一種高轉化效率大腸桿菌熱激感受態(tài)細胞制備方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明設及基因工程領域對大腸桿菌熱激感受態(tài)細胞的培養(yǎng)及制備方法，特別是 設及對大腸桿菌菌株D冊α的培養(yǎng)及制備方法，尤其是設及一項顯著提高大腸桿菌菌株熱激 轉化效率和穩(wěn)定性的關鍵技術。
【背景技術】
[0002] 大腸桿菌熱激轉化技術是基因工程和分子生物學研究的基礎，在DNA片段測序、功 能載體構建和質粒擴繁等方面廣泛使用。轉化效率對于注重克隆數(shù)量試驗來說(如文庫構 建等），一直是個技術瓶頸。截至目前，除市售的大腸桿菌熱激感受態(tài)細胞外，實驗室自制的 感受態(tài)細胞轉化效率參差不齊。也有科研機構采用電擊轉化代替熱激轉化，W提高轉化效 率，但此方法需要特殊儀器設備即電轉儀，試驗條件要求苛刻，同時電擊感受態(tài)細胞比熱激 感受態(tài)細胞價格上要貴數(shù)倍。在國家大力提倡節(jié)約的大環(huán)境下，如何減少不必要的科研專 用材料費用支出，顯得尤為重要。相比之下，大腸桿菌熱激感受態(tài)細胞因其無需特殊設備、 制備方法簡單而備受科研人員青睞，其轉化原理是利用大腸桿菌處于0 °C的氯化巧低滲溶 液中，會膨脹成球形，細胞膜的通透性發(fā)生變化，轉化混合物中的外源DNA形成抗面ase的徑 基-憐酸巧復合物，附著在細胞表面，經42 °C短時間熱激處理，細菌細胞能吸收外源DNA復 合物，通過在相應培養(yǎng)基上復蘇并分裂增殖，從而實現(xiàn)外源DNA的大量復制。然而目前尚無 一個穩(wěn)定、高效的大腸桿菌熱激感受態(tài)細胞制備技術。經過本課題組多年的探索，在高轉化 效率大腸桿菌熱激感受態(tài)細胞制備方面取得一定進展，并已成功應用在DNA測序載體、基因 功能分析載體等轉化方面，取得了理想的轉化效率。無論是哪種大腸桿菌菌株，常規(guī)方法是 先將大腸桿菌菌種在固體平板上復蘇，過夜培養(yǎng)后挑單菌落在液體培養(yǎng)基中進行少量及后 續(xù)的大量培養(yǎng)，隨后采用氯化巧溶液在4 °C條件下進行菌體漂洗，并保存于含10%甘油的氯 化巧保存液中，置-80 Γ長期保存。利用運種制備方案得到的大腸桿菌熱激感受態(tài)細胞轉 化效率十分不穩(wěn)定，且不同批次、不同制備方法得到的熱激感受態(tài)細胞轉化效率也不同，同 時操作人員的熟練程度也影響制備的感受態(tài)細胞最終轉化效率。轉化效率是評價感受態(tài)細 胞優(yōu)劣的核屯、標準。通過改進大腸桿菌細胞培養(yǎng)、漂洗環(huán)節(jié)及菌保存液成分，進一步提高制 備的大腸桿菌熱激感受態(tài)細胞轉化效率及穩(wěn)定性，對于加快基因工程和分子生物學研究進 程具有重要意義。

【發(fā)明內容】

[0003] 本發(fā)明目的是提供一項從大腸桿菌菌株制備高轉化效率和穩(wěn)定的熱激感受態(tài)細 胞的關鍵技術，作為分子生物學試驗基礎，為基因工程及功能基因組學研究提供技術支撐， 減少不必要的科研專用材料費用支出，提高科研工作效率。
[0004] -項廣泛適宜于高效大腸桿菌熱激感受態(tài)細胞制備的關鍵技術，是將-80 °C保存 的菌種（市售或實驗室保存均可）用接種環(huán)在LB固體平板上（10 g/L膜蛋白腺，Oxoid貨號： LP0042;5 g/L酵母提取物，Oxoid貨號:LP0021;10 g/L氯化鋼；12 g/L瓊脂粉，Sigma貨號： A5306)劃線，37 °C過夜培養(yǎng)，挑取直徑約1.5-2 mm的單菌落于5 mL LB液體培養(yǎng)基（lOg/L 膜蛋白腺，Oxoid貨號:LP0042; 5g/L酵母提取物，Oxoid貨號:LP0021; lOg/L氯化鋼）中，37 °C，220巧m過夜培養(yǎng)，于次日下午按1:100轉接于100 mL與上述同樣的新配制LB液體培養(yǎng) 基中，200巧m室溫(20-25 °C)培養(yǎng)10-12 h，直至OD600達到0.4-0.6間。取出菌液置于冰水 混合物上10 min,忌晃動。隨后轉入50 mL錐形離屯、管(BD FALCON貨號：352098,實驗前預 冷），并于冰水混合物上靜置5 min,置于離屯、機（Thermo Sorvall ST 16R)，在4 °C、4000 巧m離屯、10 min,取出、倒凈培養(yǎng)液。加入等量巧0血)預冷的SB溶液（10 ml PI陽S，sigma貨 號:口6757;55 1111111(：12;15 111]\1化(：12;用1((^或肥1調抑至6.7,0.22 4111孔徑的無菌濾膜過濾 滅菌后4 °C保存?zhèn)溆茫?，輕柔重懸菌體，冰水混合物上靜置10 min,再4 °C、4000巧m離屯、10 min，取出、倒凈SB溶液，并倒扣于無菌吸水紙上2 min，加入半量(25 mL)預冷的SB溶液，輕 柔重懸菌體，冰水混合物上靜置10 min,同上條件離屯、10 min,取出、倒凈SB溶液，并倒扣于 無菌吸水紙上2 min,加入10 mL預冷的SB溶液(此步需添加二甲基亞諷(DMS0)至終濃度為 7%)，用去頭的藍色移液管輕輕吸打菌體至完全松散，100 yL分裝，垂直置于液氮中，-80 °C 保存。
[0005] 上述發(fā)明中，將大腸桿菌在室溫條件下進行過夜擴繁，設置37 Γ擴繁1-2 h為對 照，經過梯度遞減漂洗后收集分裝制備的大腸桿菌菌株D冊α(本課題組保存)熱激感受態(tài)細 胞。分別用本發(fā)明和對照制備的感受態(tài)細胞進行PUC19質粒(Takara貨號：3219,大小為2686 bp)、pMD18-T與1.023 kb外源片段的連接產物（片段為小麥ARG cDNA，GenBank登錄號： 1附15197;9]\?)18-1'載體化1?1^貨號：6011，大小為2692 69)及94朋28與上述同樣片段的連 接產物(載體為本課題組改造，空載體大小為10141 bp)轉化，經37 °C、200 rpm復蘇1 h后， 涂在含有抗生素的LB固體平板中，倒置37 °C過夜培養(yǎng)，拍照統(tǒng)計轉化效率。
[0006] 經過反復試驗和對比發(fā)現(xiàn)，室溫過夜擴繁，相比正常用37 °C培養(yǎng)1-2 h后制備的 大腸桿菌熱激感受態(tài)細胞，無論在轉化對照質粒(pUC19)、T載體連接產物(PMD18-T與1.023 化小麥ARG基因 cDNA全長片段的連接產物)及基因功能研究載體(pA冊28與上述同樣片段的 連接產物）上，轉化效率顯著提高。其中，轉化對照質粒時，轉化效率為3xl08 cfiKcolony forming units)，比對照提高5倍（圖1)，轉化Τ載體連接產物時，轉化效率比對照提高8倍 (圖2 )，轉化基因功能研究載體時，轉化效率比對照提高40倍（圖3 )。同時，取出保存1年W上 利用該發(fā)明制備的大腸桿菌菌株DH5a熱激感受態(tài)細胞，進行基因功能研究載體(ΡΑΗ028與 1.023化的小麥ARG cDNA片段的連接產物，pA朋28在載體圖見圖4)轉化試驗，發(fā)現(xiàn)轉化效 率比新制備的熱激感受態(tài)略差，對于大多數(shù)實驗來說，此差別可W忽略。上述實驗結果表 明，室溫、低速擴繁大腸桿菌菌株能很好地維持大腸桿菌活力，梯度遞減方式漂洗菌細胞， 極大地維持細胞膜的通透性，促進大腸桿菌對外源DNA的融合，進而提高轉化效率。
[0007] 下面結合附圖和附表對本發(fā)明做進一步說明。
[000引 附圖和附表說明 圖1.本發(fā)明與對照轉PUC19結果圖 圖2.本發(fā)明與對照轉PMD18-T與1.023化外源片段的連接產物結果圖 圖3.本發(fā)明與對照轉pA冊28與1.023化外源片段的連接產物結果圖 圖4. PAH028載體圖 表1.連接反應體系
【具體實施方式】
[0009] 下述實施例中所用水皆為超純水，所用方法非特別說明皆為常規(guī)方法。
[0010] 實施例1、大腸桿菌菌株D冊α熱激感受態(tài)細胞制備 一、培養(yǎng)基、抗生素及相關溶液配制和滅菌 LB液體培養(yǎng)基：10 g/L膜蛋白腺(Oxoid貨號:LP0042);5 g/L酵母提取物(Oxoid貨號： LP0021);10 g/L氯化鋼（國產分析純）；調pH=7.0, W上成分采用121°C高壓濕熱滅菌20 min。
[0011] LB固體培養(yǎng)基:在LB液體培養(yǎng)基中僅添加15 g/L瓊脂粉(Sigma貨號:A5306);調抑 =7.0, W上成分采用121°C高壓濕熱滅菌20 min。
[0012] SB溶液：10 ml PIPES(sigma貨號：P6757);55 mM MnCl2(國產分析純）；15 ml 化Cl2(國產分析純）；用KOH或肥1調pH至6.7，0.22 μπι孔徑的無菌濾膜過濾，4 °C保存?zhèn)溆谩?br>[0013] 50 mg/mL卡那霉素配制：準確稱量0.5 g卡那霉素粉劑溶于10 mL超純水中，待徹 底溶解后，0.22皿孔徑的無菌濾膜過