專利名稱：：用于去除所選擇dna序列的方法和手段的制作方法用于去除所選擇DNA序列的方法和手段發(fā)明領域本發(fā)明涉及在去除步驟期間不求助于體外(invitro)培養(yǎng)，允許高效去除事先已導入所述植物內的目的DNA序列中所選擇部分例如選擇標記基因或篩選標記基因的方法和手段。去除方法可以作為用于在植物細胞和植物中將靶DNA序列經同源重組精確交換為目的DNA序列的方法的一部分使用，由此隨后可以去除同源重組階段期間為臨時選擇基因替換事件所用的選擇標記或篩選標記，而不會留下痕跡并且在去除步驟期間不求助于體外培養(yǎng)。技術背景去除導入植物細胞或植物內，但在導入后隨即因多種原因變成無用或甚至是多余的外源DNA中所選擇亞片段已經是熱點研究的主題。此類序列的實例例如是需要用于分離轉基因植物而在成熟植物內不再需要的選擇標記基因。實現高效消除選擇標記基因的方法主要依賴位點特異性重組或轉座(見例如Hohn等，PlantBioTechnology第139-143頁)。Siebert和Puchta(2002)描述可以通過同源重組和通過非同源末端連接從高等真核生物的基因組內高效地切除側翼為切點罕見限制酶位點的轉基因序列。WO03/004659涉及重組系統(tǒng)并涉及用于從真核生物的染色體DNA中去除核酸序列的方法。該文件還涉及含有所述系統(tǒng)或通過該方法產生的轉基因生物(優(yōu)選地是植物)。然而該方法基本上需要利用體外培養(yǎng)方法來鑒定或選擇其中待去除美國專利申請2005/0060769提出從第一個轉基因玉米(Zeamays)植物細胞中制備重組的轉基因玉米植物或植物細胞的方法，其中相對于第一個轉基因植物細胞內的轉基因的遺傳結構，重組植物或植物細胞內的轉基因由于同源重組介導性轉基因缺失作用而具有改變的遺傳結構。在下文，包括在權利要求書內，描述如此方法和手段的不同實施方案，該方法和手段可不求助于體外培養(yǎng)方法，高效去除已事先導入植物細胞內的DNA分子的部分中所選擇的亞序列。WO97/30166或美國專利6,407,314描述可以用于在小孢子內表達基因的來自煙草的小孢子特異性基因的啟動子片段。由本發(fā)明解決的另一個問題涉及定向和精確地將植物細胞內的靶DNA序列通過同源重組交換成替換性DNA序列，而不留下方法的痕跡，并且在同源重組的初始步驟后不求助于體外培養(yǎng)方法。為此目的，可以方便地施用如此方法，即其可以經染色體內同源重組而高效地去除事先已插入基因組、優(yōu)選地是植物細胞的核基因組內DNA分子的部分中所選擇亞序列。早已認識到需要對植物內轉基因整合的位點進行控制，并且已經開發(fā)數種方法試圖滿足這種需要(綜述見Kumar和Fladung，2001，TrendsinPlantScience,6，ppl55-159)。這些方法基本上依賴于以同源重組為基礎的轉基因整合，該策略已經成功地應用于原核生物和低等真核生物(見例如EP0317509或相應的出版物Paszkowski等，1988，EMBOJ"7，第4021-4026頁)。然而對于植物，用于轉基因整合的主導機制以很少涉及重組DNA鏈間同源性的異常重組為基礎。因而，此領域內的主要挑戰(zhàn)是檢測由所導入外源DNA經異常重組的極高效整合所掩蓋的稀有同源重組事件。解決此問題的一種方式是選擇通過異常重組發(fā)生的整合事件，如W094/17176內舉例。解決此問題的另一種方式是通過切點罕見內切核酸酶如I-Scel誘導雙鏈DNA斷裂而激活靼基因座。已經使用農桿菌(Agrobacteria)送遞修復性DNA至植物細胞證實這種l支術增加同源重組頻率至少2個數量級(Puchta等，1996，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,93，第5055-5060頁)。WO96/14408描述編碼I-Scel酶的分離的DNA。該DNA序列可以并入克隆栽體及表達載體、轉化的細胞系和轉基因動物。該栽體用于基因作圖和基因的位點定向性插入。WO00/46386描述通過I-Scel雙鏈斷裂而修飾、修復、減弱和失活細胞內的基因或其它染色體DNA的方法。還公開了治療或預防有需要的個體內遺傳疾病的方法。還公開了嵌合的限制性內切核酸酶。Chilton和Que(2003，PlantPhysiol.133:第956-965頁)和Tzifira等(2003，PlantPhysiol.133:第1011-1023頁)報道T-DNA偏好性地整合至由切點罕見酶I-Scel或I-Ceul人工誘導的雙鏈DNA斷裂內。該報道還包括包含相應切點罕見酶的識別位點的供體T-DNA載體。然而，現有技術內的方法常常依賴于通過同源重組重新形成或產生完整的選擇標記基因或篩選標記基因。因此，仍需要允許通過替換性DNA定向交換幾乎任何靶DNA序列的方法。這些問題和其它問題如下文所述在本發(fā)明不同的詳述實施方案內并在權利要求書內得到解決。發(fā)明筒述在本發(fā)明的一個實施方案中，描述了用于將目的DNA分子導入植物細胞或植物的基因組內，隨后去除目的DNA分子的亞序列(優(yōu)選地包M擇標記或篩選標記)的方法，該方法包括步驟a.將目的DNA分子導入植物細胞的基因組，目的DNA分子包含側翼為同向重復排列的兩個DNA序列的DNA分子的亞序列并且還包含至少一個切點罕見雙鏈DNA斷裂誘導(DSBI)酶的識別位點，其中所述識別位點位于以同向重復排列的兩個DNA序列附近，優(yōu)選地位于它們之間；b.選擇在其中目的DNA分子整合進入基因組內的植物細胞并從植物細胞再生植物；c.將此植物與包含編碼DSBI酶的嵌合基因的第二個植物雜交，其中所述嵌合基因包含如下有效連接的DNA區(qū)段i小孢子特異性啟動子片段，如選自核苷酸序列SEQIDNo.3的啟動子片段；iiDNA區(qū)域，其編碼識別所述識別位點的切點罕見雙鏈斷裂誘導酶，如選自I畫SceI、I誦ChuI、I誦DmoI、I誦CreI、I畫CsmI、PI曙FliI、Pt曙MtuI、I-Ceul、I-SceII、I國SceIII、HO、PI畫CivI、PI國CtrI、PI畫AaeI、PI-BSUI、PI-DhaI、PI畫DraI、PI-MavI、PI-MchI、PI誦MfuI、PI國MflI、PI畫MgaI、PI畫MgoI、PI畫MinI、PI畫MkaI、PI誦MleI、PI-MmaI、PI-MshI、PI國MsmI、PI-MthI、PI曙MtuI、PI誦MxeI、PI國NpuI、PI-PfuI、PI-RmaI、PI國SpbI、PI畫SspI、PI誦FacI、PI-MjaI、PI陽PhoI、Pi-TagI、PI-ThyI、PI-TkoI或PI-TspI的內切核酸酶或包含Zn指DNA結合結構域及DNA切割結構域的嵌合內切核酸酶；iii轉錄終止和聚腺苦酸化區(qū)域；d.選擇包含目的DNA分子和編碼DSBI酶的嵌合基因的后代植物(Fl植物)；e.將后代植物與另一植物雜交，由此使用后代植物作為花粉供體；f.選擇包含編碼DSBI酶的嵌合基因的后代植物的群體(F2群體)；和g.選擇在其中DNA分子的亞序列已經通過以同向重復排列的兩個DNA序列間的同源重組^皮缺失的后代植物，并且任選地h.將其中DNA分子的亞序列已經缺失的后代植物與另一植物雜交；和i.得到后代植物(F3植物)的群體并選擇不含編碼切點罕見的DSBI酶的嵌合基因的植物。在本發(fā)明的另一個實施方案中，提供用于將植物基因組、特別是植物的核基因組內的靶DNA序列交換為目的DNA序列的方法，該方法包含如下步驟a.在植物細胞基因組內預先選擇位點處誘導第一個雙鏈DNA斷裂，所述預先選擇位點位于靶DNA序列內或位于靶DNA序列附近；b.將目的DNA分子導入植物細胞，該DNA分子包含i.位于兩個側翼DNA區(qū)域之間的目的DNA序列，其中所述的側翼DNA區(qū)域與植物細胞基因組內靼DNA序列的側翼DNA區(qū)域并且優(yōu)選預先選擇位點的側翼DNA區(qū)域具有至少80%序列同源性、優(yōu)選100%序列同源性；ii.位于側翼DNA區(qū)域之間的選擇標記基因或篩選標記基因，該選擇標記基因或篩選標記基因還位于側翼DNA區(qū)域之一與以同向重復方式存在的部分側翼DNA區(qū)域之間，其中所述的部分側翼DNA區(qū)域包含側翼DNA區(qū)域之一的一部分；iii.位于側翼DNA區(qū)域之一與以同向重復方式存在的部分側翼DNA區(qū)域之間的DSBI酶的識別位點；c.選擇包含選擇標記或篩選標記的植物細胞的群體；d.選擇在其中目的DNA序列(和選擇標記或篩選標記)已經借助側翼DNA區(qū)域通過同源重組導入的植物細胞，并從植物細胞再生植物；e.將包含選擇標記基因的再生植物或其后代植物與包含編碼切點罕見雙鏈斷裂誘導("DSBI")酶的嵌合基因的植物雜交，其中該嵌合基因包含如下有效連接的DNA區(qū)段i.小孢子特異性啟動子；ii.編碼識別位于目的DNA內的識別位點的雙鏈DNA斷裂誘導酶的DNA區(qū)域；iii.轉錄終止和聚腺苷酸化區(qū)域；f.選擇包^S^擇標記基因或篩選標記基因和編碼DSBI酶的嵌合基因的后代植物(F1植物)；g.將后代植物與另一植物雜交，由此使用后代植物作為花粉供體；h.選擇包含編碼DSBI酶的嵌合基因的后代植物的幹本(F2和i.選擇這樣的后代植物，在其中選擇標記基因或篩選標記基因通過側翼DNA區(qū)域之一與包含側翼DNA區(qū)域之一的一部分的部分側翼DNA區(qū)域間的同源重組4皮缺失。本發(fā)明涉及通過以上所述方法可得到的植物。在本發(fā)明的又另一個實施方案中，本發(fā)明涉及包含編碼切點罕見的DSBI酶的嵌合基因，如SEQIDNO6中從核苦酸1941至核苷酸3913的嵌合基因的植物，該嵌合基因包含如下有效連接的DNA區(qū)段i.小孢子特異性啟動子，如小孢子特異性啟動子片段，如選自SEQIDNo3的核苷酸序列的啟動子或其功能性片段；ii.DNA區(qū)域，其編碼識別位于目的DNA內的識別位點的雙鏈DNA斷裂誘導酶，如選自I-Scel、I-Chul、I-Dmol、I-Crel、I-Csml、PI誦FliI、Pt-Mtul、I畫CeuI、I-SceII、I-SceIII、HO、PI畫CivI、PI-CtrI、PI陽AaeI、PI-BSUI、PI-DhaI、PI-DraI、PI-MavI、PI國MchI、PI畫MfuI、PI國MflI、PI畫MgaI、PI-MgoI、PI隱MinI、PI畫MkaI、PI-MleI、PI-MmaI、PI-MshI、PI國MsmI、PI-MthI、PI-MtuI、PI隱MxeI、PI-NpuI、PI畫PfuI、PI國RmaI、PI畫SpbI、PI國SspI、PI曙FacI、PI-MjaI、PI-PhoI、PI國TagI、PI-ThyI、PI-TkoI或PI-TspI的內切核酸酶或包含Zn指DNA結合結構域及DNA切割結構域、特別是包含SEQIDNo1或SEQIDNo2的核苷#列的DNA區(qū)域的嵌合內切核酸酶；和iii.轉錄終止和聚腺苷酸化區(qū)域。本發(fā)明還涉及以上所述的嵌合基因。在本發(fā)明的另一個實施方案中，提供如此DNA載體，其借助在耙序列內或其附近預先選擇位點處誘導雙鏈斷裂而將植物細胞基因組內的靶DNA序列交換為目的DNA序列，該DNA栽體包含a.位于兩個側翼DNA區(qū)域之間的目的DNA序列，其中所述的側翼DNA區(qū)域與耙DNA序列的側翼DNA區(qū)域和預先選擇位點的側翼DNA區(qū)域具有至少80%序列同源性、優(yōu)選100%序列同源性；b.位于側翼DNA區(qū)域之間的選擇標記基因或篩選標記基因，該選擇標記基因或篩選標記基因還位于側翼DNA區(qū)域之一與以同向重復方式存在的包含側翼DNA區(qū)域之一的一部分的部分側翼DNA區(qū)域之間；和c.位于側翼DNA區(qū)域之一與以同向重復方式存在的部分側翼DNA區(qū)域之間的DSBI酶的識別位點。附圖簡述圖1至3代表用于去除導入或已經導入植物細胞內的目的DNA中所選擇亞部分的方法的不同實施方案。這些實施方案僅用于說明目的并且不應當用來以限制性方式解釋權利要求書。圖1是用于將具有所選擇亞部分的目的DNA導入植物細胞并隨后去除目的DNA中所選擇亞部分的方法的示意圖，其中所述的亞部分包含選擇標記基因或篩選標記基因特征代表任何目的DNA序列；DSB:雙鏈斷裂謙導酶("DSBIE")的識別位點；SMG1:選擇標記基因或篩選標記基因；drs:同向重M列；SMG2:與編碼DSBIE的嵌合基因連接的選擇標記基因或篩選標記基因；MSP:小孢子特異性啟動子；3，轉錄終止和聚腺苷酸化信號；圖2是允許用替換性DNA序列精確替換靼DNA序列的方法的示意圖。DSBI:第一個雙鏈斷裂誘導酶的識別位點；FS1:側翼序列1;FS2:側翼序列2;DSB2:第二個雙鏈斷裂誘導酶的識別位點；SMG1:選擇標記基因1或篩選標記基因1;SMG2:選擇標記基因2或篩選標記基因2;DSBIE:雙鏈斷裂^秀導酶；drl:同向重復序列l(wèi)(其與作為側翼序列2的一部分的同向重復序列2相似或相同；本文中也稱作"部分側翼DNA區(qū)域")；MSP:小孢子特異性啟動子；3，轉錄終止和聚腺苷酸化信號。圖3是與圖2內所示方法類似的允許用替換性DNA序列精確替換靶DNA序列的方法的示意圖。drl在此情況下是這樣的同向重復序列，其是來自側翼序列1的一部分并與同向重復序列2(dr2)相似或相同。發(fā)明的詳細實施方案本發(fā)明基于如此發(fā)現，即可以高效地去除側翼為兩個同向重復序列并位于切點罕見雙鏈DNA斷裂誘導酶的識別位點附近的DNA分子中所選擇序列，這在當包含此DNA的植物首先與包含處于小孢子特異性啟動子控制下的編碼切點罕見雙鏈DNA斷裂誘導酶的嵌合基因的植物雜交并將所得植物的花藥用來對受體植物授粉時實現。因此，本發(fā)明在一個實施方案內涉及包含處于小孢子特異性啟動子的控制下的、編碼切點罕見雙鏈DNA斷裂誘導內切核酸酶的嵌合基因的植物的用途，以便通過雜交去除位于切點罕見雙鏈DNA斷裂誘導內切核酸酶的識別位點附近并還位于以同向重復方向存在的兩個序列之間的DNA片段(見圖1)。切點罕見的DSBI內切核酸酶在花藥形成期間于小孢子內的表達足以誘導雙鏈DNA斷裂并因而顯著刺激同向重J^列間的染色體內同源重組，導致去除位于這些同向重復序列之間的序列。也就是說，在本發(fā)明的一個實施方案中，提供用于將目的DNA分子導入植物細胞或植物的基因組內，隨后去除該DNA分子的亞序列的方法，該方法包括步驟a.將此目的DNA分子導入植物細胞的基因組，此目的DNA分子包含側翼為同向重復排列的兩個DNA序列的該DNA分子的亞序列，并且還包含至少一個切點罕見雙鏈DNA斷裂誘導(DSBI)酶的識別位點，其中所述的識別位點位于以同向重復排列的兩個DNA序列之間；b.選擇在其中目的DNA分子整合i^基因組內的植物細胞并從植物細胞再生植物；c.將此植物與包含編碼DSBI酶的嵌合基因的第二個植物雜交，其中所述的嵌合基因包含如下有效連接的DNA區(qū)段i.小孢子特異性啟動子；ii.編碼識別所述識別位點的切點罕見雙鏈斷裂誘導酶的DNA區(qū)域；iii.轉錄終止和聚腺苷酸化區(qū)域；d.選擇包含目的DNA分子和編碼DSBI酶的嵌合基因的后代植物(Fl植物)；e.將后代植物與另一植物雜交，由此使用后代植物作為花粉供體；f.選擇包含編碼DSBI酶的嵌合基因的后代植物的群體(F2群體)；和g.選擇在其中目的DNA分子的亞序列已經通過以同向重復排列的兩個DNA序列間的同源重組被缺失的后代植物。如本文中所用，"切點罕見雙鏈DNA斷裂誘導內切核酸酶"是能夠在稱作"識別位點，，的特定核苷酸序列內誘導雙鏈DNA斷裂的酶。切點罕見內切核酸酶，有時又稱作大范圍核酸酶，具有14至40個連續(xù)核苷酸的識別位點。因此，切點罕見內切核酸酶具有非常低的切割頻率，即便在較大的植物基因組內亦如此。歸巢內切核酸酶構成此類切點罕見內切核酸酶的一個家族。它們可以由內含子、獨立基因或間插序列編碼，并展示出使之與通常來自細菌限制性^f務飾II型系統(tǒng)更常見的限制酶相區(qū)別的醒目結構特性和功能特性。它們的識別位點具有廣泛非對稱性，這與絕大多數限制酶識別位點的特征性二重對稱相反。已經證實由內含子或內含肽編碼的數種歸巢內切核酸酶可促進它們各自的遺傳元件歸巢至無內含子或無內含肽的等位位點內。通#無內含子或無內含肽的等位基因內產生位點特異性雙鏈斷裂，這些核酸酶產生重組性末端，該重組末端參與了復制編碼序列并在DNA水平引起內含子或間插序列插入的基因轉變過程。充分得到表征的歸巢內切核酸酶是I-Scel。I-Scel是釀酒酵母(Saccharomycescerevisea)內負責線粒體中內含子移動的位點特異性內切核酸酶。該酶由21SrRNA基因的任選內含子ScLSU.l編碼并在內含子插入位點處誘導雙鏈DNA斷裂，產生帶3，OH突出端的4bp交錯切口。I-SceI內切核酸酶的識別位點延伸超過18bp非對稱性序列(Colleaux等1988Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:6022-6026)。I-Scel的^J^餅列和與線粒體I-Scel基因等效的通用密碼子已經例如由WO96/14408提供。WO96/14408也公開了仍有功能的I-Scel蛋白的眾多變體。PCT申請PCT/EP04/013122(本文中引用作為參考)提供已經優(yōu)化用于植物中表達的I-Scel的合成性核普酸序列變體。此合成性I-SceI編碼區(qū)的核苷酸序列以UIPAC密碼子描述于SEQIDNo1。UIPAC密碼子的符號具有它們的常用含義，即N-A或C或G或T;!^A或G;Y=C或T;B=C或G或T(非A);V=A或C或G(非T);D=A或G或T(非C);H-A或C或T(非G);K-G或T;M-A或C;S-G或C;W=A或T。其它切點罕見的DSBI酶及它們相應的識別位點的列表提供于WO03/004659的表1內(第17至第20頁)(本文中引用作為參考)。它們包括I-SceI、I-Chul、I-Dmol、I曙CreI、I-Csml、PI-FliI、Pt畫MtuI、I-Ceul、I畫SceII、I-SceIII、HO、PI-CivI、PI-CtrI、PI國AaeI、PI-BSUI、PI畫DhaI、PI-DraI、PI-MavI、PI-MchI、PI-MfuI、PI漏MflI、PI-MgaI、PI誦MgoI、PI-MinI、PI-MkaI、PI畫MleI、PI國MmaI、PI-MshI、PI-MsmI、PI-MthI、PI國MtuI、PI-MxeI、PI-NpuI、PI國PfuI、PI-RmaI、PI-SpbI、PI國SspI、PI-FacI、PI-MjaI、PI-PhoI、Pi-TagI、PI畫ThyI、PI畫TkoI或PI-TspI。此外，可獲得設計基本上識別任何所選擇耙核苷酸序列的客戶定制型切點罕見內切核酸酶的方法。筒而言之，嵌合性限制酶可以使用為識別特定核苷酸序列所^沒計的鋅指結構域與來自天然限制酶如Fokl的非特異性DNA切割結構域的雜合體加以制備。此類方法已經描述于WO03/080809、W094/18313或WO95/09233以及Isalan等，2001，NatureBiotechnology19，656-660;Liu等1997，Proc.Natl.Acad.Sci.USA94，5525-5530內。通iWv變體的文庫中選擇而產生客戶定制型大范圍核酸酶的另一個途徑描述于WO2004/067736內。如本文中所用，"側翼為同向重復排列的兩個DNA序列"表示兩個DNA區(qū)域分別緊接在待從導入的DNA分子中去除的序列的每一端，其中所述的兩個DNA區(qū)域在核苷酸序列上基本上相似。同向重復序列不必完全相同，但是可以在約75%至約100%序列同一性之間變化。重復序列越短，對序列相似性的要求越嚴格。然而，為了恢復DNA序列而不留下痕跡，如下文中所述，以同向重復排列的DNA序列優(yōu)選應當完全相同。為避免疑問，如果在核苷酸序列上基本上相似的兩個DNA區(qū)域包含于雙鏈DNA分子內，則這些DNA序列應當位于同一DNA鏈上，處于相同的5，—3，方向。重復的DNA序列可以是至少10個、50個或100個核苦酸長度，不過，序列當然可以更長。然而，已經發(fā)現長度超過300個核苷酸的重復序列不再顯著地增強導致位于同向重復序列之間DNA序列去除的染色體內同源重組。為本發(fā)明的目的，表述為百分數的兩個相關性核苷酸序列或氨基,列的"序列同一性"指在兩個優(yōu)化比對序列內具有完全相同殘基的位置數除以所比較的位置數(x100)。將空位(即對比中一個殘基存在于一個序列內而不存在于另一序列的位置)視作不具有完全相同殘基的位置。兩個序列的對比通過Needleman和Wunsch算法(Needleman和Wunsch1970)開展。計算機輔助的序列對比可以使用標準軟件程序，如作為WisconsinPackageVersion10.1(GeneticsComputerGroup,Madison,Wisconsin,USA)部分的GAP,利用具有空位生成罰值50和空位延伸罰值3的默認計分矩陣方便地開展。雖然DSBI識別位點優(yōu)選地位于同向重復的DNA序列之間，但是這既非重要，也非需要。實際上，DSBI識別位點還可能是重復DNA序列中一個序列的一部分。如本文中所用"位于附近"指DSBI的位置距離同向重復DNA序列在500bp、lkbp至10kbp之間。本文中所述的方法需要利用編碼切點罕見雙鏈斷裂誘導酶的嵌合基因，由此內切核酸酶的編碼區(qū)處在小孢子特異性啟動子片段的控制下。如本文中所用的"小孢子特異性啟動子區(qū)域"或"小孢子特異性啟動子"或"小孢子特異性啟動子片段"是能夠選擇性地、優(yōu)選是特異性地在在被子植物中，有性繁殖需要產生有活力的雄性配子體和雌性配子體。作為雄性配子體的花粉在花藥內形成并^Jt孢細胞開始，發(fā)育成性母細胞。性母細胞發(fā)生減數分裂以形成單倍體細胞的四分體，四分體隨后釋放至花藥室。隨著擴張和空泡形成，小孢子的非對稱性有絲分裂產生含有營養(yǎng)細胞和生殖細胞的雙細胞性花粉。在大部分物種內，花藥在雙細胞條件下散發(fā)。在WO97/30166(本文中引用作為參考；還見SEQIDNo3)內描述了作為合適小孢子特異性啟動子區(qū)域的煙草NTM19基因啟動子區(qū)域。其功能性片段已經整合入實施例的嵌合基因(SEQIDNo6)內。小孢子特異性啟動子片段可以包括SEQIDNo3中從位置1至位置954或從位置1至位置993的核苷酸序列或SEQIDNo6中從位置1941至2926的核苷酸序列。如本文中所用"切點罕見雙鏈斷裂誘導內切核酸酶的編碼區(qū)"或"切點罕見雙鏈斷裂誘導酶的編碼區(qū)"是編碼特征為切點罕見的DSBI酶，如列。編碼區(qū)因此可以包含編碼下表內所列歸巢內切核酸酶中任意Mi^f列的任意核苷酸序列，其中所述的歸巢內切核酸酶可以在提到的登錄號下于公共數據庫內找到(它們在本文中均引用作為參考)<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>顯而易見，為了在小孢子特異性啟動子片段的控制下表達內切核酸酶，應當調整編碼區(qū)以侵使用通用密碼子語言編碼以上提到的多肽。編碼區(qū)還可以優(yōu)化用于在植物內表達，并且合成性編碼區(qū)具有為滿足如下標準而設計的核苷酸序列a)核苷酸序列編碼有功能的切點罕見雙鏈斷裂誘導內切核酸酶，b)核苷酸序列具有約50%至約60%的GC含量，c)核苷酸序列不包含選自GATAAT、TATAAA、AATATA、AATATT、GATAAA、AATGAA、AATAAG、AATAAA、AATAAT、AACCAA、ATATAA、AATCAA、ATACTA、ATAAAA、ATGAAA、AAGCAT、ATTAAT、ATACAT、AAAATA、ATTAAA、AATTAA、AATACA和CATAAA的核苷i^列；d)核苷酸不包含選自CCAAT、ATTGG、GCAAT和ATTGC的核苷酸序列；e)核苷餅列不包含選自ATTTA、AAGGT、AGGTA、GGTA或GCAGG的序列；f)核苷酸序列不包含由選自G或C的7個連續(xù)核苷酸組成的GC段；g)核苷酸序列不包含由選自A或T的5個連續(xù)核苷酸組成的GC段；和h)核苷酸序列不包含如此密碼子，其編碼Leu、Ile、Val、Ser、Pro、Thr、Ala并在位置2和3內包含TA或CG雙體(即核苷^列不包含密碼子TTA、CTA、ATA、GTA、TCG、CCG、ACG和GCG)。雙鏈斷裂誘導酶可以包含，但不是必須包含，核定位信號(NLS)[Raikhel，PlantPhysiol.100:1627-1632(1992)及其中的參考文獻，如SV40大T抗原的NLS[Kalderon等Cell39:499-509(1984)。核定位信號可以位于蛋白質內任何地方，但是合適地位于蛋白質的氨基末端。核定位信號可以替換雙鏈斷裂誘導酶中的一個或多個氨基酸。雖然用于去除的方法在本文中描述為涉及導入目的DNA分子的活化步驟隨后去除所選擇亞片段，顯而易見的是本發(fā)明的去除方法可以用來去除位于DNA同向重復序列之間的任何序列，只要可以找到或設計出識別在重復DNA序列附近的DSBI識別位點的DSBI酶。還將顯而易見的是，用來描述本方法的術語如"DNA片段的導入"及"從細胞再生植物"不表示該DNA片段必定需要通過轉化技術而導入。實際上對于本領域4支術人員而言立刻明白目的DNA分子還可以通過育種或雜交技術從一種植物導入另一種植物內。然而，將顯而易見的是目的DNA分子可以通過本領域已知的任何方法導入植物細胞，包括農桿菌介導性轉化和DNA直接轉移方法?？梢允褂萌魏伪憷姆椒▽⑥D化性DNA分子轉移至植物細胞內，包括但不限于DNA直接轉移。如本文中所用"DNA直接轉移"是將DNA導入植物細胞的任何方法，該方法不涉及利用天然的農桿菌物種并能夠將DNA導入植物細胞。這包括本領域眾所周知的方法，如通過電穿孔法將DNA導入原生質體、通過電穿孔法將DNA導入完整的植物細胞或經部分降解的組織或植物細胞、通過試劑如PEG等的作用將DNA導入原生質體、利用珪晶須以及用包被DNA微粒轟擊。DNA可以通過如在例如PCT/EP04/013122內所述的涉及在預先選擇位點處導入雙鏈斷裂的同源重組或非同源末端連接的方法整合。在本發(fā)明的一個特定實施方案中，去除的方法可以與DNA通過定向同源重組而插入、缺失或替換組合地使用，并且在該方法中如此實現定向DNA插入，即使用選擇標記或篩選標記，隨后在包^^it擇標記或篩選標記的植物細胞或植物的群體內！Hi在其中定向DNA插入通過同源重組而發(fā)生的植物細胞或植物。當側翼序列和同向重復序列合適地進行選擇時，該方法引起把DNA精確替換成目的DNA，而不存在用來實現替換的目的DNA分子的任何殘留("痕跡")。去除的方法也不需要任何額外的體外培養(yǎng)，因而避免產生體細胞性變異。本方法的示意圖提綱可以在圖2和3內找到。有趣的是，已經觀察到使用如PCT/EP04/013122內所述的借助同源重組定向插入外源目的DNA的方法，在其中外源DNA確實經同源重組插入的那些轉化事件代表了在其中DNA通過任何手段整合入植物染色體內的事件總群體中的相對高比例(在1%至5%的數量級上)。因此，不需務農賴產生可識別表型的DNA序列(如同源重組后產生的完整選擇標記基因)經同源重組的生成或再造，以鑒定DNA因而通過同源重組得以插入的那些事件。此外，選擇標記基因或篩選標記基因可以包含于側翼DNA序列之間的DNA區(qū)域內，隨后分析數目相對較少的轉化的植物細胞或植物，以鑒定在其中定向DNA插入經同源重組而發(fā)生的那些轉化事件。因此，在本發(fā)明的這個實施方案中，提供用于將植物細胞內的耙DNA序列交換成目的DNA序列(或外源DNA)的方法，該方法包含如下步驟-在細胞基因組內預先選擇位點處誘導第一個雙鏈DNA斷裂，所述預先選擇位點位于靶DNA序列內或位于該耙DNA序列的附近；-將目的DNA分子(或外源DNA)導入植物細胞，由此DNA分子包含如下有效連接的DNA片段i.位于兩個側翼DNA區(qū)域之間的目的DNA序列，其中所述的側翼DNA區(qū)域與靶DNA序列的側翼DNA區(qū)域和預先選擇位點的側翼DNA區(qū)域具有至少80%序列同源性、優(yōu)選100%序列同源性；ii.位于側翼DNA區(qū)域之間的選擇標記基因或篩選標記基因，因而選擇標記基因或篩選標記基因還位于側翼DNA區(qū)域之一和以同向重復方式存在的所提及側翼DNA區(qū)域之一的至少部分的另一個拷貝(又標示為部分側翼序列)之間；iii.位于側翼DNA區(qū)域之一與以同向重復方式存在的部分側翼DNA區(qū)域之間的DSBI酶的識別位點；-選擇包含選擇標記或篩選標記的植物細胞的群體；-選擇在其中選擇標記或篩選標記已經借助側翼DNA區(qū)域通過同源重組導入的植物細胞，并從植物細胞再生植物；-將包含選擇標記基因的再生植物或其后代植物與包含編碼DSBI酶的嵌合基因的植物雜交，其中該嵌合基因包含如下有效連接的DNA區(qū)段■小孢子特異性啟動子；■編碼識別位于目的DNA內的識別位點的雙鏈DNA斷裂誘導酶的DNA區(qū)域；■轉錄終止和聚腺苦酸化區(qū)域；-選擇包含選擇標記基因或篩選標記基因和編碼DSBI酶的嵌合基因的后4、植物(F1植物)；-將后代植物與另一植物雜交，由此使用后代植物作為花粉供體；-選擇包含編碼DSBI酶的嵌合基因的后代植物的群體(F2群體)；和-選擇所述F2群體內的后代植物，在所述后代植物中選擇標記基因或篩選標記基因通過側翼DNA區(qū)域之一與包含側翼DNA區(qū)域之一的一部分的部分側翼DNA區(qū)域間的同源重組被缺失。因此，如本文中所用"預先選擇位點"指示植物的核基因組內位于耙DNA序列內或附近的特定核普^f列，在該位置內需要插入外源DNA或將靶DNA序列交換。本領域技術人員將能夠選擇識別所選擇M苷i^列的雙鏈DNA斷裂誘導("DSBI")酶或設計此種DSBI內切核酸酶?；蛘?，DSBI內切核酸酶識別位點可以使用任何常用的轉化方法導入或使用在其基因組內具有DSBI內切核酸酶識別位的植物系通過常規(guī)育種法導入，并且任何所需要的外源DNA可以隨后導入事先已導入的預先選則耙位點內。在轉化性DNA分子內的雙鏈DNA斷裂可以通過植物可表達的嵌合基因的瞬時導入而方便地誘導，其中所述的嵌合基因包含與編碼雙鏈斷裂誘導酶的DNA區(qū)域有效連接的植物可表達啟動子區(qū)域。編碼雙鏈斷裂誘導酶的DNA區(qū)域可以是合成性DNA區(qū)域，如(但不限于)這樣的合成性DNA區(qū)域，其中密碼子根據本申請內其它處所述的用于I-Scel編碼區(qū)設計方案而選擇。作為蛋白質，內切核酸酶本身還可以例如通過電穿孔法導入植物細胞。然而，內切核酸酶還可以通過將嵌合基因(包含與誘導型植物可表達啟動子有效連接的編碼內切核酸酶的DNA區(qū)域)導入植物細胞或植物的基因組，并在導入轉化性DNA分子之前、期間或之后立即提供合適的誘導化合物持續(xù)所限時間而以瞬時方式提供。內切核酸酶還可以作為編碼內切核酸酶的RNA前體提供。雙鏈斷裂誘導酶可以包含，但不必須包含，核定位信號(NLS)[Raikhel,PlantPhysiol.100:1627-1632(1992)及其中參考文獻]，如SV40大T抗原的NLSKalderon等Cell39:499-509(1984)。核定位信號可以位于蛋白質內任何地方，但是合適地位于蛋白質的氨基末端。核定位信號可以替換雙鏈斷裂誘導酶中的一個或多個氨基酸。如本文中所用，"靶DNA序列"是通過添加、缺失或置換而修飾的位于植物細胞基因組內的DNA序列。如本文中所用"側翼DNA區(qū)域"是分別與靶DNA序列上游或下游DNA區(qū)域具有同源性的DNA序列。這允許更好地控制外源DNA或目的DNA分子的插入。實際上，通過同源重組的整合將允許外源DNA片段與植物的核基因組在核苷酸水平上精確連接。側翼DNA區(qū)域可以在長度上變化，并且應當是至少約10個核苷酸長度。然而，側翼區(qū)域可以按照實際可能盡量地長(例如直至約100-150kb，如完整的細菌人工染色體(BAC))。優(yōu)選地，側翼區(qū)域會是約50bp至約2000bp。此外，側翼為外源目的DNA的區(qū)域不需要與預先選擇位點的側翼DNA區(qū)域完全相同，并且可以與預先選擇位點的側翼DNA區(qū)域具有約80%至約100%之間的序列同一性，優(yōu)選地約95%至約100%序列同一性。側翼區(qū)域越長，對同源性要求的嚴格性越低。此外，優(yōu)選序列同一性在靠^確插入外源DNA的位置處按照實際可能盡量地高。此外，為實現交換靼DNA序列而不改變iB比鄰DNA序列的DNA序列，側翼DNA序列應當優(yōu)選地與預先選擇位點側翼的DNA區(qū)域完全相同。此外，外源目的DNA側翼的區(qū)域不必與緊鄰預先選擇位點側翼的區(qū)域具有同源性，但是可以與距離預先選擇位點更遠的核基因組的DNA區(qū)域具有同源性。外源DNA的插入隨后將導致在預先所選擇插入位點和同源DNA區(qū)域之間的耙DNA的去除。也就是說，位于同源區(qū)域之間的靼DNA將置換成外源目的DNA。優(yōu)選地，預先選擇位點和另外提及的識別序列由不同的切點罕見雙鏈斷裂誘導內切核酸酶識別。提及的"部分側翼DNA區(qū)域，，指鄰近待缺失且通常包含選擇標記或篩選標記的DNA區(qū)域的側翼DNA區(qū)域中至少部分的DNA區(qū)域。^艮明顯，部分側翼DNA序列也可以在長度上與側翼DNA序列相等或甚至包含更長的側翼DNA序列。"選擇標記或篩選標記"如本文中所用具有本領域的通常含義并包括，但不限于植物可表達的膦絲菌素乙酰轉移酶、新霉素磷酸轉移酶、草甘膦氧化酶、草甘膦耐受EPSP酶、腈水解酶基因、突變的乙酰乳酸合酶或乙酰羥酸合酶基因、/3-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)、R-基因座基因、綠色熒光蛋白等。選擇在其中選擇標記或篩選標記和外源DNA分子的剩余部分已經借助側翼DNA區(qū)域通過同源重組得以導入的植物細胞或植物例如可以通過對如此序列的缺乏進行篩選而實現，其中所述序列存在于轉化性DNA內，但位于側翼DNA區(qū)域之外。實際上，來自轉化性DNA但位于側翼DNA區(qū)域之外的序列的存在表示著為來源于DNA隨機插入的轉化植物細胞。為此目的，選擇標記或篩選標記可以包含于側翼DNA區(qū)域之外的轉化性DNA分子內，轉化性DNA分子隨后可以用于鑒定不具有位于轉化性DNA之外的并且已經借助側翼DNA區(qū)域通同源重組而產生的選擇標記或篩選標記的植物細胞。備選地，轉化性DNA分子可以含有允許對缺少此類基因(負選擇標記基因)進行選擇的、位于側翼DNA區(qū)域之外的選擇標記。在本發(fā)明的另一個實施方案中，本文中所述的DNA去除方法可以與如此方法組合，即該方法以非同源末端連接為基礎用于在細胞基因組內預先選擇位點處插入DNA。因此，本發(fā)明提供用于在基因組內、優(yōu)選是植物細胞的核基因組內的預定位置處插入所選擇DNA分子的方法，該方法包括如下步驟國在細胞基因組內預先選擇位點處誘導第一個雙鏈DNA斷裂，所述預先選擇位點優(yōu)選地位于耙DNA序列內；-將外源DNA分子導入植物細胞，因而該DNA分子包含如下有效連接的DNA片段o所選擇目的DNA分子；o在前面或后面具有重復DNA區(qū)域的選擇標記基因或篩選標記基因，其中所述的重復DNA區(qū)域與位置緊鄰預先選擇位點的基因組DNA區(qū)域之一具有至少80%的序列同一性，因而當外源DNA分子通過非同源末端連接在預先選擇位點內插入時，該DNA區(qū)域與其基因組拷貝以同向重復方式存在；o切點罕見的DSBI酶的識別位點，位于包含所述重復DNA區(qū)域和所述選擇標記基因的外源DNA區(qū)域內；-選擇包含選擇標記或篩選標記的植物細胞的群體；-選擇在其中選擇標記或篩選標記已經通過非同源末端連接在預先選擇位點處導入的植物細胞，并從植物細胞再生植物；-將包含選擇標記基因的再生植物或其后代植物與包含編碼DSBI酶的嵌合基因的植物雜交，其中該嵌合基因包含如下有效連接的DNA區(qū)段■小孢子特異性啟動子；■編碼識別位于目的DNA內的識別位點的雙鏈DNA斷裂誘導酶的DNA區(qū)域；■轉錄終止和聚腺苷酸化區(qū)域；-選擇包含選擇標記基因或篩選標記基因和編碼DSBI酶的嵌合基因的后代植物(F1植物)；-將后代植物與另一植物雜交，由此使用后代植物作為花粉供體；-選擇包含編碼DSBI酶的嵌合基因的后代植物的群體(F2群體)；和-選擇所述F2群體內的后代植物，在所述后代植物中選擇標記基因或篩選標記基因通過重復DNA區(qū)域和位置緊鄰預先選擇位點的基因組DNA區(qū)域間的同源重組朝C缺失。以上提及的方法可以方l更地用于打斷所選擇的任何DNA序列，例如多肽編碼區(qū)、編碼生物活性RNA的DNA序列、啟動子區(qū)域、調節(jié)區(qū)、蛋白質或RNA結合的識別位點等。在該實施方案中，在其中DNA分子已經通過非同源末端連接而插入的事件可以例如使用引物序列(識別位于預先選擇位點附近的基因組序列并且還優(yōu)選地不識別識別外源DNA)和在外源DNA分子內的引物通過PCR反應方便地進行鑒定。在通過非同源末端連接在預先選擇位點處插入外源DNA時，DNA片段將擴增。當外源DNA隨機整合時，不會擴增此DNA片段?？梢岳斫獾氖潜景l(fā)明的手段和方法可以用于能夠通過花粉繁殖的任何植物內，包括玉米、煙草、谷物植物包括小麥、燕麥、大麥、黑麥、稻、草坪草、高粱、谷子或甘蔗。本發(fā)明的方法還可以應用于任何植物(被子植物或棵子植物)，包括但不限于棉花、油菜、歐洲油菜、大豆、蔬菜、馬鈴薯、浮萍屬某些種(Lenmaspp.)、煙草屬某些種(Nicotianaspp.)、擬南芥(Arabidopsis)、紫花苜蓿、大麥、菜豆、玉米、棉花、亞麻、豌豆、蕓莒、稻、黑麥、紅花、高粱、大豆、向日葵、煙草、小麥、聲夢、甜菜、西蘭花、甘藍、胡蘿卜、花椰菜、芹菜、黃瓜、茄子、萵苣、洋蔥、歐洲油菜、胡椒、馬鈴薯、西葫蘆、蘿卜、菠菜、南瓜、番茄、小胡瓜、扁桃、蘋果、杏、香蕉、黑莓、藍莓、可可、櫻桃、椰子、芟越橘、棗、葡萄、葡萄柚、番石榴、獼猴桃、檸檬、酸橙、芒果、甜瓜、油桃、桔、番木瓜、西番蓮、桃、花生、梨、菠蘿、阿月渾子、李、樹莓、草莓、橘、胡桃和西瓜。本發(fā)明的目的還是提供根據本發(fā)明方法所產生的植物細胞和植物。本發(fā)明的范圍還包括通過傳統(tǒng)育種方法產生的包含DNA插入事件的植物的配子、種子、胚、合子性或體細胞性后代或雜種。此類植物可以含有替代存在而與它們的祖先植物不同。通過本文中所述方法得到的植物可以通過常規(guī)育種技術與其它植物進一步雜交，以得到包含根據本發(fā)明所得到的定向DNA插入事件的后代植物。如下非限制性實施例描述使用處于小孢子特異性啟動子控制下表達的編碼雙鏈DNA斷裂誘導酶如I-SceI的嵌合基因從所導入DNA分子中去除所選擇亞片段。在實施例中除非另外說明，所有重組DNA技^艮據如在Sambrook等(1989)MolecularCloning:ALaboratoryManual,第二版，ColdSpringHarborLaboratoryPress,NY和在Ausubel等(1994)CurrentProtocolsinMolecularBiology,CurrentProtocols,USA的第1和2巻內所述的標準方案開展。用于植物分子工作的標準材料和方法描述于BIOSScientificPublicationsLtd(UK)和BlackwellScientificPublications,UK聯合出版的R.D.D.Croy編的PlantMolecularBiologyLabfax(1993)內。對于標準分子生物學技術的其它參考文獻包括Sambrook和Russell(2001)MolecularCloning:ALaboratoryManual,第三版，ColdSpringHarborLaboratoryPress,NY、Brown(1998)MolecularBiologyLabFax，第二版,AcademicPress(UK)第I和II巻。用于聚合Sl^式反應的標準材料和方法可以在Dieffenbach和Dveksler(1995)PCRPrimer:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratoryPress并在McPherson等(2000)PCR國Basics:FromBackgroundtoBench,第一版，SpringerVerlag，Germany內找到。在說明書和實施例通篇范圍內，提到如下序列SEQIDNol:合成性I-Scel編碼區(qū)(UIPAC編碼)的核苷酸序列。SEQIDNo2:合成性I-Scel編碼區(qū)的核普酸序列。SQIDNo3:包括啟動子區(qū)域的小孢子選擇性NTM19基因的核苷酸序列。SEQIDNo4:pTCV63的T-DNA的核苷,列。SEQIDNo5:pTCV64的T-DNA的核香餅列。SEQIDNo6:pTCV72的T-DNA的核苷酸序列。實施例通過染色體內同源重組(IHR)去除選擇標記基因已經開發(fā)出檢測去除所選擇DNA片段的重組分析法，其基于在同向重復序列(egfp序列的一部分；約300bp或約600bp)間的染色體內同源重組(IHR)而去除選擇標記基因(hyg)(2000bp)后恢復e她-6af融合基因。重復序列之一的側翼具有I-Scel(和鋅指Zif268)識別位點，這有可能在重復序列間產生DSB。為了在一個世代轉移至另一個世代期間允許IHR,將I-Scel內切核酸酶置于小孢子特異性啟動子的控制下(pNTM19)。使用標準重組DNA技術，構建以下DNA分子用于如下的實驗1.pTCV63:具有含如下有效連接的DNA構建體的同向重復短序列(300bp):-p35S3:CaMV35S啟動子片段畫egf(短)eGFP編碼序列的第一個部分，包含與隨后名為GFP序列重疊的300bp-I-Scel內切核酸酶的識別位點-含Zn指Zif268的DNA結合蛋白的識別位點-pCsVMV:木薯葉脈花葉病毒啟動子片段畫hyg:潮霉素抗性編碼區(qū)-3，35S:3，轉錄終止和聚腺苷酸化信號-gfp(短)eGFP編碼序列的3，部分，包含該質粒的先前egf部分的300bp的同向重復序列，并且在其中編碼區(qū)翻譯性地與bar基因編碼區(qū)連接。-3'nos:來自胭脂氨酸合酶基因的3，轉錄終止和聚腺苷酸化信號。將該質粒導入才艮瘤農桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)并且4吏用得到的菌林(A4330)來產生轉基因煙草植物(G7NT001)。2.pTCV64:具有含如下有效連接的DNA構建體的同向重復長序列(600bp):-p35S3:CaMV35S啟動子-egf(長)eGFP編碼序列的第一個部分，包含與隨后名為gfp序列重疊的600bp-I-Scel內切核酸酶的識別位點-含Zn指Zif268的DNA結合蛋白的識別位點-pCsVMV:木薯葉脈花葉病毒啟動子-hyg:潮霉素抗性編碼區(qū)-3，35S:3，轉錄終止和聚腺苷酸化信號-gfp(長)efgp編碼序列的3，部分，包含先前egf構建體的600bp的同向重復序列，并且在其中編碼區(qū)翻譯性地與bar基因編碼區(qū)連接。畫3，nos:來自胭脂氨酸合酶基因的3,轉錄終止和聚腺苷酸化信號。將該質粒導入根瘤農桿菌并且使用得到的菌林(A4364)來產生轉基因煙草植物(G7NT004)。3pTCV72:-pnos:胭脂氨酸合酶啟動子-neo:新霉素磷酸轉移酶II編碼區(qū)-3，ocs:來自章魚堿合酶基因的3，轉錄終止和聚腺苷酸化信號；-pNTM19:小孢子特異性啟動子片段-I-Scel:內切核酸酶I-Scel的編碼區(qū)-3'nos:來自CaMV35S轉錄物的3，轉錄終止和聚腺苷酸化信號。將該質粒導入根瘤農桿菌并且使用得到的菌林(A4331)來產生轉基因煙草植物(G7NT005)。從G7NT001和G7NT004各自的三個獨立的單拷貝轉化煙草系中，使用G7NT005作為雄性植物開展與包含編碼I-Scel的嵌合基因的兩個獨立的單拷貝轉化系(G7NT005)雜交，其中所述的嵌合基因處于小孢子特異性啟動子控制下，因而后代系如下所示G7NT001國0001xG7NT005國0001>04TDNT000001G7NT001-0002xG7NT005-0001>04TDNT000002G7NT001國0003xG7NT005-0001>04TDNT000003G7NT001-0001xG7NT005-0002>04TDNT000004G7NT001-0002xG7NT005-0002〉04TDNT000005G7NT001-0003xG7NT005-0002>04TDNT000006G7NT004-0001xG7NT005-0001>04TDNT000007G7NT004-0002xG7NT005-0001>(無后代)G7NT004-0003xG7NT005-0001>04TDNT000012G7NT004-0001xG7NT005-0002〉04TDNT000008G7NT004-0002xG7NT005國0002>04TDNT000010G7NT004-0003xG7NT005隱0002>04TDNT000011從每一雜交中，將200粒種子播種在Km(200mg/L)培養(yǎng)基上、將200粒種子播種在Hyg(50mg/L)培養(yǎng)基上并且將200粒種子播種在Km(200mg/L)+Hyg(50mg/L)培養(yǎng)基上以檢驗轉基因的正常傳遞。對于大多數雜交而言存在相當正常的不同轉基因的轉移(注意對于某些雜交，遇到污染問題和種子質量問題(見下表))<table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table>G7NT005-0002對于這12種雜交中的每一種，將少量KmK+HygK后代植物轉移運至溫室以作為WTSR1植物的授粉者使用。對于這些12種雜交，每次使用三林KmR+HygR植物作為根據如下方案的WTSR1授粉者SRlx04TDNT000001-001-002-003SRlx04TDNT000002國001-002-003SRlx04TDNT000003-001-002-003SRlx04TDNT000004畫001-002-003SR1x04TDNT000005畫001-002-003SRlx04TDNT000006掘-002-003SRlx04TDNT000007曙001-002-003SRlx04TDNT000012-001-002-003SRlx04TDNT000008-001-002-003SRlx04TDNT000010掘-002-003SR1x04TDNT00001l畫OOl-002-003從這些雜交的每一后代中(見下表)，將50粒種子播種在非選擇性基質上以測定萌發(fā)頻率，將50粒種子播種在卡那霉素基質上以測定NTM19-I-Scel基因的傳遞率并且將約4000粒種子播種在PPT基質上以測定從一個世代轉移至另一世代期間的IHR頻率。也呈現KmK的PPTR幼苗數決定著NTM19-IScel內切核酸酶所誘導的DSB是否影響從一個世代轉至另一世代期間的IHR頻率。對22個后代的后代分析結果匯總于表A、B和C內。NTM19-I-Scel對從一個世代轉移至另一世代期間的IHR頻率存在極強烈的影響，因為全部PPTK幼苗也呈Km^應當指出大部分的PPT"和GFPF幼苗沒有進一步發(fā)育成植物并且因GFP的毒性效應而死亡。表A:<table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table>表B:<table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table>*同時播種本表內提到的后代。由于漂白劑過度強烈的滅菌作用，存在不良的和不規(guī)則的萌發(fā)(對于大多數系<50%).**意味著PPTR和GFP1幼苗勤種子數低估至少因子2，因為大多數系的萌發(fā)頻率小于50%。200680011307.5轉溢也被29/3251;表C:<table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table>此外，全部PPTR和GFPF幼苗確實是潮霉素敏感的，這表明A膽基因的確已經通過在IHR基因座內的染色體間重組被去除。雜交HygR幼苗lt/對HygR篩選的PPTK和GFPF幼苗數<table>tableseeoriginaldocumentpage38</column></row><table>從18個后代群體的分離分析中，可以得出結論，NTM19-I-Scel對從一個世代轉移至另一世代期間的IHR頻率存在極強烈的影響，因為全部PP"幼苗也呈KmK。SR1(雌性)與04TDNT00000X-00Y間的雜交的后代通常將分離成25%僅具有NTM19-IScel內切核酸酶25%僅具有IHR構建體25%同時具有NTM19-I-Scel內切核酸酶+IHR構建體25%既沒有NTM19-I-Scel內切核酸酶，也沒有IHR構建體全部PPI^幼苗也呈Kn^的事實表明，全部IHR重組僅發(fā)生在含有處于NTM19小孢子特異性啟動子控制下的I-Scel內切核酸酶和IHR構建體的部分內。我們的結果表明，在最佳情況下多達11%的含有NTM19-IScel內切核酸酶+IHR構建體的小孢子已經發(fā)生了導致缺陷性e她-6flr融合基因恢復的染色體內同源重組(SR1x04TDNT000006-001)。由于在僅含有IHR構建體的部分中沒有得到產生功能性e她-^r基因的IHR重組，我們可以得出結論，即自發(fā)性IHR(在小孢子內缺乏定向DSB誘導情況下)沒有發(fā)生，或如果自發(fā)性IHR的確發(fā)生，則它沒有導致缺陷性e她-6w融合基因恢復。相反，小孢子內DSB誘導的IHR允許導致陷性eg分-6flr融合基因恢復的更精確的染色體內同源重組。序列分析顯示在通過小孢子內DSB誘導的IHR介導去除選擇標記后，沒有留下痕跡。權利要求1.用于將目的DNA分子導入植物細胞或植物的基因組內，隨后去除所述目的DNA分子的亞序列的方法，包括步驟a.將所述目的DNA分子導入所述植物細胞的基因組內，所述目的DNA分子包含側翼為同向重復排列的兩個DNA序列的所述DNA分子的所述亞序列并且還包含至少一個切點罕見雙鏈DNA斷裂誘導(DSBI)酶的識別位點，其中所述識別位點位于以同向重復排列的所述兩個DNA序列附近，優(yōu)選地位于它們之間；b.選擇在其中所述目的DNA分子整合進入基因組內的植物細胞并從所述植物細胞再生植物；c.將所述植物與包含編碼DSBI酶的嵌合基因的第二個植物雜交，其中所述嵌合基因包含如下有效連接的DNA區(qū)段i.小孢子特異性啟動子；ii.編碼識別所述識別位點的雙鏈DNA斷裂誘導酶的DNA區(qū)域；iii.轉錄終止和聚腺苷酸化區(qū)域；d.選擇包含所述目的DNA分子和編碼DSBI酶的所述嵌合基因的后代植物(F1植物)；e.將所述后代植物與另一植物雜交，由此使用所述后代植物作為花粉供體；f.選擇包含編碼DSBI酶的所述嵌合基因的后代植物的群體(F2群體)；和g.選擇在其中所述DNA分子的亞序列已經通過以同向重復排列的所述兩個DNA序列間的同源重組被缺失的后代植物。2.權利要求l所述的方法，還包括步驟h.將在其中所述DNA分子的所述亞序列已經缺失的所述后代植物與另一植物雜交；和i.得到后代植物的群體(F3植物)并選擇不含有編碼切點罕見的DSBI酶的所述嵌合基因的植物。3.權利要求1或2所述的方法，其中所述目的DNA分子的所述亞序列包含選擇標記基因或篩選標記基因。4.權利要求1至3中任一項所述的方法，其中所述DSBI酶是選自I-SceI、I國ChuI、I-Dmol、I畫CreI、I誦CsmI、PI曙FliI、Pt畫MtuI、I-Ceul、I國SceII、I-SceIII、HO、PI誦CivI、PI畫CtrI、PI-AaeI、PI-BSUI、PI-DhaI、PI-DraI、PI-MavI、PI-MchI、PI-MfuI、PI-MflI、PI-MgaI、PI-MgoI、PI-MinI、PI-MkaI、PI-MleI、PI-MmaI、PI畫MshI、PI-MsmI、PI-MthI、PI-MtuI、PI-MxeI、PI-NpuI、PI-PfuI、PI-RmaI、PI-SpbI、PI-SspI、PI-FacI、PI-MjaI、PI-PhoI、PI-TagI、PI陽ThyI、PI畫TkoI或PI畫TspI的內切核酸酶或包含Zn指DNA結合結構域和DNA切割結構域的嵌合內切核酸酶。5.權利要求1至4中任一項所述的方法，其中所述的DSBI酶是I-SceI。6.權利要求1至5中任一項所述的方法，其中編碼所述雙鏈DNA斷裂誘導酶的所述DNA區(qū)域包含SEQIDNo1或SEQIDNo2的核普酸序列。7.權利要求1至6中任一項所述的方法，其中所述的小孢子特異性啟動子包含選自SEQIDNo3的核苷^列的啟動子片段或其功能性片段。8.權利要求1至7中任一項所述的方法，其中所述目的DNA分子的所述亞序列側翼為所述DSBI酶的兩個識別位點。9.權利要求1至8中任一項所述的方法，其中編碼DSBI酶的所述嵌合基因包含SEQIDNo.6中從核苷酸1941至3913的核苷酸序列。10.用于將植物基因組內的靶DNA序列交換成目的DNA序列的方法，包括如下步驟a.在植物細胞基因組內預先選擇位點處誘導第一個雙鏈DNA斷裂，所述預先選擇位點位于所述靶DNA序列內或位于所述靼DNA序列附近；b.將目的DNA分子導入所述的植物細胞，所述的DNA分子包含i.位于兩個側翼DNA區(qū)域之間的所述目的DNA序列，其中所述的側翼DNA區(qū)域與所述植物細胞基因組內所述靶DNA序列的側翼DNA區(qū)域并且優(yōu)選所述預先選擇位點的側翼DNA區(qū)域具有至少80%序列同源性；ii.位于所述側翼DNA區(qū)域之間的選擇標記基因或篩選標記基因，所述選擇標記基因或篩選標記基因還位于側翼DNA區(qū)域之一與以同向重復方式存在的至少部分的所述側翼DNA區(qū)域之一的另一拷貝之間，其中所述另一拷貝標示為部分側翼DNA序列；iii.位于側翼DNA區(qū)域之一與以同向重復方式存在的所述部分側翼DNA區(qū)域之間的DSBI酶的識別位點；c.選擇包含所述選擇標記或篩選標記的植物細胞的群體；d.選擇在其中所述選擇標記或篩選標記已經借助所述側翼DNA區(qū)域通過同源重組而導入的植物細胞并從所述植物細胞再生植物；e.將包含所述選擇標記基因的所述再生植物或其后代植物與包含編碼DSBI酶的嵌合基因的植物雜交，所述嵌合基因包含如下有效連接的DNA區(qū)段iv.小孢子特異性啟動子；v.編石馬可識別位于所述目的DNA內的所述識別位點的雙鏈DNA斷裂i秀導酶的DNA區(qū)域；vi.轉錄終止和聚腺苷酸化區(qū)域；f.選擇包含所述選擇標記基因或篩選標記基因和編碼DSBI酶的所述嵌合基因的后代植物(F1植物)；g.將所述的后代植物與另一植物雜交，由此使用所述后代植物作為花粉供體；h.選擇包含編碼DSBI酶的所述嵌合基因的后代植物的群體(F2群體)；和i.選擇如此的后代植物，在所述后代植物中所述的選擇標記基因或篩選標記基因通過在所述側翼DNA區(qū)域之一與包含所述側翼DNA區(qū)域之一的一部分的部分側翼DNA區(qū)域之間的同源重組被缺失。11.權利要求10所述的方法，其中在所述預先選擇位點處的所述第一個雙鏈斷裂通過導入第一個DSBI酶誘導，所述的第一個DSBI酶不識別位于所述目的DNA內的DSBI酶的所述識別位點。12.權利要求11所述的方法，其中所述的第一個DSBI酶和識別位于所述目的DNA內的所述識別位點的所述DSBI酶是選自I-SceI、I-ChuI、I隱DmoI、I-CreI、I-CsmI、PI-FliI、Pt國MtuI、I畫CeuI、I國SceII、I畫SceIII、HO、PI-CivI、PI-CtrI、PI-AaeI、PI國BSUI、PI誦DhaI、PI國DraI、PI國MavI、PI畫MchI、PI-MfuI、PI畫MflI、PI-MgaI、PI-MgoI、PI-MinI、PI-MkaI、PI畫MleI、PI國MmaI、PI畫MshI、PI國MsmI、PI-MthI、PI-MtuI、PI-MxeI、PI-NpuI、PI-PfuI、PI畫RmaI、PI-SpbI、PI-SspI、PI-FacI、PI-MjaI、PI國PhoI、PI陽TagI、PI畫ThyI、PI國TkoI或PI-TspI的兩種不同DSBI酶或是包含Zn指DNA結合結構域和DNA切割結構域的嵌合內切核酸酶。13.權利要求10至12中任一項所述的方法，其中識別位于所述目的DNA內的DSBI酶的所述識別位點的所述DSBI酶是I-Scel。14.權利要求13所迷的方法，其中編碼所述雙鏈DNA斷裂誘導酶的所述DNA區(qū)域包含SEQIDNo1或SEQIDNo2的核苷斷列。15.權利要求10至14中任一項所述的方法，其中所述小孢子特異性啟動子包含選自SEQIDNo3的核苷酸序列的啟動子或其功能性片段。16.權利要求10至15中任一項所述的方法，其中編碼DSBI的所述嵌合基因包含SEQIDNo.6中從核苷酸1941至3913的核苷i^f列。17.植物，其通過權利要求1至9中任一項所述的方法可得到。18.植物，其通過權利要求10至16中任一項所述的方法可得到。19.包含編碼DSBI酶的嵌合基因的植物，所述嵌合基因包含如下有效連接的DNA區(qū)段i.小孢子特異性啟動子；ii.編碼可識別位于所述目的DNA內的所述識別位點的雙鏈DNA斷裂誘導酶的DNA區(qū)域；iii.轉錄終止和聚腺苷酸化區(qū)域。20.權利要求19所述植物，其中所述小孢子特異性啟動子包含選自SEQIDNo3的核苷,列的啟動子片段或其功能性片段。21.權利要求19所述植物，其中編碼所述雙鏈DNA斷裂誘導酶的所述DNA區(qū)域包含SEQIDNo1或SEQIDNo2的核苷酸序列。22.權利要求19所述植物，其中編碼DSBI酶的所述嵌合基因包含SEQIDNo.6中從核苷酸1941至3913的核苷酸序列。23.嵌合基因，其包含如下有效連接的DNA區(qū)段i.小孢子特異性啟動子；ii.編碼可識別位于所述目的DNA內的所述識別位點的雙鏈DNA斷裂誘導酶的DNA區(qū)域；和iii.轉錄終止和聚腺苷酸化區(qū)域。24.權利要求23所述嵌合基因，其中所述DNA區(qū)域編碼選自I-Scel、I-Chul、I-Dmol、I國CreI、I-Csml、PI-FliI、Pt畫MtuI、I-CeuI、I國SceII、I畫SceIII、HO、PI-CivI、PI-CtrI、PI-AaeI、PI-BSUI、PI-DhaI、PI國DraI、PI-MavI、PI-MchI、PI國MfuI、PI-MflI、PI畫MgaI、PI-MgoI、PI畫MinI、PI畫MkaI、PI-MleI、PI-MmaI、PI誦MshI、PI誦MsmI、PI畫MthI、PI-MtuI、PI-MxeI、PI-NpuI、PI國PfuI、PI國RmaI、PI-SpbI、PI-SspI、PI誦FacI、PI-MjaI、PI誦PhoI、Pi-TagI、PI-ThyI、PI畫TkoI或PI-TspI的雙鏈DNA斷裂誘導酶或包含Zn指DNA結合結構域和DNA切割結構域的嵌合內切核酸酶。25.權利要求23所述嵌合基因，包含SEQIDNo1或SEQIDNo2的核苷酸序列。26.權利要求23至25中任一項所述嵌合基因，其中所述小孢子特異性啟動子包含選自SEQIDNo3的核苷酸序列的啟動子片段或其功能性片段。27.用于通過在所述靶序列內或在其附近的預先選擇位點處誘導雙鏈斷裂而將植物細胞基因組內的靶DNA序列替換成目的DNA序列的DNA栽體，所述DNA載體包含a.位于兩個側翼DNA區(qū)域之間的所述目的DNA序列，其中所述的側翼DNA區(qū)域與所述耙DNA序列的側翼DNA區(qū)域和所述預先選擇位點的側翼DNA區(qū)域具有至少80%序列同源性；b.位于所述側翼DNA區(qū)域之間的選擇標記基因或篩選標記基因，所述選擇標記基因或篩選標記基因還位于側翼DNA區(qū)域之一與以同向重復方式存在的包含所述側翼DNA區(qū)域之一的一部分的部分側翼DNA區(qū)域之間；和c.位于所述側翼DNA區(qū)域之一與以同向重復方式存在的所述部分側翼DNA區(qū)域之間的DSBI酶的識別位點。全文摘要本發(fā)明描述用于使用處于小孢子特異性啟動子控制下表達切點罕見雙鏈斷裂誘導DNA內切核酸酶通過在兩個同向重復DNA序列間的染色體內重組而從DNA分子內精確去除所選擇亞片段的方法。本方法可以應用于用來將植物細胞和植物內的靶DNA片段精確交換成目的DNA片段的方法內。文檔編號C12N15/82GK101155921SQ200680011307公開日2008年4月2日申請日期2006年3月31日優(yōu)先權日2005年4月4日發(fā)明者K·達倫,R·魯伊特申請人:拜爾生物科學公司