專利名稱：浸礦細(xì)菌－嗜鐵鉤端螺旋菌的選擇性分離方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及到一種專性化能無機自養(yǎng)細(xì)菌-嗜鐵鉤端螺旋菌的選擇性分離方法。
背景技術(shù)：
各種證據(jù)表明，鉤端螺旋菌(leptospirilla)在生物采礦過程中扮演了極為重要的角色。迄今為止，鉤端螺旋菌屬(The genus leptospirillum)至少包括4個種，即氧化亞鐵鉤端螺旋菌(L.ferrooxidan)、嗜熱氧化亞鐵鉤端螺旋菌(已丟失)(L.thermoferrooxidans)、嗜鐵鉤端螺旋菌(L.ferriphilum)和最近分離的第四個種-固氮鐵氧化鉤端螺旋菌(L.ferrodiazotrophum)。該屬細(xì)菌均屬于革蘭氏陰性無機化能自養(yǎng)菌，都是通過氧化亞鐵離子來獲得維持生命活動的能量。相對于異養(yǎng)菌而言，由于這些專性化能自養(yǎng)菌對有機質(zhì)非常敏感，以至于它們在普通的固體培養(yǎng)基上難以分離。各種試驗結(jié)果表明，這些中度嗜溫細(xì)菌在生物冶金領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景，然而，到目前為止，有關(guān)嗜鐵鉤端螺旋菌的生物學(xué)研究報道得很少，究其原因，就在于這種細(xì)菌純培養(yǎng)的困難。目前，真正在實驗室條件下分離這些細(xì)菌最成功、最有效的方法為雙層平板分離技術(shù)(Johnson，D B.Selective solid media for isolating and enumerating acidophilicbacteria.J.Microbiol.Meth.1995，23(2)，205-218.)。這種技術(shù)的最成功之處是涉及到一種叫做嗜酸異養(yǎng)菌SJH(Acidiphilium SJH)的加入。這種異養(yǎng)細(xì)菌事先與雙層平板中的底層混合，其目的是消除培養(yǎng)基釋放出的簡單糖類和一些代謝產(chǎn)物對其所產(chǎn)生的抑制作用，從而使目標(biāo)細(xì)菌很好的生長。雙層平板技術(shù)在分離上述化能自養(yǎng)細(xì)菌方面雖然非常有效，但嗜酸異養(yǎng)菌的加入使得這種雙層平板的制備較之于傳統(tǒng)的單層平板的制備要復(fù)雜得多，而且對亞鐵離子氧化細(xì)菌不具備選擇性分離能力。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種嗜鐵鉤端螺旋菌的選擇性分離方法。
浸礦細(xì)菌-嗜鐵鉤端螺旋菌的選擇性分離方法，首先將樣品接種到一只已高溫滅菌的盛有9K液體培養(yǎng)基的容器中，培養(yǎng)基pH＝2.5，20-30g/lFeSO4·7H2O，將該容器置于30℃空氣浴搖床中振蕩，搖床轉(zhuǎn)速為180rpm，當(dāng)培養(yǎng)基顏色變成紅色時，獲得第一代培養(yǎng)富集物；鏡檢到螺旋狀細(xì)菌后，將適量第一代富集物接種到上述9K液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基中亞鐵離子濃度為40-60g/l，pH＝2.5，溫度30℃，當(dāng)培養(yǎng)基顏色變成紅色時，獲得第二代培養(yǎng)富集物；鏡檢到螺旋狀細(xì)菌后，將適量第二代富集物接種到9K液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基中亞鐵離子濃度為40-60g/l，pH＝1.6，溫度為40℃，同時加入終濃度為5-10mM的Fe2(SO4)3，當(dāng)培養(yǎng)基顏色變成紅色時，獲得第三代培養(yǎng)富集物；鏡檢到螺旋狀細(xì)菌后，將適量第三代富集物接種到9K液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基中亞鐵離子濃度為40-60g/l，pH＝1.6，溫度為40℃，同時加入終濃度為5-10mM的Fe2(SO4)3，加入終濃度為0.5-1.5mM的Al3+，當(dāng)培養(yǎng)基顏色變成紅色時，獲得第四代培養(yǎng)富集物；鏡檢到螺旋狀細(xì)菌后，將第四代富集物分別按稀釋分離和平板分離進行純化，稀釋純化時，將第四代富集物分別按10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9稀釋度，接種到9K液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件與第四代相同，選擇最高稀釋度的培養(yǎng)物按上述稀釋分離法重復(fù)三次，最后獲得目標(biāo)菌株即純培養(yǎng)物；平板純化時，將上述第四代富集物接種到編號為Medium 882(DSMZ)的固體平板中培養(yǎng)，將第四代富集物接種到Medium 882培養(yǎng)基制備的固體平板中培養(yǎng)，在該培養(yǎng)基中加入終濃度為1mM的Al3+，其他成分保持不變，瓊脂糖濃度為0.8-1.0％，培養(yǎng)溫度37-40℃，pH為2.0，挑取第一次獲得的單個菌落進行劃線培養(yǎng)2-3次，既獲得目標(biāo)菌株的純培養(yǎng)物。
與雙層平板技術(shù)相比，上述稀釋分離法和平板分離法均不涉及嗜酸異養(yǎng)細(xì)菌-AcidiphiliumSJH的加入，使得分離過程相對簡單得多；本發(fā)明培養(yǎng)介質(zhì)中較高的Fe3+/Fe2+比例即較高的氧化還原電位，對鉤端螺旋菌的抑制作用較小；培養(yǎng)介質(zhì)中較低的pH(≤1.4)和較高的溫度(≥40℃)有利于鉤端螺旋菌的生長；較低濃度的Al3+不但有利于嗜鐵鉤端螺旋菌對亞鐵離子的生物氧化，而且還能促進嗜鐵鉤端螺旋菌。


圖1嗜鐵鉤端螺旋菌YSK在平板上形成的單菌落；圖2嗜鐵鉤端螺旋菌JE在平板上形成的單菌落；
圖3稀釋法分離后嗜鐵鉤端螺旋菌的掃描電鏡照片。
具體實施例方式首先，將采自江西某礦堆浸液5-10ml樣品接種到已滅菌的盛有9K液體培養(yǎng)基(pH＝2.5，20g/l FeSO4.7H2O)三角瓶中，將該三角瓶置于30℃空氣浴搖床中振蕩，搖床轉(zhuǎn)速為180rpm。當(dāng)培養(yǎng)基顏色變成紅色時，獲得第一代培養(yǎng)富集物。鏡檢到螺旋狀細(xì)菌后，將適量第一代富集物接種到上述9K液體培養(yǎng)基中(除亞鐵離子濃度改變?yōu)?0g/l外，其它條件不變)，當(dāng)培養(yǎng)基顏色變成紅色時，獲得第二代培養(yǎng)富集物。鏡檢到螺旋狀細(xì)菌后，將適量第二代富集物接種到9K液體培養(yǎng)基中(亞鐵離子濃度仍為50g/l，但pH＝1.6，溫度為40℃，同時加入終濃度為10mM的Fe2(SO4)3)，當(dāng)培養(yǎng)基顏色變成紅色時，獲得第三代培養(yǎng)富集物。鏡檢到螺旋狀細(xì)菌后，將適量第三代富集物接種到9K液體培養(yǎng)基中(除了加入終濃度為1.0mM的Al3+外，其他培養(yǎng)條件與第三代相同)，當(dāng)培養(yǎng)基顏色變成紅色時，獲得第四代培養(yǎng)富集物。鏡檢到螺旋狀細(xì)菌后，將第四代富集物分別按稀釋分離和平板分離路線純化。稀釋純化時，將第四代富集物分別按10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9稀釋度，接種到9K液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)(培養(yǎng)條件與第四代相同)，選擇最高稀釋度的培養(yǎng)物按上述稀釋分離法重復(fù)三次，最后獲得目標(biāo)菌株(純培養(yǎng)物)。采用該方法，獲得了5株嗜鐵鉤端螺旋菌的純培養(yǎng)物。
平板純化時，將上述第四代富集物接種到編號為Medium 882(DSMZ)的固體平板中培養(yǎng)(瓊脂糖濃度為1.0％，培養(yǎng)溫度40℃，pH為2.0)，挑取第一次獲得的單個菌落進行劃線培養(yǎng)2-3次，最終獲得一株螺旋狀細(xì)菌，命名YSK。采用該方法，獲得了6株嗜鐵鉤端螺旋菌的純培養(yǎng)物，該菌株經(jīng)過形態(tài)、生理、生化以及分子生物學(xué)的鑒定，確認(rèn)為鉤端螺旋菌屬的嗜鐵鉤端螺旋菌，其16SrDNA序列的基因庫登陸號DQ343299。
權(quán)利要求
1.浸礦細(xì)菌-嗜鐵鉤端螺旋菌的選擇性分離方法，其特征在于首先將樣品接種到盛有9K液體培養(yǎng)基的容器中，培養(yǎng)基pH＝2.5，20-30g/lFeSO4·7H2O，將該容器置于30℃空氣浴搖床中振蕩，搖床轉(zhuǎn)速為180rpm，當(dāng)培養(yǎng)基顏色變成紅色時，獲得第一代培養(yǎng)富集物；將適量第一代富集物接種到上述9K液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基中亞鐵離子濃度為40-60g/l，pH＝2.5，溫度30℃，當(dāng)培養(yǎng)基顏色變成紅色時，獲得第二代培養(yǎng)富集物；將適量第二代富集物接種到9K液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基中亞鐵離子濃度為40-60g/l，pH＝1.6，溫度為40℃，同時加入終濃度為5-10mM的Fe2(SO4)3，當(dāng)培養(yǎng)基顏色變成紅色時，獲得第三代培養(yǎng)富集物；將適量第三代富集物接種到9K液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基中亞鐵離子濃度為40-60g/l，pH＝1.6，溫度為40℃，同時加入終濃度為5-10mM的Fe2(SO4)3，加入終濃度為0.5-1.5mM的Al3+，當(dāng)培養(yǎng)基顏色變成紅色時，獲得第四代培養(yǎng)富集物；將第四代富集物分別按10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9稀釋度，接種到9K液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件與第四代相同，選擇最高稀釋度的培養(yǎng)物按上述稀釋過程重復(fù)三次，最后獲得目標(biāo)菌株即純培養(yǎng)物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的選擇性分離方法，其特征在于對第四代富集物還可以按下述方法分離，將第四代富集物接種到Medium 882培養(yǎng)基制備的固體平板中培養(yǎng)，在該培養(yǎng)基中加入終濃度為1mM的Al3+，其他成分保持不變，瓊脂糖濃度為0.8-1.0％，培養(yǎng)溫度37-40℃，pH為2.0，挑取第一次獲得的單個菌落進行劃線培養(yǎng)2-3次，既獲得目標(biāo)菌株的純培養(yǎng)物。
全文摘要
浸礦細(xì)菌－嗜鐵鉤端螺旋菌的選擇性分離方法，將樣品采用9K液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，經(jīng)過四代富集培養(yǎng)后，采用稀釋分離法或平板純化分離法對菌株進行純化培養(yǎng)，最后獲得目標(biāo)菌株即純培養(yǎng)物。與雙層平板技術(shù)相比，上述稀釋分離法和平板分離法均不涉及嗜酸異養(yǎng)細(xì)菌－Acidiphilium SJH的加入，使得分離過程相對簡單得多；本發(fā)明培養(yǎng)介質(zhì)中較高的Fe
文檔編號C12N1/20GK101016520SQ200610032338
公開日2007年8月15日 申請日期2006年9月28日 優(yōu)先權(quán)日2006年9月28日
發(fā)明者邱冠周, 高健, 康健, 吳學(xué)玲, 丁建南, 夏樂先 申請人:中南大學(xué)