專利名稱：大麥黃矮病毒的特異性引物、探針制備及快速檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。進(jìn)-步，本發(fā)明涉及一種引起小麥黃矮病的大麥黃矮病毒的不同株系的檢測方法。
背景技術(shù)：
由大麥黃矮病毒(Barley yellow dwarf virus，簡稱BYDV)引起的小麥黃矮病是世界上分布最廣、危害最嚴(yán)重的禾谷類病毒病之一。我國的西北、華北、東北、華中、西南及華東等麥區(qū)均有分布，其中陜西、甘肅、寧夏、內(nèi)蒙、山東、河北、河南、山西等省為主要流行區(qū)。自60年代以來，我國曾七次大面積流行成災(zāi)，受災(zāi)小麥平均減產(chǎn)40％左右，嚴(yán)重可達(dá)70％以上，以至于絕收。1970和1987年僅陜西、甘肅兩省就曾因小麥黃矮病的為害損失小麥共9億多公斤，1999年我國西北麥區(qū)又再次流行成災(zāi)。
BYDV能侵染大麥、小麥、黑麥、燕麥、水稻、玉米以及多種早熟禾科雜草等約150種植物，而且此病只能由麥蚜傳播。根據(jù)不同種麥蚜傳播BYDV的專化性及能力，BYDV可分為不同的類型。我國的大麥黃矮病毒分離物可劃分為GAV、GPV、PAV和RMV 4種株系。但主流株系的演替與品種布局、農(nóng)業(yè)栽培措施以及氣象因子等的改變密切相關(guān)，如自1980年至1990年約10年時(shí)間內(nèi)，由麥二叉蚜(Schizaphis graminum)、禾縊管蚜(Rhopalosiphum padi)非?；詡鞑サ奈覈赜械腂YDV-GPV，一直為小麥黃矮病流行區(qū)的流行株系。而自上世紀(jì)九十年代以來，由麥二叉蚜、麥長管蚜(Sitobion avenae)非?；詡鞑サ腂YDV-GAV的分布范圍和比例不斷擴(kuò)大，現(xiàn)已逐漸成為我國各主要冬春麥區(qū)的主流株系。
由于該病危害嚴(yán)重，各發(fā)生國家都十分重視。長期以來科學(xué)家們對該病毒的鑒定、流行規(guī)律、致病機(jī)理及檢測檢驗(yàn)技術(shù)等已做了許多深入的研究，取得了一定進(jìn)展。就大麥黃矮病毒的檢測檢驗(yàn)而言，由于BYDV只能由麥蚜持久性傳播，不能摩擦接種，其寄主又是單子葉麥類作物，而病毒又僅僅局限在韌皮部，且病毒含量極低，使得對大麥黃矮病毒的檢測受限。近年來，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，植物病毒的檢測除傳統(tǒng)的生物學(xué)、血清學(xué)、免疫學(xué)和電鏡鑒定方法外，開發(fā)出一些以核酸分子雜交和PCR為基礎(chǔ)的新技術(shù)，大大提高了病毒檢測的靈敏度。目前，國內(nèi)外廣泛應(yīng)用的檢測病毒方法主要是酶聯(lián)免疫吸附法、核酸分子雜交法、PCR及其他分子生物學(xué)技術(shù)與免疫學(xué)技術(shù)相結(jié)合的改進(jìn)技術(shù)。依賴于抗血清的免疫學(xué)檢測技術(shù)以ELISA技術(shù)最成熟，應(yīng)用最廣泛。但其檢測的特異性較差，往往會(huì)出現(xiàn)假陽性反應(yīng)。因此建立一套分子檢測系統(tǒng)，對于BYDV的高效、快速鑒定乃是當(dāng)務(wù)之急。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對上述缺陷，提供大麥黃矮病毒不同株系的特異性引物。
同時(shí)提供大麥黃矮病毒不同株系的探針制備方法及檢測、鑒別大麥黃矮病毒不同株系的方法，為檢測BYDV提供一種有效、安全的技術(shù)。
大麥黃矮病毒的特異性引物，其特征在于所述大麥黃矮病毒BYDV-GPV株系特異性引物序列為SEQ 1，SEQ 2；所述大麥黃矮病毒BYDV-GAV株系特異性引物序列為SEQ 3，SEQ 4；所述大麥黃矮病毒BYDV-PAV株系特異性引物序列為SEQ 5，SEQ 6。
大麥黃矮病毒株系探針制備方法，其特征在于運(yùn)用上述特異性引物，以地高辛為標(biāo)記物，PCR法制得cDNA探針。
所述BYDV-GPV株系特異性引物為SEQ 1，SEQ 2，所述PCR退火溫度52℃。
所述BYDV-GAV株系特異性引物為SEQ 3，SEQ 4，所述PCR退火溫度50℃。
所述BYDV-PAV株系特異性引物為SEQ 5，SEQ 6，所述PCR退火溫度55℃。
一種用于大麥黃矮病毒不同株系的檢測方法，其特征在于應(yīng)用上述方法制備的探針建立的核酸斑點(diǎn)雜交檢測方法。
運(yùn)用Vector NT軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，確定制備BYDV-GPV、GAV、PAV探針?biāo)褂玫囊?。用TRIzol法提取罹病植物總RNA，用PCR法合成cDNA，經(jīng)PCR擴(kuò)增后，回收產(chǎn)物，再與pGEM-T Easy克隆載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM110，堿裂解法提取重組質(zhì)粒后，進(jìn)行PCR及酶切的鑒定。對鑒定得到陽性克隆進(jìn)行序列測定，獲得BYDV三種病毒目的基因的DNA序列。以含有目的DNA片段的重組質(zhì)粒為模板，通過PCR法合成相應(yīng)的DIG標(biāo)記的DNA探針。
利用DIG探針核酸斑點(diǎn)雜交和免疫檢測方法進(jìn)行檢測，建立了核酸斑點(diǎn)雜交檢測體系。免疫檢測實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，BYDV-GPV、GAV、PAV的PCR產(chǎn)物與本發(fā)明制備的DIG探針有強(qiáng)烈的雜交信號(hào)，可用于PCR-Southern-blot實(shí)驗(yàn)。BYDV-GPV、GAV、PAV病毒材料的RNA也只與其相應(yīng)的DIG探針有明顯的雜交信號(hào)，說明本發(fā)明制備的地高辛標(biāo)記的cDNA探針具有較好的特異性，基于該探針建立的核酸斑點(diǎn)雜交檢測體系可用于鑒別大麥黃矮病毒不同株系。
本發(fā)明核酸雜交檢測技術(shù)是根據(jù)互補(bǔ)的核酸單鏈可以相互結(jié)合的原理，將一段病毒核酸單鏈以某種方式加以標(biāo)記，制成探針，再與互補(bǔ)的待測樣品核酸雜交，通過帶有探針的雜交核酸來指示病原的存在。尤其是基于病毒核酸序列的RT-PCR和核酸雜交技術(shù)等，能更準(zhǔn)確靈敏地鑒定病毒的種類，甚至能區(qū)分同種病毒不同的株系。本發(fā)明采用非放射性探針標(biāo)記物如地高辛，具有安全、穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明將地高辛標(biāo)記的核酸斑點(diǎn)雜交檢測技術(shù)引入BYDV不同株系間檢測，為快速診斷、檢測BYDV提供了一種新途徑。


圖1.BYDV-GPV特異性引物的PCR擴(kuò)增結(jié)果其中，泳道M為標(biāo)準(zhǔn)分子量DL2000(從上到下依次為2000、1000、750、500、250、100，下同)；泳道2、3、4、5依次為GPV、GAV、PAV及健株的PCR產(chǎn)物。
圖2.BYDV-GAV特異性引物的PCR擴(kuò)增結(jié)果其中，泳道M為標(biāo)準(zhǔn)分子量DL2000；泳道2、3、4、5依次為GAV、GPV、PAV及健株的PCR產(chǎn)物。
圖3.BYDV-PAV特異性引物的PCR擴(kuò)增結(jié)果其中，泳道M為標(biāo)準(zhǔn)分子量DL2000；泳道2、3、4、5依次為PAV、GPV、GAV及健株的PCR產(chǎn)物。
圖4.BYDV-GPV地高辛探針制備的PCR擴(kuò)增結(jié)果其中，泳道M為標(biāo)準(zhǔn)分子量DL2000；泳道2為未標(biāo)記的GPV的PCR產(chǎn)物，泳道3為地高辛標(biāo)記的GPV探針。
圖5.BYDV-GAV地高辛探針制備的PCR擴(kuò)增結(jié)果其中，泳道M為標(biāo)準(zhǔn)分子量DL2000；泳道2為未標(biāo)記的GAV的PCR產(chǎn)物，泳道3為地高辛標(biāo)記的GAV探針。
圖6.BYDV-PAV地高辛探針制備的PCR擴(kuò)增結(jié)果其中，泳道M為標(biāo)準(zhǔn)分子量DL2000；泳道2為未標(biāo)記的PAV的PCR產(chǎn)物，泳道3為地高辛標(biāo)記的PAV探針。
圖7.BYDV-GPV探針的NASH特異性檢測結(jié)果其中，泳道1為BYDV-GPV的PCR產(chǎn)物；泳道2、3、4、5依次為GPV、GAV、PAV及健株的RNA。
圖8.BYDV-GAV探針的NASH特異性檢測結(jié)果其中，泳道1為BYDV-GAV的PCR產(chǎn)物；泳道2、3、4、5依次為GAV、GPV、GAV及健株的RNA。
圖9.BYDV-PAV探針的NASH特異性檢測結(jié)果其中，泳道1為BYDV-PAV的PCR產(chǎn)物；泳道2、3、4、5依次為PAV、GPV、GAV及健株的RNA。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說明。應(yīng)該說明的是，本發(fā)明的實(shí)施例對于本發(fā)明只有說明作用，而沒有限制作用。
需特別指出的是，盡管在實(shí)施例中詳盡描述了BYDV-GPV、PAV、GAV三種株系的特異性引物的設(shè)計(jì)，然而這并不意味本發(fā)明的引物序列只限用于BYDV-GPV、PAV、GAV的檢測。因此，使用本發(fā)明所描述的BYDV檢測用引物、地高辛標(biāo)記的核酸探針以及檢測技術(shù)(NASH)，以及本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所具有的任何涉及上述的引物、方法(如Southern-blot、PCR-Southern-blot)檢測其他作物病毒和其他方面的應(yīng)用，均包括在本發(fā)明所要求的權(quán)利范圍之內(nèi)。由于本發(fā)明是對大麥黃矮病毒的檢測，因此應(yīng)用本發(fā)明對任何引起小麥黃矮病的大麥黃矮病毒相近株系的檢測均也包括在本發(fā)明所要求的權(quán)利范圍之內(nèi)。
下述實(shí)施例中所述試劑原料除特別注明來源外，均為市售的常用原料，試劑的配制均采用常規(guī)方法。
雜交所用溶液的配制N-Lauroylarcosine 10％(w/v)SDS10％(w/v)20×SSC3MNaCl，3M Na-citrate，pH7.0(20℃)封閉母液 試劑盒封閉劑用Buffer1稀釋到10％，滅菌4℃保存洗滌液 Buffer1+Tween-200.3％(w/v)Buffer 1 0.1M馬來酸，0.15M NaCl，pH7.5(20℃)高壓滅菌；Buffer 2 將封閉液用Buffer 1稀釋10倍；Buffer 3 100mMTris-HCl，100mMNaCl.pH9.5Buffer 4 10mMTris-HCl，1mM EDTA，pH8.0(20℃)顯色底物溶液 200μl NBT/BCIP加入10ml Buffer3中(現(xiàn)用現(xiàn)配)雜交緩沖液 5×SSC，2％(W/V)封閉液，0.1％(w/v)N-lauroylsarcosine，0.02％(w/v)SDS，50％甲酰胺實(shí)施例1.BYDV-GPV株系的特異性引物、地高辛標(biāo)記的cDNA探針的制備及檢測方法1.1特異性引物的設(shè)計(jì)運(yùn)用Vector NT軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，確定BYDV-GPV探針的引物(編號(hào)SEQ 1，SEQ2)為(目的片段大小約為1300bp)上游引物5’ATG AGT ACG GTC GCC 3’15bp下游引物5’TTC GTC AAG CGT AAC TGT 3’18bp1.2RNA的提取取BYDV-GPV、GAV和PAV的毒源及健康植株葉片組織0.1g，加入液氮充分研磨，再加入1ml TRIZOL reagent(購自Invitrogen公司)充分研磨，室溫放置5min；加入氯仿200μl，充分振蕩15sec，室溫放置2-3min；12,000rpm，4℃離心10min；取上層水相至新管中，加入0.5ml異丙醇，室溫放置10min 1,2000rpm，4℃離心10min，棄上清液；沉淀用75％乙醇洗滌；1,2000rpm，4℃離心2min，棄上清液；真空干燥RNA沉淀；dd H2O 40μl溶解RNA，如難溶，可55-60℃孵育10min。-20℃暫存；-70℃長期保存。
1.3 RT-PCR條件的優(yōu)化13.1 cDNA的合成在PCR反應(yīng)管中，加入RNA提取液1ul；下游引物(50pmol/ul)1ul；5×MMLVFirst strand Buffer 4ul；ddH2O 4ul；混勻后，90℃變性1min，瞬離置于冰上2min。再依次加入下列試劑dNTPs(10mmol/L)2ul；Rnasin(40U/ul)1ul；DTT(100mM)1ul；MgCl2(25mM)1ul；MMLV Reverse Transcriptase(200U/ul)1ul；ddH2O 4ul；37℃水浴1h，100℃滅活1min，-20℃保存?zhèn)溆谩?br> 1.3.2聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)50ul反應(yīng)體系中加入如下試劑cDNA 5ul；10×PCR buffer 5ul；10mM dNTPs 2ul；50pmol/ul的上、下游引物各0.7ul；Taq酶(5U/ul)0.3ul；超純無菌水36.3ul；混勻后離心，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR基本擴(kuò)增程序?yàn)?4℃預(yù)變性2min；94℃變性45sec，52℃退火30sec，72℃延伸2min；35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10min。反應(yīng)結(jié)束4℃保存。
瓊脂糖電泳檢測擴(kuò)增結(jié)果(如圖1)。用SEQ 1、SEQ 2引物反轉(zhuǎn)錄PCR進(jìn)行體外擴(kuò)增，以提取的BYDV-GAV毒源的總DNA為模板的反應(yīng)呈陽性，擴(kuò)增產(chǎn)生1300bp的條帶一條，而以提取的BYDV-GAV和PAV的毒源及健康植株的總DNA為模板的反應(yīng)均呈陰性。表明引物是特異性的，該RT-PCT檢測體系可用于將鑒別BYDV-GPV株系。
1.4基因的克隆及序列測定
利用瓊脂糖電泳檢測擴(kuò)增結(jié)果，按照天為時(shí)代公司(中國北京清華大學(xué)學(xué)研大廈B座1115室)提供的PCR Fragment Recovery Kit使用說明書進(jìn)行PCR產(chǎn)物的回收。把PCR回收產(chǎn)物與pGEM-T Easy克隆載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM110，堿裂解法提取重組質(zhì)粒后，進(jìn)行PCR及酶切的鑒定。對鑒定得到陽性克隆進(jìn)行序列測定，DNA序列測定由上海華諾生物科技有限公司(中國上海市徐匯區(qū)石龍路345弄7號(hào)5樓)完成。獲得BYDV-GPV株系目的基因的DNA序列。
1.5地高辛標(biāo)記的DNA探針制備以含有目的DNA片段的重組質(zhì)粒為模板，用PCR合成DIG探針試劑盒(購自Roche公司，貨號(hào)1636090)，通過PCR法合成相應(yīng)的DIG標(biāo)記的DNA探針。擴(kuò)增病毒特異性基因片段，以此帶有DIG的特異片段作為探針(如圖4)。所用的dNTP底物中，含0.7mMDIG-11-dUTP，1.3mMdTTP，其余dNTP為2mM。因地高辛分子量大，第3泳道的地高辛標(biāo)記的PCR產(chǎn)物比第2泳道的未標(biāo)記的PCR產(chǎn)物分子量的高，說明標(biāo)記較為成功。
1.6DIG探針核酸斑點(diǎn)雜交剪取PolyNC(+)膜(購自Amersham pharmacia bioteeh公司)，戴手套操作，并剪去右上角，以便辨別方位，并用鉛筆在膜上做好標(biāo)記，以便區(qū)分；吸取1μl RNA樣品，點(diǎn)于膜上；120℃烤膜30min；將固定好的膜放入雜交袋中，加入2ml標(biāo)準(zhǔn)雜交緩沖液(50％甲酰胺)(按100cm2膜面積加20ml計(jì)算)，平放于培養(yǎng)皿中，50℃輕搖20min以上；探針用100℃沸水煮5min-10min，使之變性，立即置于冰上冷卻；更換雜交液，加入DIG探針使其濃度為5-30ng/ml，50℃，輕搖1.5小時(shí)以上；用2×洗液(2×SSC，0.1％SDS)洗膜2次，10-15min/次；0.5×洗液(0.5×SSC，0.1％SDS)于50℃洗膜2次，10min/次；1.7免疫檢測用洗滌液(Buffer1+0.3％Tween)浸膜1min，以平衡膜；膜裝入袋中，按100cm2膜面積加20ml計(jì)算加入Buffer2(含1％封閉劑)2ml，趕出袋中氣泡，封袋，輕搖封閉20min以上；更換Buffer2，加入堿性磷酸酶標(biāo)記的DIG抗體(購自Roche公司)達(dá)工作濃度為(1∶7500)，趕出袋中氣泡，封膜，輕搖30min；棄抗體液，取出膜放入培養(yǎng)皿中，洗滌液洗膜2次，10min/次；用Buffer3平衡膜2min；倒出Buffer3，加入10ml顯色底物溶液(用前避免陽光直射)，暗處靜置顯色。一般顯色10-30min即可。觀察到理想的顯色結(jié)果后，將膜移入TE緩沖液(pH8.0)或滅菌水中終止反應(yīng)。
免疫檢測實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，BYDV-GPV的PCR產(chǎn)物與本發(fā)明制備的DIG探針有強(qiáng)烈的雜交信號(hào)，可用于PCR-Southern-blot實(shí)驗(yàn)。GPV毒源材料的RNA也與其DIG探針有明顯的雜交信號(hào)，而與GAV、PAV毒源材料及健株的RNA均無雜交信號(hào)(見圖7)。說明本發(fā)明制備的BYDV-GPV地高辛標(biāo)記的cDNA探針具有較好的特異性，基于該探針建立的BYDV-GPV核酸斑點(diǎn)雜交檢測體系可用于特異性地鑒別BYDV的GPV株系。
實(shí)施例2.BYDV-GAV株系的特異性引物、地高辛標(biāo)記的cDNA探針的制備及檢測方法2.1特異性引物的設(shè)計(jì)運(yùn)用Vector NT軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，確定BYDV-GAV探針的引物(編號(hào)SEQ 3、SEQ4)為(目的片段大小約為960bp)上游引物5’ATG AAT TCA GTA GGC CGT AGA A3’(22bp)下游引物5’GTC TCG GTT TCC TCC AAT GTG 3’(21bp)2.2RNA的提取操作與1.2同。
2.3 RT-PCR條件的優(yōu)化2.3.1 cDNA的合成在PCR反應(yīng)管中，加入RNA提取液1ul；下游引物(50pmol/ul)1ul；5×MMLVFirst strand Buffer 4ul；ddH2O 4ul；混勻后，90℃變性1min，瞬離置于冰上2min。再依次加入下列試劑dNTPs(10mmol/L)2ul；Rnasin(40U/ul)1ul；DTT(100mM)1ul；MgCl2(25mM)1ul；MMLV Reverse Transcriptase(200U/ul)1ul；ddH2O 4ul；37℃水浴1h，100℃滅活1min，-20℃保存?zhèn)溆谩?br> 2.3.2聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)50ul反應(yīng)體系中加入如下試劑cDNA 5ul；10×PCR buffer 5ul；10mM dNTPs 2ul；50pmol/ul的上、下游引物各0.7ul；Taq酶(5U/ul)0.3ul；超純無菌水36.3ul；混勻后離心，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR基本擴(kuò)增程序?yàn)?4℃預(yù)變性2min；94℃變性45sec，50℃退火30sec，72℃延伸2min；35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10min。反應(yīng)結(jié)束4℃保存。
瓊脂糖電泳檢測擴(kuò)增結(jié)果(如圖2)。用SEQ 3、SEQ 4引物反轉(zhuǎn)錄PCR進(jìn)行體外擴(kuò)增，以提取的BYDV-GAV毒源的總RNA為模板的反應(yīng)呈陽性，擴(kuò)增產(chǎn)生960bp的條帶一條，而以提取的BYDV-GPV和PAV的毒源及健康植株的總RNA為模板的反應(yīng)均呈陰性。表明引物是特異性的，該RT-PCR檢測體系可用于鑒別BYDV-GAV株系。
2.4基因的克隆及序列測定利用瓊脂糖電泳檢測擴(kuò)增結(jié)果，按照天為時(shí)代公司(中國北京清華大學(xué)學(xué)研大廈B座1115室)提供的PCR Fragment Recovery Kit使用說明書進(jìn)行PCR產(chǎn)物的回收。把PCR回收產(chǎn)物與pGEM-T Easy克隆載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM110，堿裂解法提取重組質(zhì)粒后，進(jìn)行PCR及酶切的鑒定。對鑒定得到陽性克隆進(jìn)行序列測定，DNA序列測定由上海華諾生物科技有限公司(中國上海市徐匯區(qū)石龍路345弄7號(hào)5樓)完成。獲得BYDV-GAV病毒目的基因的DNA序列。
2.5地高辛標(biāo)記的DNA探針制備以含有目的DNA片段的重組質(zhì)粒為模板，用PCR合成DIG探針試劑盒(購自Roche公司，貨號(hào)1636090)，通過PCR法合成相應(yīng)的DIG標(biāo)記的DNA探針。所用的dNTP底物中，含0.7mMDIG-11-dUTP，1.3mMdTTP，其余dNTP為2mM。擴(kuò)增病毒特異性基因片段，以此帶有DIG的特異片段作為探針(如圖5)。
因地高辛分子量大，第3泳道的地高辛標(biāo)記的PCR產(chǎn)物比第2泳道的未標(biāo)記的PCR產(chǎn)物分子量的高，說明標(biāo)記較為成功。
2.6 DIG探針核酸斑點(diǎn)雜交剪取PolyNC(+)膜(購自Amersham pharmacia biotech公司)，戴手套操作，并剪去右上角，以便辨別方位，并用鉛筆在膜上做好標(biāo)記，以便區(qū)分；吸取1μl RNA樣品，點(diǎn)于膜上；120℃烤膜30min；將固定好的膜放入雜交袋中，加入2ml標(biāo)準(zhǔn)雜交緩沖液(50％甲酰胺)(按100cm2膜面積加20ml計(jì)算)，平放于培養(yǎng)皿中，50℃輕搖20min以上；探針用100℃沸水煮5min-10min，使之變性，立即置于冰上冷卻；更換雜交液，加入DIG探針使其濃度為5-30ng/ml，50℃，輕搖1.5小時(shí)以上；用2×洗液(2×SSC，0.1％SDS)洗膜2次，10-15min/次；0.5×洗液(0.5×SSC，0.1％SDS)于50℃洗膜2次，10min/次；2.7免疫檢測用洗滌液(Buffer1+0.3％Tween)浸膜1min，以平衡膜；膜裝入袋中，按100cm2膜面積加20ml計(jì)算加入Buffer2(含1％封閉劑)2ml，趕出袋中氣泡，封袋，輕搖封閉20min以上；更換Buffer2，加入堿性磷酸酶標(biāo)記的DIG抗體(購自Roche公司)達(dá)工作濃度為(1∶7500)，趕出袋中氣泡，封膜，輕搖30min；棄抗體液，取出膜放入培養(yǎng)皿中，洗滌液洗膜2次，10min/次；用Buffer3平衡膜2min；倒出Buffer3，加入10ml顯色底物溶液(用前避免陽光直射)，暗處靜置顯色。一般顯色10-30min即可。觀察到理想的顯色結(jié)果后，將膜移入TE緩沖液(pH8.0)或滅菌水中終止反應(yīng)。
免疫檢測實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，BYDV-GAV的PCR產(chǎn)物與本發(fā)明制備的DIG探針有強(qiáng)烈的雜交信號(hào)，可用于PCR-Southern-blot實(shí)驗(yàn)。GAV毒源材料的RNA也與其DIG探針有明顯的雜交信號(hào)，而與GPV、PAV毒源材料及健株的RNA均無雜交信號(hào)(見圖8)。說明本發(fā)明制備的BYDV-GAV地高辛標(biāo)記的cDNA探針具有較好的特異性，基于該探針建立的BYDV-GAV核酸斑點(diǎn)雜交檢測體系可用于特異性地鑒別BYDV的GAV株系。
實(shí)施例3.BYDV-PAV株系的特異性引物、地高辛標(biāo)記的cDNA探針的制備及檢測方法3.1特異性引物的設(shè)計(jì)運(yùn)用Vector NT軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，確定BYDV-PAV探針的引物(編號(hào)為SEQ 5、SEQ6)為(目的片段大小約為1500bp)上游引物5’GTA CAA GGC AAA TGG CAC GAC 3’下游引物5’GTT CTG CCT GTT TCC CAG CAT 3’3.2RNA的提取操作與1.2同。
3.3RT-PCR條件的優(yōu)化3.3.1cDNA的合成在PCR反應(yīng)管中，加入病毒RNA提取液1ul；下游引物(50pmol/ul)1ul；5×MMLV First strand Buffer 4ul；ddH2O 4ul；混勻后，90℃變性1min，瞬離置于冰上2min。再依次加入下列試劑dNTPs(10mmol/L)2ul；Rnasin(40U/ul)1ul；DTT(100mM)1ul；MgCl2(25mM)1ul；MMLV Reverse Transcriptase(200U/ul)1ul；ddH2O 4ul；37℃水浴1h，100℃滅活1min，-20℃保存?zhèn)溆谩?br> 3.3.2聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)50ul反應(yīng)體系中加入如下試劑cDNA 5ul；10×PCR buffer 5ul；10mM dNTPs 2ul；50pmol/ul的上、下游引物各0.7ul；Taq酶(5U/ul)0.3ul；超純無菌水36.3ul；混勻后離心，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR基本擴(kuò)增程序?yàn)?4℃預(yù)變性2min；94℃變性45sec，55℃退火30sec，72℃延伸2min；35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10min。反應(yīng)結(jié)束4℃保存。
瓊脂糖電泳檢測擴(kuò)增結(jié)果(如圖3)。用SEQ5、SEQ 6引物反轉(zhuǎn)錄PCR進(jìn)行體外擴(kuò)增，以提取的BYDV-PAV毒源的總RNA為模板的反應(yīng)呈陽性，擴(kuò)增產(chǎn)生1500bp的條帶一條，而以提取的BYDV-GPV和GAV的毒源及健康植株的總RNA為模板的反應(yīng)均呈陰性。表明引物是特異性的，該RT-PCR檢測體系可用于鑒別BYDV-PAV株系。
3.4基因的克隆及序列測定利用瓊脂糖電泳檢測擴(kuò)增結(jié)果，按照天為時(shí)代公司(中國北京清華大學(xué)學(xué)研大廈B座1115室)提供的PCR Fragment Recovery Kit使用說明書進(jìn)行PCR產(chǎn)物的回收。把PCR回收產(chǎn)物與pGEM-T Easy克隆載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM110，堿裂解法提取重組質(zhì)粒后，進(jìn)行PCR及酶切的鑒定。對鑒定得到陽性克隆進(jìn)行序列測定，DNA序列測定由上海華諾生物科技有限公司(中國上海市徐匯區(qū)石龍路345弄7號(hào)5樓)完成。獲得BYDV-PAV病毒目的基因的DNA序列。
3.5地高辛標(biāo)記的DNA探針制備以含有目的DNA片段的重組質(zhì)粒為模板，用PCR合成DIG探針試劑盒(購自Roche公司，貨號(hào)1636090)，通過PCR法合成相應(yīng)的DIG標(biāo)記的DNA探針。所用的dNTP底物中，含0.7mMDIG-11-dUTP，1.3mMdTTP，其余dNTP為2mM。擴(kuò)增病毒特異性基因片段，以此帶有DIG的特異片段作為探針。(如圖6)因地高辛分子量大，第3泳道的地高辛標(biāo)記的PCR產(chǎn)物比第2泳道的未標(biāo)記的PCR產(chǎn)物分子量的高，說明標(biāo)記較為成功。
3.6 DIG探針核酸斑點(diǎn)雜交剪取PolyNC(+)膜(購自Amersham pharmacia biotech公司)，戴手套操作，并剪去右上角，以便辨別方位，并用鉛筆在膜上做好標(biāo)記，以便區(qū)分；吸取1μl RNA樣品，點(diǎn)于膜上；120℃烤膜30min；將固定好的膜放入雜交袋中，加入2ml標(biāo)準(zhǔn)雜交緩沖液(50％甲酰胺)(按100cm2膜面積加20ml計(jì)算)，平放于培養(yǎng)皿中，50℃輕搖20min以上；探針用100℃沸水煮5min-10min，使之變性，立即置于冰上冷卻；更換雜交液，加入DIG探針使其濃度為5-30ng/ml，50℃，輕搖1.5小時(shí)以上；用2×洗液(2×SSC，0.1％SDS)洗膜2次，10-15min/次；0.5×洗液(0.5×SSC，0.1％SDS)于50℃洗膜2次，10min/次。
3.7免疫檢測用洗滌液(Buffer1+0.3％Tween)浸膜1min，以平衡膜；膜裝入袋中，按100cm2膜面積加20ml計(jì)算加入Buffer2(含1％封閉劑)2ml，趕出袋中氣泡，封袋，輕搖封閉20min以上；更換Buffer2，加入堿性磷酸酶標(biāo)記的DIG抗體(購自Roche公司)達(dá)工作濃度為(1∶7500)，趕出袋中氣泡，封膜，輕搖30min；棄抗體液，取出膜放入培養(yǎng)皿中，洗滌液洗膜2次，10min/次；用Buffer3平衡膜2min；倒出Buffer3，加入10ml顯色底物溶液(用前避免陽光直射)，暗處靜置顯色。一般顯色10-30min即可。觀察到理想的顯色結(jié)果后，將膜移入TE緩沖液(pH8.0)或滅菌水中終止反應(yīng)。
免疫檢測實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，BYDV-PAV的PCR產(chǎn)物與本發(fā)明制備的DIG探針有強(qiáng)烈的雜交信號(hào)，可用于PCR-Southern-blot實(shí)驗(yàn)。PAV病毒材料的RNA也與其DIG探針有明顯的雜交信號(hào)，而與GPV、PAV病毒材料及健株的RNA均無雜交信號(hào)(如圖9)。說明本發(fā)明制備的BYDV-PAV地高辛標(biāo)記的cDNA探針具有較好的特異性，基于該探針建立的BYDV-PAV核酸斑點(diǎn)雜交檢測體系可用于特異性地鑒別BYDV的PAV株系。
附錄1.BYDV-GPV株系的特異性引物的核苷酸序列SEQ15’ATG AGT ACG GTC GCC 3’(15bp)SEQ25’TTC GTC AAG CGT AAC TGT 3’(18bp)2.BYDV-GAV株系的特異性引物的核苷酸序列SEQ35’ATG AAT TCA GTA GGC CGT AGA A3’(22bp)SEQ45’GTC TCG GTT TCC TCC AAT GTG 3’(21bp)3.BYDV-PAV株系的特異性引物的核苷酸序列SEQ55’GTA CAA GGC AAA TGG CAC GAC 3’(21bp)SEQ65’GTT CTG CCT GTT TCC CAG CAT 3’(21bp)
權(quán)利要求
1.大麥黃矮病毒的特異性引物，其特征在于所述大麥黃矮病毒BYDV-GPV株系的特異性引物序列為SEQ1，SEQ2；所述大麥黃矮病毒BYDV-GAV株系的特異性引物序列為SEQ3，SEQ4；所述大麥黃矮病毒BYDV-PAV株系的特異性引物序列為SEQ5，SEQ6。
2.大麥黃矮病毒的探針制備方法，其特征在于運(yùn)用權(quán)利要求1所述的大麥黃矮病毒的特異性引物，以地高辛為標(biāo)記物，PCR法制得cDNA探針。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的大麥黃矮病毒的探針制備方法，所述特異性引物序列為SEQ1，SEQ2，所述PCR退火溫度52℃。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的大麥黃矮病毒的探針制備方法，所述特異性引物序列為SEQ3，SEQ4，所述PCR退火溫度50℃。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的大麥黃矮病毒的探針制備方法，所述特異性引物序列為SEQ5，SEQ6，所述PCR退火溫度55℃。
6.一種大麥黃矮病毒的檢測方法，其特征在于運(yùn)用權(quán)利要求2-5所述的任一制備方法的制得的探針建立的核酸斑點(diǎn)雜交檢測方法。
全文摘要
本發(fā)明“大麥黃矮病毒的特異性引物、探針制備及快速檢測方法”。大麥黃矮病毒的特異性引物，其特征在于大麥黃矮病毒GPV株系，特異性引物為SEQ 1，SEQ 2；大麥黃矮病毒GAV株系，特異性引物為SEQ 3，SEQ 4；大麥黃矮病毒PAV株系，特異性引物為SEQ5，SEQ 6。本發(fā)明以我國大麥黃矮病毒GPV、GAV和PAV三種株系為材料，采用其特異性引物，以非放射性物質(zhì)地高辛為標(biāo)記物，應(yīng)用PCR法有效地制備了大麥黃矮病毒GPV、GAV和PAV三種株系的cDNA探針，并建立了大麥黃矮病毒的核酸斑點(diǎn)雜交檢測技術(shù)，為大麥黃矮病毒株系間的特異性檢測提供了一種簡便、有效和安全的技術(shù)方法。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1710099SQ20051001197
公開日2005年12月21日 申請日期2005年6月21日 優(yōu)先權(quán)日2005年6月21日
發(fā)明者劉艷, 王錫鋒, 周廣和, 李莉 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所