專利名稱：晚春含笑的組織培養(yǎng)繁殖方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物技術領域，具體地，涉及一種木蘭科植物晚春含笑的組織培養(yǎng)繁殖方法。
背景技術：
木蘭科(Magonliaceae)是古老的被子植物類群，該種群植物日趨減少瀕危。其中含笑屬(Michelia)植物有許多是重要的園林觀賞植物，并具有較高經濟價值，從該屬中分離出多種倍半萜內酯，有些具有抗癌活性；晚春含笑是以球花含笑(M.sphaerantha)為母本，云南含笑(M.yunnanensis)為父本，屬內種間雜交F1篩選培育出來的品種。樹形優(yōu)美、常綠、白色花有香味、灌木，是理想的庭園觀賞樹種；進行組織培養(yǎng)無性繁殖技術研究對保持它的雜交優(yōu)勢，新品種推廣具有現實應用價值。目前，木蘭科植物一般通過播種和嫁接來繁殖，扦插繁殖生根率低對母樹傷害大，組織培養(yǎng)技術難度較大，現有技術中未有晚春含笑組織培養(yǎng)快速繁殖的方法的報道。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于提供一種晚春含笑組織培養(yǎng)快速繁殖的方法，該方法取1-2年生晚春含笑幼齡樹莖段作外植體，用幼齡樹外植體建立起無菌系，增殖系數高，采用二步法生根使小苗健壯，繁殖過程暢通，生根效果好，移栽成活率可達到90％。
為了實現本發(fā)明的上述目的，本發(fā)明提供了如下的技術方案晚春含笑的組織培養(yǎng)繁殖方法，主要包括誘導分化培養(yǎng)、繼代增植培養(yǎng)、生根培養(yǎng)、移栽步驟，以MS+BA1mg/l+NAA0.2mg/l為誘導分化培養(yǎng)基，MS+BA0.8mg/l+NAA0.2mg/l為繼代增殖培養(yǎng)基，MS+NAA2mg/l為生根培養(yǎng)基進行二次生根。
上述方法中，誘導分化培養(yǎng)優(yōu)選晚春含笑1-2年生幼齡樹莖段為外植體，洗凈，灑精浸泡，轉入0.1％的HgCl2溶液中消毒8-10分鐘，再用無菌水沖洗4-5次，切為0.5cm帶腋芽的小段，接種于已加入0.8％瓊脂固化，蔗糖3％并在120℃條件中滅菌18分鐘，PH為5.6的MS+BA1mg/l+NAA0.2mg/l培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度24±2℃，光照強度2000lx，光照時間12h.d-1。
二次生根是將已生根的苗取出，將根截短保留一小部分集中接入培養(yǎng)基3-4周，待長出5-7條側根時，將未誘導出根的苗切掉底部愈傷組織，再接入生根培養(yǎng)基進行二次生根培養(yǎng)。
移栽所用基質優(yōu)選過篩的紅土和腐質土2∶1的混合基質，栽培場地優(yōu)選玻璃鋼溫室。移栽所用基質進一步優(yōu)選草莓土加紅土1∶1的混和基質，過篩后500倍液白菌清消毒，初期放入溫室，保持80％以上的濕度，白天溫度25℃，夜間不低于5℃。
更具體地，本發(fā)明的技術方案優(yōu)選晚春含笑1-2年生幼齡樹莖段為外植體，洗凈，灑精浸泡，轉入0.1％的HgCl2溶液中消毒8-10分鐘，再用無菌水沖洗4-5次，切為0.5cm帶腋芽的小段，接種于已加入0.8％瓊脂固化，蔗糖3％并在120℃條件中滅菌18分鐘，PH為5.6的MS+BA1mg/l+NAA0.2mg/l培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度24±2℃，光照強度2000lx，光照時間12h.d-1；培養(yǎng)4-5周后，轉入MS+BA0.8mg/l+NAA0.2mg/l培養(yǎng)基中繼代增殖培養(yǎng)，8-10周，待分化出叢芽后，將1cm以上的芽留2-3片葉切下，接入生根培養(yǎng)基MS+NAA2mg/l中50-60天，將已生根的苗取出，將根截短保留一小部分集中接入培養(yǎng)基3-4周，待長出5-7條側根時，將未誘導出根的苗切掉底部愈傷組織，再接入生根培養(yǎng)基進行二次生根培養(yǎng)；然后將具有3條根的苗移栽入草莓土加紅土1∶1的混和移栽基質，過篩后500倍液白菌清消毒，移栽初期放入溫室，保持80％以上的濕度，白天溫度25℃，夜間不低于5℃。
具體實施例方式下面用本發(fā)明的實施例來進一步說明本發(fā)明，但本發(fā)明內容不以實施例為限。
實施例1取以球花含笑(M.sphaerantha)為母本，云南含笑(M.yunnanensis)為父本，屬內種間雜交F1篩選培育出來的晚春含笑1-2年生幼齡樹莖段為外植體，洗凈，灑精浸泡，轉入0.1％的HgCl2溶液中消毒8-10分鐘，再用無菌水沖洗4-5次，切為0.5cm帶腋芽的小段，接種于已加入0.8％瓊脂固化，蔗糖3％并在120℃條件中滅菌18分鐘，PH為5.6的MS+BA1mg/l+NAA0.2mg/l培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度24±2℃，光照強度2000lx，光照時間12h.d-1；培養(yǎng)4-5周后，轉入MS+BA0.8mg/l+NAA0.2mg/l培養(yǎng)基中繼代增殖培養(yǎng)，8-10周，待分化出叢芽后，將1cm以上的芽留2-3片葉切下，接入生根培養(yǎng)基MS+NAA2mg/l中50-60天，將已生根的苗取出，將根截短保留一小部分集中接入培養(yǎng)基3-4周，待長出5-7條側根時，將未誘導出根的苗切掉底部愈傷組織，再接入生根培養(yǎng)基進行二次生根培養(yǎng)；然后將具有3條根的苗移栽入草莓土加紅土1∶1的混和移栽基質，過篩后500倍液白菌清消毒，移栽初期放入溫室，保持80％以上的濕度，白天溫度25℃，夜間不低于5℃。
下面用本發(fā)明的詳細試驗過程和結果來進一步詳細闡述本發(fā)明。
一.材料和方法取以球花含笑(M.sphaerantha)為母本，云南含笑(M.yunnanensis)為父本，屬內種間雜交F1篩選培育出來的能開花結籽的晚春含笑成年樹的當年生枝條，葉片；取扦插試驗成活的晚春含笑1-2年生植株上萌發(fā)的枝條、葉片，作外植體誘導對象，取材時間分不同時期，成年樹取材分基部和中部以上兩種。
材料取回后將老葉剪去露出腋芽，去掉已木質化部分莖段，留下嫩莖、幼葉，用自來水沖洗一段時間，毛筆輕輕刷干凈后，75％酒精浸泡30s，轉入0.1％的HgCl2溶液消毒，葉片消毒5-6min，莖段消毒8-10min，然后用無菌水沖洗4-5次備用。培養(yǎng)基(1)MS+KT2mg/l(單位下同)+NAA0.2，(2)MS+KT1+NAA0.2，(3)MS+BA1+NAA0.2，(4)MS+BA0.8+NAA0.2，(5)MS+2，4-D1，(6)MS+BA1+NAA0.2+AC0.3g/l，(7)MS+BA0.8+NAA0.2+AC0.3g/l，以上培養(yǎng)基均加入0.8％瓊脂固化，蔗糖3％，PH5.6，50ml三角瓶作初次接種培養(yǎng)容器，高壓鍋蒸汽滅菌120℃、18min，培養(yǎng)室溫度24±2℃，光照強度2000lx，光照時間12h.d-1。生根培養(yǎng)(8)MS+IBA3，(9)MS+NAA3，將消毒好的莖段切為0.5cm帶腋芽的小段，葉片切割為0.5cm2的片狀，分別接種到以上(1)-(7)培養(yǎng)基中，放入培養(yǎng)室培養(yǎng)。移栽基質為過篩的紅土和腐質土，混合物比例為2∶1，栽培場地為玻璃鋼溫室。
二.結果與分析1.葉接種在(1)(2)(3)(4)(5)培養(yǎng)基培養(yǎng)2-3周，在材料切口四周，葉背面的葉脈上，生長出許多愈傷組織，它們呈綠色顆粒狀，有的呈白色粉狀，其中(3)(4)(5)比(1)(2)生長快，4-5周后將它們轉入相同的新鮮培養(yǎng)基中培養(yǎng)觀察，愈傷組織能繼續(xù)增多，但未見分化出苗，若不轉瓶，在原培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)到6-8周，培養(yǎng)基褐化嚴重，材料也逐漸褐化死亡，成年樹、幼樹葉片培養(yǎng)表現基本一致無差別。
2.幼樹莖段接種在(1)(2)(3)(4)培養(yǎng)基中，四種激素組合都能使莖段腋芽分化，但誘導出芽的外形差異較大，(1)(2)誘導出的芽葉子細長、硬，叢芽萌發(fā)少或不發(fā)，(3)(4)誘導出的形態(tài)較粗壯正常，叢芽數較多。經多次試驗總結認為，(3)MS+BA1+NAA0.2，最適合作外植體誘導培養(yǎng)基。繼代增殖培養(yǎng)采用(4)MS+BA0.8+NAA0.2效果較好。培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)基有褐化現象，但與成年樹的對照相比較，褐化基本不影響生長分化，在現有設定的培養(yǎng)條件下，75天可以擴大4-6倍，用加活性碳的(6)(7)培養(yǎng)基來繼代培養(yǎng)，能減少褐化，但同時也會抑制叢芽的生長分化，活性炭的用量不高但抑制現象卻很明顯。
3.成年樹不同部位莖段培養(yǎng)結果差異較大，本實驗將50cm以下劃為基部，50cm以上劃為上部，經過不同時期多次試驗小結表明，上部莖段外植體接到培養(yǎng)基上成活率極低，幾乎全部褐化死亡，基部莖段培養(yǎng)情況好于上部，有8-10％接種存活，這一現象與木蘭科枝條扦插生根實驗報道有相似之處，接活的材料在后期培養(yǎng)中褐化嚴重，經多次轉代增殖效果仍然很差。
4.取自不同時期、不同植株的莖段外植體，誘導分化表現出的差異很大。成年樹和扦插成活的幼樹莖段對比實驗表明幼樹材料比成年樹材料容易接種成活，褐化現象較輕，誘導分化時間短，相反，成年樹外植體褐化嚴重，誘導分化時間較長(見表1)，表1不同時期不同植株莖段外植體接種生長情況

從表中統(tǒng)計的數字可看出，幼樹外植體誘導分化較容易，接種死亡的原因主要是由于污染，材料褐化死亡數極少，接種最低成活率在50％以上，受季節(jié)影響不大；相反，成年樹材料褐化嚴重，接種成活率低，誘導時間長，受季節(jié)影響大，誘導時間長，12月接種情況稍好，8月表現最差，接種存活的無菌系在后期的繼代培養(yǎng)中，褐化嚴重，難分化。而幼樹材料誘導出的叢芽長勢明顯好于成年樹，后期增殖培養(yǎng)也明顯有5.二步法生根法，將1cm以上的芽留2-3片葉切下，接入生根培養(yǎng)基(8)MS+IBA3，(9)MS+NAA3兩種培養(yǎng)，30天左右開始長根，60天后進行生根統(tǒng)計，生根率在82％-88％，兩種培養(yǎng)基生根情況不同，(8)誘導出的根約有1-2條，較細顏色較深，(9)誘導出的根約有2-3條，較粗色白，相比之下(9)比(8)誘導出的苗健壯；以下實驗都用(9)作生根培養(yǎng)基，第一次生根完畢，苗的長勢及根的長短參差不齊，不便于栽種，因此采用二次生根，將已生根的苗統(tǒng)一取出，將根截短保留一小部分集中接入培養(yǎng)基，3-4周可促發(fā)5-7條側根，將未誘導出根的苗切掉底部愈傷組織，集中接入培養(yǎng)基再次生根培養(yǎng)；這樣可大大提高生根率，可形成健壯整齊的試管苗，便于統(tǒng)一移栽管理，用二步法生根可使晚春含笑的整個組培法繁殖過程暢通。
6.移栽，一般取具有3條根以上的正常苗移栽，移栽基質采用草莓土加紅土1∶1的混和基質，過篩后500倍液白菌清消毒可用；移栽初期放入溫室，保80％以上的濕度、白天溫度25℃夜間不低于5℃，移栽成活率可達到90％以上。
下面再詳細說明晚春含笑的雜交過程晚春含笑球花含笑(Michelia sphaerantha)(♀)X云南含笑(M.yunnanensis)(♂)，在母本花朵還未張開時，輕輕扳開花被片，去掉雄蕊，用父本的花粉給其受粉，然后將花被片復原而包裹雌蕊群，并套袋，約1星期后去袋。雜交時間為上午8:00-9:00。未成功的一個月左右落果。種子成熟后采集果實并陰干后收集種子，洗去油質外種皮，在室溫下保濕沙藏。第二年早春播種，適時分苗移栽。觀察實生苗的適應性及形態(tài)形狀。
母本球花含笑(Michelia sphaerantha)常綠大喬木，幼枝被褐色絨毛。葉革質，倒卵狀長圓形，先端具驟尖頭，葉上面無毛，下面被短柔毛，中脈在葉面凹下，側脈網絡致密；葉柄無托葉痕?；ò咨?，下垂，不張開，花被片12，長6-7.5cm，寬1-2.5cm，狹倒卵形，雄蕊長約2cm，雌蕊群被短柔毛，花期4-5月。
父本云南含笑(M.yunnanensis)常綠灌木，枝葉茂密，高可達4米芽、嫩枝、嫩葉上面及葉柄、花梗密被深紅色平伏毛。葉硬革質，倒卵形、狹倒卵形或狹倒卵狀橢圓形，長4-10cm，寬1.5-3.5cm，先端圓鈍或短急尖，基部楔形，上面深綠色，下面殘留平伏毛；托葉痕為葉柄長的2/3或達頂端毛下面灰白色?；ü４謮?，花白色，張開成一個平面或呈杯狀，芳香，花被片6-12(17)，倒卵形或倒卵狀橢圓形，長3-3.5cm，內輪較狹小，雄蕊長0.5-1cm，雄蕊群及雌蕊群柄均被紅褐色平伏細毛，花期3-4月。
晚春含笑常綠灌木至小喬木，從莖基部開始分枝，分枝多而密，呈塔形芽、葉柄、幼葉兩面被棕色短絨毛。葉革質，倒長卵形或長圓形，長6.5-16cm，寬2.5-5cm，先端具驟尖頭或稍圓鈍，基部楔形，葉面深綠色，葉面無毛，背面殘留棕色短絨毛，中脈在葉面凹下，側脈每邊9-11，葉柄上托葉痕為葉柄長的1/3?；ㄈ榘咨?，花被片(7)11-12，狹倒卵形或匙形，長3.5-6cm，寬1-2cm，呈3輪排列，張開呈鐘形?；ㄆ?-5月。晚春含笑于1998年首次育成，此后多次培育出了該雜交種，2003年春首次開花。
晚春含笑已于2005年6月21日提出植物品種權申請，已受理。受理部門國家林業(yè)局植物新品種保護辦公室，申請?zhí)?0050039，申請日2005年6月21日。
三.結論晚春含笑組織培養(yǎng)快速繁殖外植體適宜選擇1-2年生幼齡樹莖段。誘導分化培養(yǎng)基MS+BA1+NAA0.2，繼代增殖培養(yǎng)基MS+BA0.8+NAA0.2，生根培養(yǎng)基為MS+NAA3。采用二步法生根，可使整個繁殖過程暢通。
雜交F1新品種“晚春含笑”的組織培養(yǎng)繁殖研究表明葉片較容易誘導出愈傷組織，但愈傷組織難以分化出芽，莖段培養(yǎng)能誘導出叢芽。成年樹莖段誘導時間長、褐化嚴重、后期繼代增殖表現差，不適合作外植體，取1-2年生幼齡樹莖段較容易誘導分化，用幼齡樹外植體建立的無菌系增殖系數高，適宜作組織培養(yǎng)快速繁殖的外植體來源。MS+BA1mg/l+NAA0.2mg/l，MS+BA0.8mg/l+NAA0.2mg/l，以上兩種培養(yǎng)基對誘導和增殖培養(yǎng)效果較好，將1cm以上的芽留2-3片葉剪下，放在MS+NAA2mg/l比MS+IBA2mg/l生根培養(yǎng)基上生根效果好，采用二步法生根能使小苗健壯，繁殖過程暢通，在條件適宜有保護設施條件下，移栽成活率達到90％以上。
權利要求
1.晚春含笑的組織培養(yǎng)繁殖方法，主要包括誘導分化培養(yǎng)、繼代增植培養(yǎng)、生根培養(yǎng)、移栽步驟，其特征在于以MS+BA1mg/l+NAA0.2mg/l為誘導分化培養(yǎng)基，MS+BA0.8mg/l+NAA0.2mg/l為繼代增殖培養(yǎng)基，MS+NAA2mg/l為生根培養(yǎng)基進行二次生根。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于誘導分化培養(yǎng)優(yōu)選晚春含笑1-2年生幼齡樹莖段為外植體，洗凈，灑精浸泡，轉入0.1％的HgCl2溶液中消毒8-10分鐘，再用無菌水沖洗4-5次，切為0.5cm帶腋芽的小段，接種于已加入0.8％瓊脂固化，蔗糖3％并在120℃條件中滅菌18分鐘，PH為5.6的MS+BA1mg/l+NAA0.2mg/l培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度24±2℃，光照強度2000lx，光照時間12h.d-1。
3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于所說二次生根是將已生根的苗取出，將根截短保留一小部分集中接入培養(yǎng)基3-4周，待長出5-7條側根時，將未誘導出根的苗切掉底部愈傷組織，再接入生根培養(yǎng)基進行二次生根培養(yǎng)。
4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于移栽所用基質優(yōu)選過篩的紅土和腐質土2∶1的混合基質，栽培場地優(yōu)選玻璃鋼溫室。
5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于移栽所用基質優(yōu)選草莓土加紅土1∶1的混和基質，過篩后500倍液白菌清消毒，初期放入溫室，保持80％以上的濕度，白天溫度25℃，夜間不低于5℃。
6.根據權利要求1或2或3或4或5所述的方法，其特征在于優(yōu)選晚春含笑1-2年生幼齡樹莖段為外植體，洗凈，灑精浸泡，轉入0.1％的HgCl2溶液中消毒8-10分鐘，再用無菌水沖洗4-5次，切為0.5cm帶腋芽的小段，接種于已加入0.8％瓊脂固化，蔗糖3％并在120℃條件中滅菌18分鐘，PH為5.6的MS+BA1mg/l+NAA0.2mg/l培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度24±2℃，光照強度2000lx，光照時間12h.d-1；培養(yǎng)4-5周后，轉入MS+BA0.8mg/l+NAA0.2mg/l培養(yǎng)基中繼代增殖培養(yǎng)，8-10周，待分化出叢芽后，將1cm以上的芽留2-3片葉切下，接入生根培養(yǎng)基MS+NAA2mg/l中50-60天，將已生根的苗取出，將根截短保留一小部分集中接入培養(yǎng)基3-4周，待長出5-7條側根時，將未誘導出根的苗切掉底部愈傷組織，再接入生根培養(yǎng)基進行二次生根培養(yǎng)；然后將具有3條根的苗移栽入草莓土加紅土1∶1的混和移栽基質，過篩后500倍液白菌清消毒，移栽初期放入溫室，保持80％以上的濕度，白天溫度25℃，夜間不低于5℃。
全文摘要
一種以球花含笑(M. sphaerantha)為母本，云南含笑(M. yunnanensis)為父本，屬內種間雜交F
文檔編號C12N5/04GK1887065SQ20061001106
公開日2007年1月3日 申請日期2006年7月21日 優(yōu)先權日2006年7月21日
發(fā)明者郭瑞賢, 胡虹, 何學葵, 曾德祿, 王 華, 龔洵 申請人:中國科學院昆明植物研究所, 云南綠大地生物科技股份有限公司