮后切成1厘米見(jiàn)方的小塊，加1000毫升水煮沸30分鐘，用紗布濾去馬鈴薯塊，加水補(bǔ)足1000毫升，然后加入蔗糖并使之完全溶化后，調(diào)pH值為8，分裝在1000毫升三角瓶中。裝液量為300毫升，在121℃下滅菌40分鐘，在無(wú)菌室內(nèi)將斜面母菌種轉(zhuǎn)入搖瓶，搖床轉(zhuǎn)速為200轉(zhuǎn)/分，發(fā)酵溫度31℃，發(fā)酵時(shí)間為10天，得到二級(jí)菌種-分生孢子液。
3.固體發(fā)酵所采用的固體發(fā)酵培養(yǎng)基成分以重量百分比計(jì)算為培養(yǎng)料為玉米渣70％、稻殼30％，水為培養(yǎng)料的50％。制作方法為將培養(yǎng)料與水充分混合后制成固體培養(yǎng)基裝入耐高溫發(fā)酵瓶中，在121℃下滅菌60分鐘，接入二級(jí)菌種，接菌量為培養(yǎng)基重量的5％，發(fā)酵溫度為30℃，接菌后第5天晃動(dòng)一次，發(fā)酵時(shí)間10天，培養(yǎng)料變成綠色即耐干燥木霉菌分生孢子。
4.木霉菌分生孢子粉塵劑的生產(chǎn)將滿載木霉菌分生孢子的固體培養(yǎng)料經(jīng)常溫干燥后，用萬(wàn)能粉碎機(jī)粉碎成木霉菌分生孢子母粉，按重量百分比取5％分生孢子母粉、5％350目輕質(zhì)碳酸鈣、90％325目硅藻土充分混合后制成分生孢子粉塵劑。
將木霉菌孢子粉塵劑用農(nóng)用噴粉器每667m2溫室噴粉0.8千克，防治番茄葉霉病，在發(fā)病前或發(fā)病初期施用，防治效果達(dá)60％以上。
權(quán)利要求
1.一種木霉菌分生孢子粉塵劑的生產(chǎn)方法，其特征在于包括如下具體步驟1)斜面母菌種制備取蔬菜葉片5-10克，加無(wú)菌水50-100毫升，經(jīng)振蕩后加水成1000-10000倍稀釋液；取馬鈴薯150-200克，葡萄糖15-20克，孟加拉紅0.04-0.07克、硫酸鏈霉素0.03-0.05克，瓊脂17-20克，水1000毫升，配制成母菌種培養(yǎng)基；取稀釋液與菌種培養(yǎng)基以1∶9混合后倒入培養(yǎng)皿內(nèi)制成培養(yǎng)基平板，在25-28℃下培養(yǎng)48小時(shí)，經(jīng)分離獲得木霉菌菌株，經(jīng)純化后轉(zhuǎn)移至試管斜面內(nèi)作斜面母菌種；2)二級(jí)菌種制備取馬鈴薯150-200克，葡萄糖或蔗糖15-20克，磷酸二氫鉀1-2克，硫酸鎂0.5-1克，水1000毫升，配制成二級(jí)發(fā)酵培養(yǎng)液，調(diào)pH值為6-8，分裝在250-1000毫升三角瓶中，裝液量為100-300毫升，在121℃下滅菌20-40分鐘，在無(wú)菌室內(nèi)將斜面母菌種轉(zhuǎn)入搖瓶，搖床轉(zhuǎn)速為150-200轉(zhuǎn)/分，發(fā)酵溫度28-31℃，發(fā)酵時(shí)間為3-5天，得到二級(jí)菌種；3)固體發(fā)酵所采用的固體發(fā)酵培養(yǎng)基成分以重量百分比計(jì)算為培養(yǎng)料為麥麩或秸稈粉或玉米渣70-80％、稻殼20-30％，水為培養(yǎng)料的50-100％，制作方法是將培養(yǎng)料與水充分混合后制成固體培養(yǎng)基裝入耐高溫塑料袋或發(fā)酵瓶中，在121℃下滅菌40-60分鐘，接入二級(jí)菌種，接菌量為固體培養(yǎng)基的5-10％，發(fā)酵溫度為25-30℃，接菌后第3-5天翻動(dòng)一次，發(fā)酵時(shí)間7-10天，至培養(yǎng)料變成綠色即木霉菌分生孢子；4)木霉菌分生孢子粉塵劑的生產(chǎn)將滿載木霉菌分生孢子的固體培養(yǎng)料經(jīng)常溫干燥后，用萬(wàn)能粉碎機(jī)粉碎成木霉菌分生孢子母粉，按重量百分比取5-10％分生孢子母粉、5-10％300-350目輕質(zhì)碳酸鈣、80-90％300-350目硅藻土充分混合后制成分生孢子粉塵劑。
2.一種如權(quán)利要求1所述木霉菌分生孢子粉塵劑的應(yīng)用，其特征在于將木霉菌分生孢子粉塵劑通過(guò)噴粉器噴施于塑料大棚及各種溫室中防治棚菜葉部病害。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)一種木霉菌分生孢子粉塵劑的生產(chǎn)方法及其應(yīng)用，利用從蔬菜葉表分離獲得的木霉菌，純化后轉(zhuǎn)移至PDA試管斜面內(nèi)作母菌種，通過(guò)調(diào)節(jié)溫度、pH值、供氧量等技術(shù)參數(shù)使其產(chǎn)生分生孢子液，再采用固體發(fā)酵獲得大量耐干燥分生孢子，將分生孢子粉碎后與超細(xì)度硅藻土混合制成木霉菌分生孢子粉塵劑，該粉塵劑采用噴粉的方法用于保護(hù)地蔬菜生產(chǎn)，對(duì)由灰霉病菌、葉霉病菌等病原菌引起的葉部病害防效達(dá)60－85％。
文檔編號(hào)C12R1/885GK101024816SQ20071001026
公開(kāi)日2007年8月29日 申請(qǐng)日期2007年2月2日 優(yōu)先權(quán)日2007年2月2日
發(fā)明者莊敬華, 陳捷, 楊長(zhǎng)成, 高增貴 申請(qǐng)人:沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué), 上海交通大學(xué)