專(zhuān)利名稱(chēng)：預(yù)防不同血清群?jiǎn)柼?hào)鉤端螺旋體感染的通用型三價(jià)基因重組疫苗及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種疫苗及其制備方法，尤其是用于預(yù)防鉤端螺旋體病的三價(jià)基因重 組疫苗及其制備方法。
背景技術(shù)：
由致病的問(wèn)號(hào)鉤端螺旋體(Leptospira interrogans)感染所引起的鉤端螺旋體 病是全世界流行的自然疫源性人獸共患傳染病，尤其好發(fā)于水稻種植地區(qū)，因而我國(guó)是鉤 端螺旋體病流行的主要疫區(qū)之一。問(wèn)號(hào)鉤端螺旋體自然宿主動(dòng)物眾多，感染后無(wú)癥狀或癥狀輕微，通常不死亡，但可 從尿液中排出問(wèn)號(hào)鉤端螺旋體，直接污染水源或經(jīng)土壤污染水源(疫水)。由于問(wèn)號(hào)鉤端螺 旋體在多種水系中能存活較長(zhǎng)時(shí)間并可經(jīng)疫水迅速傳播，故鉤端螺旋體病是洪澇、地震等 自然災(zāi)害時(shí)重點(diǎn)防疫的傳染病之一。我國(guó)地域遼闊，自然災(zāi)害頻繁，因而始終存在著鉤端螺 旋體病暴發(fā)流行的危險(xiǎn)。2005年，鉤端螺旋體病被列為國(guó)家重點(diǎn)監(jiān)測(cè)的13種重大傳染病之 一，最近又被列入國(guó)家計(jì)劃免疫項(xiàng)目之中。接種疫苗是預(yù)防和控制鉤端螺旋體病最為經(jīng)濟(jì)和有效的措施。目前國(guó)際上有兩種 鉤端螺旋體疫苗產(chǎn)品多價(jià)全菌死疫苗和多價(jià)外膜疫苗，目前以前者應(yīng)用為主。然而，上述 疫苗在預(yù)防鉤端螺旋體病中存在的問(wèn)題是①問(wèn)號(hào)鉤端螺旋體血清群眾多，不同地區(qū)流行 的鉤端螺旋體血清群可有差別，多價(jià)全菌死疫苗或多價(jià)外膜疫苗對(duì)疫苗中不包含的問(wèn)號(hào)鉤 端螺旋體血清群感染僅有微弱保護(hù)力甚至無(wú)保護(hù)力；②鉤端螺旋體病病人主要是農(nóng)民，由 于多價(jià)鉤端螺旋體全菌死疫苗、多價(jià)鉤端螺旋體外膜疫苗均含脂多糖內(nèi)毒素，故副作用很 大，接種者數(shù)日內(nèi)不能進(jìn)行體力勞動(dòng)，嚴(yán)重影響了免疫接種的積極性。因此，研制對(duì)不同血 清群鉤端螺旋體有廣泛交叉保護(hù)作用通用型疫苗，對(duì)于鉤端螺旋體病預(yù)防和控制具有極為 重要的意義并有廣闊的應(yīng)用前景?；蚬こ桃呙缫匀斯ぶ亟M表達(dá)的蛋白分子為抗原，免疫成分明確，無(wú)明顯的毒副 作用，因而是當(dāng)今新型疫苗研制的主要方向。病毒的抗原構(gòu)造十分簡(jiǎn)單，其基因工程疫苗的 免疫保護(hù)效果較好，如乙型肝炎病毒的重組表面抗原疫苗。但細(xì)菌的抗原構(gòu)造復(fù)雜，單一抗 原的基因工程疫苗往往免疫保護(hù)效果不佳，這是目前尚無(wú)細(xì)菌單一抗原基因工程疫苗產(chǎn)品 的主要原因，采用多抗原是提高基因工程疫苗免疫保護(hù)效果的有效途徑之一。屬特異性抗原是所有鉤端螺旋體血清群均含有的一類(lèi)抗原。我們發(fā)現(xiàn)，外膜脂 蛋白LipL32和LipL21及穿膜蛋白OmpLl是我國(guó)15群15型鉤端螺旋體參考標(biāo)準(zhǔn)株、鉤 端螺旋體分離株均表達(dá)的外膜蛋白抗原，其中LipL21編碼基因只有一個(gè)基因型，OmpLl和 LipL32編碼基因分別有3個(gè)(ompLl/1、ompLl/2和ompLl/3)和2個(gè)基因型(lipL32/l禾口 lipL32/2)，但各基因型表達(dá)產(chǎn)物抗血清對(duì)我國(guó)15群15型問(wèn)號(hào)鉤端螺旋體參考標(biāo)準(zhǔn)株均 有不同程度的交叉凝集，表明OmpLl和LipL32也是屬特異性表面蛋白抗原。黃疸出血群 是我國(guó)主要流行的問(wèn)號(hào)鉤端螺旋體血清群，70%鉤端螺旋體病例均為感染問(wèn)號(hào)鉤端螺旋體黃疸出血群所致，其余30%鉤端螺旋體病例為感染問(wèn)號(hào)鉤端螺旋體流感傷寒群、秋季群、波 摩那群、澳洲群、犬群、七日熱群等所致。上述問(wèn)號(hào)鉤端螺旋體各血清群lipL32基因型均 為lipL32/l型，問(wèn)號(hào)鉤端螺旋體黃疸出血群、波摩那群、澳洲群、犬群、七日熱群ompLl基因 型為ompLl/2型，流感傷寒群、秋季群為ompLl/Ι型。因此，我們采用黃疸出血群賴(lài)型賴(lài)株 LipL32/l、LipL21和OmpLlA作為問(wèn)號(hào)鉤端螺旋體通用性三價(jià)基因重組新疫苗的抗原
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是要填補(bǔ)現(xiàn)有問(wèn)號(hào)鉤端螺旋體多價(jià)全菌死疫苗和多價(jià)外膜疫苗的 缺陷，提供一種能有效預(yù)防不同血清群?jiǎn)柼?hào)鉤端螺旋體感染且制造成本較低的通用型三價(jià) 基因重組疫苗及其制備方法。本發(fā)明提供的預(yù)防不同血清群?jiǎn)柼?hào)鉤端螺旋體感染的通用型三價(jià)基因重組疫 苗，是一種同時(shí)含三種不同的問(wèn)號(hào)鉤端螺旋體屬特異性外膜抗原LipL32/l、LipL21和 0mpLl/2的基因重組疫苗；它從黃疸出血群賴(lài)型賴(lài)株問(wèn)號(hào)鉤端螺旋體基因組中克隆了 lipL32/l、lipL21和ompLl/2三個(gè)基因，通過(guò)基因工程技術(shù)制備了上述三個(gè)基因的融合基 因^？！^？/！-^？！^丨 ！^！^/^彳所述的融合基因lipLSZ/l-lipI^l-ompLl/^具有序列5所 示的核苷酸序列和氨基酸序列)，為了保證融合基因原核重組表達(dá)產(chǎn)物中三個(gè)蛋白抗原有 良好的空間構(gòu)型，lipL32/l與lipL21、lipL21與ompLl/2基因之間用序列4所示的相同的 兩條柔性肽序列(Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly GlySer Gly Gly Gly Gly Ser)連 接，構(gòu)建了 lipL32/l-lipL21-ompLl/2 融合基因原核表達(dá)載體 pET42alipU2/1_lipm_°_V2，轉(zhuǎn)化入 大腸桿菌 E. coli BL21DE3 中，建立了重組原核表達(dá)系統(tǒng) E. coliBL21DE3pET42a-lipL32/1-lipL21-°mpL1/2, 其表達(dá)產(chǎn)物 rLipL32/l-LipL21-0mpLl/2 分子中同時(shí)含有 rLipL32/l、rLipL21、r0mpLl/2 三 種重組蛋白抗原，從而能對(duì)不同血清群?jiǎn)柼?hào)鉤端螺旋體感染具有免疫預(yù)防效果，不需要分 別重組表達(dá)rLipL32/l、rLipL21和r0mpLl/2，降低了生產(chǎn)成本，同時(shí)使制備方法更為簡(jiǎn)便 可靠。本發(fā)明預(yù)防不同血清群?jiǎn)柼?hào)鉤端螺旋體感染的通用型三價(jià)基因重組疫苗的制 備方法及其效果鑒定步驟1)黃疸出血群賴(lài)型賴(lài)株問(wèn)號(hào)鉤端螺旋體lipL32/l、lipL21 和ompLl/2基因的克隆和測(cè)序及其原核表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建；2)lipL32/l-lipL21-ompLl/2融 合基因及其原核表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建和測(cè)序；3)含IPTG的LB培養(yǎng)基中誘導(dǎo)目的重組蛋白抗原 rLipL32/l-LipL21-0mpLl/2表達(dá)，SDS-PAGE和BioRad凝膠圖象分析系統(tǒng)確定表達(dá)情況 和產(chǎn)量；4)利用lipL32/l-lipL21-ompLl/2融合基因3’端預(yù)先設(shè)置的His標(biāo)簽序列，其 表達(dá)產(chǎn)物rLipL32/l-LipL21-0mpLl/2可用Ni-NTA親和層析柱一次性提純，提純的產(chǎn)物用 SDS-PAGE和BioRad凝膠圖象分析系統(tǒng)確定純度；5)提純的rLipLSZ/l-LipI^l-OmpLl/^直 接與氫氧化鋁混合制備成注射液；6)采用問(wèn)號(hào)鉤端螺旋體金地鼠感染模型、金地鼠血清特 異性抗體顯微鏡凝集效價(jià)檢測(cè)等方法，測(cè)定和確定問(wèn)號(hào)鉤端螺旋體通用型三價(jià)基因重組疫 苗rLipL32-LipL21-0mpLl免疫保護(hù)作用及其特異性抗體產(chǎn)生情況。本發(fā)明的有益效果是1)本發(fā)明通過(guò)人工融合基因及其原核表達(dá)的三價(jià)融合重 組蛋白rLipLSZ/l-LipI^l-OmpLl/^提供一種能預(yù)防不同血清群?jiǎn)柼?hào)鉤端螺旋體感染的皮 內(nèi)注射多價(jià)抗原基因工程疫苗，并采用金地鼠感染模型、血清特異性抗體測(cè)定等方法，證實(shí) 該基因重組疫苗皮下注射免疫后可使83. 3% 91. 7%金地鼠能抵抗三種不同血清群?jiǎn)柼?hào)鉤端螺旋體致死性感染而存活，存活金地鼠血清中含有能與我國(guó)15群15型問(wèn)號(hào)鉤端螺旋 體參考標(biāo)準(zhǔn)株產(chǎn)生效價(jià)為1 50 1 400的顯微鏡交叉凝集抗體，因此能有效預(yù)防不同 血清群?jiǎn)柼?hào)鉤端螺旋體感染而弓I起的鉤端螺旋體病，從而解決了當(dāng)今使用的問(wèn)號(hào)鉤端螺旋 體多價(jià)全菌死疫苗和多價(jià)外膜疫苗無(wú)交叉保護(hù)的缺點(diǎn)；2)本發(fā)明方法制備的多價(jià)重組蛋 白rLipL32/l-LipL21-OmpLl/2是一種對(duì)人體無(wú)害的細(xì)菌融合蛋白，不僅制備方法安全可 靠，同時(shí)也解決了當(dāng)今使用的問(wèn)號(hào)鉤端螺旋體多價(jià)全菌死疫苗副作用大的缺點(diǎn)；3)本發(fā)明 預(yù)防不同血清群?jiǎn)柼?hào)鉤端螺旋體感染的通用型三價(jià)基因重組疫苗，是以基因工程技術(shù)一次 性表達(dá)和提純?nèi)N抗原融合的蛋白分子，故減少了制備環(huán)節(jié)而成本較低，有利于推廣應(yīng)用。
具體實(shí)施例方式序列表說(shuō)明序列1 (SEQ ID NO 1)是問(wèn)號(hào)鉤端螺旋體黃疸出血群賴(lài)型賴(lài)株lipL32/l基因核苷酸和氨基酸序列(問(wèn)號(hào)鉤端螺旋體黃疸出血群賴(lài)型賴(lài)株購(gòu)自北京中國(guó)藥品生物制品檢定 所，每排上一行為核苷酸序列，下一行為氨基酸序列，lipL32/l基因去除信號(hào)肽序列及終止 密碼TAA)。序列2 (SEQ ID NO 2)是問(wèn)號(hào)鉤端螺旋體黃疸出血群賴(lài)型賴(lài)株lipL21基因核苷酸 和氨基酸序列(問(wèn)號(hào)鉤端螺旋體黃疸出血群賴(lài)型賴(lài)株購(gòu)自北京中國(guó)藥品生物制品檢定所， 每排上一行為核苷酸序列，下一行為氨基酸序列，lipL21基因去除信號(hào)肽序列及啟動(dòng)密碼 ATG和終止密碼TAA)。序列3 (SEQ ID NO 3)是問(wèn)號(hào)鉤端螺旋體黃疸出血群賴(lài)型賴(lài)株ompLl/2基因核苷 酸和氨基酸序列(問(wèn)號(hào)鉤端螺旋體黃疸出血群賴(lài)型賴(lài)株購(gòu)自北京中國(guó)藥品生物制品檢定 所，每排上一行為核苷酸序列，下一行為氨基酸序列，ompLl基因去除信號(hào)肽序列及及啟動(dòng) 密碼ATG)。序列4(SEQ ID NO 4)是用于連接各目的基因的柔性肽序列(柔性肽序列為自行 設(shè)計(jì)，每排上一行為核苷酸序列，下一行為氨基酸序列)。序列5(SEQ ID NO :5)是問(wèn)號(hào)鉤端螺旋體黃疸出血群賴(lài)型賴(lài)株人工融合 lipL32/l-lip21-ompLl/2基因核苷酸和氨基酸序列(問(wèn)號(hào)鉤端螺旋體黃疸出血群賴(lài)型賴(lài) 株購(gòu)自北京中國(guó)藥品生物制品檢定所，每排上一行為核苷酸序列，下一行為氨基酸序列，下 劃?rùn)M線區(qū)為柔性肽序列，有方框區(qū)為表達(dá)載體自行攜帶、用于Ni-NTA親和層析提取重組融 合抗原rLipLSZ/l-LipI^l-OmpLl/^的8XHis標(biāo)簽，*表示終止密碼TAA)。以下結(jié)合實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明實(shí)施例1、本實(shí)施例預(yù)防鉤端螺旋體病的通用型三價(jià)基因重組疫苗是采用基因工 程技術(shù)，首先分別獲得lipL32/l、lipL21與ompLlA基因克隆，然后采用相同的兩條柔性 肽序列分別連接問(wèn)號(hào)鉤端螺旋體黃疸出血群賴(lài)型賴(lài)株lipL32/l與lipL21基因、lipL21 與ompLl/2基因，構(gòu)建出同時(shí)含外膜脂蛋白LipL32/l、LipL21和穿膜蛋白0mpLl/2三 種問(wèn)號(hào)鉤端螺旋體屬特異性表面抗原的人工融合基因1 ipL32/1 -1 ipL21 -ompLl/2及其 原核表達(dá)系統(tǒng)E. coliBL21DE3pET42a-lipL32/1-lipL21-°mpL1/2,提純的該表達(dá)系統(tǒng)的重組表達(dá)產(chǎn)物 rLipL32/l-LipL21-0mpLl/2 作為疫苗抗原。本發(fā)明預(yù)防鉤端螺旋體病的通用型三價(jià)基因重組疫苗對(duì)抗原及其基因的選擇依據(jù)70%我國(guó)鉤端螺旋體病例均為感染問(wèn)號(hào)鉤端螺旋體黃疸出血群所致，其余30%鉤端螺 旋體病例為感染問(wèn)號(hào)鉤端螺旋體流感傷寒群、秋季群、波摩那群、澳洲群、犬群、七日熱群等 所致。上述問(wèn)號(hào)鉤端螺旋體各血清群lipL32基因型均為lipL32/l型，問(wèn)號(hào)鉤端螺旋體黃 疸出血群、波摩那群、澳洲群、犬群、七日熱群ompLl基因型為ompLl/2型，流感傷寒群、秋季 群為ompLl/1型。然而，不同lipL32和ompLl基因型表達(dá)產(chǎn)物抗血清對(duì)我國(guó)15群15型問(wèn) 號(hào)鉤端螺旋體參考標(biāo)準(zhǔn)株均有不同程度的交叉凝集。因此，黃疸出血群賴(lài)型賴(lài)株LipL32/l、 LipL21和OmpLl/2可作為問(wèn)號(hào)鉤端螺旋體通用性三價(jià)基因重組新疫苗的抗原。
本發(fā)明預(yù)防鉤端螺旋體病的通用型三價(jià)基因重組疫苗同時(shí)采用rLipL32/l、 rLipL21和rOmpLl/2三種蛋白抗原的理由是增加抗原種類(lèi)，更有效地刺激機(jī)體產(chǎn)生高效 價(jià)抗體；增加抗體作用靶位，提高疫苗免疫保護(hù)效果。本發(fā)明預(yù)防鉤端螺旋體病的通用型三價(jià)基因重組疫苗采用 rLipL32/l-LipL21-0mpLl/2 融合蛋白抗原的理由是單一的 rLipL32/l、rLipL21 和r0mpLl/2需分別構(gòu)建相應(yīng)的三個(gè)原核表達(dá)系統(tǒng)，分別三次誘導(dǎo)重組抗原表達(dá)和 提純，若將lipL32/l、lipL21和ompLl/2三個(gè)基因用柔性肽序列連接后成為一個(gè) lipL32/l-lipL21-ompLl/2融合基因，然后構(gòu)建該融合基因原核表達(dá)系統(tǒng) E. coliBL21DE3pET42a-lipL32"-lipL21_。mpL"2，可一次性表達(dá)和提純同時(shí)含有 rLipL32/l、rLipL21 禾口 rOmpLlA抗原的一個(gè)融合蛋白抗原分子rLipL32/l-LipL21-0mpLl/2，減少了表達(dá)和提純 工序并由此降低了成本，同時(shí)抗原分子量增大可具有提高抗原性的效果。本實(shí)施例預(yù)防鉤端螺旋體病的通用型三價(jià)基因重組疫苗的抗原制備方法包含以 下的步驟1)問(wèn)號(hào)鉤端螺旋體黃疸出血群賴(lài)型賴(lài)株lipL32/l、lipL21和ompLl/2基因克隆 和測(cè)序；2)lipL32/l-lipL21-ompLl/2人工融合基因及其原核表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建和測(cè)序；3)三 價(jià)重組融合蛋白抗原rLipLSZ/l-LipI^l-OmpLl/^表達(dá)及提純。本實(shí)施例中的問(wèn)號(hào)鉤端螺旋體黃疸出血群賴(lài)型賴(lài)株可從我國(guó)法定菌種保藏單位 購(gòu)得；本實(shí)施例中所用的一切實(shí)驗(yàn)用材料和試劑及相關(guān)設(shè)備均可從各自國(guó)內(nèi)外相關(guān)產(chǎn)業(yè)公 司或國(guó)外公司國(guó)內(nèi)銷(xiāo)售代理公司購(gòu)得。在微生物學(xué)、分子生物學(xué)等技術(shù)領(lǐng)域的專(zhuān)業(yè)人員，均 可重復(fù)本實(shí)施例中的制備方法并進(jìn)行試用。上述問(wèn)號(hào)鉤端螺旋體黃疸出血群賴(lài)型賴(lài)株lipL32/l、lipL21和ompLl/2基因的克 隆和測(cè)序的方法是1)取用購(gòu)自北京中國(guó)藥品生物制品檢定所的問(wèn)號(hào)鉤端螺旋體黃疸出 血群賴(lài)型賴(lài)株，問(wèn)號(hào)鉤端螺旋體拉丁文名是L印tospira interrogans (L. interrogans)；問(wèn) 號(hào)鉤端螺旋體黃疸出血群賴(lài)型賴(lài)株接種于EMJH或含8%兔血清的柯氏液體培養(yǎng)基中，普通 大氣中28°C培養(yǎng)7 10天；12000轉(zhuǎn)/分、4°C離心收集問(wèn)號(hào)鉤端螺旋體沉淀，懸浮于滅菌 生理鹽水問(wèn)中，按上法反復(fù)離心、懸浮2次；2)分別取離心沉淀的問(wèn)號(hào)鉤端螺旋體，用苯酚 (pH7. 8-8.0)-氯仿(1 1，V V)提取、0. 1倍3mol乙酸鈉和2倍體積無(wú)水乙醇沉淀獲得 基因組DNA ；3)以問(wèn)號(hào)鉤端螺旋體基因組DNA為模板，采用PCR分別擴(kuò)增lipL32/l、lipL21 和ompLl/2基因，各上下游引物序列中均分別設(shè)置限制性核酸內(nèi)切酶位點(diǎn)Nde I和Xhol， PCR 參數(shù):94°C 5 分鐘；940C 30 秒、50°C 30 秒、72°C 90 秒，30 個(gè)循環(huán)；72°C 10 分鐘；4) PCR 產(chǎn)物經(jīng)1. 5%瓊脂糖凝膠電泳后，在紫外線下觀察目的DNA擴(kuò)增條帶；5)采用多家公司均可 提供的PCR產(chǎn)物純化試劑盒，根據(jù)其操作說(shuō)明書(shū)，先提取目的DNA擴(kuò)增條帶；然后采用多家 公司均可提供的T-A克隆試劑盒，根據(jù)其操作說(shuō)明書(shū)，用T4DNA連接酶16°C作用12小時(shí)將提純的DNA條帶與克隆質(zhì)粒如pUC-M-T連接，反應(yīng)總體積20 μ 1 ；6)取用可購(gòu)自多家分子生物學(xué)試劑公司大腸桿菌DH5 α株，大腸桿菌拉丁文名是Escherichia coli (Ε. coli)，該菌 (Ε. C0Ii DH5 α )接種于LB培養(yǎng)液中37°C培養(yǎng)24小時(shí)，5000轉(zhuǎn)/分4°C離心15分鐘，收集 細(xì)菌沉淀懸于冰浴預(yù)冷的Iml 0. lmol/L CaCl2溶液中冰浴30分鐘，4000轉(zhuǎn)/分4°C離心10 分鐘，收集細(xì)菌沉淀懸于冰浴預(yù)冷的100 μ 1上述CaCl2溶液中，冰浴30分鐘，制備成感受態(tài) Ε. coli DH5a ；7)在上述100 μ 1感受態(tài)E. coli DH5 α懸液中加入上述連接產(chǎn)物2 μ 1，輕 輕混勻后冰浴30分鐘，42°C水浴熱激90秒，再冰浴2分鐘后加入SOC培養(yǎng)液500 μ 1，37°C 旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)(160-180轉(zhuǎn)/分)培養(yǎng)1小時(shí)；8)在含100 μ g/ml氨芐青霉素LB瓊脂平板上分 別用濃度為20mg/ml的X-gal溶液40μ l、100mmol/L IPTG 20 μ 1均勻涂布，37°C干燥30分 鐘，然后涂布接種上述SOC培養(yǎng)物37°C培養(yǎng)24小時(shí)后觀察菌落產(chǎn)生情況；9)選取白色菌落 在含100 μ g/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液中37°C旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)(160-180轉(zhuǎn)/分)培養(yǎng)4_6小時(shí)， 采用多家公司均可提供的細(xì)菌質(zhì)粒提取試劑盒，按說(shuō)明書(shū)操作進(jìn)行質(zhì)粒提取，提取的質(zhì)粒 按上述方法進(jìn)行Nde I和XhoI酶切、1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離，在紫外線下分別確認(rèn)有目 的DNA片段lipL32/l、lipL21或ompLl/^后，委托上海Invetrogen等專(zhuān)業(yè)公司采用雙末端 脫氧法測(cè)定克隆片段的核苷酸序列，序列正確者即為重組質(zhì)粒pUC-M-T1—2^1、PUC-M-Tlipm 或 pUC-M-T。mpL1 氣 上述人工融合基因lipLSZ/l-lipI^l-ompLl/^的制備方法是1)上述含有重組 質(zhì)粒 pUC-M-TlipL32/\pUC-M-TlipL21 或 pUC-M-TompL"2 的 E. coli DH5 α 分別在含 100 μ g/ml 氨 芐青霉素的LB培養(yǎng)液中37V旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)(160-180轉(zhuǎn)/分)培養(yǎng)4_6小時(shí)，采用多家公司 均可提供的細(xì)菌質(zhì)粒提取試劑盒，按說(shuō)明書(shū)操作，分別提取E. coli DH5a中的重組質(zhì)粒 pUC-M-TlipL32/1、pUC-M-TlipL21 或 pUC-M-T。mpL1/2 ;2)根據(jù)柔性肽(Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser GlyGly Gly Gly Ser)核苷酸序列，設(shè)計(jì)分別擴(kuò)增 lipL32/l、lipL21 或ompLl/2基因片段的引物，其中l(wèi)ipL32/l、lipL21基因下游引物含柔性肽正鏈序列， lipL21、ompLl/2基因上游引物含柔性肽負(fù)鏈序列，lipL32/l基因上游引物不含柔性肽序 列但設(shè)置限制性核酸內(nèi)切酶Nde I位點(diǎn)，ompLl/2基因下游引物不含柔性肽序列但設(shè)置限 制性核酸內(nèi)切酶XhoI位點(diǎn)，各引物委托上海Irwetrogen等專(zhuān)業(yè)公司合成，然后分別以重 組質(zhì)粒pUC-M-TlipL32\ pUC-M-TlipL21或pUC-M-T°mpLV2為模板，采用PCR擴(kuò)增出帶有柔性肽序 列的 lipL32/l、lipL21 和 ompLl/^2 基因片段，PCR 參數(shù)94°C 5 分鐘；94°C 30 秒、50°C 30 秒、72°C 90秒，30個(gè)循環(huán)；72°C 10分鐘；3)各PCR產(chǎn)物經(jīng)1. 5%瓊脂糖凝膠電泳分離后，在 紫外線下確認(rèn)分別有l(wèi)ipL32/l、lipL21或ompLlA基因擴(kuò)增片段后，采用多家分子生物學(xué) 試劑公司均可提供的PCR產(chǎn)物純化試劑盒，按說(shuō)明書(shū)操作，提純各目的擴(kuò)增片段后用紫外 分光廣度法測(cè)定各提取物DNA濃度；4)將IOOng提純的lipL32/l基因擴(kuò)增片段和IOOng 提純的lipL21基因擴(kuò)增片段混合，加入除引物外的其它PCR試劑進(jìn)行反應(yīng)(反應(yīng)參數(shù) 940C 5分鐘；94°C 30秒、45°C 30秒、72°C 60秒，10個(gè)循環(huán))，利用柔性肽正、負(fù)鏈互補(bǔ)性形成 lipL32/l-lipL21復(fù)合模板，然后加入lipL32/l基因上游引物及l(fā)ipL21基因下游引物進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增(PCR 參數(shù)94°C 5 分鐘；94°C 30 秒、50°C 30 秒、72°C 120 秒，30 個(gè)循環(huán)；72°C 10 分 鐘)，按上述方法進(jìn)行PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳分離、紫外線下觀察、提純1 ipL32/1-1 ipL21 擴(kuò)增片段、測(cè)定提取物DNA濃度；5)將IOOng提純的lipL32/l_lipL21擴(kuò)增片段與IOOng 提純的ompLl/2基因擴(kuò)增片段混合，加入除引物外的其它PCR試劑進(jìn)行反應(yīng)(反應(yīng)參數(shù)94°C 5分鐘；94°C 30秒、45°C 30秒、72°C 60秒，10個(gè)循環(huán))，利用柔性肽正、負(fù)鏈互補(bǔ)性形 成lipL32/l-lipL21-ompLl/2復(fù)合模板，然后加入lipL32/l基因上游引物及ompLl/2基 因下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增(PCR參數(shù)94°C 5分鐘；94°C 30秒、50°C 30秒、72°C 150秒，30 個(gè)循環(huán)；72°C 15分鐘)，按上述方法進(jìn)行PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳分離、紫外線下觀察、提 純lipL32/l-lipL21-ompLl/2擴(kuò)增片段；6)采用多家公司均可提供的T-A克隆試劑盒，根 據(jù)其操作說(shuō)明書(shū)，用T4 DNA連接酶16°C作用12小時(shí)將提純的lipLSZ/l-lipI^l-ompLl/^ 片段與克隆質(zhì)粒如pUC-M-T連接，反應(yīng)總體積20μ 1 ;6)E. coli DH5 α接種于LB培養(yǎng)液 中37°C培養(yǎng)24小時(shí)，5000轉(zhuǎn)/分4°C離心15分鐘，收集細(xì)菌沉淀懸于冰浴預(yù)冷的Iml
0.lmol/L CaCl2溶液中冰浴30分鐘，4000轉(zhuǎn)/分4°C離心10分鐘，收集細(xì)菌沉淀懸于冰 浴預(yù)冷的100 μ 1上述CaCl2溶液中，冰浴30分鐘，制備成感受態(tài)E. coli DH5 α ；7)在上 述100 μ 1感受態(tài)Ε. coli DH5 α懸液中加入上述連接產(chǎn)物2 μ 1，輕輕混勻后冰浴30分鐘， 42°C水浴熱激90秒，再冰浴2分鐘后加入SOC培養(yǎng)液500 μ 1，37°C旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)(160-180轉(zhuǎn) /分)培養(yǎng)1小時(shí)；8)在含100μ g/ml氨芐青霉素LB瓊脂平板上分別用濃度為20mg/ml 的X-gal溶液40μ l、100mmol/L IPTG 20 μ 1均勻涂布，37°C干燥30分鐘，然后涂布接種 上述SOC培養(yǎng)物37°C培養(yǎng)24小時(shí)后觀察菌落產(chǎn)生情況；9)選取白色菌落在含100 μ g/ml 氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液中37°C旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)(160-180轉(zhuǎn)/分)培養(yǎng)4_6小時(shí)，采用多家公司 均可提供的細(xì)菌質(zhì)粒提取試劑盒，按說(shuō)明書(shū)操作進(jìn)行質(zhì)粒提取，提取的質(zhì)粒按上述方法進(jìn) 行Nde I和XhoI酶切、1. 5%瓊脂糖凝膠電泳分離，在紫外線下分別確認(rèn)有目的DNA片段 lipL32/l-lipL21-ompLl/2后，委托上海Invetrogen等專(zhuān)業(yè)公司采用雙末端脫氧法測(cè)定克 隆片段的核苷酸序列，序列正確者即為含人工融合基因lipLSZ/l-lipI^l-ompLl/^片段的
puc-M-TiipL32/i^iipL2i"ompLi/2。
上述原核表達(dá)系統(tǒng) E. coliBL21DE3pET42a-lipL32/1-lipL21-°mpL1/2 的制備方法是1)含有重 組質(zhì)粒pUC-M-Tiipu/i-iipLShmpu/2的E. coli DH5 Q在含100 μ g/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液
中37°C旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)(160-180轉(zhuǎn)/分)培養(yǎng)4-6小時(shí)，采用多家公司均可提供的細(xì)菌質(zhì)粒提 取試劑盒，按說(shuō)明書(shū)操作，提取E. coli DH5a中的重組質(zhì)粒pUC-M-TlipL32/1-lipL21-°mpW2 ;2)提 取的質(zhì)粒用8-16單位的限制性核酸內(nèi)切酶Nde I和XhoI 37°C酶切12小時(shí)，酶切產(chǎn)物經(jīng)
1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離后，在紫外線下確認(rèn)有目的DNA片段lipLSZ/l-lipI^l-ompLl/^ 后，采用多家分子生物學(xué)試劑公司均可提供的DNA膠回收試劑盒，按說(shuō)明書(shū)操作，切膠回收 lipLSZ/l-lipI^l-ompLl/^片段；3)原核表達(dá)載體pET42a購(gòu)自Novagen公司，用8-16單位 的限制性核酸內(nèi)切酶Nde I和XhoI 37°C酶切12小時(shí)，酶切產(chǎn)物用1. 5%瓊脂糖凝膠電泳分 離線性化的pET42a，采用多家分子生物學(xué)試劑公司均可提供的DNA膠回收試劑盒，按說(shuō)明 書(shū)操作，回收線性化pET42a片段；4)根據(jù)lipL32/l-lipL21-ompLl/2與線性化pET42a片段 在瓊脂糖凝膠中紫外線照射下的熒光強(qiáng)度估計(jì)其濃度，然后lipL32/l-lipL21-ompLl/2與 線性化pET42a片段按3 1的比例混合，加入T4 DNA連接酶37°C連接12小時(shí)，反應(yīng)總體 積20 μ 1 ；5)取用購(gòu)自Novagen公司的大腸桿菌BL21DE3株(E. coli BL21DE3)，該菌接種于 LB培養(yǎng)液中37°C培養(yǎng)24小時(shí)，5000轉(zhuǎn)/分4°C離心15分鐘，收集細(xì)菌沉淀懸于冰浴預(yù)冷 的Iml 0. lmol/L CaCl2溶液中冰浴30分鐘，4000轉(zhuǎn)/分4°C離心10分鐘，收集細(xì)菌沉淀懸 于冰浴預(yù)冷的100 μ 1上述CaCl2溶液中，冰浴30分鐘，制備成感受態(tài)Ε. coli BL21DE3 ；6) 在上述100 μ 1感受態(tài)E. coli BL21DE3懸液中加入上述連接產(chǎn)物2μ 1，輕輕混勻后冰浴30分鐘，42°C水浴熱激90秒，再冰浴2分鐘后加入SOC培養(yǎng)液500 μ 1，37°C旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)(160-180 轉(zhuǎn)/分)培養(yǎng)1小時(shí)；7)在含100 μ g/ml氨芐青霉素LB瓊脂平板上涂布接種上述SOC培 養(yǎng)物，37°C培養(yǎng)24小時(shí)；8)挑取菌落在含100 μ g/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液中37°C旋轉(zhuǎn) 培養(yǎng)(160-180轉(zhuǎn)/分)培養(yǎng)4-6小時(shí)，采用多家公司均可提供的細(xì)菌質(zhì)粒提取試劑盒，按 說(shuō)明書(shū)操作進(jìn)行質(zhì)粒提取，提取的質(zhì)粒按上述方法進(jìn)行Nde I和XhoI酶切，1. 5%瓊脂糖凝 膠電泳分離后，在紫外線下確認(rèn)有目的DNA片段lipL32/l-lipL21-ompLl/2后，委托上海 Invetrogen等專(zhuān)業(yè)公司采用雙末端脫氧法測(cè)定目的片段的核苷酸序列，序列正確者即為目 的原核表達(dá)系統(tǒng) E. C0liBL21DE3pET42a-lipL32-lipL21-。mpU。
上述重組表達(dá)產(chǎn)物rLipL32-LipL21-OmpLl的表達(dá)和提純方法是1)在LB液 體培養(yǎng)液中接種 E. Co 1 iBL2lDE3pET42a-lipL32"lipL21-ompL1, 30 V 或 37 300 轉(zhuǎn) / 分旋轉(zhuǎn)培養(yǎng) 4小時(shí)，加入0. 5mol/L的IPTG，按上述條件繼續(xù)培養(yǎng)4 6小時(shí)；2)上述培養(yǎng)物5000 轉(zhuǎn)/分4 °C離心15分鐘，收集細(xì)菌沉淀用超聲破碎(電壓300V，破碎3秒后間歇3秒，共200 次)，采用多家公司均可提供的Ni-ΝΓΑ親和層析柱，根據(jù)說(shuō)明書(shū)操作，將破碎產(chǎn)物過(guò)Ni-NTA柱， 利用重組表達(dá)產(chǎn)物rLipL32/l-LipL2WtapLl/2羧基端SXHis標(biāo)簽進(jìn)行分離、洗脫、收集目的重 組表達(dá)產(chǎn)物 rLipL32/l-LipL2LLl/2。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下:1)E. coli BL21DE3pET42riipL32/1"lipI21"onpL1/2 能 有效表達(dá)rLipL32/l-LipL21-0mpLl/2，經(jīng)SDS-PAGE及Bio-Rad凝膠圖象分析系統(tǒng)檢 測(cè)，rLipL32/l-LipL21-0mpLl/2產(chǎn)量可達(dá)細(xì)菌總蛋白的36. 5 % ；2)Ni-NTA親和層析后 rLipL32/l-LipL21-0mpLl/2 可達(dá)到電泳純。為證實(shí)目的重組表達(dá)產(chǎn)物rLipLSZ/l-LipI^l-OmpLl/^的抗原性和免疫反應(yīng)性， 用rLipL32/l-LipL21-0mpLl/2為抗原免疫家兔并檢測(cè)其誘導(dǎo)血清特異性抗體產(chǎn)生情況； 以rLipL32/l-LipL21-0mpLl/2為抗原，檢測(cè)其與問(wèn)號(hào)鉤端螺旋體全菌兔抗血清(購(gòu)自北京 中國(guó)藥品生物制品檢定所)的免疫結(jié)合反應(yīng)性。目的重組表達(dá)產(chǎn)物rLipL32-LipL21-OmpLl的抗原性和免疫反應(yīng)性佐劑 活性實(shí)驗(yàn)分別描述如下1)抗原性檢測(cè)選用體重2. 5 3. Okg家兔，先將0. 5ml 含Img rLipL32/l-LipL21-0mpLl/2與等量弗氏完全佐劑混合，背部皮內(nèi)多點(diǎn)注 射，間隔一周注射一次，共4次；末次注射后第10天，抽取免疫家兔心血、分離 血清，以rLipL32/l-LipL21-0mpLl/2為抗原，用瓊脂雙擴(kuò)散法鑒定血清中有無(wú) rLipL32/l-LipL21-0mpLl/2特異性抗體及其效價(jià)；2)免疫反應(yīng)性檢測(cè)以每孔50ng rLipL32/l-LipL21-0mpLl/2為抗原、1 500-10000稀釋的問(wèn)號(hào)鉤端螺旋體全菌兔抗血清 (購(gòu)自北京中國(guó)藥品生物制品檢定所)為一抗、多家公司均可提供的1 2000稀釋的HRP 標(biāo)記羊抗兔IgG為二抗，采用Western Blot檢測(cè)rLipLSZ/l-LipI^l-OmpLl/^的免疫結(jié)合反 應(yīng)性。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下l)rLipL32/l-LipL21-0mpLl/2免疫家兔后可產(chǎn)生特異性抗體， 其瓊脂雙擴(kuò)散法效價(jià)為1 4;2)稀釋度高達(dá)1 5000的問(wèn)號(hào)鉤端螺旋體全菌抗體能識(shí)別 rLipL32-LipL21-0mpLl并與之結(jié)合，形成明顯的特異性黑褐色雜交條帶。實(shí)施例2、本實(shí)施例是將提純的重組表達(dá)產(chǎn)物rLipLSZ/l-LipI^l-OmpLl/^為抗原 與氫氧化鋁為佐劑1 10混合(W W)后成為預(yù)防鉤端螺旋體病的通用型三價(jià)基因重組 疫苗，通過(guò)金地鼠保護(hù)試驗(yàn)及免疫金地鼠血清特異性抗體檢測(cè)，確定預(yù)防鉤端螺旋體病的 通用型三價(jià)基因重組疫苗通過(guò)皮下注射途徑免疫金地鼠后，免疫金地鼠對(duì)抗不同血清群?jiǎn)?號(hào)鉤端螺旋體致死性感染的免疫保護(hù)效果及血清抗體效價(jià)。
本發(fā)明預(yù)防鉤端螺旋體病的通用型三價(jià)基因重組疫苗中采用氫氧化鋁作為佐劑的理由是氫氧化鋁是實(shí)際應(yīng)用多年、安全而有明確效果的注射用佐劑。本發(fā)明預(yù)防鉤端螺旋體病的通用型三價(jià)基因重組疫苗采用皮下注射的理由是問(wèn) 號(hào)鉤端螺旋體侵入人體后引起鉤端螺旋體血癥，因此血清抗體是主要保護(hù)性抗體，采用皮 下注射是誘導(dǎo)血清抗體產(chǎn)生的最為有效的途徑。本實(shí)施例預(yù)防鉤端螺旋體病的通用型三價(jià)基因重組疫苗的金地鼠保護(hù)試驗(yàn)及血 清特異性抗體檢測(cè)包含以下的步驟1)問(wèn)號(hào)鉤端螺旋體黃疸出血群賴(lài)型賴(lài)株、流感傷寒群 臨型臨6株、波摩那群波摩那型羅株對(duì)金地鼠(8 9周齡，120 150g體重)100%最低致死 量的確定；2)預(yù)防鉤端螺旋體病的通用型三價(jià)基因重組疫苗(rLipL32/l-LipL21-0mpLl/2 與氫氧化鋁混合物)對(duì)金地鼠的免疫保護(hù)作用，即了解該疫苗免疫金地鼠對(duì)抗上述三種問(wèn) 號(hào)鉤端螺旋體2倍100%最低致死量攻擊后的存活率；3)攻擊后存活的金地鼠血清抗體效 價(jià)測(cè)定。本實(shí)施例中的問(wèn)號(hào)鉤端螺旋體黃疸出血群賴(lài)型賴(lài)株、流感傷寒群臨型臨6株、波 摩那群波摩那型羅株分別可從北京中國(guó)藥品生物制品檢定所及其它我國(guó)法定菌種保藏單 位購(gòu)得；實(shí)施例中所用的金地鼠可從多個(gè)國(guó)內(nèi)大學(xué)、中國(guó)科學(xué)院、中國(guó)疾病預(yù)防控制中心、 各省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心等單位購(gòu)得，氫氧化鋁和牛血清白蛋白等材料國(guó)內(nèi)多家公司或國(guó)外公司 國(guó)內(nèi)代理商均可提供。在醫(yī)學(xué)微生物學(xué)、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)等技術(shù)領(lǐng)域的專(zhuān)業(yè)人員，均可重復(fù)本實(shí) 施例中的實(shí)驗(yàn)方法并進(jìn)行試用。上述不同血清群?jiǎn)柼?hào)鉤端螺旋體對(duì)金地鼠100%最低致死量的測(cè)定方法是1)問(wèn) 號(hào)鉤端螺旋體黃疸出血群賴(lài)型賴(lài)株、流感傷寒群臨型臨6株、波摩那群波摩那型羅株腹腔 內(nèi)接種金地鼠，感染2-3天后采集心血分離各群?jiǎn)柼?hào)鉤端螺旋體，在含8%兔血清的柯氏培 養(yǎng)液中增菌，以達(dá)到問(wèn)號(hào)鉤端螺旋體增強(qiáng)毒力的效果；2)新鮮培養(yǎng)的問(wèn)號(hào)鉤端螺旋體黃疸 出血群賴(lài)型賴(lài)株、流感傷寒群臨型臨6株、波摩那群波摩那型羅株15°C中12000轉(zhuǎn)/分離心 15分鐘，收集沉淀的問(wèn)號(hào)鉤端螺旋體，用滅菌生理鹽水懸浮，配制成不同濃度的問(wèn)號(hào)鉤端螺 旋體懸液；3)每只金地鼠分別腹腔注射不同濃度不同問(wèn)號(hào)鉤端螺旋體懸液1ml，共6只，常 規(guī)飼養(yǎng)條件下觀察7天；4)以觀察期限內(nèi)所有金地鼠均死亡的最低問(wèn)號(hào)鉤端螺旋體濃度為 該血清群?jiǎn)柼?hào)鉤端螺旋體100%最低致死劑量。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下問(wèn)號(hào)鉤端螺旋體黃疸 出血群賴(lài)型賴(lài)株、流感傷寒群臨型臨6株、波摩那群波摩那型羅株100%最低致死劑量分別 為 1. 5X IO8,3. OXlO9 ^P 1. 5X109。上述預(yù)防鉤端螺旋體病的通用型三價(jià)基因重組疫苗對(duì)金地鼠免疫保護(hù)作用的 測(cè)定方法是1)按1 10(w W)的比例，分別將rLipLSZ/l-LipI^l-OmpLl/^與氫氧化 鋁、牛血清白蛋白與氫氧化鋁混合后形成兩種混合物，一種混合物中含200yg/0. Iml的 rLipL32/l-LipL21-0mpLl/2 和 2mg/0. Iml 的氫氧化鋁，另一種混合物含 200 μ g/0. Iml 的 牛血清白蛋白和2mg/0. Iml的氫氧化鋁；3)將金地鼠分成1_6組，每組12只，第1 3組 于一側(cè)腹股溝皮下注射rLipLSZ/l-LipI^l-OmpLl/^與氫氧化鋁混合物0. 1ml，第4 6組 于一側(cè)腹股溝皮下注射牛血清白蛋白與氫氧化鋁混合物0. Iml ；兩周后第1 3組、第4 6組在另一側(cè)腹股溝皮下注射與第一次成分、劑量完全相同的混合物；4)末次注射后第四 周，第1和第4組金地鼠腹腔注射2倍100%最低致死劑量的問(wèn)號(hào)鉤端螺旋體黃疸出血群賴(lài) 型賴(lài)株(3.0X108)懸液lml，第2組和第5組金地鼠腹腔注射2倍100%最低致死劑量的問(wèn)號(hào)鉤端螺旋體流感傷寒群臨型臨6株(6. OX 109)懸液1ml，第3組和第6組金地鼠腹腔 注射2倍100%最低致死劑量的問(wèn)號(hào)鉤端螺旋體波摩那群波摩那型羅株(3.0X109/ml)懸 液1ml ；5)上述金地鼠常規(guī)飼養(yǎng)條件下觀察7天，記錄各組死亡情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。表1鉤端螺旋體病通用型三價(jià)基因重組疫苗金地鼠免疫保護(hù)試驗(yàn)結(jié)果 上述預(yù)防鉤端螺旋體病的通用型三價(jià)基因重組疫苗免疫金地鼠經(jīng)問(wèn)號(hào)鉤端螺旋 體黃疸出血群賴(lài)型賴(lài)株、流感傷寒群臨型臨6株、波摩那群波摩那型羅株1/2倍的100% 最低致死劑量攻擊后存活者的血清抗體效價(jià)測(cè)定方法是1)按1 10(W W)的比例，分 別將rLipL32/l-LipL21-0mpLl/2與氫氧化鋁形成混合物，該混合物中含200 y g/0. lml的 rLipL32/l-LipL21-0mpLl/2和2mg/0. lml的氫氧化鋁；2)將金地鼠分成3組，每組12只， 各組于一側(cè)腹股溝皮下注射rLipL32/l-LipL21-0mpLl/2與氫氧化鋁混合物0. 1ml，兩周后 另一側(cè)腹股溝皮下注射與第一次成分、劑量完全相同的混合物；3)末次注射后第四周，第 1組金地鼠腹腔注射1/2倍的100%最低致死劑量的問(wèn)號(hào)鉤端螺旋體黃疸出血群賴(lài)型賴(lài)株 (0. 75X 108)懸液1ml，第2組金地鼠腹腔注射1/2倍的100%最低致死劑量的問(wèn)號(hào)鉤端螺 旋體流感傷寒群臨型臨6株(1.5X109)懸液lml，第3組金地鼠腹腔注射1/2倍的100%最 低致死劑量的問(wèn)號(hào)鉤端螺旋體波摩那群波摩那型羅株(0. 75X 109/ml)懸液lml ；4)上述金 地鼠常規(guī)飼養(yǎng)條件下觀察7天，第8天采集各存活金地鼠心血2ml、分離血清；5)采用顯微 鏡凝集試驗(yàn)檢測(cè)血清中特異性凝集抗體，先將各血清用生理鹽水進(jìn)行對(duì)倍稀釋(1 50 1 1600)，取0. lml各稀釋血清與0. lml我國(guó)15群15型問(wèn)號(hào)鉤端螺旋體參考標(biāo)準(zhǔn)株新鮮 培養(yǎng)物混合，37°C震蕩孵育1小時(shí)，然后在400倍暗視野顯微鏡下觀察問(wèn)號(hào)鉤端螺旋體凝集 情況，以引起50%問(wèn)號(hào)鉤端螺旋體凝集的血清最高稀釋度為效價(jià)判斷標(biāo)準(zhǔn)。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果 見(jiàn)表2。表2問(wèn)號(hào)鉤端螺旋體通用型三價(jià)基因重組疫苗免疫金地鼠顯微鏡凝集試驗(yàn)結(jié)果
權(quán)利要求
預(yù)防不同血清群?jiǎn)柼?hào)鉤端螺旋體感染的通用型三價(jià)基因重組疫苗，其特征在于所述融合基因lipL32/1-lipL21-ompL1/2的核苷酸序列和氨基酸序列如SEQ ID NO5所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的預(yù)防不同血清群?jiǎn)柼?hào)鉤端螺旋體感染的通用型三價(jià)基因重 組疫苗，其特征在于所述融合基因lipLSZ/l-lipI^l-ompLl/^的柔性肽序列如SEQ ID NO 4所示。
3.預(yù)防不同血清群?jiǎn)柼?hào)鉤端螺旋體感染的通用型三價(jià)基因重組疫苗的制備方法，以問(wèn) 號(hào)鉤端螺旋體外膜脂蛋白LipL32/l、LipL21和穿膜蛋白OmpLlA為抗原，采用基因工程技 術(shù)構(gòu)建lipL32/l、lipL21和ompLl/^的人工融合基因lipLSZ/l-lipI^l-ompLl/^及其原核 表達(dá)系統(tǒng)，采用提純的同時(shí)含三種不同蛋白分子重組表達(dá)產(chǎn)物rLipLSZ/l-LipI^l-OmpLl/^ 為抗原的問(wèn)號(hào)鉤端螺旋體基因工程疫苗。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的預(yù)防不同血清群?jiǎn)柼?hào)鉤端螺旋體感染的通用型三價(jià)基因重 組疫苗的制備方法，包含以下的步驟1)問(wèn)號(hào)鉤端螺旋體lipL32/l、lipL21和ompLlA基 因的克隆和測(cè)序；2) lipL32/l-lipL21-ompLl/2人工融合基因及其原核表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建和測(cè) 序；3)含IPTG的LB培養(yǎng)基中誘導(dǎo)三價(jià)重組蛋白抗原分子rLipL32/l-LipL21-0mpLl/2表 達(dá)，SDS-PAGE和BioRad凝膠圖象分析系統(tǒng)確定表達(dá)情況和產(chǎn)量；4) Ni-NTA親和層析法提 純 rLipL32/l-LipL21-0mpLl/2 ；5) rLipL32/l-LipL21-0mpLl/2 與氫氧化鋁(alum)混合后 組成可注射疫苗劑型。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的預(yù)防不同血清群?jiǎn)柼?hào)鉤端螺旋體感染的通用型三價(jià)基因重 組疫苗的方法，其特征在于所說(shuō)的融合基因rLipL32/l-LipL21-0mpLl/2與氫氧化鋁混合 液直接制備成注射液。
6.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的預(yù)防不同血清群?jiǎn)柼?hào)鉤端螺旋體感染的通用型三價(jià)基 因重組疫苗的方法，其特征在于問(wèn)號(hào)鉤端螺旋體lipL32/l、lipL21和ompLlA基因的克隆 方法是1)取用問(wèn)號(hào)鉤端螺旋體黃疸出血群賴(lài)型賴(lài)株，將其接種、培養(yǎng)后離心收集問(wèn)號(hào)鉤 端螺旋體沉淀；2)分別取離心沉淀的問(wèn)號(hào)鉤端螺旋體，用苯酚、-氯仿、提取、乙酸鈉和無(wú) 水乙醇沉淀獲得基因組DNA ；3)以問(wèn)號(hào)鉤端螺旋體基因組DNA為模板，采用PCR分別擴(kuò)增 lipL32/l、lipL21和ompLlA基因，各上下游引物序列中均分別設(shè)置限制性核酸內(nèi)切酶位 點(diǎn)Nde I和XhoI ；4) PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳后，在紫外線下觀察目的DNA擴(kuò)增條帶；5)采用PCR產(chǎn) 物純化試劑盒，先提取目的DNA擴(kuò)增條帶；然后采用T-A克隆試劑盒，用T4 DNA連接酶將 提純的DNA條帶與克隆質(zhì)粒如pUC-M-T連接；6)取用大腸桿菌DH5a株，將其接種、培養(yǎng)， 然后收集細(xì)菌沉淀，制備成感受態(tài)E. coli DH5a懸液；7)在上述感受態(tài)Ε. coli DH5 α懸 液中加入上述連接產(chǎn)物，加入SOC培養(yǎng)液培養(yǎng)；8)在LB瓊脂平板上涂布接種上述SOC培養(yǎng) 物；9)選取SOC培養(yǎng)物上的白色菌落在含LB培養(yǎng)液中培養(yǎng)，采用細(xì)菌質(zhì)粒提取試劑盒進(jìn)行 質(zhì)粒提取，提取的質(zhì)粒進(jìn)行Nde I和XhoI酶切、電泳分離，在紫外線下分別確認(rèn)有目的DNA 片段lipL32/l、lipL21或ompLl/2后，測(cè)定克隆片段的核苷酸序列，序列正確者即為重組質(zhì) 粒 pUC-M-TlipL:W1、pUC-M-TlipL21 或 pUC-M-T。mpW2。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的預(yù)防不同血清群?jiǎn)柼?hào)鉤端螺旋體感染的通用型三價(jià)基因 重組疫苗的方法，其特征在于上述人工融合基因lipL32/l-lipL21-ompLl/2的制備方法 是1)上述含有重組質(zhì)粒 pUC-M-TlipL32\ pUC-M-TlipL21 或 pUC-M-T。mpW2 的 Ε. coli DH5 α 分 別在LB培養(yǎng)液中培養(yǎng)后，采用細(xì)菌質(zhì)粒提取試劑盒，分別提取Ε. coli DH5a中的重組質(zhì)粒PUC-M-Tlipcwi、pUC-M-Tlipm或pUC-M-T°mpW2 ；2)根據(jù)柔性肽核苷酸序列，設(shè)計(jì)分別擴(kuò)增lipL32/l、lipL21或ompLl/2基因片段的引物，其中l(wèi)ipL32/l、lipL21基因下游引物含柔性 肽正鏈序列，lipL21、ompLl/2基因上游引物含柔性肽負(fù)鏈序列，lipL32/l基因上游引物不 含柔性肽序列但設(shè)置限制性核酸內(nèi)切酶Nde I位點(diǎn)，ompLl/2基因下游引物不含柔性肽序 列但設(shè)置限制性核酸內(nèi)切酶XhoI位點(diǎn)，然后分別以重組質(zhì)粒pUC-M-TlipL32A、pUC-M-TlipL21或 pUC-M-TompL1/2為模板，采用PCR擴(kuò)增出帶有柔性肽序列的lipL32/l、lipL21和ompLl/2基 因片段；3)各PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳分離后，在紫外線下確認(rèn)分別有l(wèi)ipL32/l、lipL21或ompLl/2 基因擴(kuò)增片段后，采用PCR產(chǎn)物純化試劑盒，提純各目的擴(kuò)增片段后測(cè)定各提取物DNA濃 度；4)將提純的lipL32/l基因擴(kuò)增片段和提純的lipL21基因擴(kuò)增片段混合，加入除引物 外的其它PCR試劑進(jìn)行反應(yīng)，利用柔性肽正、負(fù)鏈互補(bǔ)性形成lipL32/l-lipL21復(fù)合模板， 然后加入lipL32/l基因上游引物及l(fā)ipL21基因下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增；按上述方法進(jìn)行 PCR產(chǎn)物電泳分離、紫外線下觀察、提純lipL32/l-lipL21擴(kuò)增片段、測(cè)定提取物DNA濃度； 5)將提純的lipL32/l-lipL21擴(kuò)增片段與提純的ompLlA基因擴(kuò)增片段混合，加入除引物 外的其它PCR試劑進(jìn)行反應(yīng)，利用柔性肽正、負(fù)鏈互補(bǔ)性形成lipL32/l-lipL21-ompLl/2復(fù) 合模板，然后加入lipL32/l基因上游引物及ompLl/2基因下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，按上述 方法進(jìn)行PCR產(chǎn)物電泳分離、紫外線下觀察、提純lipL32/l-lipL21-ompLl/2擴(kuò)增片段；6) 采用T-A克隆試劑盒，用T4DNA連接酶將提純的lipLSZ/l-lipI^l-ompLl/^片段與重組質(zhì) 粒連接，獲得連接產(chǎn)物；6)E. coli DH5a接種于LB培養(yǎng)液中培養(yǎng)，離心收集細(xì)菌沉淀，制備 成感受態(tài)E. coli DH5a懸液；7)在上述感受態(tài)E. coli DH5 α懸液中加入上述連接產(chǎn)物，混 勻后加入SOC培養(yǎng)液培養(yǎng)；8)在LB瓊脂平板上分別用X-gal溶液、IPTG均勻涂布，然后涂 布接種上述SOC培養(yǎng)物培養(yǎng)、觀察；9)選取SOC培養(yǎng)物上的白色菌落在LB培養(yǎng)液中培養(yǎng)， 采用細(xì)菌質(zhì)粒提取試劑盒進(jìn)行質(zhì)粒提取，提取的質(zhì)粒按上述方法進(jìn)行Nde I和XhoI酶切、 電泳分離，在紫外線下分別確認(rèn)有目的DNA片段lipLSZ/l-lipI^l-ompLl/^后，測(cè)定克隆片 段的核苷酸序列；序列正確者即為含人工融合基因lipLSZ/l-lipI^l-ompLl/^片段的重組 質(zhì)粒 pUC-M-TlipL32/l-lipL2l-ompLl/2。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的預(yù)防不同血清群?jiǎn)柼?hào)鉤端螺旋體感染的通用型三價(jià)基因重 組疫苗的方法，其特征在于上述原核表達(dá)系統(tǒng)E. coliBL21DE3pET42a-lipL32/1-lipL21-°mpL1/2的制備 方法是1)含有重組質(zhì)粒PUC-M-TlipL32/1-lipL21-°mpW2的E.coli DH5a在LB培養(yǎng)液中培養(yǎng) 后，采用細(xì)菌質(zhì)粒提取試劑盒，提取E. coli DH5 α中的重組質(zhì)粒ρυ^—τ —^Ρ.?！/2 . 2)提取的質(zhì)粒用限制性核酸內(nèi)切酶Nde I和XhoI酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)電泳分離后，在紫外 線下確認(rèn)有目的DNA片段lipL32/l-lipL21-ompLl/2后，采用DNA膠回收試劑盒，切膠回 收l(shuí)ipL32/l-lipL21-ompLl/2片段；3)原核表達(dá)載體pET42a用限制性核酸內(nèi)切酶Nde I 和XhoI酶切，酶切產(chǎn)物用電泳分離線性化的pET42a，采用DNA膠回收試劑盒，回收線性 化pET42a片段；4)根據(jù)lipL32/l-lipL21-ompLl/2與線性化pET42a片段估計(jì)濃度，然后 lipL32/l-lipL21-ompLl/2與線性化pET42a片段按3 1的比例混合，加入T4 DNA連接 酶連接，獲得連接產(chǎn)物；5)取用大腸桿菌BL21DE3株，接種于LB培養(yǎng)液中培養(yǎng)，離心收集細(xì) 菌沉淀，制備成感受態(tài)E. coli BL21DE3懸液；6)在上述感受態(tài)懸液中加入上述連接產(chǎn)物， 再加入SOC培養(yǎng)液培養(yǎng)；7)在LB瓊脂平板上涂布接種上述SOC培養(yǎng)物培養(yǎng)；8)挑取SOC 培養(yǎng)物上的菌落在LB培養(yǎng)液中培養(yǎng)4-6，采用細(xì)菌質(zhì)粒提取試劑盒進(jìn)行質(zhì)粒提取，提取的質(zhì)粒按上述方法進(jìn)行Nde I和XhoI酶切、電泳分離后，在紫外線下確認(rèn)有目的DNA片段 lipLSZ/l-lipI^l-ompLl/^，測(cè)定目的片段的核苷酸序列，序列正確者即為目的原核表達(dá)系 統(tǒng) E. coliBL21DE3pET42a-lipL32-lipL2卜卿L1。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的預(yù)防不同血清群?jiǎn)柼?hào)鉤端螺旋體感染的通用型三價(jià)基因重 組疫苗的方法，其特征在于上述重組表達(dá)產(chǎn)物rLipL32-LipL21-0mpLl的表達(dá)和提純方法 是1)在LB液體培養(yǎng)液中接種E. coliBL21DE3pET42a"lipL32"lipL21"ompL1培養(yǎng)，加入IPTG繼續(xù)培 養(yǎng)；2)上述培養(yǎng)物離心、收集細(xì)菌沉淀用超聲破碎，采用M-NTA親和層析柱，將破碎產(chǎn)物過(guò) Ni-NTA柱，利用重組表達(dá)產(chǎn)物rLipL32/l-LipL21-0mpLl/2羧基端8 X His標(biāo)簽進(jìn)行分離、洗 脫、收集目的重組表達(dá)產(chǎn)物rLipLSZ/l-LipI^l-OmpLl/^。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用于預(yù)防鉤端螺旋體病的三價(jià)基因重組疫苗及其制備方法。目的是提供的疫苗及其制備方法能夠有效預(yù)防不同血清群?jiǎn)柼?hào)鉤端螺旋體感染且制造成本較低。技術(shù)方案是本發(fā)明提供的預(yù)防不同血清群?jiǎn)柼?hào)鉤端螺旋體感染的通用型三價(jià)基因重組疫苗，是從黃疸出血群賴(lài)型賴(lài)株問(wèn)號(hào)鉤端螺旋體基因組中克隆了lipL32/1、lipL21和ompL1/2三個(gè)基因，通過(guò)基因工程技術(shù)制備的融合基因lipL32/1-lipL21-ompL1/2具有序列5所示的核苷酸序列和氨基酸序列，lipL32/1與lipL21、lipL21與ompL1/2基因之間用序列4所示的相同的兩條柔性肽連接。
文檔編號(hào)C07K19/00GK101874898SQ20101020646
公開(kāi)日2010年11月3日 申請(qǐng)日期2010年6月21日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月21日
發(fā)明者嚴(yán)杰 申請(qǐng)人:嚴(yán)杰