專利名稱：縮膽囊素活性片段的串聯(lián)表達(dá)及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域。具體涉及表達(dá)縮膽囊素基因的重組質(zhì)粒的構(gòu)建、縮膽囊素基因在大腸桿菌中的表達(dá)和縮膽囊素基因工程產(chǎn)物的純化。本發(fā)明進(jìn)一步涉及重組縮膽囊素多肽對(duì)豬、兔、牛、雞等動(dòng)物的主動(dòng)免疫技術(shù)及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
縮膽囊素(Cholecystokinin，CCK)是一種調(diào)節(jié)動(dòng)物采食量的有效因子。縮膽囊素又稱膽囊收縮素或促胰酶素，是由小腸粘膜的I細(xì)胞分泌的多肽類激素。CCK前體為130個(gè)氨基酸，逐步分解成為小分子的CCK，目前發(fā)現(xiàn)的CCK有CCK-83，CCK-58，CCK-39，CCK-33，CCK-12，CCK-8和CCK-4。其不同部位主要在羧基端，但長(zhǎng)度延伸在氨基端。餐后血漿中主要為大分子CCK，包括CCK-58，CCK-39，CCK-33和CCK-12。這些大分子CCK經(jīng)胰蛋白酶水解后均成為8肽的氨基酸殘基，即CCK-8。CCK-8具有CCK分子的全部活性，與8肽的胃泌素結(jié)構(gòu)相似，都具有相同的氨基末端序列Gly-Trp-Met-Asp-Phe-NH2，該序列是CCK和胃泌素發(fā)揮其生物活性所必需的。CCK存在于腦和胃腸道中，是腦內(nèi)含量較高的一種腦腸肽(brain-gutpeptide)類物質(zhì)。CCK在各部位的含量則差別很大。在胃腸道，CCK可以促進(jìn)膽囊、胃和幽門括約肌的收縮；促進(jìn)遠(yuǎn)端十二指腸和空腸蠕動(dòng)；促進(jìn)膽汁、胃酸、胰液的分泌；增強(qiáng)胰酶的活性；促進(jìn)胰島素、胰高血糖素、降鈣素的釋放；調(diào)節(jié)胰多肽在腸道和胰液中的釋放；抑制胃排空等功能。CCK受體有兩種CCK-A受體和CCK-B受體，其中CCK-A受體在外周器官含量很高，而CCK-B受體在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中含量很高。CCK-A受體有兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)高親和力位點(diǎn)和低親和力位點(diǎn)。近年來的研究表明CCK是和CCK-A的低親和力位點(diǎn)結(jié)合使動(dòng)物產(chǎn)生飽感從而使動(dòng)物采食停止。
CCK可以降低多種動(dòng)物的采食量。CCK-A受體基因敲除大鼠表現(xiàn)為肥胖、易饑餓、采食增加(Schwartz等，1999)。研究發(fā)現(xiàn)，在多種動(dòng)物中，無論是外源性CCK，還是機(jī)體自身生成的內(nèi)源性CCK都能使機(jī)體產(chǎn)生飽感(Della等，1979，1981；Gibbs等，1973；Mc Laughlin等，1980)。外源性注入CCK也會(huì)降低動(dòng)物的采食量。中樞和外周引入CCK具有相同的降低采食量的作用，CCK作為神經(jīng)遞質(zhì)直接在腦內(nèi)產(chǎn)生飽感。小劑量CCK就可以有效地抑制動(dòng)物采食，在狗、鼠、兔、猴等多種哺乳動(dòng)物及人體實(shí)驗(yàn)研究中發(fā)現(xiàn)，無論生理劑量或藥理劑量的CCK都能抑制進(jìn)食后的胃排空活動(dòng)(Doong等，1998)，進(jìn)而抑制動(dòng)物采食。血漿CCK濃度與胃排空率呈反比關(guān)系。
對(duì)CCK免疫的研究已經(jīng)開展了較長(zhǎng)時(shí)間，早期研究表明，利用免疫調(diào)控技術(shù)可有效調(diào)控體內(nèi)激素的分泌，從而調(diào)節(jié)動(dòng)物的生產(chǎn)性能(Della等，1981；Lawrence等，1986；Pekas，1991，1993；Schanbacher等，1994)。目前，在豬和一些反芻動(dòng)物上已有以CCK為抗原進(jìn)行主動(dòng)免疫和被動(dòng)免疫的研究報(bào)道，結(jié)果表明對(duì)動(dòng)物生產(chǎn)性能有一定的調(diào)控作用。Jens等(1978)用CCK-33單獨(dú)免疫兔子，在加強(qiáng)免疫3次后，獲得了效價(jià)很高的抗CCK-33的抗血清，說明CCK有一定的抗原性，可以用來接種動(dòng)物使之產(chǎn)生抗體。而國(guó)內(nèi)，陳均輝(1992)用CCK-8大分子與牛血清蛋白(BSA)聯(lián)結(jié)形成全抗原免疫兔子，加強(qiáng)免疫后也獲得了高滴度的抗CCK-8抗血清。雖然CCK免疫調(diào)控在豬、羊上有一定效果，但為了在生產(chǎn)中能夠應(yīng)用該技術(shù)，必須尋找到一種CCK免疫原，其免疫用量少，免疫過程方便可行，抗體相對(duì)穩(wěn)定、易于保存使用，而且能大量生產(chǎn)抗體，又符合動(dòng)物保護(hù)法規(guī)的方法。
用CCK作抗原主動(dòng)免疫動(dòng)物可以提高動(dòng)物的采食量和增重。Pekas和Trout(1990)用CCK免疫生長(zhǎng)豬后，其采食量和增重分別提高了8.2％和10.6％，胴體重提高8.7％，體長(zhǎng)增加2.4％，對(duì)瘦肉/脂肪的比值和蛋白質(zhì)/脂肪的比值沒有影響，但CCK免疫豬的胴體瘦肉和脂肪重增加。由此可見，CCK免疫后，豬的生長(zhǎng)速度增加是因?yàn)殡伢w增重增加，但對(duì)胴體組成沒有影響。Mclaughlin等(1985)用CCK主動(dòng)免疫鼠后發(fā)現(xiàn)，處理組比對(duì)照組的采食量增加了9％(P＜0.04)，增重提高了17％(P＜0.02)。這些研究結(jié)果表明應(yīng)用CCK主動(dòng)免疫動(dòng)物對(duì)于動(dòng)物的采食具有一定的促進(jìn)作用，但結(jié)論也僅限于一些哺乳動(dòng)物，對(duì)于其它動(dòng)物方面的效果還有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí)。
以上研究都是將化學(xué)合成的，或者是從動(dòng)物組織中分離純化的CCK或其活性部分與大分子物質(zhì)(如BSA等)偶聯(lián)，然后免疫動(dòng)物。但還沒有采用大腸桿菌表達(dá)CCK或其活性片段(如CCK-33肽、CCK-8肽)的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一個(gè)獲得縮膽囊素活性片段多串聯(lián)體的方法。
本發(fā)明提供的獲得縮膽囊素活性片段多串聯(lián)體的方法的關(guān)鍵，是構(gòu)建表達(dá)縮膽囊素33肽的多串聯(lián)體的重組質(zhì)粒。該質(zhì)粒是采用基因工程方法獲得的，具體構(gòu)建方法如下(1)根據(jù)雞cck基因的堿基序列及大腸桿菌高頻密碼子，設(shè)計(jì)合成cck-33基因，基因序列為GGTTCTACTGGCCGCTTCTCTGTCCTTGGCAACCGTGTACAGAGCATTGATCCGACG CACCGTATTAATGACCGTGACTACATGGGCTGGATGGATTTT。
(2)將cck-33基因插入pRSETA質(zhì)粒，獲得重組質(zhì)粒pRSETA-1CCK，具體操作如下根據(jù)人工合成的cck-33基因設(shè)計(jì)特異性引物P1(5′-CATGGATCCGGTTCTACTGGCCGCT-3′)/P2(5′-CATGAGCTCCCAAAATCCATC CAGCC-3′)，采用PCR方法，以人工合成的cck-33基因?yàn)槟０?，擴(kuò)增cck-33基因片段。。擴(kuò)增cck-33基因片段的PCR反應(yīng)體系(200μL)組成如下20μL 10 ×buffer，16μL dNTPs，2μL Taq酶，1.5μL引物P1，1.5μL引物P2，0.5μL人工合成的cck-33基因模板，最后加水至總體積達(dá)到200μL。PCR溫度循環(huán)程序如下循環(huán)194℃ 3min；循環(huán)2～3194℃ 40sec，56℃40sec，72℃ 60sec；循環(huán)3272℃ 10min。擴(kuò)增產(chǎn)物在4℃保存。用2％瓊脂糖凝膠(含0.5μg/mL溴化乙錠，EB)電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，觀察到大小約120bp的特異性條帶。
用SacI和BamH I在37℃分別消化cck-33基因的PCR產(chǎn)物和質(zhì)粒pRSETA，接著在T4連接酶的作用之下，連接已消化的cck-33基因的PCR產(chǎn)物和質(zhì)粒pRSETA。用連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α。經(jīng)Ampr抗性篩選，獲得插入了cck-33基因的轉(zhuǎn)化子。然后用特異性引物P1/P2對(duì)含有cck-33基因的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行PCR篩選。檢測(cè)cck-33基因片段的PCR反應(yīng)體系(20μL)組成如下2μL 10×buffer，1.6μL dNTPs，0.2μL Taq酶，0.5μL引物P1，0.5μL引物P2，1μL待檢菌液，最后加水至總體積達(dá)到20μL。PCR溫度循環(huán)程序如下循環(huán)194℃ 3min；循環(huán)2～3194℃ 40sec，56℃ 40sec，72℃ 60sec；循環(huán)3272℃ 10min。擴(kuò)增產(chǎn)物在4℃保存。用2％瓊脂糖凝膠(含0.5μg/mL溴化乙錠，EB)電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，觀察到大小約120bp的特異性條帶。
對(duì)PCR篩選陽性的細(xì)菌，挑取單菌落接種于3mL LA培養(yǎng)基中，37℃，200r/m振搖培養(yǎng)16～20h，抽提質(zhì)粒，再經(jīng)限制性內(nèi)切酶消化和序列測(cè)定，獲得重組質(zhì)粒命名為pRSETA-1CCK。
(3)根據(jù)BamHI和Bg1II互為同尾酶的特性，構(gòu)建cck-33基因2串聯(lián)體(簡(jiǎn)稱2cck)，具體操作如下將重組質(zhì)粒pRSETA-1CCK用兩組酶在37℃進(jìn)行消化第一組用BamHI和HindIII進(jìn)行消化，回收較小的片段；第二組用BglII、HindIII和CIAP進(jìn)行消化，回收較大的片段。接著在T4連接酶的作用之下，連接回收的大片段和小片段。用連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α。經(jīng)Ampr抗性篩選，獲得攜帶2cck的重組子。然后用特異性引物P1/P2對(duì)含有2cck的重組子進(jìn)行PCR篩選。檢測(cè)2cck的PCR反應(yīng)體系(20μL)組成如下2μL 10×buffer，1.6μL dNTPs，0.2μL Taq酶，0.5μL引物P1，0.5μL引物P2，1μL待檢菌液，最后加水至總體積達(dá)到20μL。PCR溫度循環(huán)程序如下循環(huán)194℃ 3min；循環(huán)2～3194℃ 40sec，56℃ 40sec，72℃ 60sec；循環(huán)3272℃ 10min。擴(kuò)增產(chǎn)物在4℃保存。用2％瓊脂糖凝膠(含0.5μg/mL溴化乙錠，EB)電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，觀察到約230bp的特異性條帶。
對(duì)PCR篩選陽性的細(xì)菌，挑取單菌落接種于3mL LA培養(yǎng)基中，37℃，200r/m振搖培養(yǎng)16～20h，抽提質(zhì)粒，再經(jīng)限制性內(nèi)切酶消化和序列測(cè)定，獲得的重組質(zhì)粒命名為pRSETA-2CCK。
(4)在pRSETA-2CCK的基礎(chǔ)上構(gòu)建cck-33基因的4串聯(lián)體(簡(jiǎn)稱4cck)，具體操作如下
將重組質(zhì)粒pRSETA-2CCK用兩組酶在37℃進(jìn)行消化第一組用BamHI和HindIII進(jìn)行消化，回收較小的片段；第二組用BglII、HindIII和CIAP進(jìn)行消化，回收較大的片段。接著在T4連接酶的作用之下，連接回收的大片段和小片段。用連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α。經(jīng)Ampr抗性篩選，獲得攜帶4cck的重組子。然后用特異性引物P3(5’-GATAAGGATCGATGGGGATCC-3’)/P4(5’-ATGGTACCAGCTGCAGATCT-3’)對(duì)含有4cck的重組子進(jìn)行PCR篩選。對(duì)PCR篩選陽性的細(xì)菌，挑取單菌落接種于3mL LA培養(yǎng)基中，37℃，200r/m振搖培養(yǎng)16～20h，抽提質(zhì)粒，再經(jīng)限制性內(nèi)切酶消化和序列測(cè)定，獲得的重組質(zhì)粒命名為pRSETA-4CCK。
采用相同的方法，分別獲得攜帶CCK-33基因6串聯(lián)體(簡(jiǎn)稱6cck)、8串聯(lián)體(簡(jiǎn)稱8cck)的重組質(zhì)粒，相應(yīng)地命名為pRSETA-6CCK、pRSETA-8CCK。
獲得表達(dá)CCK-33肽多串聯(lián)體的重組質(zhì)粒后，用重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌，獲得表達(dá)CCK-33肽多串聯(lián)體的基因工程菌，然后在IPTG的誘導(dǎo)之下，表達(dá)CCK-33肽多串聯(lián)體，并對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行鑒定和純化。以CCK-33肽4串聯(lián)體(簡(jiǎn)稱4CCK)的表達(dá)為例，方法如下(1)經(jīng)測(cè)序鑒定的重組質(zhì)粒pRSETA-4CCK轉(zhuǎn)化E.coLi BL-21(DE3)受體菌，挑取單個(gè)重組菌落，接種于3mL LA液體培養(yǎng)基中，37℃振搖培養(yǎng)5h后，用特異性引物P3/P4進(jìn)行PCR鑒定，陽性菌為可表達(dá)cck-33基因4串聯(lián)體的基因工程菌，命名為E-4CCK。
(2)取E-4CCK在LA平板上于37℃劃線培養(yǎng)16～20小時(shí)。挑取單個(gè)菌落在LA液體培養(yǎng)基中于37℃培養(yǎng)12～16小時(shí)，將菌液置于4℃冰箱保存。按1％比例接種LA液體培養(yǎng)基，37℃，200r/m振搖培養(yǎng)至OD600值達(dá)0.5左右時(shí)，加入終濃度為1mmol/L的IPTG，分別在加入IPTG后0、1、2、3、4小時(shí)取菌液，用SDS-PAGE進(jìn)行鑒定。用CCK陽性血清對(duì)表達(dá)的融合蛋白進(jìn)行Western Blot分析。
SDS-PAGE方法如下將細(xì)菌懸液于10000r/m離心1min，取沉淀。加入一定量的雙蒸水，重懸細(xì)菌。將樣品保存在4℃冰箱備用。參照汪家政等(2000)編《蛋白質(zhì)手冊(cè)》方法制備SDS-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)。成層膠濃度為5％，分離膠濃度為12～15％，根據(jù)所檢測(cè)的目的產(chǎn)物的分子量而定。將待檢樣品煮沸5min，取10μL加入凝膠點(diǎn)樣孔中，在電場(chǎng)作用下進(jìn)行電泳。電泳緩沖液為Tris-甘氨酸。電壓為80v/cm，待溴酚藍(lán)到達(dá)成層膠底部時(shí)電壓升高到160v/cm。待溴酚藍(lán)接近凝膠底部時(shí)，停止電泳，取下凝膠，置于1％考馬斯亮藍(lán)溶液中染色過夜，用脫色液脫色。
Western Blot分析方法如下SDS-PAGE電泳結(jié)束后，不對(duì)凝膠進(jìn)行染色。剪一張與凝膠相同大小的硝酸纖維素膜及兩張濾紙，與電泳之后的凝膠一起在室溫浸泡在轉(zhuǎn)移緩沖液中15min，按海綿-濾紙-凝膠-硝酸纖維素膜-濾紙-海綿的順序安裝轉(zhuǎn)印夾。將夾中有膜的一側(cè)接正極，并在15V的電壓下轉(zhuǎn)移1.5h。轉(zhuǎn)移后的膜用5％脫脂奶粉封閉過夜，棄去封閉液，用TBS洗膜三次。棄去TBS，加入用1％脫脂奶粉1000倍稀釋的兔抗CCK-8肽陽性血清(SIGMA公司)，溫和振搖3h。棄去一抗血清，用TBS洗膜三次，每次約10min。棄去TBS，加入用1％脫脂奶粉50倍稀釋的二抗(辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體，華美公司)，溫和振搖至少1h。棄去二抗，用TBS洗膜三次，每次約30min。棄去TBS，加入DAB溶液顯色，輕搖硝酸纖維素膜，待顯色達(dá)一定程度，用雙蒸水洗膜終止顯色反應(yīng)。
(3)將IPTG誘導(dǎo)表達(dá)的E-4CCK菌體收集后，于0℃冰浴上進(jìn)行超聲破碎、離心后，沉淀用8mol/L的尿素進(jìn)行溶解。用50％Ni-NTA純化樹脂在變性條件下進(jìn)行純化。具體操作如下將1000mL基因工程菌E-4CCK在IPTG誘導(dǎo)表達(dá)4h取樣，4℃10000r/m離心2min，收集菌體并保存在-20℃；將表達(dá)的保存細(xì)菌菌體沉淀置冰上解凍15min，加20mL Buffer B懸浮細(xì)菌，將懸浮液在冰浴條件下置搖床上溫和搖動(dòng)30min，充分變性裂解包涵體，然后在冰浴中進(jìn)行超聲破碎，超聲時(shí)間為6秒，間隔時(shí)間為8秒，功率為400W，破碎次數(shù)40次。4℃ 10000r/m離心20min，取上清液進(jìn)行純化。
將純化柱中裝入20mL的Buffer B，將50％Ni-NTA純化樹脂混勻，取出4mL裝柱，待樹脂沉淀好后，將純化柱的開關(guān)關(guān)閉，用Buffer B平衡純化柱，約需12h。用Buffer B清洗純化柱。待Buffer B即將流盡(但不能流干)時(shí)將裂解上清2mL緩慢加入到純化柱中，然后依次用4mL BufferC、4mL Buffer D、4mL Buffer E過柱洗脫，并分別收集樣品。將以上樣品進(jìn)行SDS-PAGE分析。純化用緩沖液Buffer B、Buffer C、Buffer D、Buffer E必須新鮮配制，其組成如下Buffer B100mmol/L NaH2PO4、10mmol/L Tris HCL、8mol/L尿素，pH8.0；Buffer C100mmol/L NaH2PO4、10mmol/L Tris-HCL、8mol/L尿素，pH6.3；Buffer D100mmol/L NaH2PO4、10mmol/L Tris-HCL、8mol/L尿素，pH5.9；Buffer E100mmol/L NaH2PO4、10mmol/L Tris-HCL、8mol/L尿素，pH4.5。
經(jīng)50％Ni-NTA樹脂純化的蛋白再用透析袋透析。用棉繩將透析袋的一側(cè)系緊，將適量的蛋白純化溶液裝在透析袋內(nèi)，再將透析袋的另一側(cè)用棉繩系緊；將裝有純化蛋白的透析袋放置在大體積的透析液I中，4℃下在磁力攪拌器上進(jìn)行攪拌4～5h。依次更換透析液II、III、IV、V、VI、VII、VIII，重復(fù)上述操作過程。最后透析袋放置在大體積的生理鹽水中，4℃下在磁力攪拌器上進(jìn)行攪拌4～5h。透析袋埋在硅膠里進(jìn)行蛋白濃縮，將濃縮后的蛋白取出放在4℃冰箱保存。透析液的組成如下透析液I6mol/L尿素、10mmol/L Tris-HCL、0.1mol/L NaH2PO4，pH4.5；透析液II6mol/L尿素、10mmol/L Tris-HCL、0.1mol/L NaH2PO4，pH5.5；透析液III4mol/L尿素、10mmol/L Tris-HCL、0.1mol/L NaH2PO4，pH5.5；透析液IV4mol/L尿素、10mmol/L Tris-HCL、0.1mol/L NaH2PO4，pH6.5；透析液V2mol/L尿素、10mmol/L Tris-HCL、0.1mol/L NaH2PO4，pH6.5；透析液VI2mol/L尿素、10mmol/L Tris-HCL、0.1mol/L NaH2PO4，pH7.5；透析液VII10mmol/L Tris-HCL、0.1mol/L NaH2PO4，pH7.5；透析液VIII10mmol/L Tris-HCL、0.1mol/L NaH2PO4，pH8.5。
本發(fā)明提供的表達(dá)CCK-33肽多串聯(lián)體的重組質(zhì)粒的特征為(1)本發(fā)明提供的重組質(zhì)粒pRSETA-1CCK、pRSETA-2CCK、pRSETA-4CCK、pRSETA-6CCK、pRSETA-8CCK都具有序列表中序列1的核苷酸序列，或序列1的串聯(lián)體序列。序列1又稱為cck-33基因，由99個(gè)堿基對(duì)組成，是根據(jù)雞cck基因的堿基序列及大腸桿菌高頻密碼子而設(shè)計(jì)的。序列1的串聯(lián)體序列，是用若干個(gè)堿基將兩個(gè)cck-33基因以首尾相連的方式，將若干個(gè)cck-33基因連接起來形成的序列。對(duì)于序列1和序列1的多串聯(lián)體，采用PCR方法可以擴(kuò)增出特異性條帶，也可以采用DNA序列測(cè)定的方法進(jìn)行確定。
(2)本發(fā)明提供的重組質(zhì)粒的表達(dá)產(chǎn)物具有序列表中序列2的氨基酸序列，或序列2的串聯(lián)體序列。序列2又稱為CCK-33肽，是由序列1編碼的。序列2的串聯(lián)體序列，是用若干個(gè)氨基酸將兩個(gè)CCK-33肽以首尾相連的方式，將若干個(gè)CCK-33肽連接起來形成的序列。采用抗CCK-33肽的特異性抗體，或者抗CCK-8肽的特異性抗體，或者抗其它形式的CCK的特異性抗體，都可以檢測(cè)到該多肽產(chǎn)物。
(3)本發(fā)明提供的重組質(zhì)粒還包括具有cck等同序列的質(zhì)粒。cck等同序列，是與cck-33基因的核苷酸序列，或CCK-33肽的氨基酸殘基序列相比有一個(gè)或若干個(gè)核苷酸或氨基酸殘基的差別，包括堿基或氨基酸殘基的改變、缺失、添加、或插入，或與cck-33基因序列中的連續(xù)24個(gè)堿基以上的區(qū)段有75％以上的同源性。
本發(fā)明提供的重組CCK-33肽多串聯(lián)體具有重要的應(yīng)用價(jià)值。應(yīng)用之一是將所述的重組CCK-33肽多串聯(lián)體作為抗原，采用重組CCK-33肽多串聯(lián)體直接免疫或?qū)⑵渑c佐劑同時(shí)免疫豬、牛、兔、雞等動(dòng)物，可以促進(jìn)動(dòng)物采食，提高生產(chǎn)性能。
本發(fā)明提供的重組CCK-33肽多串聯(lián)體的第二個(gè)應(yīng)用，是采用重組CCK-33肽多串聯(lián)體直接免疫或?qū)⑵渑c佐劑配合制成疫苗免疫蛋雞，通過收集免疫雞的雞蛋，可以大量獲得抗CCK的特異性抗體。
本發(fā)明提供的重組CCK-33肽多串聯(lián)體的另一個(gè)應(yīng)用，是將所述的重組CCK-33肽多串聯(lián)體作為抗原，應(yīng)用于包括但不限于ELISA(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn))，檢測(cè)動(dòng)物血清中的CCK特異性抗體。
本發(fā)明具有明顯的優(yōu)點(diǎn)和效果。(1)本發(fā)明根據(jù)大腸桿菌偏愛密碼子設(shè)計(jì)基因序列，采用基因工程的方法表達(dá)CCK-33肽多串聯(lián)體，表達(dá)量高，成本低。(2)本發(fā)明獲得的CCK-33肽多串聯(lián)體具有很好的免疫原性。CCK在動(dòng)物體內(nèi)主要以羥基端酰胺化的CCK-8和CCK-33的形式存在。由于CCK-33和CCK-8的分子量太小，不能直接作為抗原免疫動(dòng)物，一般需要將它們與大分子物質(zhì)(如BSA)偶聯(lián)。而本發(fā)明將CCK-33肽進(jìn)行串聯(lián)，獲得的CCK-33肽多串聯(lián)體分子量大，抗原位點(diǎn)增加，免疫原性好，因此不需要與大分子物質(zhì)偶聯(lián)就可以作為抗原免疫動(dòng)物。和化學(xué)合成方法獲得CCK蛋白相比，該方法具有明顯的優(yōu)點(diǎn)。
以下結(jié)合實(shí)施例和附圖對(duì)本發(fā)明提供的表達(dá)CCK-33肽多串聯(lián)體質(zhì)粒的構(gòu)建、表達(dá)產(chǎn)物的特征分析、應(yīng)用途徑作具體說明。


圖1為cck-33基因及其多串聯(lián)體構(gòu)建示意圖。pRSET A為克隆質(zhì)粒載體，pRSETA-1CCK為插入了cck-33基因的重組質(zhì)粒，pRSETA-2CCK為插入了cck-33基因2串聯(lián)體(2cck)的重組質(zhì)粒，pRSETA-4CCK為插入了cck-33基因4串聯(lián)體(4cck)的重組質(zhì)粒，pRSETA-6CCK為插入了cck-33基因6串聯(lián)體(6cck)的重組質(zhì)粒，pRSETA-8CCK為插入了cck-33基因8串聯(lián)體(8cck)的重組質(zhì)粒。BamHI、HindIII、BglII、SacI是質(zhì)粒上的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)。
圖2為cck-33基因及其多串聯(lián)體的PCR鑒定結(jié)果圖。泳道1或2是cck-33基因及其多串聯(lián)體的PCR產(chǎn)物，泳道M為DNA分子量標(biāo)記。A為cck-33基因PCR產(chǎn)物，B為cck-33基因4串聯(lián)體(4cck)PCR產(chǎn)物，C為cck-33基因8串聯(lián)體(8cck)PCR產(chǎn)物。
圖3為用限制性內(nèi)切酶BamH I和HindIII分別對(duì)重組質(zhì)粒pRSETA-1CCK、pRSETA-2CCK、pRSETA-4CCK、pRSETA-6CCK和pRSETA-8CCK進(jìn)行雙酶切的電泳鑒定圖。M為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)DL2000；1泳道為pRSETA-1CCK質(zhì)粒酶切產(chǎn)物，外源片斷大小約為120bp；2泳道為pRSETA-2CCK質(zhì)粒酶切產(chǎn)物，外源片斷大小約為230bp；3泳道為pRSETA-4CCK質(zhì)粒酶切產(chǎn)物，外源片斷大小約為450bp；4泳道為pRSETA-6CCK質(zhì)粒酶切產(chǎn)物，外源片斷大小約為700bp；5泳道為pRSETA-8CCK質(zhì)粒酶切產(chǎn)物，外源片斷大小約為1100bp。
圖4為大腸桿菌表達(dá)CCK-33肽4串聯(lián)體(4CCK)表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE(12％)檢測(cè)圖。M為蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)；1～5泳道為在1mmol/L的IPTG誘導(dǎo)下的含有CCK-33肽4串聯(lián)體(4CCK)表達(dá)產(chǎn)物的細(xì)菌裂解物，誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)間分別為0h、1h、2h、3h和4h。箭頭所指為CCK-33肽4串聯(lián)體(4CCK)表達(dá)產(chǎn)物。
圖5為大腸桿菌表達(dá)的CCK-33肽6串聯(lián)體(6CCK)表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE(12％)檢測(cè)圖。M為蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)；1～4泳道為在1mmol/L的IPTG誘導(dǎo)下的含有CCK-33肽6串聯(lián)體(6CCK)表達(dá)產(chǎn)物的細(xì)菌裂解物，誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)間分別為0h、1h、2h和3h。箭頭所指為CCK-33肽6串聯(lián)體(6CCK)表達(dá)產(chǎn)物，分子量約為27kD。
圖6為CCK-33肽4串聯(lián)體表達(dá)產(chǎn)物的免疫印跡(westernblot)檢測(cè)圖。M為蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)；1為CCK-33肽4串聯(lián)體(4CCK)表達(dá)產(chǎn)物。
圖7為CCK-33肽4串聯(lián)體(4CCK)表達(dá)產(chǎn)物親和層析純化過程中不同階段組分的SDS-PAGE檢測(cè)圖。M為蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)；1～2為洗脫液E洗脫組分；3為洗脫液D洗脫組分；4為洗脫液C洗脫組分；5～6為洗脫液B洗脫組分；7為未經(jīng)純化的含有4CCK表達(dá)產(chǎn)物的細(xì)菌裂解物；8為不含有4CCK表達(dá)產(chǎn)物的細(xì)菌裂解物。
圖8為CCK-33肽4串聯(lián)體(4CCK)融合蛋白透析后的SDS-PAGE檢測(cè)圖。M為蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；1-2泳道為透析后的4CCK融合蛋白，分子量約約為21kD。
實(shí)施方法1、表達(dá)縮膽囊素33肽的重組質(zhì)粒的構(gòu)建首先根據(jù)雞cck基因的堿基序列及大腸桿菌高頻密碼子，設(shè)計(jì)合成cck-33基因，基因序列為GGTTCTACTGGCCGCTTCTCTGTCCTTGGCAACCGTGTACAGAGCATTGATCCGACGCACCGTATTAATGACCGTGACTACATGGGCTGGATGGATTTT。然后，將cck-33基因插入pRSETA質(zhì)粒，獲得重組質(zhì)粒pRSETA-1CCK，具體操作如下根據(jù)人工合成的cck-33基因設(shè)計(jì)特異性引物P1(5’-CATGGATCCGGTTCTACTGGCCGCT-3’)/P2(5’-CATGAGCTCCCAAAATCCATCCAGCC-3’)，采用PCR方法，以人工合成的cck-33基因?yàn)槟０?，擴(kuò)增cck-33基因片段。擴(kuò)增cck-33基因片段的PCR反應(yīng)體系(200μL)組成如下20μL10×buffer，16μL dNTPs，2μL Taq酶，1.5μL引物P1，1.5μL引物P2，0.5μL人工合成的cck-33基因模板，最后加水至總體積達(dá)到200μL。PCR溫度循環(huán)程序如下循環(huán)194℃ 3min；循環(huán)2～3194℃ 40sec，56℃ 40sec，72℃ 60sec；循環(huán)3272℃ 10min。擴(kuò)增產(chǎn)物在4℃保存。用2％瓊脂糖凝膠(含0.5μg/mL溴化乙錠，EB)電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，觀察到特異性條帶。
用SacI和BamHI在37℃分別消化cck-33基因的PCR產(chǎn)物和質(zhì)粒pRSETA，接著在T4連接酶的作用之下，連接消化的cck-33基因的PCR產(chǎn)物和質(zhì)粒pRSETA。用連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α。經(jīng)Ampr抗性篩選，獲得插入了cck-33基因的轉(zhuǎn)化子。然后用特異性引物P1/P2對(duì)含有cck-33基因的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行PCR篩選。檢測(cè)cck-33基因片段的PCR反應(yīng)體系(20μL)組成如下2μL 10×buffer，1.6μL dNTPs，0.2μL Taq酶，0.5μL引物P1，0.5μL引物P2，1μL待檢菌液，最后加水至總體積達(dá)到20μL。PCR溫度循環(huán)程序如下循環(huán)194℃ 3min；循環(huán)2～3194℃ 40sec，56℃40sec，72℃ 60sec；循環(huán)3272℃ 10min。擴(kuò)增產(chǎn)物在4℃保存。用2％瓊脂糖凝膠(含0.5μg/mL溴化乙錠，EB)電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，觀察到特異性條帶(圖2)。對(duì)PCR篩選陽性的細(xì)菌，挑取單菌落接種于3mL LA培養(yǎng)基中，37℃，200r/m振搖培養(yǎng)16～20h，抽提質(zhì)粒，再經(jīng)限制性內(nèi)切酶消化和序列測(cè)定，獲得重組質(zhì)粒命名為pRSETA-1CCK。
2、表達(dá)縮膽囊素33肽2串聯(lián)體(2CCK)的重組質(zhì)粒的構(gòu)建在獲得表達(dá)CCK-33肽重組質(zhì)粒pRSETA-1CCK的基礎(chǔ)上，根據(jù)BamH I和Bgl II互為同尾酶的特性，構(gòu)建cck-33基因的2串聯(lián)體(2cck)，具體操作如下將重組質(zhì)粒pRSETA-1CCK用兩組酶在37℃進(jìn)行消化第一組用BamHI和HindIII進(jìn)行消化，回收較小的片段；第二組用BglII、HindIII和CIAP進(jìn)行消化，回收較大的片段。接著在T4連接酶的作用之下，連接回收的大片段和小片段。用連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α。經(jīng)Ampr抗性篩選，獲得攜帶2cck的重組子。然后用特異性引物P1/P2對(duì)含有CCK-33基因2串聯(lián)體的重組子進(jìn)行PCR篩選。PCR方法參照“實(shí)施方法1”。對(duì)PCR篩選陽性的細(xì)菌，挑取單菌落接種于3mL LA培養(yǎng)基中，37℃，200r/m振搖培養(yǎng)16～20h，抽提質(zhì)粒，再經(jīng)限制性內(nèi)切酶消化和序列測(cè)定，獲得的重組質(zhì)粒命名為pRSETA-2CCK。
3、表達(dá)縮膽囊素33肽4串聯(lián)體(4CCK)的重組質(zhì)粒的構(gòu)建在獲得表達(dá)縮膽囊素33肽2串聯(lián)體(2CCK)重組質(zhì)粒pRSETA-2CCK之后，在pRSETA-2CCK的基礎(chǔ)上，根據(jù)BamHI和Bg1II互為同尾酶的特性，構(gòu)建表達(dá)CCK33肽4串聯(lián)體(4CCK)的重組質(zhì)粒，具體操作如下將重組質(zhì)粒pRSETA-2CCK用兩組酶在37℃進(jìn)行消化第一組用BamHI和HindIII進(jìn)行消化，回收較小的片段；第二組用Bg1II、HindIII和CIAP進(jìn)行酶消化，回收較大的片段。接著在T4連接酶的作用之下，連接回收的大片段和小片段。用連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α。經(jīng)Ampr抗性篩選，獲得攜帶CCK-33基因4串聯(lián)體(4cck)的重組子。然后用特異性引物P3(5’-GATAAGGATCGATGGGGATCC-3’)/P4(5’-ATGGTACCAGCTGCAGATCT-3’)對(duì)含有4cck的重組子進(jìn)行PCR篩選。PCR方法參照“實(shí)施方法1”。電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，觀察到特異性條帶(圖2)。對(duì)PCR篩選陽性的細(xì)菌，挑取單菌落接種于3mL LA培養(yǎng)基中，37℃，200r/m振搖培養(yǎng)16～20h，抽提質(zhì)粒，再經(jīng)限制性內(nèi)切酶消化和序列測(cè)定，獲得的重組質(zhì)粒命名為pRSETA-4CCK。
4、表達(dá)縮膽囊素33肽6串聯(lián)體(6CCK)的重組質(zhì)粒的構(gòu)建在獲得表達(dá)縮膽囊素33肽2串聯(lián)體(2CCK)重組質(zhì)粒pRSETA-2CCK和表達(dá)縮膽囊素33肽4串聯(lián)體(4CCK)重組質(zhì)粒pRSETA-4CCK之后，根據(jù)BamHI和BglII互為同尾酶的特性，構(gòu)建表達(dá)CC-K33肽6串聯(lián)體(6CCK)的重組質(zhì)粒，具體操作如下將重組質(zhì)粒pRSETA-2CCK用BamHI和HindIII在37℃進(jìn)行消化，回收較小的片段；將重組質(zhì)粒pRSETA-4CCK用BglII、HindIII和CIAP進(jìn)行消化，回收較大的片段。接著在T4連接酶的作用之下，連接回收的大片段和小片段。用連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α。經(jīng)Ampr抗性篩選，獲得攜帶6cck的重組子。然后用特異性引物P3/P4對(duì)含有6cck的重組子進(jìn)行PCR篩選。PCR方法參照“實(shí)施方法1”。對(duì)PCR篩選陽性的細(xì)菌，挑取單菌落接種于3mL LA培養(yǎng)基中，37℃，200r/m振搖培養(yǎng)16～20h，抽提質(zhì)粒，再經(jīng)限制性內(nèi)切酶消化和序列測(cè)定，獲得的重組質(zhì)粒命名為pRSETA-6CCK。
5、表達(dá)縮膽囊素33肽8串聯(lián)體(8CCK)的重組質(zhì)粒的構(gòu)建在獲得表達(dá)縮膽囊素33肽2串聯(lián)體(2CCK)重組質(zhì)粒pRSETA-2CCK和表達(dá)縮膽囊素3 3肽6串聯(lián)體(6CCK)重組質(zhì)粒pRSETA-6CCK之后，根據(jù)BamH I和BglII互為同尾酶的特性，構(gòu)建表達(dá)CCK-33肽8串聯(lián)體(8CCK)的重組質(zhì)粒，具體操作如下將重組質(zhì)粒pRSETA-2CCK用BamHI和HindIII在37℃進(jìn)行消化回收較小的片段；將重組質(zhì)粒pRSETA-6CCK用BglII、HindIII和CIAP進(jìn)行消化，回收較大的片段。接著在T4連接酶的作用之下，連接回收的大片段和小片段。用連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α。經(jīng)Ampr抗性篩選，獲得攜帶cck-33基因8串聯(lián)體(8cck)的重組子。然后用特異性引物P3/P4對(duì)含有8cck的重組子進(jìn)行PCR篩選。PCR方法參照“實(shí)施方法1”。電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，觀察到特異性條帶(圖2)。對(duì)PCR篩選陽性的細(xì)菌，挑取單菌落接種于3mLLA培養(yǎng)基中，37℃，200r/m振搖培養(yǎng)16～20h，抽提質(zhì)粒，再經(jīng)限制性內(nèi)切酶消化和序列測(cè)定，獲得的重組質(zhì)粒命名為pRSETA-8CCK。
6、縮膽囊素33肽4串聯(lián)體(4CCK)在大腸桿菌中的表達(dá)與鑒定首先，將經(jīng)過測(cè)序鑒定的重組質(zhì)粒pRSETA-4CCK轉(zhuǎn)化E.coLi BL-21(DE3)受體菌，挑取單個(gè)重組菌落，接種于3mL LA液體培養(yǎng)基中，37℃振搖培養(yǎng)5h后，用特異性引物P3/P4做PCR鑒定，陽性菌為可表達(dá)4CCK的基因工程菌，命名為E-4CCK。
然后，取E-4CCK在LA平板上于37℃劃線培養(yǎng)16～20小時(shí)。挑取單個(gè)菌落在LA液體培養(yǎng)基中于37℃培養(yǎng)12～16h，將菌液置于4℃冰箱保存。按1％比例接種LA液體培養(yǎng)基，37℃，200r/m振搖培養(yǎng)至OD600值達(dá)0.5左右時(shí)，加入終濃度為1mmol/L的IPTG，分別在加入I PTG后0、1、2、3、4h取菌液，用SDS-PAGE進(jìn)行鑒定。用CCK陽性血清對(duì)表達(dá)的融合蛋白進(jìn)行Western Blot分析。
SDS-PAGE方法如下將細(xì)菌懸液于10000r/m離心1min，取沉淀。加入一定量的雙蒸水，重懸細(xì)菌。將樣品保存在4℃冰箱備用。參照汪家政等(2000)編《蛋白質(zhì)手冊(cè)》方法制備SDS-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)。成層膠濃度為5％，分離膠濃度為12％。將待檢樣品煮沸5min，取10μL加入凝膠點(diǎn)樣孔中，在電場(chǎng)作用下進(jìn)行電泳。電泳緩沖液為Tris-甘氨酸。電壓為80v/cm，待溴酚藍(lán)到達(dá)成層膠底部時(shí)電壓升高到160v/cm。待溴酚藍(lán)接近凝膠底部時(shí)，停止電泳，取下凝膠，置于1％考馬斯亮藍(lán)溶液中染色過夜，用脫色液脫色。電泳結(jié)果(圖4)表明，4CCK融合蛋白的分子量約為21kD。隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)，表達(dá)產(chǎn)物的量逐步增加，3h后趨于穩(wěn)定。用VL凝膠成像系統(tǒng)BioID++程序?qū)﹄娪窘Y(jié)果進(jìn)行掃描分析，結(jié)果如下(表1)。
表1 CCK33肽4串聯(lián)體(4CCK)在細(xì)菌總蛋白中的含量(％)

Western Blot分析方法如下SDS-PAGE電泳結(jié)束后，不對(duì)凝膠進(jìn)行染色。剪一張與凝膠相同大小的硝酸纖維素膜及兩張濾紙，與電泳之后的凝膠一起在室溫浸泡在轉(zhuǎn)移緩沖液中15min，按海綿-濾紙-凝膠-硝酸纖維素膜-濾紙-海綿的順序安裝轉(zhuǎn)印夾。將夾中有膜的一側(cè)接正極，并在15V的電壓下轉(zhuǎn)移1.5h。轉(zhuǎn)移后的膜用5％脫脂奶粉封閉過夜，棄去封閉液，用TBS洗膜三次。棄去TBS，加入用1％脫脂奶粉1000倍稀釋的兔抗CCK-8肽陽性血清(Sigma公司)，溫和振搖3h。棄去一抗血清，用TBS洗膜三次，每次約10min。棄去TBS，加入用1％脫脂奶粉50倍稀釋的二抗(辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體，華美公司)，溫和振搖至少1h。棄去二抗，用TBS洗膜三次，每次約30min。棄去TBS，加入DAB溶液顯色，輕搖硝酸纖維素膜，待顯色達(dá)一定程度，用雙蒸水洗膜終止顯色反應(yīng)。在21kD位置可見一特異性條帶(圖6)。
7縮膽囊素33肽4串聯(lián)體(4CCK)的純化將IPTG誘導(dǎo)表達(dá)的E-4CCK菌體收集后，于0℃冰浴上進(jìn)行超聲破碎、離心后，沉淀用8mol/L的尿素進(jìn)行溶解。用50％Ni-NTA純化樹脂在變性條件下進(jìn)行純化。具體操作如下將1000mL基因工程菌E-4CCK在IPTG誘導(dǎo)表達(dá)4h取樣，4℃10000r/m離心2min，收集菌體并保存在-20℃；將保存的細(xì)菌菌體沉淀置冰上解凍15min，加20mL Buffer B懸浮細(xì)菌，將懸浮液在冰浴條件下置搖床上溫和搖動(dòng)30min，充分變性裂解包涵體，然后在冰浴中進(jìn)行超聲破碎，超聲時(shí)間為6秒，間隔時(shí)間為8秒，功率為400W，破碎次數(shù)40次。4℃ 10000r/m離心20min，取上清進(jìn)行純化。
往純化柱中裝入20mL的Buffer B，將純化樹脂50％Ni-NTA混勻，取出4mL裝柱，待樹脂沉淀好后，將純化柱的開關(guān)關(guān)閉，用Buffer B平衡純化柱，約需12h。用Buffer B清洗純化柱。待Buffer B即將流盡(但不能流干)時(shí)將裂解上清2mL緩慢加入到純化柱中，然后依次用4mLBuffer C、4mL Buffer D、4mL Buffer E過柱洗脫，并分別收集樣品。純化用緩沖液Buffer B、Buffer C、Buffer D、Buffer E必須新鮮配制，其組成如下Buffer B100mmol/L NaH2PO4、10mmol/L Tris HCL、8mol/L尿素，pH8.0；Buffer C100mmol/L NaH2PO4、10mmol/L Tris-HCL、8mol/L尿素，pH6.3；
Buffer D100mmol/L NaH2PO4、10mmol/L Tris-HCL、8mol/L尿素，pH5.9；Buffer E100mmol/L NaH2PO4、10mmol/L Tris-HCL、8mol/L尿素，pH4.5。
將以上樣品進(jìn)行SDS-PAGE分析，可見Buffer E的洗脫物中有較純的目的蛋白(圖7)。
經(jīng)50％Ni-NTA樹脂純化的蛋白再用透析袋透析。用棉繩將透析袋的一側(cè)系緊，將適量的蛋白純化溶液裝在透析袋內(nèi)，再將透析袋的另一側(cè)用棉繩系緊；將裝有純化蛋白的透析袋放置在大體積的透析液I中，4℃下在磁力攪拌器上進(jìn)行攪拌4～5h。依次更換透析液II、III、IV、V、VI、VII、VIII，重復(fù)上述操作過程。透析液組成如下透析液I6mol/L尿素、10mmol/L Tris-HCL、0.1mol/L NaH2PO4，pH4.5；透析液II6mol/L尿素、10mmol/L Tris-HCL、0.1mol/L NaH2PO4，pH5.5；透析液III4mol/L尿素、10mmol/L Tris-HCL、0.1mol/L NaH2PO4，pH5.5；透析液IV4mol/L尿素、10mmol/L Tris-HCL、0.1mol/L NaH2PO4，pH6.5；透析液V2mol/L尿素、10mmol/L Tris-HCL、0.1mol/L NaH2PO4，pH6.5；透析液VI2mol/L尿素、10mmol/L Tris-HCL、0.1mol/L NaH2PO4，pH7.5；透析液VII10mmol/L Tris-HCL、0.1mol/L NaH2PO4，pH7.5；透析液VIII10mmol/L Tris-HCL、0.1mol/L NaH2PO4，pH8.5。
最后透析袋放置在大體積的生理鹽水中，4℃下在磁力攪拌器上進(jìn)行攪拌4～5h。透析袋埋在硅膠里進(jìn)行蛋白濃縮，將濃縮后的蛋白取出放在4℃冰箱保存。將濃縮后的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)，電泳圖上可見透析后的蛋白只有一條帶(圖8)。
8、縮膽囊素33肽6串聯(lián)體(6cck)在大腸桿菌中的表達(dá)首先，將經(jīng)過測(cè)序鑒定的重組質(zhì)粒pRSETA-6CCK轉(zhuǎn)化E.coLi BL-21(DE3)受體菌，挑取單個(gè)重組菌落，接種于3mL LA液體培養(yǎng)基中，37℃振搖培養(yǎng)5h后，用特異性引物P3/P4做PCR鑒定，陽性菌為可表達(dá)6CCK的基因工程菌，命名為E-6CCK。
然后，取E-6CCK在LA平板上于37℃劃線培養(yǎng)16～20小時(shí)。挑取單個(gè)菌落在LA液體培養(yǎng)基中于37℃培養(yǎng)12～16小時(shí)，將菌液置于4℃冰箱保存。按1％比例接種LA液體培養(yǎng)基，37℃，200r/m振搖培養(yǎng)至OD600值達(dá)0.5左右時(shí)，加入終濃度為1mmol/L的IPTG，分別在加入IPTG后0、1、2、3h取菌液，用SDS-PAGE進(jìn)行分析。SDS-PAGE方法參照實(shí)施方法6。電泳結(jié)果(圖5)表明，6CCK融合蛋白的分子量約為27kD。隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)，表達(dá)產(chǎn)物的量逐步增加，3h后趨于穩(wěn)定。用VL凝膠成像系統(tǒng)BioID++程序?qū)﹄娪窘Y(jié)果進(jìn)行掃描分析，結(jié)果如下(表2)。
表2 CCK33肽6串聯(lián)體(6CCK)在細(xì)菌總蛋白中的含量(％)

10 血清CCK抗體的ELISA檢測(cè)以純化的4CCK融合蛋白為抗原，建立檢測(cè)血清CCK抗體的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)方法。用方陣法，將純化的4CCK融合蛋白以10 10、1020、10 40、10 80、10 160、10 320、10 640的比例用包被緩沖液稀釋，每孔加入100μL 4℃包被過夜。棄去包被液，每孔用200μL清洗緩沖液洗酶標(biāo)板3次，在紗布上拍干清洗緩沖液后，每孔加入封閉液(5％脫脂奶粉)100μL，37℃封閉2h。棄去封閉液，每孔用200μL清洗緩沖液洗酶標(biāo)板3次，在紗布上拍干清洗緩沖液，每孔加入以10 10、10 102、10 103、10 104、10 105、10 106的比例用稀釋緩沖液稀釋的一抗(免抗CCK陽性血清或免疫前的兔陰性血清，其中CCK陽性血清購(gòu)自華西醫(yī)科大學(xué))100μL，37℃反應(yīng)1h。棄去一抗，每孔用200μL清洗緩沖液洗酶標(biāo)板3次，在紗布上拍干清洗緩沖液后，每孔加入用稀釋緩沖液1∶1000稀釋的二抗(辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體)100μL，37℃反應(yīng)1h。棄去二抗，每孔用200μL清洗緩沖液洗酶標(biāo)板3次，在紗布上拍干清洗緩沖液后，每孔加入顯色緩沖液100μL，當(dāng)達(dá)顯色高峰時(shí)(約10～30min)加入1mol/L H2SO4 100μL終止反應(yīng)，在酶標(biāo)儀上讀取OD450值。包被抗原4CCK融合蛋白在1∶80倍稀釋(4CCK濃度相當(dāng)于0.2mg/ml)，陽性血清在1∶102時(shí)P/N值達(dá)最大(表3)，將此時(shí)的抗原抗體的濃度確定為最適工作濃度。
表3 抗原(4CCK)與抗體(陽性血清)最佳工作濃度的確定

該方法具有良好的特異性，用該方法檢測(cè)未免疫的雞、鼠、兔血清，其P/N均小于2。
11 主動(dòng)免疫CCK融合蛋白對(duì)肉雞生產(chǎn)性能的影響將純化的融合蛋白4CCK制成油乳劑疫苗進(jìn)行肉雞免疫實(shí)驗(yàn)，疫苗中4CCK融合蛋白的含量為1mg/mL。將360只胡須肉雞飼養(yǎng)至20日齡后隨機(jī)分成2組，每組三個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)60只雞，1組為對(duì)照組，2組為4CCK免疫組。20日齡免疫第一次，以后每隔20天免疫一次，共免疫3次。肉雞飼養(yǎng)至90日齡結(jié)束。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，稱重并統(tǒng)計(jì)耗料量，計(jì)算全期的平均增重、平均采食量和料肉比。結(jié)果表明4CCK免疫組的體增重明顯高于對(duì)照組(P＜0.05)，采食量也明顯高于對(duì)照組(P＜0.05)，料肉比也有所下降，但差異不顯著(P＞0.05)。
表3 CCK免疫對(duì)雞生產(chǎn)性能的影響體重、采食量和料肉比

12 用4CCK融合蛋白免疫肉雞后血清CCK抗體的變化將純化的融合蛋白4CCK制成油乳劑疫苗進(jìn)行肉雞免疫實(shí)驗(yàn)，疫苗中4CCK融合蛋白的含量為1mg/mL。將360只胡須肉雞飼養(yǎng)至20日齡后隨機(jī)分成2組，每組三個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)60只雞，1組為對(duì)照組，2組為4CCK免疫組。20日齡免疫第一次，以后每隔20天免疫一次，共免疫3次。肉雞飼養(yǎng)至90日齡結(jié)束。分別在35、55和90天齡時(shí)采血，測(cè)定血清中CCK抗體。
在96孔酶標(biāo)板上，每孔加上用0.2mg/ml4CCK融合蛋白100μL，4℃包被過夜。棄去包被液，每孔用200μL清洗緩沖液洗酶標(biāo)板3次，在紗布上拍干清洗緩沖液后，每孔加入5％脫脂奶粉100μL封閉液，37℃封閉2h。棄去封閉液，每孔用200μL清洗緩沖液洗酶標(biāo)板3次，在紗布上拍干清洗緩沖液，每孔加入最適稀釋濃度的一抗100μL，37℃反應(yīng)1h。棄去一抗，每孔用200μL清洗緩沖液洗酶標(biāo)板3次，在紗布上拍干清洗緩沖液后，每孔加入用1∶1000稀釋的二抗100μL，37℃反應(yīng)1h。棄去二抗，每孔用200μL清洗緩沖液洗酶標(biāo)板3次，在紗布上拍干清洗緩沖液后，每孔加入顯色緩沖液100μL，當(dāng)達(dá)顯色高峰時(shí)(約10～30min)加入1mol/L H2SO4100μL終止反應(yīng)，在酶標(biāo)儀上讀取OD450值。用P/N表示抗體水平?？瞻讓?duì)照組3次檢測(cè)的結(jié)果均為P/N＜2，且三次的結(jié)果變化幅度非常小。而免疫組3次檢測(cè)P/N均超過2，且后兩次結(jié)果高于第一次(表4)。
表4重組CCK免疫后雞血中CCK抗體的ELISA檢測(cè)結(jié)果(P/N)

SEQUENCE LISTING<110>華南農(nóng)業(yè)大學(xué)<120>縮膽囊素活性片段的串聯(lián)表達(dá)及其應(yīng)用<130>15<160>2<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>99<212>DNA<213>縮膽囊素-33(Cholecystokinin-33，CCK-33)<220>
<221>cDNA seqence<222>(1)..(99)<220>
<221>CDS<222>(1)..(99)<400>1ggt tct act ggc cgc ttc tct gtc ctt ggc aac cgt gta cag agc att48Gly Ser Thr Gly Arg Phe Ser Val Leu Gly Asn Arg Val Gln Ser Ile1 5 10 15gat ccg acg cac cgt att aat gac cgt gac tac atg ggc tgg atg gat96Asp Pro Thr His Arg Ile Asn Asp Arg Asp Tyr Met Gly Trp Met Asp20 25 30ttt99Phe<210>2<211>33<212>PRT<213>縮膽囊素-33(Cholecystokinin-33，CCK-33)
<400>2Gly Ser Thr Gly Arg Phe Ser Val Leu Gly Asn Arg Val Gln Ser Ile1 5 10 15Asp Pro Thr His Arg Ile Asn Asp Arg Asp Tyr Met Gly Trp Met Asp20 25 30Phe
權(quán)利要求
1.一種編碼縮膽囊素活性片段的核苷酸序列，其特征在于它由兩個(gè)或以上的具有SEQ ID NO1的序列，或與其相比有一個(gè)或若干個(gè)核苷酸的差別，包括堿基的改變、缺失、添加或插入，但具有同樣活性的序列頭尾串聯(lián)而成。
2.重組表達(dá)載體，含有權(quán)利要求1所述序列。
3.宿主細(xì)胞或轉(zhuǎn)化體，含有權(quán)利要求2所述的重組表達(dá)載體。
4.一種縮膽囊素多肽，其特征在于它由兩個(gè)或以上的具有SEQ ID NO2的序列，或與其相比有一個(gè)或若干個(gè)氨基酸殘基的差別，包括氨基酸殘基的改變、缺失、添加或插入，但具有同樣活性的序列頭尾串聯(lián)而成。
5.獲得權(quán)利要求4所述多肽的方法，包括a.構(gòu)建權(quán)利要求2所述重組表達(dá)載體；b.將重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌表達(dá)；c.分離純化表達(dá)產(chǎn)物。
6.基因工程疫苗，含有權(quán)利要求4所述多肽。
7.權(quán)利要求4所述多肽在制備縮膽囊素抗體中的應(yīng)用。
8.權(quán)利要求4所述多肽在體外檢測(cè)血清中縮膽囊素抗體水平中的應(yīng)用。
9.一種促進(jìn)動(dòng)物采食，提高生產(chǎn)性能的方法，包括將權(quán)利要求4所述多肽直接免疫或?qū)⑵渑c佐劑同時(shí)免疫該動(dòng)物。
全文摘要
本發(fā)明提供了一個(gè)獲得縮膽囊素活性片段多串聯(lián)體的方法，包括表達(dá)縮膽囊素基因的重組質(zhì)粒的構(gòu)建、縮膽囊素基因在大腸桿菌中的表達(dá)和縮膽囊素基因工程產(chǎn)物的純化。表達(dá)縮膽囊素基因的重組質(zhì)粒具有雞縮膽囊素33基因或其多串聯(lián)體的核苷酸序列，縮膽囊素基因工程產(chǎn)物具有雞縮膽囊素33肽或其多串聯(lián)體的氨基酸殘基序列。本發(fā)明進(jìn)一步涉及重組重組縮膽囊素多肽對(duì)動(dòng)物的主動(dòng)免疫技術(shù)及其應(yīng)用。
文檔編號(hào)C12N15/12GK1687412SQ20051001158
公開日2005年10月26日 申請(qǐng)日期2005年4月15日 優(yōu)先權(quán)日2005年4月15日
發(fā)明者曹永長(zhǎng), 覃健萍, 畢英佐, 舒鼎銘, 馬靜云, 謝青梅 申請(qǐng)人:華南農(nóng)業(yè)大學(xué)