專利名稱：同時檢測a、b型流感病毒的實時熒光定量檢測方法及試劑盒的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種檢測方法及其試劑盒，更具體地說，涉及一種同時檢測A型和B型流感病毒的實時熒光定量檢測方法及其檢測試劑盒。
背景技術：
眾所周知，禽流感病毒(AIV)是由A型流感病毒引起的家禽和野禽的一種烈性傳染病，給養(yǎng)禽業(yè)造成巨大損失，我國農業(yè)部和國際獸醫(yī)局都將其定為A類傳染病。禽流感其病理變化因感染病毒毒株毒力的強弱、病程長短和禽種的不同而不同。其臨床癥狀因感染禽的種類、年齡、性別、并發(fā)感染情況及所感染毒株的毒力和其他環(huán)境等不同而表現(xiàn)出的癥狀很不一致。自1878年禽流感在意大利爆發(fā)和流行到如今已有100多年的歷史。禽流感已成為具有重要公共衛(wèi)生意義的傳染病，該病不僅具有發(fā)生突然、傳播迅速、發(fā)病率高、致死率高等特點，而且禽流感病毒是幾乎所有A型流感病毒的基因庫，其自然宿主的廣泛性及遺傳變異給禽流感的及時定性診斷和預防帶來很大困難。由于候鳥的遷徙和國際間禽類貿易的日益頻繁，使得該病呈全球性分布，給養(yǎng)禽業(yè)造成巨大的經濟損失。以往認為禽流感病毒對人群無致病力，但1997年“香港H5禽流感、2000年H9、2003年荷蘭H7至2004年亞洲的H5均發(fā)生感染人，甚至導致人員死亡，死亡率約30％左右。其危害性比2003年的SARS還大、還難于預料。在現(xiàn)有技術中，長期以來禽流感的診斷一直依賴于病原的分離和鑒定。近年來相繼建立的禽流感瓊脂擴散(AGP)、血凝抑制試驗(HI)、神經氨酸酶抑制試驗(NI)、間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELAISA)等血清學診斷技術及分子診斷技術(RT-PCR)，已經遠遠滿足不了我國禽流感及呼吸道疾病的流行病學監(jiān)測及現(xiàn)場診斷與防制的迫切需要。
實時熒光定量PCR技術于1996年由美國Applied Biosystems公司推出，是集PCR擴增技術、探針雜交技術和熒光共振能量轉移光譜技術于一體的新興技術，該技術實現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍，是目前國際上用在病毒檢測上最先進的檢測方法之一，具有普通的PCR擴增技術無法比擬的優(yōu)點1、特異性高因為只有當探針與待測模板匹配時Taq酶才會啟動其5’-3’端的外切酶活性，將探針上的熒光基團切割下來而產生熒光強度的增長，因此熒光定量PCR技術克服了普通PCR由于非特異性擴增而導致的假陽性問題；2、敏感度高熒光PCR技術可檢出極低拷貝數(shù)的核酸，使真正意義上的早期診斷成為現(xiàn)實；3、高通量、高效率1～2小時可全自動同步完成近百個樣品的擴增及檢測，且結果重現(xiàn)性好；4、無須凝膠電泳，采用全封閉反應管及光電傳導系統(tǒng)，無管道內污染。該方法可對DNA和RNA的PCR產物進行定量分析。
近幾年歐美、日本一些國家也進行RT-PCR和多重熒光定量PCR的研究。國內未見多重熒光定量PCR檢測流感病毒文獻報道。目前國內常用的快速檢測方法為傳統(tǒng)PCR或半巢式-MPCR。上述方法存在一定的缺陷，如傳統(tǒng)PCR或半巢式-MPCR技術易出現(xiàn)假陽性、交叉污染、操作步驟多和費時。而雙重熒光定量PCR具有的操作簡單、可定量、污染少、檢測速度快，同時檢測A、B型流感病毒。檢出病毒的最小量為10-5TCID50等優(yōu)點越來越受學者的認同和研究?！半p重熒光定量PCR快速檢測流感人(禽)病毒和準確分型”，這一研究不僅在國內屬于首次，而且在國際上也屬于先進水平。在我國流感快速診斷研究方面仍停留在傳統(tǒng)PCR或半巢式-MPCR技術中，這與我國作為流感多發(fā)地來說是極不相稱，因此，研究開發(fā)雙重熒光定量PCR檢測流感病毒技術，為使我國的流感病毒快速診斷技術盡快的與國際接軌，適應當今快速前進社會的發(fā)展，確保人們的生命安全和國家的利益具有重要意義。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于提供一種操作簡便、污染少、檢測速度快，并可同時檢測A型和B型流感病毒的實時熒光定量檢測方法及試劑盒。
為了達到上述目的，本發(fā)明提供了如下的技術方案采用一種同時檢測A型和B型流感病毒的實時熒光定量檢測方法，過程包括合成引物和熒光探針，和使用所述的引物、探針及其它聚合酶鏈式反應成份組成熒光聚合酶鏈式反應體系，從待測標本中提取DNA或提取RNA，加入前述的反應體系中，經混合后進行RT-PCR擴增和熒光信號測定，本發(fā)明的具體方法為(1)針對A型、B型流感病毒保守序列的引物及相應探針，具備如下DNA序列A型上游引物5’CAGAGACTTGAAGATGTTTTTGC，下游引物5’CTACGCRGCAGTCCTCGCTC，TaqMan探針5’FAM-CAAGACCAATCCTGTCACCTCTGA-BHQ1；B型上游引物5’AAATACGGTGGATTAAATAAAAGCAA，下游引物5’CCAGCAATAGCTCCGAAGAAA，TaqMan探針5’CY5-CACCCATATTGGGCAATTTCTATGGC-BHQ2；(2)建立和優(yōu)化包括引物、探針、酶、寡聚核苷酸和鎂離子的A型、B型定量反應體系和反應條件(2-1)建立具有如下組分濃度的50μl反應體系10倍反應緩沖液5μl，鎂離子5mM，寡聚核苷酸4mM，RNA酶抑制劑40U，反轉錄酶25U，Taq酶5U，A型上、下游引物各0.5mM，B型上、下游引物各0.5mM，A型探針250nM，B型探針200nM，A、B型模板RNA各10μl；(2-2)確立如下的反應條件48℃30分鐘→95℃10分鐘→95℃15秒→60℃1分鐘，其中95℃15秒→60℃1分鐘之間進行45次循環(huán)；選擇熒光定量PCR儀上FAM和CY5雙色熒光通道進行檢測；(2-3)建立標準曲線取流感A、B病毒培養(yǎng)液抽提RNA，然后將RNA進行10倍梯度稀釋，最高稀釋度為10-6，各濃度梯度RNA同時進行熒光反應，計算并匯出標準曲線。
本發(fā)明還提供同時檢測A型和B型流感病毒方法的試劑盒，其中用于100次試驗的試劑盒的構成為RT-PCR反應緩沖液1.6ml，Taq酶(5U/μl)50μl，RT-PCR酶(200U/μl)10μl，RT-PCR酶稀釋液10μl，二乙基焦碳酸酯水1ml，陽性對照1ml，陰性對照1ml。試劑盒中的RT-PCR酶溶液是使用時用RT-PCR酶稀釋液稀釋8倍的現(xiàn)配溶液或稀釋后在-20℃下保存一周內的酶溶液。換句話說，RT-PCR酶(200U/μl)使用時，請用RT-PCR酶稀釋液稀釋成25U/μl(8倍稀釋)后使用。盡量保證現(xiàn)配現(xiàn)用，用多少配多少，稀釋后的酶溶液在-20℃下保存時不要超過一周。
本發(fā)明所述的試劑盒，是經包裝并在-20℃或以下保存期為一年或以內的試劑盒。換句話說，所述試劑盒的保存期為不超過一年，并應經包裝后保存。
本發(fā)明試劑盒中的二乙基焦碳酸酯水，也即焦碳酸二乙酯水或DEPC水，采用行業(yè)內通用的DEPC水，是用DEPC處理過的水。
與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有以下明顯的優(yōu)點1、雙重熒光定量PCR具有操作簡單、可定量、污染少、檢測速度快，同時檢測A、B型流感病毒，檢出病毒的最小量達10-5TCID50。2、技術效果好建立“多重熒光定量RT-PCR技術快速檢測A型、B型流感病毒”的檢測試劑盒，可在3-4小時內從被檢測標本中，快速、準確、特異、安全、簡便的鑒定出流感病毒的A型、B型，檢出病毒的最小量為分別為2.56×10-5，5.0×10-5個TCID50，可定量分析，比巢式RT-PCR靈敏度高、靈敏，而且不容易污染，而傳統(tǒng)PCR或半巢式-MPCR檢出病毒的最小量為0.01-0.1TCID50。3、適用范圍廣可適用于各種呼吸道病毒疾病及流感、禽流感的檢測和鑒別，同時也可檢測被禽流感病毒污染，而病毒含量級少，一般方法不容易檢測到的禽類產品和半成品。


以下是本發(fā)明的

圖1是A、B型流感病毒雙重熒光RT-PCR靈敏度檢測圖；圖2是A、B型流感病毒雙重熒光RT-PCR十倍稀釋標準曲線圖。
參照圖1，根據流感毒株A，B TCID50法的滴定結果，分別取2.56個和5.0個TICD50的病毒RNA，分別十倍梯度稀釋，最大稀釋度分別為2.56×10-6，5.0×10-6，將相同稀釋度A、B病毒RNA混合加入同一個雙重反應體系管中，熒光RT-PCR反應結果見圖1，圖中可以看出A型曲線的熒光值較B型的要高，這是由于熒光基團FAM與CY5本身的差異所造成的；相同稀釋度A、B病毒的CT值很接近，提示雖然A、B流感病毒的TCID50值不同，但其病毒拷貝數(shù)是很接近的，這反應了A、B流感病毒的致病能力是有一定差異的，雙重反應體系中A、B病毒10-6濃度組均成陰性，較單一熒光反應減少了一個數(shù)量級，原因是反應體系增加，使得病毒RNA的相對濃度下降的緣故。
參照圖2，分別以A型、B型流感病毒的TCID50濃度為橫坐標，以各自RT-PCT循環(huán)的CT值為縱坐標作圖，可以得到雙重熒光RT-PCR反應對A型、B型病毒進行相對定量的兩條標準曲線，見圖2。其中A型標準曲線的斜率為-3.024，擴增效率為114.1％，相關系數(shù)為0.997，幾項參數(shù)與A型單一熒光反應均很接近，說明此雙重反應檢測體系對A型流感病毒的檢測無明顯影響；B型標準曲線的斜率為-3.149，擴增效率為107.8％，相關系數(shù)為0.998，幾項參數(shù)與B型單一熒光反應也都很接近，說明此雙重反應檢測體系對B型流感病毒的檢測也無明顯影響。
具體實施例方式
以下通過具體的實施方式對本發(fā)明進行更加詳細的描述A、原理概述在熒光定量RT-PCR的擴增反應體系中，同時加入分別與A型、B型流感病毒匹配的兩對引物及兩條特異性的TaqMan探針。兩條探針的兩端分別標記一個熒光報告基團和一個熒光淬滅基團，其中兩個報告基團的激發(fā)和發(fā)射波長不同。探針完整時，報告基團發(fā)射的熒光信號被淬滅基團吸收；RT-PCR擴增時，Taq聚合酶的5′→3′外切酶活性將結合于模板上的探針酶切降解，使報告基團和淬滅基團分離，從而產生熒光信號，根據針對A型、B型流感病毒熒光探針所發(fā)出的不同波長的熒光信號就可以從未知樣本中判斷出流感病毒的類型。當熒光信號累積達到儀器設置的檢測閾值時，對應的RT-PCR擴增的循環(huán)數(shù)CT與對應的病毒模板數(shù)之間成線性關系，可對病毒進行定量分析。
B、實施詳情1、材料A型、B型流感病毒由本實驗室培養(yǎng)保存；RNA提取試劑盒購自ROCHE公司；引物及TaqMan探針均由上海博亞公司合成；熒光定量PCR儀是Stratagene公司的MX4000型。
2、方法2.1利用Primer Express軟件分別設計針對A型、B型流感病毒保守序列的引物及其相應TaqMan探針。具體DNA序列如下(1)針對A型、B型流感病毒保守序列的引物及相應探針，具備如下DNA序列A型上游引物5’CAGAGACTTGAAGATGTTTTTGC，下游引物5’CTACGCRGCAGTCCTCGCTC，TaqMan探針5’FAM-CAAGACCAATCCTGTCACCTCTGA-BHQ1，擴增片段大小154bp；B型上游引物5’AAATACGGTGGATTAAATAAAAGCAA，下游引物5’CCAGCAATAGCTCCGAAGAAA，TaqMan探針5’CY5-CACCCATATTGGGCAATTTCTATGGC-BHQ2，
擴增片段大小170bp；2.2取A型、B型流感病毒培養(yǎng)液各200μl，用ROCHE公司的RNA提取試劑盒分別提取總RNA，用50μl溶解緩沖液溶解。
2.3檢測試劑盒50μl反應體系包括10倍反應緩沖液5μl，鎂離子5mM，寡聚核苷酸4mM，RNA酶抑制劑40U，反轉錄酶25U，Taq酶5U，A型上、下游引物各0.5mM，B型上、下游引物各0.5mM，A型探針250nM，B型探針200nM，A、B型模板RNA各10μl。
2.4反應條件先48℃30分鐘；再95℃10分鐘；最后95℃15秒，60℃1分鐘，循環(huán)45次，然后選擇熒光定量PCR儀上FAM和CY5雙色熒光通道進行檢測。
2.5靈敏度分析及標準曲線的建立取適當?shù)味鹊牧鞲蠥、B病毒培養(yǎng)液抽提RNA，然后將RNA進行10倍梯度稀釋，最高稀釋度為10-6。各濃度梯度RNA同時進行熒光RT-PCR反應，由熒光定量PCR儀計算出標準曲線。
2.6檢驗試劑盒的研發(fā)及推廣將反應體系中相應的引物、探針、酶、寡聚核苷酸、鎂離子等分別按比例進行混合及包裝，并在相關機構進行中試及推廣。
3、結果3.1A型、B型流感病毒雙重熒光RT-PCR檢測靈敏度根據流感毒株A，B TCID50法的滴定結果，分別取2.56個和5.0個TICD50的病毒RNA，分別十倍梯度稀釋，最大稀釋度分別為2.56×10-6，5.0×10-6。將相同稀釋度A、B病毒RNA混合加入同一個雙重反應體系管中，熒光RT-PCR反應結果見圖1，圖中可以看出A型曲線的熒光值較B型的要高，這可能是由于熒光基團FAM與CY5本身的差異所造成的；相同稀釋度A、B病毒的CT值很接近，提示雖然A、B流感病毒的TCID50值不同，但其病毒拷貝數(shù)是很接近的，這反應了A、B流感病毒的致病能力是有一定差異的；相同稀釋度A、B病毒的CT值很接近，提示雖然A、B流感病毒的TCID50值不同，但其病毒拷貝數(shù)是很接近的，這反應了A、B流感病毒的致病能力是有一定差異的；雙重反應體系中A、B病毒10-6濃度組均成陰性，較單一熒光反應減少了一個數(shù)量級，原因可能是反應體系增加，使得病毒RNA的相對濃度下降的緣故。
3.2A型、B型流感病毒雙重熒光RT-PCR檢測標準曲線分別以A型、B型流感病毒的TCID50濃度為橫坐標，以各自RT-PCT循環(huán)的CT值為縱坐標作圖，可以得到雙重熒光RT-PCR反應對A型、B型病毒進行相對定量的兩條標準曲線，見圖2。其中A型標準曲線的斜率為-3.024，擴增效率為114.1％，相關系數(shù)為0.997，幾項參數(shù)與A型單一熒光反應均很接近，說明此雙重反應檢測體系對A型流感病毒的檢測無明顯影響；B型標準曲線的斜率為-3.149，擴增效率為107.8％，相關系數(shù)為0.998，幾項參數(shù)與B型單一熒光反應也都很接近，說明此雙重反應檢測體系對B型流感病毒的檢測也無明顯影響。
3.3本發(fā)明試劑盒的構成見下表

核甘酸序列表<110>程小雯<120>同時檢測A型和B型流感病毒的實時熒光定量檢測方法及試劑盒<160>6<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>23<212>DNA<213>Homo sapiens<400>1CAGAGACTTG AAGATGTTTT TGC23<210>2<211>20<212>DNA<213>Homo sapiens<400>2CTACGCRGCA GTCCTCGCTC20<210>3<211>31<212>DNA<213>Homo sapiens<400>3FAM-CAAGACCAAT CCTGTCACCT CTGA-BHQ131
<210>4<211>26<212>DNA<213>Homo sapiens<400>4AAATACGGTG GATTAAATAA AAGCAA26<210>5<211>21<212>DNA<213>Homo sapiens<400>5CCAGCAATAG CTCCGAAGAA A21<210>6<211>33<212>DNA<213>Homo sapiens<400>6CY5-CACCCATATT GGGCAATTTC TATGGC-BHQ23權利要求
1.一種同時檢測A型和B型流感病毒的實時熒光定量檢測方法，過程包括合成引物和熒光探針，和使用所述的引物、探針組成熒光聚合酶鏈式反應體系，從待測標本中提取DNA或提取RNA，加入前述的反應體系中，經混合后進行RT-PCR擴增和熒光信號測定，其特征在于(1)針對A型、B型流感病毒保守序列的引物及相應探針，具備如下DNA序列A型上游引物5’CAGAGACTTGAAGATGTTTTTGC，下游引物5’CTACGCRGCAGTCCTCGCTC，TaqMan探針5’FAM-CAAGACCAATCCTGTCACCTCTGA-BHQ1；B型上游引物5’AAATACGGTGGATTAAATAAAAGCAA，下游引物5’CCAGCAATAGCTCCGAAGAAA，TaqMan探針5’CY5-CACCCATATTGGGCAATTTCTATGGC-BHQ2；(2)建立和優(yōu)化包括引物、探針、酶、寡聚核苷酸和鎂離子的A型、B型定量反應體系和反應條件(2-1)建立具有如下組分濃度的50μl反應體系10倍反應緩沖液5μl，鎂離子5mM，寡聚核苷酸4mM，RNA酶抑制劑40U，反轉錄酶25U，Taq酶5U，A型上、下游引物各0.5mM，B型上、下游引物各0.5mM，A型探針250nM，B型探針200nM，A、B型模板RNA各10μl；(2-2)確立如下的反應條件先48℃30分鐘；再95℃10分鐘；最后95℃15秒，60℃1分鐘，循環(huán)45次，然后選擇熒光定量PCR儀上FAM和CY5雙色熒光通道進行檢測；(2-3)建立標準曲線取流感A、B病毒培養(yǎng)液抽提RNA，然后將RNA進行10倍梯度稀釋，最高稀釋度為10-6，各濃度梯度RNA同時進行熒光反應，計算并匯出標準曲線。
2.采用權利要求1所述方法的試劑盒，其特征在于用于100次試驗的該試劑盒的構成為RT-PCR反應緩沖液 1.6mlTaq酶(5U/μl) 50μlRT-PCR酶(200U/μl) 10μlRT-PCR酶稀釋液 10μl二乙基焦碳酸酯水 1ml陽性對照 1ml陰性對照 1ml。
3.根據權利要求2所述的試劑盒，其特征在于所述的試劑盒是經包裝并在-20℃或以下保存期不超過一年的試劑盒。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種同時檢測A型和B型流感病毒的實時熒光定量檢測方法及試劑盒，針對A型、B型流感病毒保守序列的引物及相應探針不同DNA序列，分別建立和優(yōu)化包括引物、探針、酶、寡聚核苷酸和鎂離子的A型、B型定量反應體系和反應條件，檢測并建立標準曲線，試劑盒包括RT－PCR反應緩沖液、Taq酶、RT－PCR酶、RT－PCR酶稀釋液、DEPC水、陽性對照、陰性對照。解決了雙重熒光定量PCR檢測體系等問題，具有操作簡單、可定量、污染少、檢測速度快等優(yōu)點，可同時檢測A、B型流感病毒，檢出病毒的最小量達10
文檔編號C12Q1/68GK1865937SQ20051003483
公開日2006年11月22日 申請日期2005年5月20日 優(yōu)先權日2005年5月20日
發(fā)明者程小雯 申請人:程小雯