專利名稱：瓊脂糖水凝膠固定化酶電極及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種固定化酶電極及其制備方法和應(yīng)用，具體說是一種瓊脂糖水凝膠固定化酶電極及其制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
電化學(xué)酶傳感器結(jié)合了電化學(xué)方法的高靈敏性和酶的高選擇性，其主要應(yīng)用是定量檢測復(fù)雜樣品中組分的含量。為了提高電化學(xué)酶傳感器測定的專一性、靈敏度、準確度、穩(wěn)定性和使用壽命，研究工作主要集中在構(gòu)筑酶傳感器條件的優(yōu)化，如選擇固定酶的材料、固定方法、適當?shù)拿浇轶w和電極基底材料等。
生物電化學(xué)酶傳感器的制備中，最關(guān)鍵的技術(shù)包括(1)如何將酶固定在電極表面；(2)如何保持固定化酶的催化活性；(3)酶修飾電極能在有機相使用。使用的方法有吸附法，包埋法，自組裝法等，其中吸附法容易造成酶的流失，電極壽命短，而自組裝法固定酶的量較少，而且制作過程所需的時間較長。所以固定化酶的方法主要是包埋法。使用包埋法，要求固定材料能形成穩(wěn)定的膜；具有生物親和性；能保持酶的催化活性等特點。存在的不足是傳統(tǒng)的包埋法中所用的凝膠主要有聚丙烯酰胺、聚氯乙烯、聚乙烯醇等有機合成高分子材料，這些材料的生物親合性較差、傳質(zhì)阻力大，制備的酶電極不能用于有機相。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種具有較高的穩(wěn)定性、響應(yīng)快和重現(xiàn)性好、能在有機相等特殊條件下使用、應(yīng)用范圍廣，可用于化工、醫(yī)藥、環(huán)境等行業(yè)的安全檢測、環(huán)保監(jiān)測、生產(chǎn)過程控制等的瓊脂糖水凝膠固定化酶電極，為制備生物傳感器尋找新的固定化材料。
本發(fā)明的另一目的在于提供上述瓊脂糖水凝膠固定化酶電極的制備方法。
本發(fā)明的目的還在于提供上述瓊脂糖水凝膠固定化酶電極的應(yīng)用。
本發(fā)明的設(shè)計思想是瓊脂糖在熱水溶液中呈粘稠無序的水溶膠，冷卻后聚糖鏈呈螺旋狀且聚集成空腔，空腔里含有大量的水。在有機小分子的協(xié)同作用下，形成的瓊脂糖水凝膠膜具有較強的彈性和較高穩(wěn)定性。利用瓊脂糖這一特性和良好的生物親和性，制備瓊脂糖固定化酶電極。
本發(fā)明的技術(shù)方案是這樣實現(xiàn)的將瓊脂糖0.4～0.8克溶解于100mL沸水中，然后室溫冷卻，配制成瓊脂糖水凝膠；將有機溶劑與上述瓊脂糖水凝膠按有機溶劑∶瓊脂糖水凝膠＝1∶3～1∶6體積比混合后，再與酶溶液等體積混合，攪拌均勻制成混合溶液；滴涂在電極表面，室溫干燥，得到瓊脂糖固定化酶電極。
本發(fā)明可在有機溶劑中加入媒介體，其濃度為0.01mol·L-1，將含有媒介體的有機溶劑，與瓊脂糖水凝膠混合(含有媒介體的有機溶劑與瓊脂糖水凝膠體積比為1∶3～1∶6)均勻后，再與酶溶液等體積混合，攪拌均勻，滴涂在電極表面，室溫干燥，得到含有媒介體的瓊脂糖固定化酶電極。
本發(fā)明所述的有機溶劑為N，N-二甲基甲酰胺、二甲亞砜、甘油、吡啶或環(huán)己烷等。
本發(fā)明所述的酶為血紅蛋白、肌紅蛋白、過氧化物酶、過氧化氫酶、酪氨酸氧化酶、葡萄糖氧化酶、葡萄糖脫氫酶或乙醇脫氫酶等。
所述的媒介體為二茂鐵及其衍生物；鋨、釕有機配合物；醌類或有機染料等。
本發(fā)明利用瓊脂糖在有機小分子的協(xié)同作用下，形成穩(wěn)定的膜，能將酶固定在電極表面；而且瓊脂糖水凝膠具有較好生物親和性，為固定化酶提供良好的微環(huán)境，保持酶的催化活性；瓊脂糖膜在水溶液和有機溶液中均較穩(wěn)定。
由于本發(fā)明制備的瓊脂糖水凝膠具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，加入有機溶劑后，加速了凝膠化過程，使瓊脂糖水凝膠溶脹效應(yīng)小，具有較強的彈性、高穩(wěn)定性和良好的生物親和性，制備的酶電極響應(yīng)穩(wěn)定。制備酶電極時，將酶、媒介體與瓊脂糖水凝膠混合均勻成膜，制備的酶電極響應(yīng)快，穩(wěn)定性和重現(xiàn)性好，使用壽命長，準確度高，精密度好，測量范圍寬。在水相、含水有機相和有機相中，能催化還原有機氯化物、過氧化物、酚和一氧化氮等。
本發(fā)明制備的酶電極使用范圍廣，在水相、含水有機相和有機相中均能工作且均具有生物催化活性。因為瓊脂糖水凝膠為包埋在凝膠內(nèi)的酶提供微水環(huán)境，保持酶的原始構(gòu)象和催化活性，同時酶不易泄漏出來，所以該酶電極具有較高的穩(wěn)定性。


圖1為實施例1的瓊脂糖水凝膠包埋血紅蛋白的原子力顯微形貌。
圖2為實施例1的血紅蛋白修飾電極檢測六氯乙烷的循環(huán)伏安圖。
圖3為實施例2的肌紅蛋白修飾電極檢測NO2-的循環(huán)伏安圖。
圖4為實施例3的辣根過氧化物酶修飾電極檢測氫過氧化叔丁基的循環(huán)伏安圖。
具體實施例方式
實施例1制備血紅蛋白修飾電極。瓊脂糖(0.4g，agarose，Sigma)溶解于100mL沸水中，然后室溫冷卻，配制成0.4％的水凝膠，將瓊脂糖水凝膠和N，N-二甲基甲酰胺(DMF)的混合液(agarose∶DMF＝4∶1)，與血紅蛋白溶液(1.34×10-4M)等體積混合。取10μl混合溶液滴涂在裂解石墨電極表面，罩上有孔的小管，室溫干燥約8小時。該電極具有優(yōu)異的性能，響應(yīng)時間快(30秒)；使用壽命長(30天)；準確度高(＜5％)；精密度好(＜5‰)在水相、含水有機相和有機相中，能檢測一氧化氮，過氧化物和氯代乙烷，測量范圍寬。
實施例2制備肌紅蛋白修飾電極。瓊脂糖(0.4g，agarose，Sigma)溶解于100mL沸水中，然后室溫冷卻，配制成0.4％的水凝膠，將瓊脂糖水凝膠和N，N-二甲基甲酰胺(DMF)的混合液(agarose∶DMF＝4∶1)，與肌紅蛋白溶液(2.04×10-5M)等體積混合。取10μl混合溶液滴涂在裂解石墨電極表面，罩上有孔的小管，室溫干燥約8小時。該電極具有優(yōu)異的性能，響應(yīng)時間快(30秒)；使用壽命長(30天)；準確度高(＜5％)；精密度好(＜5‰)在水相、含水有機相和有機相中，能檢測一氧化氮，過氧化物和氯代乙烷，測量范圍寬。
實施例3制備辣根過氧化物酶修飾電極。瓊脂糖(0.4g，agarose，Sigma)溶解于100mL沸水中，然后室溫冷卻，配制成0.4％的水凝膠，將瓊脂糖水凝膠和N，N-二甲基甲酰胺(DMF)的混合液(agarose∶DMF＝4∶1)，與辣根過氧化物酶溶液(7.82×10-5M)等體積混合。取10μl混合溶液滴涂在裂解石墨電極表面，罩上有孔的小管，室溫干燥約8小時。該電極具有優(yōu)異的性能，響應(yīng)時間快(30秒)；使用壽命長(30天)；準確度高(＜5％)；精密度好(＜5‰)在水相、含水有機相和有機相中，能檢測過氧化物，測量范圍寬。
實施例4制備過氧化氫酶修飾電極。瓊脂糖(0.4g，agarose，Sigma)溶解于100mL沸水中，然后室溫冷卻，配制成0.4％的水凝膠，將瓊脂糖水凝膠和N，N-二甲基甲酰胺(DMF)的混合液(agarose∶DMF＝4∶1)，與過氧化氫酶酶溶液(6.53×10-5M)等體積混合。取10μl混合溶液滴涂在裂解石墨電極表面，罩上有孔的小管，室溫干燥約8小時。該電極具有優(yōu)異的性能，響應(yīng)時間快(30秒)；使用壽命長(30天)；準確度高(＜5％)；精密度好(＜5‰)在水相、含水有機相和有機相中，能檢測過氧化物，測量范圍寬。
實施例5制備二茂鐵為媒介體的辣根過氧化物酶修飾電極。瓊脂糖(0.4g，agarose，Sigma)溶解于100mL沸水中，然后室溫冷卻，配制成0.4％的水凝膠。將媒介體二茂鐵溶于有機溶劑N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，濃度為0.01mol·L-1，然后將二茂鐵的N，N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液與瓊脂糖水凝膠混合(體積比為1∶5)均勻后，再與辣根過氧化物酶溶液(7.82×10-5M)等體積混合。取10μl混合溶液滴涂在裂解石墨電極表面，罩上有孔的小管，室溫干燥約8小時。該電極具有優(yōu)異的性能，響應(yīng)時間快(30秒)；使用壽命長(30天)；準確度高(＜5％)；精密度好(＜5‰)在水相、含水有機相和有機相中，能檢測過氧化物，測量范圍寬。
圖2、圖3、圖4中，橫坐標為相對于飽和甘汞電極(SCE)的電位(E)，單位為V，縱坐標為電流(I)，單位為微安(μA)。
圖2中，六氯乙烷濃度分別為(mM)為(a)0，(b)0.3086，(c)0.6098，(d)0.9036。
圖3中，NO2-的濃度(mM)分別為(a)0，(b)3.64，(c)16.82(d)33.10。
圖4中，氫過氧化叔丁基的濃度(M)分別為(a)0，(b)0.045，(c)0.089，(d)0.13。
瓊脂糖是D-半乳糖和3，6脫水的L-半乳糖連接構(gòu)成的多鏈糖(圖1所示)。在熱水溶液中，瓊脂糖呈粘稠無序的水溶膠，冷卻時聚糖鏈呈螺旋狀且聚集成空腔，空腔里含有大量的水。瓊脂糖水凝膠具有較強的彈性、高穩(wěn)定性和良好的生物親和性，是固定蛋白質(zhì)的理想生物聚合物，常用于生物大分子的分離。瓊脂糖水凝膠具有一定的孔徑，底物分子能自由擴散至瓊脂糖凝膠中，與固定化的蛋白質(zhì)作用。
利用瓊脂糖水凝膠將血紅蛋白、肌紅蛋白、過氧化物酶和辣根過氧化物酶固定在玻碳電極表面，形成穩(wěn)定的血紅素蛋白質(zhì)-瓊脂糖膜修飾電極。在瓊脂糖膜中，血紅蛋白、肌紅蛋白、過氧化物酶和辣根過氧化物酶等血紅素蛋白質(zhì)直接與電極之間傳遞電子。
在水凝膠之中加入適量的二甲基甲酰胺，增強了瓊脂糖水凝膠的凝膠化過程，將蛋白質(zhì)牢固地固定在電極表面，而且能促進蛋白質(zhì)與電極之間的電子傳遞。
血紅素蛋白質(zhì)-瓊脂糖修飾電極在乙醇、DMSO和DMF等親水性有機溶劑與水的混合溶液中，也表現(xiàn)出直接電化學(xué)和催化活性，表明有機溶劑并沒有較大地影響蛋白質(zhì)的構(gòu)象及其催化功能，說明瓊脂糖水凝膠中含水空腔在保持蛋白質(zhì)構(gòu)象和活性諸方面起了重要的作用。
本發(fā)明的修飾電極還包括以下應(yīng)用(1)在水溶液中，血紅素蛋白質(zhì)-瓊脂糖修飾電極催化還原H2O2、NO和NO2-，能用于這些物質(zhì)的定量檢測；(2)在乙醇/水的混合溶液中，血紅素蛋白質(zhì)-瓊脂糖修飾電極催化還原NO、有機過氧化物和氯代乙烷，能用于這些物質(zhì)的定量檢測。
(3)在水溶液中和乙醇/水的混合溶液中，血紅素蛋白質(zhì)-瓊脂糖修飾電極能催化還原氧氣，能作為生物燃料電池的正極。
權(quán)利要求
1.一種瓊脂糖水凝膠固定化酶電極，其特征在于將瓊脂糖溶解于沸水中配制成瓊脂糖水凝膠；將瓊脂糖水凝膠與有機溶劑混合后，再與酶溶液混合制得混合溶液；將此混合溶液滴涂在電極基底表面，室溫干燥，得到瓊脂糖固定化酶電極。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的瓊脂糖水凝膠固定化酶電極，其特征在于所述有機溶劑為N，N-二甲基甲酰胺、二甲亞砜、甘油、吡啶或環(huán)己烷。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的瓊脂糖水凝膠固定化酶電極，其特征在于所述酶是血紅蛋白、肌紅蛋白、過氧化物酶、過氧化氫酶、酪氨酸氧化酶、葡萄糖氧化酶、葡萄糖脫氫酶或乙醇脫氫酶。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的瓊脂糖水凝膠固定化酶電極，其特征在于在所述有機溶劑，為含媒介體的有機溶劑，所述媒介體為二茂鐵及其衍生物；鋨、釕有機配合物；醌類或有機染料。
5.一種權(quán)利要求1所述的瓊脂糖水凝膠固定化酶電極的制備方法，其特征在于將瓊脂糖0.4～0.8克溶解于100mL沸水中，然后室溫冷卻，配制成瓊脂糖水凝膠；將有機溶劑與上述瓊脂糖水凝膠按1∶3～1∶6體積比混合后，再與酶溶液等體積均勻混合；將此混合溶液滴涂在電極表面，室溫干燥，得到瓊脂糖固定化酶電極。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的瓊脂糖水凝膠固定化酶電極的制備方法，其特征在于在所述有機溶劑中加入媒介體得含有媒介體有機溶劑，將含有濃度為0.01mol·L-1媒介體的有機溶劑，與瓊脂糖水凝膠按1∶3～1∶6體積比混合后，再與酶溶液等體積均勻混合；將此混合溶液滴涂在電極表面，室溫干燥，得到含媒介體的瓊脂糖固定化酶電極。
7.一種權(quán)利要求1所述的瓊脂糖水凝膠固定化酶電極在水溶液中催化還原H2O2、NO和NO2-，及其定量檢測這些物質(zhì)中的應(yīng)用。
8.一種權(quán)利要求1所述的瓊脂糖水凝膠固定化酶電極在乙醇/水的混合溶液中催化還原NO、有機過氧化物和氯代乙烷，及其定量檢測這些物質(zhì)中的應(yīng)用。
9.一種權(quán)利要求1所述的瓊脂糖水凝膠固定化酶電極在水溶液中和乙醇/水的混合溶液中，催化還原氧氣，作為生物燃料電池的正極的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供一種瓊脂糖水凝膠固定化酶電極及其制備方法和應(yīng)用。將瓊脂糖0.4～0.8克溶解于100mL沸水中配制成瓊脂糖水凝膠，將瓊脂糖水凝膠與有機溶劑混合后，再與酶溶液混合制得混合溶液，將此混合溶液滴涂在電極基底表面，室溫干燥，得到瓊脂糖固定化酶電極。本發(fā)明利用瓊脂糖的特性和良好的生物親和性，制備瓊脂糖固定化酶電極。本發(fā)明制備的酶電極使用范圍廣，在水相、含水有機相和有機相中均能使用且均具有生物催化活性。該酶電極響應(yīng)快，穩(wěn)定性和重現(xiàn)性好，使用壽命長，準確度高，精密度好，測量范圍寬。
文檔編號G01N27/327GK1869674SQ200610019470
公開日2006年11月29日 申請日期2006年6月25日 優(yōu)先權(quán)日2006年6月25日
發(fā)明者劉慧宏 申請人:襄樊學(xué)院