專利名稱：一組與人乳腺癌組織高特異性和高親和力的核酸適配子及其制備方法與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及到利用分子生物學(xué)技術(shù)中的 SELEX技術(shù)(即系統(tǒng)進(jìn)化指數(shù)富集技術(shù))制備一組與人乳腺癌組織高特異 性和高親和力的核酸適配子，以及所述核酸適配子衍生的序列和修飾序列 用于乳腺癌的診斷和靶向治療。(二) 背景技術(shù)-乳腺癌是全球女性發(fā)病率最高的惡性腫瘤，據(jù)權(quán)威醫(yī)學(xué)資料統(tǒng)計，全 球每B分鐘就有一人死于乳腺癌，乳腺癌已經(jīng)成為嚴(yán)重威脅女性健康的重 要疾病。隨著國民經(jīng)濟(jì)發(fā)展和人民生活水平提高，我國乳腺癌的發(fā)病率和 死亡率亦呈迅猛上升態(tài)勢。中國抗癌協(xié)會的最新統(tǒng)計數(shù)字顯示，中國婦女 乳腺癌死亡率正在以每年3%的速度增長，成為城市中死亡率上升最快的癌 癥；乳腺癌在我國的發(fā)病率趨于年輕化；85%的患者到醫(yī)院檢査時己處于 乳腺癌的中晚期，早期發(fā)現(xiàn)率極低。更加值得注意的是，乳腺癌可通過直 接浸潤、淋巴、血液等途徑轉(zhuǎn)移，其常見的轉(zhuǎn)移部位依次為肺及胸膜、骨 骼、皮膚軟組織、肝、腦，好發(fā)血行轉(zhuǎn)移是乳腺癌突出的生物學(xué)特征，這 是本病治療失敗的主要原因所在，也是乳腺癌防治上一個非常棘手的難題， 造成數(shù)百億人民幣的社會負(fù)擔(dān)。鑒于以上情況，衛(wèi)生部疾控司在全國范圍 內(nèi)開展"百萬婦女乳腺普查工程"，科學(xué)規(guī)范的乳腺篩査方案為其主要目 的之一，以最終實現(xiàn)對婦女乳腺癌的早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷和早期治療，提 高患者生活質(zhì)量；因此乳腺癌診治方法的研究對我國有著特殊而重要的社 會意義，同時也形成了相關(guān)醫(yī)藥產(chǎn)品的巨大市場，蘊藏著不可估量的經(jīng)濟(jì) 效益。SELEX技術(shù)(即系統(tǒng)進(jìn)化指數(shù)富集技術(shù))是20世紀(jì)90年代初研制/ 發(fā)展起來的一種新的組合化學(xué)技術(shù)，其運用大容量的隨機寡核苷酸文庫， 結(jié)合體外PCR擴增技術(shù)，以指數(shù)富集與靶分子特異結(jié)合的寡核苷酸，經(jīng)過 多輪篩選，獲得親和力高、特異性強的核苷酸適配子(aptamers )。該技 術(shù)己成功運用于許多靶分子的篩選，包括金屬離子、有機染料、藥物、蛋 白質(zhì)、氨基酸以及各種細(xì)胞因子等。這種方法具有簡便、快速、經(jīng)濟(jì)等特 點，與其他組合化學(xué)庫如隨機膚/肽庫、抗體庫和噬菌體表面展示文庫相比，從寡核苷酸文庫中篩選出的適配子具許多優(yōu)勢a.本身是寡核苷酸，分子量較小，可以化學(xué)合成，節(jié)約成本。b.具有比抗體更高的親和性和特異性。c.便于標(biāo)記，可以在不同部位有選擇性的標(biāo)記。d.重復(fù)性好，穩(wěn)定性好，易于保存，對高溫和劇烈條件不敏感。因此，寡核苷酸適配子/SELEX技術(shù) 具有良好的應(yīng)用前景，特別是在抗體工程領(lǐng)域。消減SELEX技術(shù)是識別癌 與非癌細(xì)胞間微小差異、篩選癌細(xì)胞特異性親和適配子的有力工具。研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌細(xì)胞和正常乳腺細(xì)胞有著不同的形態(tài)和結(jié)構(gòu)，造成 腫瘤細(xì)胞特征性形貌的分子基礎(chǔ)可能是腫瘤細(xì)胞表面的特異分子、受體等， 也可能是癌組織特異標(biāo)志物，或同一蛋白分子的不同修飾狀態(tài)或構(gòu)象結(jié)構(gòu)， 這些特征不會因腫瘤的轉(zhuǎn)移而丟失。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一組與人乳腺癌組織高特異性和高親和力的核酸適配子及其制備方法與應(yīng)用，它利用分子生物學(xué)技術(shù)中的SELEX技術(shù) (即系統(tǒng)進(jìn)化指數(shù)富集技術(shù))采用消減-復(fù)合靶SELEX技術(shù)對乳腺癌組織和 正常乳腺組織進(jìn)行篩選，獲得與乳腺癌細(xì)胞有特異親和能力的核酸適配子， 并通過對其核酸適配子特異耙標(biāo)(腫瘤特異)的鑒定，發(fā)現(xiàn)腫瘤治療新的 藥物作用耙點，由此可以構(gòu)建乳腺癌特異的耙向藥物和早期診斷試劑。本發(fā)明的技術(shù)方案 一組與人乳腺癌組織高特異性和高親和力的核酸 適配子，其特征在于其核苷酸序列選自參 ATCCGCCTGATTAGCGATACTGCAAAATACGCTGCTCTACTGGCTATCACTCTCGGACTTGAGCAAAATCACCTGCAGGGG 參 ATCCGCCTGATTAGCGATACTTCCCCCAGGCTATTTCCAACTAGCAGCAAGGATAAACTTGAGCAAAATCACCTGCAGGGG 參 ATCCGCCTGATTAGCGATACTGCCTCCCAACCTATTCGCATTGCCCGACGTCAGCTACTTGAGCAAAATCACCTGCAGGGG 爭 ATCCGCCTGATTAGCGATACTGACTCCCTCCATCTTCCCGGCTACACTGGTCAGGGACTTGAGCAAAATCACCTGCAGGGG 攀 ATCCGCCTGATTAGCGATACTCATTCCACATGTTCTACACCCTAGCCCCGTAGACAACTTGAGCAAAATCACCTGCAGGGG ATCCGCCTGATTAGCGATACTTCCCATCACCGCGTCAGACAAAGACCCACAACACCACTTGAGCAAAATCACCTGCAGGGG 肇 ATCCGCCTGATTAGCGATACTACCCCCTATCACCTCAGTAAATGGGCAGTGTCCGAACTTGAGCAAAATCACCTGCAGGGG ATCCGCCTGATTAGCGATACTTGCGCCCCCCTCTTTAAAGTCTCTCTACTGACCTGACTTGAGCAAAATCACCTGCAGGGG ATCCGCCTGATTAGCGATACTGGCCAGTACGTAACCTCGTCACTCTCCTTCGCCTC ACTTGAGCAAAATCACCTGCAGGGGACTTGAGCAAAATCACCTGCAGGGG ATCCGCCTGATTAGCGATACTCCACGCACCCTACGCAAAGACCGTTACCACGCCGAACTTGAGCAAAATCACCTGCAGGGG 參 ATCCGCCTGATTAGCGATACTCCCTCCCAACTGCCCCACGATACCCTCGATTAAGCACTTGAGCAAAATCACCTGCAGGGG上述所說的核酸適配子，包括DNA序列和RNA序列，其序列的結(jié)構(gòu) 形式是下面12種二級結(jié)構(gòu)之一。<formula>formula see original document page 9</formula>
上述所說的核酸適配子具有至少60%以上同源序列，且是具有相同功 能的核酸適配子。上述所說的核酸適配子，刪除部分或增加部分核酸適配子殘基，得到的具有相同功能的核酸適配子序列。上述所說的核酸適配子，進(jìn)行堿基取代或部分修飾后，得到具有相同功能的核酸適配子序列。上述所說的核酸適配子有相應(yīng)的衍生的核酸適配子序列。 上述所說的核酸適配子有相應(yīng)的能與其序列進(jìn)行雜交的核酸序列。 上述所說的核酸適配子通過對其核酸適配子腫瘤特異耙標(biāo)的鑒定，發(fā)現(xiàn)腫瘤治療新的藥物作用靶點，由此構(gòu)建乳腺癌特異的耙向藥物和早期診斷試劑。本發(fā)明中用于SELEX (即系統(tǒng)進(jìn)化指數(shù)富集)篩選的單鏈DNA隨機 文庫及引物由invitrogen公司合成，兩端為固定序列，中間為35個堿基的 隨機序列5'-ATCCGCCTGATTAGCGATACT- ( N35)-ACTTGAGCAAAATCACCTGCAGGGG-3'，庫容量為1015，引物 l:5'-ATCCGCCTGATTAGCGATACT—3'，引物2:5'-biotin-CCCCTGCAGGTGATTTTGCTCAAGT-3'，弓l物3: 5'-biotin-ATC CGCCTGATTAGCGATACT-3'，引物4:5'-CCCCTGCAGGTGATTTTGCTCAAGT-3'。人乳腺癌組織來源于醫(yī)院確 診乳腺癌病人病人病理組織切片，核酸適配子的純化試劑購于寶生物公司， PCR試劑盒、鏈霉親和素磁珠與pGEM -T載體購于Promega公司。一組與人乳腺癌組織高特異性和高親和力的核酸適配子的制備方法， 它是篩選和鑒定核酸適配子的技術(shù)路線，包括以下步驟
(1) ssDNA隨機核酸文庫的制備——利用消減SELEX方法進(jìn)行篩選；(2) 擴增與人乳腺癌組織特異結(jié)合的核酸適配子——進(jìn)行下一輪篩選；(3) 不少于12輪篩選后獲得目的核酸適配子序列；(4) 克隆測序；(5) 與人乳腺癌組織的特異結(jié)合活性檢測。 本發(fā)明的優(yōu)越性在于1、本發(fā)明采用的技術(shù)可以高通量的篩選與人乳腺癌組織高特異性和高親和力的一組核酸適配子；2、核酸適配子具有比抗 體不可比擬的優(yōu)勢，如體外篩選、合成，易于標(biāo)記、穩(wěn)定性高等優(yōu)點；3、 所獲得的針對人乳腺癌組織的核酸適配子通過對其核酸適配子腫瘤特異靶 標(biāo)的鑒定，可以發(fā)現(xiàn)腫瘤治療新的藥物作用靶點，由此用于人乳腺癌的靶 向治療的乳腺癌特異靶向藥物和人乳腺癌臨床診斷的早期診斷試劑。(四)


附圖1為本發(fā)明所涉一組與人乳腺癌組織高特異性和高親和力的核酸適配子及其制備方法與應(yīng)用中的核酸適配子T載體陽性克隆的質(zhì)粒瓊脂糖 凝膠電泳圖(如圖所示在分子量3000bp左右有明顯的質(zhì)粒條帶，而且 以超螺旋為主)。附圖2為本發(fā)明所涉一組與人乳腺癌組織高特異性和高親和力的核酸 適配子及其制備方法與應(yīng)用中的質(zhì)粒PCR鑒定的瓊脂糖凝膠電泳圖(我們 的目標(biāo)條帶的分子量大小為81bp，如圖所示有分子量為81bp的目標(biāo)條帶， 將有目標(biāo)條帶的陽性克隆進(jìn)行測序)。附圖3為本發(fā)明所涉一組與人乳腺癌組織高特異性和高親和力的核酸 適配子及其制備方法與應(yīng)用中的核酸適配子的特異性鑒定結(jié)果(如圖所示-空白對照的病理切片上沒有棕黃色顆粒的出現(xiàn)，而乳腺癌組織切片上的乳 腺癌變部位顯示明顯的棕黃色顆粒，表明我們篩選得到的DNA適配子與人 乳腺癌組織有特異反應(yīng))。附圖4為本發(fā)明所涉一組與人乳腺癌組織高特異性和高親和力的核酸 適配子及其制備方法與應(yīng)用中的獲得的一個核酸適配子的檢測乳腺癌的結(jié) 果(如圖所示空白對照組無明顯棕黃色沉淀，而乳腺癌組織顯示明顯的 棕黃色沉淀，表明篩選得到的核酸適配子能與乳腺癌組織特異結(jié)合，從而 在臨床上可用于乳腺癌的檢測和診斷。(五)
具體實施例方式實施例l:體外篩選與人乳腺癌特異結(jié)合的核酸適配子 利用引物l、引物2擴增單鏈DNA文庫引物1和引物2的濃度為 lOOpmol，擴增條件為94。C預(yù)變性3min，然后94'C變性40s， 65。C退火 lmin, 72。C延伸2min，循環(huán)30次，最后72。C延伸7min。將擴增5，端帶有 生物素標(biāo)記的dsDNA產(chǎn)物與鏈酶親和素磁珠結(jié)合，室溫30min，然后用 0.15mol/L的NaOH作用15min使dsDNA變性解鏈，磁分離得到ssDNA， 將ssDNA于95t:作用5min，于冰中2min，室溫放置10min,既為ssDNA 文庫。病理切片常規(guī)脫蠟至水，將制備ssDNA文庫與正常乳腺組織反篩 后，與人乳腺癌組織孵育。用洗脫緩沖液(20mmol/L Tris—HCl， 4mol/L 異硫氰酸呱，lmmol/LDTT)將ssDNA從人乳腺癌組織上洗脫下來，用作 擴增的模板，進(jìn)行下一輪篩選。共進(jìn)行12輪篩選以便得到預(yù)期具有高親 和力的寡聚核苷酸。以第12輪篩選所得文庫為模板，以引物1和引物4進(jìn)行PCR，瓊脂糖 電泳后回收81bp處片斷，與T載體4"C連接過夜，轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細(xì)胞， 涂板(Amp+， IPTG誘導(dǎo)，X—gal為底物)，37'C培養(yǎng)16h后，挑取單克 隆白斑，置Amp+液體培養(yǎng)基搖菌過夜，提取質(zhì)粒，如圖l所示質(zhì)粒電泳 圖。以質(zhì)粒為模板，以引物l，引物4擴增，如圖2所示在81bp左右處有 擴增出的目標(biāo)條帶，將有目的條帶的陽性克隆進(jìn)行序列測定。以第12輪篩選所得文庫為模板，以引物3和引物4進(jìn)行不對稱PCR, 反應(yīng)產(chǎn)物主要為5'生物素標(biāo)記的DNA適配子于95'C作用5min,于冰中 2min，室溫放置10min，人乳腺癌病理切片常規(guī)脫蠟至水，3%&02作用20min 封閉內(nèi)源性過氧化物酶，PBS洗5min，與制備好DNA適配子室溫孵育lh， PBS洗3X5min。切片與辣根過氧化物酶標(biāo)記的親和素孵育30min， DAB顯 色，鏡下觀察并照相，如圖3所示空白對照的病理切片上沒有棕黃色顆 粒的出現(xiàn)，而乳腺癌組織切片上的乳腺癌變部位顯示明顯的棕黃色顆粒。實施例2:體外篩選與人乳腺癌特異結(jié)合的核酸適配子利用引物l、引物2擴增單鏈DNA文庫采用不對稱PCR，引物l/引 物2濃度比100: 1，擴增條件為94T:預(yù)變性3min，然后94'C變性30s， 65。C退火45s，循環(huán)35次，72。C延伸lmin，最后72。C延伸7min。將獲得 的產(chǎn)物主要為ssDNA，于95。C作用3min，于冰中2min,室溫放置10min， 既為ssDNA文庫。乳腺癌病理切片常規(guī)脫蠟至水，將制備ssDNA文庫與正 常乳腺組織反篩后，與人乳腺癌組織孵育。用洗脫緩沖液(20mmol/L Tris—HC1， 4mol/L異硫氰酸呱，l咖ol/L DTT)將ssDNA從人乳腺癌組織 上洗脫下來，用作擴增的模板，進(jìn)行下一輪篩選。共進(jìn)行12輪篩選以便
得到預(yù)期具有高親和力的寡聚核苷酸。以第12輪篩選所得文庫為模板，以引物1和引物4進(jìn)行PCR， 3%瓊脂 糖凝膠電泳后回收81bp處目的片斷，與T載體4'C連接過夜，轉(zhuǎn)化DH5a 感受態(tài)細(xì)胞，涂板(A卿+， IPTG誘導(dǎo)，X—gal為底物)，37。C培養(yǎng)18h后， 挑取單克隆白斑，置Amp+液體培養(yǎng)基搖菌16h,提取質(zhì)粒以質(zhì)粒為模板， 以引物l,引物4擴增，在81bp左右處有擴增出的目標(biāo)條帶，將有目的條 帶的陽性克隆進(jìn)行序列測定。以第12輪篩選所得文庫為模板，以引物3和引物4進(jìn)行不對稱PCR， 引物3/引物4濃度比100: 1反應(yīng)產(chǎn)物主要為5'生物素標(biāo)記的DNA適配 子于95TM乍用5min，于冰中2min，室溫放置10min備用。人乳腺癌病理 切片常規(guī)脫蠟至水，設(shè)立空白對照組，0.3%H202-甲醇溶液作用20min封閉 內(nèi)源性過氧化物酶，TBS洗5min，與制備好DNA適配子室溫孵育lh， TBS 洗3X5min。切片與辣根過氧化物酶標(biāo)記的親和素孵育30min， DAB顯色， 鏡下觀察，空白對照組無明顯棕黃色沉淀，而乳腺癌組織顯示明顯的棕黃色 沉淀，表明篩選到的核酸適配子與乳腺癌組織特異結(jié)合。實施例3:篩選的核酸適配子用于乳腺癌的檢測以篩選的所測序列為ATCCGCCTGATTAGCGATACTGACTCCCTCCATCTTCCCG GCTACACTGGTCAGGGACTTGAGCMAATCACCTGCAGGGG陽性克隆質(zhì)粒為模板，以 引物3和引物4進(jìn)行不對稱PCR，引物3 (lOOpmol) /引物4濃度比200: 1,擴增條件為94-C預(yù)變性3min，然后94。C變性30s, 65。C退火45 s， 72'C延伸lniin，循環(huán)35次，最后72。C延伸7min，。將獲得的產(chǎn)物主要為 biotin-ssDNA，于95。C作用3min,于冰中2min，室溫放置10min，作為檢 測試劑備用。人乳腺癌病理切片常規(guī)脫蠟至水，設(shè)立空白對照組，0. 3%H202-甲醇溶液作用30min封閉內(nèi)源性過氧化物酶，TBS洗5min，與制備好DNA適 配子室溫孵育lh， TBS洗3X5min。切片與辣根過氧化物酶標(biāo)記的親和素 (1: 1000稀釋)孵育30min, DAB顯色液(50mg溶于100ml TB液中，臨 用前加入1011130%}|202)中顯色5-10min，鏡下觀察控制顯色程度。如圖 4所示空白對照組無明顯棕黃色沉淀，而乳腺癌組織顯示明顯的棕黃色 沉淀，表明篩選得到的核酸適配子能與乳腺癌組織特異結(jié)合，從而在臨床 上可用于乳腺癌的檢測和診斷。
權(quán)利要求
1、一組與人乳腺癌組織高特異性和高親和力的核酸適配子，特征在于其核苷酸序列選自● ATCCGCCTGATTAGCGATACTGCAAAATACGCTGCTCTACTGGCTATCACTCTCGGACTTGAGCAAAATCACCTGCAGGGG● ATCCGCCTGATTAGCGATACTTCCCCCAGGCTATTTCCAACTAGCAGCAAGGATAAACTTGAGCAAAATCACCTGCAGGGG● ATCCGCCTGATTAGCGATACTGCCTCCCAACCTATTCGCATTGCCCGACGTCAGCTACTTGAGCAAAATCACCTGCAGGGG● ATCCGCCTGATTAGCGATACTGACTCCCTCCATCTTCCCGGCTACACTGGTCAGGGACTTGAGCAAAATCACCTGCAGGGG● ATCCGCCTGATTAGCGATACTCATTCCACATGTTCTACACCCTAGCCCCGTAGACAACTTGAGCAAAATCACCTGCAGGGG● ATCCGCCTGATTAGCGATACTTCCCATCACCGCGTCAGACAAAGACCCACAACACCACTTGAGCAAAATCACCTGCAGGGG● ATCCGCCTGATTAGCGATACTACCCCCTATCACCTCAGTAAATGGGCAGTGTCCGAACTTGAGCAAAATCACCTGCAGGGG● ATCCGCCTGATTAGCGATACTTGCGCCCCCCTCTTTAAAGTCTCTCTACTGACCTGACTTGAGCAAAATCACCTGCAGGGG● ATCCGCCTGATTAGCGATACTGGCCAGTACGTAACCTCGTCACTCTCCTTCGCCTCACTTGAGCAAAATCACCTGCAGGGG● ATCCGCCTGATTAGCGATACTAACCCCACAACGCCAGACCTCGAAGGGACAACCGAACTTGAGCAAAATCACCTGCAGGGG● ATCCGCCTGATTAGCGATACTCCACGCACCCTACGCAAAGACCGTTACCACGCCGAACTTGAGCAAAATCACCTGCAGGGG● ATCCGCCTGATTAGCGATACTCCCTCCCAACTGCCCCACGATACCCTCGATTAAGCACTTGAGCAAAATCACCTGCAGGGG
2、 根據(jù)權(quán)力要求1所述的一組與人乳腺癌組織高特異性和高親和力的 核酸適配子，其特征在于它包括DNA序列和RNA序列，其其序列的結(jié)構(gòu) 形式是下面12種二級結(jié)構(gòu)之一。 <formula>formula see original document page 3</formula>
3、 根據(jù)權(quán)力要求1所述的一組與人乳腺癌組織高特異性和高親和力的 核酸適配子，其特征在于所說的核酸適配子具有至少60%以上同源序列， 且是具有相同功能的核酸適配子。
4、 根據(jù)權(quán)力要求1所述的一組與人乳腺癌組織高特異性和高親和力的 核酸適配子，其特征在于所說的核酸適配子，刪除部分或增加部分核酸適 配子殘基，得到的具有相同功能的核酸適配子序列。
5、 根據(jù)權(quán)力要求1所述的一組與人乳腺癌組織高特異性和高親和力的核酸適配子，其特征在于所說的核酸適配子，進(jìn)行堿基取代或部分修飾后， 得到具有相同功能的核酸適配子序列。
6、 根據(jù)權(quán)力要求1所述的一組與人乳腺癌組織高特異性和高親和力的 核酸適配子，其特征在于所說的核酸適配子有相應(yīng)的衍生的核酸適配子序 列。
7、 根據(jù)權(quán)力要求1所述的一組與人乳腺癌組織高特異性和高親和力的 核酸適配子，其特征在于所說的核酸適配子有相應(yīng)的能與其序列進(jìn)行雜交 的核酸適配子序列。
8、 一組與人乳腺癌組織高特異性和高親和力的核酸適配子的應(yīng)用，其 特征在于所說的核酸適配子通過對其核酸適配子腫瘤特異耙標(biāo)的鑒定，發(fā) 現(xiàn)腫瘤治療新的藥物作用靶點，由此構(gòu)建乳腺癌特異的耙向藥物和早期診 斷試劑。
9、 一組與人乳腺癌組織高特異性和高親和力的核酸適配子的制備方 法，它是篩選和鑒定核酸適配子的技術(shù)路線，包括以下步驟(1) ssDNA隨機核酸適配子庫的制備——利用消減SELEX方法進(jìn)行篩選；(2) 擴增與人乳腺癌組織特異結(jié)合的核酸適配子——進(jìn)行下一輪篩選；(3) 不少于12輪篩選后獲得目的核酸適配子序列；(4) 克隆測序；(5) 與人乳腺癌組織的特異結(jié)合活性檢測。
全文摘要
本發(fā)明涉及一組與人乳腺癌組織高特異性和高親和力的核酸適配子及其制備方法與應(yīng)用，該核酸適配子包括DNA序列和RNA序列，它能與人乳腺癌組織特異性地結(jié)合。因此，本發(fā)明核酸適配子可以用來診斷人乳腺癌和用于人乳腺癌的靶向治療。本發(fā)明中的核酸適配子對人乳腺癌具有高的特異性、親和力，而對正常乳腺組織無反應(yīng)。本發(fā)明還涉及所述核酸適配子序列的衍生序列，包括修飾后的序列。
文檔編號C12N15/12GK101148666SQ200610015738
公開日2008年3月26日 申請日期2006年9月22日 優(yōu)先權(quán)日2006年9月22日
發(fā)明者吳淑慶, 弓景波 申請人:國家納米技術(shù)與工程研究院;清華大學(xué)