專利名稱：一種制備高效電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞的培養(yǎng)基及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，具體地說(shuō)是一種制備感受態(tài)細(xì)胞的培養(yǎng)基及其應(yīng)用，使用此特殊的培養(yǎng)基培養(yǎng)革蘭氏陰性菌——大腸桿菌(Escherichia coli，E.coli)DH10B菌株制備高效電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞。
背景技術(shù)：
轉(zhuǎn)化是分子克隆中將外源DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞的關(guān)鍵技術(shù)。自1970年Mandle和Higa發(fā)現(xiàn)用CaCl2處理的細(xì)胞可以被λ噬菌體DNA轉(zhuǎn)染后，1972年和1973年Cohen等人用同樣的方法首次成功地將R因子和重組質(zhì)粒DNA導(dǎo)入大腸桿菌，從而奠定了遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)。轉(zhuǎn)化的方法很多，如氯化鈣法、Hanahan法和Inoue法等都可以滿足一般實(shí)驗(yàn)需求，但這些方法轉(zhuǎn)化效率較低，最高可達(dá)到107～108cfu/μg質(zhì)粒DNA，且操作復(fù)雜，可重復(fù)性不高。而建立大片段基因組文庫(kù)，如BAC文庫(kù)，則需要用轉(zhuǎn)化率更高，結(jié)果更穩(wěn)定的電轉(zhuǎn)化方法(Taketo A.DNA transfection of Escherichia coli byelectroporation.Biochim Biophys Acta，1988，949(3)318-324)。
電轉(zhuǎn)化的基本原理是利用瞬時(shí)脈沖電場(chǎng)作用于受體細(xì)胞，使細(xì)胞膜組分被極化，并在細(xì)胞膜兩邊產(chǎn)生電位差。當(dāng)電位差超過某一臨界水平，細(xì)胞膜局部被擊穿，形成一些可逆孔洞，孔徑大小足以讓大分子和小分子進(jìn)入或從細(xì)胞中排出。
不同類型的培養(yǎng)基對(duì)感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化效率有一定的影響。培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)成分越高，細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)就越好，轉(zhuǎn)化效率就越高；離子強(qiáng)度越小，對(duì)轉(zhuǎn)化的負(fù)面影響也就越小(Dower W J，Miller J F，Ragsdale C W.Highefficiency transformation of E.coli by high voltage electroporation.NucleicAcids Res，1988，16(13)6127-6145)。因?yàn)樵陔姶┛左w系中，低離子強(qiáng)度是維持一定時(shí)間高場(chǎng)強(qiáng)的關(guān)鍵。電擊液中的電解質(zhì)濃度越高，越容易對(duì)受體細(xì)胞形成無(wú)效放電或是旁路放電，不能產(chǎn)生傳輸孔道。另外，瞬間強(qiáng)電流會(huì)導(dǎo)致電擊體系溫度驟然升高，細(xì)菌大量死亡。
感受態(tài)細(xì)胞的生長(zhǎng)時(shí)期是影響電轉(zhuǎn)化效率的重要因素之一。用處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)前期或是末期的細(xì)胞制備的感受態(tài)很難實(shí)現(xiàn)高效轉(zhuǎn)化。由于細(xì)胞的性質(zhì)不同，所用培養(yǎng)基的種類不同，細(xì)菌達(dá)到最高轉(zhuǎn)化效率時(shí)對(duì)應(yīng)的生長(zhǎng)時(shí)間就會(huì)有很大差別。
高效電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞是構(gòu)建高質(zhì)量基因組文庫(kù)尤其是大片段基因組文庫(kù)的保證。Invitrogen、Stratagene、Lucigen等許多國(guó)外知名生物試劑公司均有高質(zhì)量的電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞出售，但價(jià)格昂貴。以InvitrogenElectroMAX DH10B Competent Cell為例，雖然其轉(zhuǎn)化效率能達(dá)到1×1010cfu/μg pUC19 DNA，但每500μl售價(jià)高達(dá)$258，對(duì)于一個(gè)平均插入片段在150kb，含有150000克隆的BAC文庫(kù)來(lái)說(shuō)，僅感受態(tài)細(xì)胞一項(xiàng)就要花費(fèi)近$30000。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種成本低、應(yīng)用效果好的制備感受態(tài)細(xì)胞的培養(yǎng)基及其應(yīng)用。
為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下一種制備感受態(tài)細(xì)胞的培養(yǎng)基，每升YENB培養(yǎng)基中含有，用于細(xì)胞培養(yǎng)的酵母提取物6～9g，用于細(xì)胞培養(yǎng)的營(yíng)養(yǎng)肉湯6～9g，余量為水。
所述YENB培養(yǎng)基可用于培養(yǎng)革蘭氏陰性菌——大腸桿菌菌株，制備高效電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞。
所述菌株為大腸桿菌DH10B菌株，一次培養(yǎng)DH10B感受態(tài)細(xì)胞的條件為單菌落接種8～12ml YENB培養(yǎng)基于50ml尖底塑料離心管，37℃、240～260rpm下培養(yǎng)9～11h；二次培養(yǎng)DH10B感受態(tài)細(xì)胞的條件為將一次培養(yǎng)的DH10B細(xì)胞按照1∶1000比例接種YENB培養(yǎng)基，37℃、180～220rpm培養(yǎng)至OD550＝0.78～0.80時(shí)收集細(xì)菌。
本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)1、配制簡(jiǎn)單、成本低。YENB是一種應(yīng)用很廣泛的無(wú)鹽培養(yǎng)基。制備感受態(tài)細(xì)胞所用的大部分試劑為國(guó)產(chǎn)分析純，如培養(yǎng)基、甘油等，由國(guó)產(chǎn)分析純替代了價(jià)格昂貴的進(jìn)口試劑，從而大大降低了材料成本，使得制備感受態(tài)細(xì)胞的材料成本僅為商品感受態(tài)細(xì)胞售價(jià)的5％左右。
2.應(yīng)用方便。SOB培養(yǎng)基(無(wú)Mg2+)的含鹽量近0.7‰，而YENB是一種無(wú)鹽培養(yǎng)基，因此用它制備感受態(tài)細(xì)胞時(shí)，對(duì)洗滌的要求不是很嚴(yán)格，僅需1～2次洗滌就可將細(xì)菌代謝雜質(zhì)和微量鹽離子去除，大大降低了無(wú)效放電和旁路放電的可能。YENB培養(yǎng)基廣泛適用于各種E.coli電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞的制備培養(yǎng)，具有普遍性。
3.營(yíng)養(yǎng)豐富，可以滿足大部分細(xì)胞的生長(zhǎng)需要。YENB不僅是一種無(wú)鹽培養(yǎng)基(salt-free media)，而且其中的營(yíng)養(yǎng)肉湯(Nutrient Broth)營(yíng)養(yǎng)成分豐富，可以滿足大部分細(xì)胞的生長(zhǎng)需要，用YENB培養(yǎng)基制備的DH10B感受態(tài)細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好。因此YENB培養(yǎng)基可以廣泛應(yīng)用于絕大部分的細(xì)菌培養(yǎng)和感受態(tài)細(xì)胞的制備過程中。
4.使用效果好。用本發(fā)明制備的感受態(tài)細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)和轉(zhuǎn)化效率明顯優(yōu)于傳統(tǒng)上制備電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞所用的SOB培養(yǎng)基；與SOB培養(yǎng)基相比，由于沒有鹽離子的存在，對(duì)洗滌的要求不是很嚴(yán)格，由于洗滌次數(shù)明顯減少，對(duì)感受態(tài)細(xì)胞的損傷也就小的多，因此感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化效率比SOB培養(yǎng)基明顯升高，可達(dá)2.19×1010cfu/μg pUC19DNA；超過了同種類商品感受態(tài)細(xì)胞(Invitrogen ElectroMAX DH10B Competent Cell)的轉(zhuǎn)化效率，并能在低溫冰箱中長(zhǎng)期保存。該技術(shù)為基因組文庫(kù)尤其是DNA大片段基因組文庫(kù)的高效轉(zhuǎn)化提供了技術(shù)基礎(chǔ)。


圖1為不同培養(yǎng)時(shí)間對(duì)新鮮制備感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化效率的影響。
具體實(shí)施例方式
新型培養(yǎng)基YENB作為制備DH10B感受態(tài)細(xì)胞的培養(yǎng)基，是一種由酵母提取物(YeastExtract)和營(yíng)養(yǎng)肉湯(NutrientBroth)混合而成的無(wú)鹽培養(yǎng)基；YENB培養(yǎng)基配方以及制備方法配制每升培養(yǎng)基，在950ml超純水(Millpore產(chǎn)品)中加入用于細(xì)胞培養(yǎng)的酵母提取物6～9g(OXOID公司貨號(hào)LP0021；上海生工貨號(hào)BN5245等)，用于細(xì)胞培養(yǎng)的營(yíng)養(yǎng)肉湯6～9g(Gibco公司貨號(hào)0003-17；天津市奧佳科技有限公司貨號(hào)05443等)，搖動(dòng)容器直至溶質(zhì)完全溶解。用5mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH到7.0，用超純水定容至1L。在15psi(1.05kg/cm2)高壓下蒸汽滅菌20min。
實(shí)施例1.YENB培養(yǎng)基配制每升培養(yǎng)基，在950ml超純水中加入酵母提取物8g，營(yíng)養(yǎng)肉湯8g，搖動(dòng)容器直至溶質(zhì)完全溶解。用5mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH到7.0，用超純水定容至1L。在15psi(1.05kg/cm2)高壓下蒸汽滅菌20min。
2.培養(yǎng)基的優(yōu)選采用營(yíng)養(yǎng)成分和離子強(qiáng)度不同的YENB、SOB(無(wú)Mg2+)、2×YT、LB培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)基的選擇優(yōu)化(SOB、2×YT、LB配方見《分子克隆》第三版)；DH10B感受態(tài)細(xì)胞的培養(yǎng)條件如下從超低溫冰箱取出DH10B菌種在無(wú)抗性的LB固體培養(yǎng)基平板上劃線，37℃倒置培養(yǎng)14～16h。挑取個(gè)體圓潤(rùn)有光澤的單菌落接種10ml YENB培養(yǎng)基于50ml尖底塑料離心管，37℃、250rpm下培養(yǎng)10h。將一次培養(yǎng)物以1∶1000的比例接種無(wú)抗性YENB液體培養(yǎng)基(如，500μl培養(yǎng)細(xì)胞接種500ml YENB培養(yǎng)基)，37℃、200rpm培養(yǎng)至適當(dāng)OD550，取出培養(yǎng)物并立即冰浴20min。
利用YENB、SOB(無(wú)Mg2+)、2×YT、LB培養(yǎng)基制備的新鮮感受態(tài)細(xì)胞(OD550＝0.78)進(jìn)行轉(zhuǎn)化。實(shí)驗(yàn)條件為1μl pUC19 DNA(2pg/μl)、40μl感受態(tài)細(xì)胞、脈沖場(chǎng)強(qiáng)21kV/cm。結(jié)果如表1所示，用YENB培養(yǎng)基制備的新鮮感受態(tài)細(xì)胞的平均轉(zhuǎn)化效率最高，達(dá)到2.19×1010cfu/μg pUC19DNA。
表1、不同種類培養(yǎng)基對(duì)感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化效率的影響

轉(zhuǎn)化效率計(jì)算公式見“感受態(tài)細(xì)胞的電轉(zhuǎn)化以及效率測(cè)定”部分，轉(zhuǎn)化效率單位cfu/μg pUC19 DNA。
3、感受態(tài)細(xì)胞二次培養(yǎng)最佳生長(zhǎng)時(shí)間的優(yōu)化以YENB為培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，分別收集OD550＝0.30、0.40、0.50、0.60、0.70、0.80、0.90、1.00、1.10時(shí)的菌液制備新鮮感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化條件同上。結(jié)果如圖1所示，采用對(duì)數(shù)中期OD550＝0.78～0.80的細(xì)胞制備的感受態(tài)轉(zhuǎn)化效率最高。
一次培養(yǎng)DH10B感受態(tài)細(xì)胞的最佳條件為單菌落接種10ml YENB培養(yǎng)基于50ml尖底塑料離心管，37℃、250rpm下培養(yǎng)10h；二次培養(yǎng)DH10B感受態(tài)細(xì)胞的最佳生長(zhǎng)條件和生長(zhǎng)時(shí)間為將一次培養(yǎng)的DH10B細(xì)胞500μl接種500ml YENB培養(yǎng)基于2500ml玻璃三角瓶，37℃、200rpm培養(yǎng)至OD550＝0.78～0.80時(shí)收集細(xì)菌，此條件下制備的感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化效率達(dá)到2.19×1010cfu/μg pUC19 DNA。
4、感受態(tài)細(xì)胞的制備和凍存*儀器設(shè)備Millipore公司純水系統(tǒng)；Sorvall GSA柜式冷凍離心機(jī)；37℃恒溫培養(yǎng)箱及搖床。
(1)從超低溫冰箱取出DH10B菌種在無(wú)抗性的LB固體培養(yǎng)基平板上劃線，37℃倒置培養(yǎng)14～16h；(2)挑取個(gè)體圓潤(rùn)有光澤的單菌落接種10ml YENB培養(yǎng)基于50ml尖底塑料離心管，37℃、250rpm培養(yǎng)10h；(3)將500μl培養(yǎng)物加入500ml YENB培養(yǎng)基(1∶1000比例接種)，37℃、200rpm培養(yǎng)至OD550＝0.78～0.80時(shí)，立即冰浴20min，期間輕輕晃動(dòng)三角瓶2～3次；(4)將培養(yǎng)物轉(zhuǎn)入預(yù)冷的500ml離心瓶中，Sorvall GSA 3000轉(zhuǎn)子、0～2℃、4000rpm離心10～15min，小心棄上清；(5)等體積的預(yù)冷的超純水重懸細(xì)胞，0～2℃4000rpm離心10～15min，小心棄上清；(6)等體積的預(yù)冷的10％甘油重懸細(xì)胞，0～2℃ 5000rpm離心10～15min，小心棄上清**。
(7)每升培養(yǎng)物以2ml 10％預(yù)冷甘油重懸，每管40μl分裝后液氮速凍3min放入低溫冰箱保存。
*所使用的儀器設(shè)備以及實(shí)驗(yàn)用品必須保證干凈無(wú)污染，整個(gè)操作過程應(yīng)盡量在低溫環(huán)境中進(jìn)行。
**經(jīng)10％甘油洗滌的細(xì)胞離心后非常松散，小心取出離心瓶，傾倒上清時(shí)要格外小心。此過程中會(huì)不可避免的損失少量細(xì)胞，切勿盲目提高轉(zhuǎn)速增加感受態(tài)細(xì)胞產(chǎn)量，因?yàn)殡S著轉(zhuǎn)速的增大，對(duì)細(xì)胞的損傷更加嚴(yán)重，從而降低了轉(zhuǎn)化效率；5、感受態(tài)細(xì)胞的電轉(zhuǎn)化以及效率測(cè)定儀器設(shè)備Bio-Rad公司生的Micropulser電穿孔儀；37℃恒溫培養(yǎng)箱及搖床。
(1)取1μl pUC19 DNA(2pg/μl)與40μl感受態(tài)細(xì)胞混合均勻后加入1mmgap的預(yù)冷電極杯，避免產(chǎn)生氣泡，脈沖場(chǎng)強(qiáng)度為21kV/cm，電擊后迅速加入960μl常溫?zé)o抗性SOC培養(yǎng)基，37℃200rpm培養(yǎng)1h。每個(gè)條件重復(fù)6次，并設(shè)立空白陰性對(duì)照；(2)分別取1μl、2μl、5μl、10μl菌液點(diǎn)在含有適量氨芐青霉素的LB平板上，37℃倒置培養(yǎng)12～14h，計(jì)數(shù)并按照以下公式計(jì)算轉(zhuǎn)化效率。
CFU on platepg pUC19DNA×1×106pgμg×volume of transformantsvolume plated×dilution factor]]>本發(fā)明通過對(duì)感受態(tài)細(xì)胞一次培養(yǎng)和二次培養(yǎng)條件的優(yōu)化，以及比較YENB、SOB、2×YT、LB四種不同培養(yǎng)基制備的新鮮感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化效率，最終確定了DH10B感受態(tài)細(xì)胞的最佳培養(yǎng)條件并優(yōu)選出YENB作為制備高效DH10B感受態(tài)細(xì)胞的培養(yǎng)基。利用YENB培養(yǎng)基，通過控制細(xì)胞生長(zhǎng)時(shí)間、離心時(shí)的轉(zhuǎn)速和時(shí)間等重要參數(shù)成功制備了高效電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞。
權(quán)利要求
1.一種制備感受態(tài)細(xì)胞的培養(yǎng)基，其特征在于每升YENB培養(yǎng)基中含有，用于細(xì)胞培養(yǎng)的酵母提取物6～9g，用于細(xì)胞培養(yǎng)的營(yíng)養(yǎng)肉湯6～9g，余量為水。
2.按照權(quán)利要求1所述培養(yǎng)基，其特征在于每升YENB培養(yǎng)基中含有，用于細(xì)胞培養(yǎng)的酵母提取物8g，用于細(xì)胞培養(yǎng)的營(yíng)養(yǎng)肉湯8g，余量為水。
3.一種權(quán)利要求1所述制備感受態(tài)細(xì)胞培養(yǎng)基的應(yīng)用，其特征在于權(quán)利要求1所述YENB培養(yǎng)基用于培養(yǎng)革蘭氏陰性菌——大腸桿菌菌株，制備高效電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞。
4.按照權(quán)利要求3所述制備感受態(tài)細(xì)胞培養(yǎng)基的應(yīng)用，其特征在于所述菌株為大腸桿菌DH10B菌株，一次培養(yǎng)DH10B感受態(tài)細(xì)胞的條件為單菌落接種8～12ml YENB培養(yǎng)基于50ml尖底塑料離心管，37℃、240～260rpm下培養(yǎng)9～11h。
5.按照權(quán)利要求4所述制備感受態(tài)細(xì)胞培養(yǎng)基的應(yīng)用，其特征在于所述菌株為大腸桿菌DH10B菌株，二次培養(yǎng)DH10B感受態(tài)細(xì)胞的條件為將一次培養(yǎng)的DH10B細(xì)胞按照1∶1000比例接種YENB培養(yǎng)基，37℃、180～220rpm培養(yǎng)至OD550＝0.78～0.80時(shí)收集細(xì)菌。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種制備高效電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞的培養(yǎng)基，每升YENB培養(yǎng)基中含有，用于細(xì)胞培養(yǎng)的酵母提取物6～9g，用于細(xì)胞培養(yǎng)的營(yíng)養(yǎng)肉湯6～9g，余量為水。本發(fā)明采用特殊配方的培養(yǎng)基，控制細(xì)胞一次培養(yǎng)和二次培養(yǎng)的生長(zhǎng)時(shí)間、制備離心時(shí)的轉(zhuǎn)速和時(shí)間等重要參數(shù)制備高效電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，其轉(zhuǎn)化效率高于同種類進(jìn)口商品感受態(tài)，可達(dá)2.19×10
文檔編號(hào)C12N1/20GK101050420SQ20061004625
公開日2007年10月10日 申請(qǐng)日期2006年4月7日 優(yōu)先權(quán)日2006年4月7日
發(fā)明者相建海, 張洋, 劉斌, 張曉軍, 李富花 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院海洋研究所