專利名稱：酶催化生產(chǎn)腺苷輔酶維生素b12的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種腺苷輔酶維生素B12的生產(chǎn)方法，尤其是指利用生物催化工程和藥物化學(xué)制劑相關(guān)技術(shù)來生產(chǎn)。
背景技術(shù)：
腺苷輔酶維生素B12(以下簡稱腺苷輔酶B12)是由5′-脫氧腺嘌呤核苷取代普通維生素B12的氰基而成的新型維生素B12制劑，是維生素B12在體內(nèi)的活化形式，具有抗貧血、抗組胺、護肝、神經(jīng)保護、蛋白同化、促進生長等生理作用。與常用普通維生素B12相比，腺苷輔酶B12具有毒性小、可直接被機體利用、對組織的親和力大、在體內(nèi)的利用率高、活性強等優(yōu)點。在臨床上主要用于治療惡性貧血及其他巨幼紅細胞性貧血以及其他B12適應(yīng)癥，如神經(jīng)炎、急慢性肝炎的輔助治療等。腺苷輔酶B12還是形成消化道正常上皮細胞的必要物質(zhì)，對損傷的胃粘膜修復(fù)具有良好的促進作用。腺苷輔酶B12還被廣泛用于治療由對腫瘤的化學(xué)或放射性治療導(dǎo)致的白細胞減少癥。腺苷輔酶B12的應(yīng)用為維生素B12適應(yīng)癥的治療提供了更好的基礎(chǔ)。目前腺苷輔酶B12的生產(chǎn)主要依靠發(fā)酵法，其生產(chǎn)工藝復(fù)雜，終產(chǎn)品純化難度大，純化粹取要求使用多種有機溶劑，生產(chǎn)成本高，轉(zhuǎn)化率低，對環(huán)境容易造成污染。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種酶催化生產(chǎn)腺苷輔酶維生素B12的方法，以解決目前生產(chǎn)存在的工藝復(fù)雜、生產(chǎn)周期長、成本高和污染大的問題。
本發(fā)明采用三磷酸腺苷和羥鈷型維生素B12作為合成腺苷輔酶維生素B12的起始原料，其中的羥鈷型維生素B12使用的終濃度為0.001-0.05mol/l。
應(yīng)用經(jīng)酶工程技術(shù)篩選優(yōu)化的三磷酸腺苷維生素B12腺苷轉(zhuǎn)移酶作為催化劑在反應(yīng)體系的pH值為8.0±1.0條件下，反應(yīng)時間1-3小時，在酶促反應(yīng)中含有0.002-0.1mol/l濃度的三磷酸腺苷，0.002-0.1mol/L的MnCl2，一步獲得終產(chǎn)物腺苷輔酶維生素B12，原料轉(zhuǎn)化率大于90％。該技術(shù)大大簡化了腺苷輔酶維生素B12生產(chǎn)的下游純化和制劑工藝。
本發(fā)明方法的特征為反應(yīng)體系中使用的還原劑為四氫硼鉀(Potasium Borohydride，KBH4，四氫硼鈉Sodium Borohydride，NaBH4，四氫鋰鋁Lithium Aluminum Hydride，LiAlH4，或Ferredoxin(flavodoxin)NADP+Reductase等生物還原系統(tǒng)。
本發(fā)明方法的特征為合成的反應(yīng)進程用高壓液色譜儀和紫外/可見分光光度計監(jiān)測。
本發(fā)明方法的特征為使用疏水層析進行催化反應(yīng)體系中終產(chǎn)物腺苷輔酶維生素B12的分離和純化，疏水層析采用反向疏水樹質(zhì)。
本發(fā)明方法的特征為利用減壓蒸發(fā)和低溫結(jié)晶技術(shù)獲得高純度腺苷輔酶維生素B12粉末狀結(jié)晶制劑。
我們利用酶工程技術(shù)篩選優(yōu)化的三磷酸腺苷ATP維生素B12(Cob(I)alamin)腺苷轉(zhuǎn)移酶催化效率高、催化反應(yīng)調(diào)價簡單，為酶促大規(guī)模生產(chǎn)腺苷輔酶B12奠定了技術(shù)基礎(chǔ)。利用體外酶催化法生產(chǎn)腺苷輔酶B12，具有生產(chǎn)工藝簡單，催化反應(yīng)條件可控，終產(chǎn)品純化容易等特點，為低成本生產(chǎn)腺苷輔酶B12提供了一條新的途徑。
本發(fā)明克服了微生物發(fā)酵法具有生產(chǎn)工藝繁瑣、終產(chǎn)品的純化工藝尤其復(fù)雜、投入大、轉(zhuǎn)化率低等缺點。經(jīng)酶工程優(yōu)化的三磷酸腺苷ATP維生素B12(Cob(I)alamin)腺苷轉(zhuǎn)移酶具有催化活性高、催化條件簡單等優(yōu)點。小試結(jié)果表明利用三磷酸腺苷(ATP)維生素B12(Cob(I)alamin)腺苷轉(zhuǎn)移酶可將三磷酸腺苷和維生素B12在簡單條件下一步轉(zhuǎn)化成腺苷輔酶維生素B12，工藝流程短，生產(chǎn)條件溫和，對環(huán)境無污染。由于三磷酸腺苷和維生素B12等反應(yīng)原料價格低廉，利用三磷酸腺苷ATP維生素B12(Cob(I)alamin)腺苷轉(zhuǎn)移酶體外催化生產(chǎn)腺苷輔酶維生素B12將大大降低了生產(chǎn)成本。該技術(shù)工藝具有明顯的創(chuàng)新優(yōu)勢和市場競爭力，將為在短時間內(nèi)占領(lǐng)國內(nèi)外腺苷輔酶B12市場打下良好基礎(chǔ)。
具體實施例方式
實驗材料和方法工程菌和試劑大腸桿菌基因重組工程菌，該菌種已提交中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，地址北京市海淀區(qū)中關(guān)村，保藏日期2005年10月17日，保藏編號CGMCCNo.1491，分類命名大腸埃希氏菌Escherichia coli，攜帶三磷酸腺苷ATP羥鈷型維生素B12(Cob(I)alamin)腺苷轉(zhuǎn)移酶基因。各分析純級試劑配成以下濃度備用。1mol/l TRIS-HCl緩沖液，pH值為8.0；3mol/l CoCl2；1mol/l MnCl2；0.4mol/l ATP；0.2mol/l羥鈷型維生素B12；固體四氫硼鉀Potasium Borohydride(KBH4)，Lithium Borohydride(LiBH4)，四氫硼鈉Sodium Borohydride(NaBH4)，四氫鋰鋁Lithium Aluminum Hydride(LiAlH4)，或SodiumCyanoborohydride(NaBH3CN)，去離子水。碳十八(C18)，碳八(C8)等硅膠反向疏水樹質(zhì)。
1、培養(yǎng)基A培養(yǎng)基蛋白胨10g/l；酵母粉5g/l，NaCl 10g/l，四環(huán)素10μg/ml。上述試劑用去離子水溶解后，在120℃滅菌25分鐘，然后在接種時加入四環(huán)素達25μg/ml，B培養(yǎng)基在A培養(yǎng)基中加入1.5％的瓊脂后進行滅菌，條件同A培養(yǎng)基，滅菌后未凝固前加入四環(huán)素，加入量為10μg/ml，凝固后即制成瓊脂平板培養(yǎng)基。
2、發(fā)酵將上述瓊脂平板培養(yǎng)基(B培養(yǎng)基)上培養(yǎng)的三磷酸腺苷維生素B12腺苷轉(zhuǎn)移酶基因工程菌，挑起單菌落，接入20ml A培養(yǎng)基中(含10μg/ml四環(huán)素)，37℃搖床培養(yǎng)20小時。
將以上的菌液接種到61的A培養(yǎng)基中(含10μg/ml四環(huán)素)，37℃搖床培養(yǎng)20小時左右，測菌液的OD600＝1.8以上。
將二級培養(yǎng)后收集的菌液進行離心，轉(zhuǎn)速為4000rpm，離心時間10分針，棄去上清液，收集沉淀的菌體，-70℃凍存。
3、酶液的制作將發(fā)酵獲得的工程菌細胞，檢驗后目的蛋白應(yīng)占總蛋白的20以上，用Tris-HCl，pH8.0緩沖液進行懸浮，每克細胞泥用4毫升緩沖液，懸浮后的菌液利用均質(zhì)機進行破碎，操作的壓力為60MPa，溫度控制在15℃以下，循環(huán)兩次。收集懸浮液進行離心，轉(zhuǎn)速為15000rpm，溫度為4±2℃。離心后收集上清液備用，24小時內(nèi)使用可儲存在4℃，長期儲存溫度-70℃。
實施例一 酶催化腺苷輔酶維生素B12合成(1)以一升的反應(yīng)體系為例1、加入試劑向反應(yīng)釜中分別加入以下配制好的試劑1mol/l Tris-HCl緩沖液50毫升；0.1mol/l CoCl25毫升；0.1mol/l MnCl210毫升；0.5mol/l ATP 10毫升；0.5mol/l羥鈷型維生素B12 10毫升；去離子水定容至1升；充氮除氧后加入四氫硼鉀Potasium Borohydride(KBH4)10克。
2、反應(yīng)溫度和時間設(shè)置反應(yīng)溫度為30±5℃，10分鐘后加入100IU三磷酸腺苷維生素B12腺苷轉(zhuǎn)移酶，讓反應(yīng)時間持續(xù)2-3小時，用高效液相色譜儀和UV/VIS分光光度計監(jiān)測反應(yīng)進程直至反應(yīng)完成。在結(jié)束反應(yīng)的上述混合液中加入鹽酸，終濃度為0.1mol/l，15000rpm離心10分鐘，棄去沉淀物，收集上清液備用。
實施例二 酶催化腺苷輔酶維生素B12合成(2)以一升的反應(yīng)體系為例3、加入試劑向反應(yīng)釜中分別加入以下配制好的試劑1mol/l Tris-HCl緩沖液50毫升；0.1mol/l CoCl25毫升；0.1mol/l MnCl210毫升；0.5mol/l ATP 20毫升；0.5mol/l羥鈷型維生素B12 20毫升；去離子水定容至1升；充氮除氧后加入四氫硼鈉Sodium Borohydride(NaBH4)15克。
4、反應(yīng)溫度和時間設(shè)置反應(yīng)溫度為30±5℃，10分鐘后加入200IU腺苷三磷酸維生素B12腺苷轉(zhuǎn)移酶，讓反應(yīng)時間持續(xù)2-3小時直至反應(yīng)完成。在結(jié)束反應(yīng)的上述混合液中加入鹽酸，終濃度為0.1mol/l，15000rpm離心10分鐘，棄去沉淀物，收集上清液備用。
實施例三 酶催化腺苷輔酶維生素B12合成(3)以一升的反應(yīng)體系為例5、加入試劑向反應(yīng)釜中分別加入以下配制好的試劑1mol/l Tris-HCl緩沖液50毫升；0.1mol/l CoCl210毫升；0.1mol/l MnCl220毫升；0.5mol/l ATP 30毫升；0.5mol/l羥鈷型維生素B12 30毫升；去離子水定容至1升；充氮除氧后加入Sodium Cyanoborohydride(NaBH3CN)20克。
6、反應(yīng)溫度和時間設(shè)置反應(yīng)溫度為30±5℃，10分鐘后加入250IU腺苷三磷酸維生素B12腺苷轉(zhuǎn)移酶，讓反應(yīng)時間持續(xù)2-3小時直至反應(yīng)完成。在結(jié)束反應(yīng)的上述混合液中加入鹽酸，終濃度為0.1mol/L，15000rpm離心10分鐘，棄去沉淀物，收集上清液備用。
實施例四 腺苷輔酶維生素B12的層析純化1、層析介質(zhì)的處理反向C18硅膠樹脂(Silica-based Reversed-phase C18 Resin，Waters)溶于去離子水后裝柱，用甲醇清洗3個柱體積，用去離子水沖洗3個柱體積。
2、上樣將已除蛋白的反應(yīng)混合液以每分鐘0.02個柱體積的流速加到層析柱上，每毫升介質(zhì)約可吸附15毫克的腺苷輔酶維生素B12。
3、沖洗上樣后用去離子水沖洗10個柱體積，至260nm和370nm波長檢測無吸收為止。
4、洗脫用95％甲醇進行洗脫，收集260波長處的洗脫峰。收集液放在4-8℃冷藏箱中避光保存、備用。
實施例五 腺苷輔酶維生素B12的濃縮干燥1、層析純化收集液的濃縮將含有腺苷輔酶維生素B12的層析純化收集液加入減壓濃縮器中進行避光減壓蒸發(fā)直至所以甲醇和水份除去為止。濃縮溫度不高于40±5℃，濃縮壓力應(yīng)低于-0.1Mpa。
2、腺苷輔酶維生素B12的結(jié)晶將含有腺苷輔酶維生素B12的層析純化收集液加入減壓濃縮器中進行避光減壓蒸發(fā)至腺苷輔酶B12濃度約0.1mol/l時，將盛有腺苷輔酶B12溶液的燒瓶移至冷水中降溫至4±2攝氏度，向腺苷輔酶B12溶液中緩慢加入丙酮攪拌直至有晶體析出。該結(jié)晶溶液在4±2攝氏度保存6小時后繼續(xù)加入少量丙酮，在4±2攝氏度保存6小時后過濾收集腺苷輔酶B12晶體，用少量乙醚沖洗后減壓干燥晶體。腺苷輔酶B12晶體收獲率超過90％。
權(quán)利要求
1.一種酶催化生產(chǎn)腺苷輔酶維生素B12的方法，其特征在于合成反應(yīng)使用的起始原料為三磷酸腺苷和羥鈷型維生素B12，其中的羥鈷型維生素B12使用的終濃度為0.001-0.05mol/l。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的酶催化生產(chǎn)腺苷輔酶維生素B12的方法，其特征在于在酶促反應(yīng)中含有0.002-0.1mol/公升濃度的三磷酸腺苷，0.002-0.1mol/l的MnCl2，反應(yīng)體系的pH值為8.0±1.0。
3.據(jù)權(quán)利要求1所述的酶催化生產(chǎn)腺苷輔酶維生素B12的方法，該方法的特征為反應(yīng)體系中使用的還原劑為四氫硼鉀，四氫硼鈉，四氫鋰鋁，或NaBH3CN等生物還原系統(tǒng)。
4.據(jù)權(quán)利要求1所述的酶催化生產(chǎn)腺苷輔酶維生素B12的方法，該方法的特征為合成的反應(yīng)進程用高壓液色譜儀和紫外/可見分光光度計監(jiān)測。
5.據(jù)權(quán)利要求1所述的酶催化生產(chǎn)腺苷輔酶維生素B12的方法，該方法的特征為使用疏水層析進行催化反應(yīng)體系中終產(chǎn)物腺苷輔酶維生素B12的分離和純化。
6.據(jù)權(quán)利要求1所述的酶催化生產(chǎn)腺苷輔酶維生素B12的方法，該方法的特征為利用減壓蒸發(fā)和低溫結(jié)晶技術(shù)獲得高純度腺苷輔酶維生素B12粉末狀結(jié)晶制劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種酶催化生產(chǎn)腺苷輔酶維生素B12的方法，屬于腺苷輔酶維生素B12的生產(chǎn)方法。利用三磷酸腺苷維生素B12腺苷轉(zhuǎn)移酶生產(chǎn)腺苷輔酶維生素B12，其中的羥鈷型維生素B12使用的終濃度為0.001－0.05mol/l。該方法具有工藝簡潔、生產(chǎn)周期短、生產(chǎn)成本低的特點。利用本發(fā)明中的生產(chǎn)工藝獲得的終產(chǎn)物腺苷輔酶維生素B12純度高、穩(wěn)定性強，可加工成多種劑型，為藥用腺苷輔酶維生素B12的大規(guī)模生產(chǎn)提供了一條新途徑。
文檔編號C12P19/42GK1814773SQ20051011901
公開日2006年8月9日 申請日期2005年11月25日 優(yōu)先權(quán)日2005年11月25日
發(fā)明者陳大偉 申請人:吉林省奇健生物技術(shù)有限公司