專利名稱：赤霉基因工程菌及其制備與應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明提供了一種可產生赤霉素的赤霉基因工程菌及其制備與應用，屬于基因工程領域。
背景技術：
赤霉素(gibberellins，GAs)是一種植物生長調節(jié)劑，在植物生長發(fā)育中有非常重要的作用。它可以促進植物的節(jié)間伸長，解除種子、塊莖、芽的休眠，促進植物開花，能誘導單性結果及抑制衰老等。在水果、蔬菜、水稻等作物上赤霉素有廣泛的應用。赤霉素還可以用于啤酒生產工業(yè)中。近年來，隨著赤霉素的推廣使用，市場需求量不斷增長。
赤霉素主要依靠微生物發(fā)酵生產，生產菌是水稻惡苗病菌藤倉赤霉(Gibberella fujikuroi)，赤霉素是該菌的異戊二烯類次生代謝物。赤霉素的生產至今已有近半個世紀的歷史，幾十年間，為了提高赤霉素產量，主要采用誘變育種及發(fā)酵工藝改進等傳統(tǒng)的方法。但是，傳統(tǒng)的菌株育種方法主要依靠隨機的理化誘變，目標不明確，費時費力而且收效不明顯。目前通過采用這些方法來提高藤倉赤霉合成赤霉素的能力已經很有限，潛力不大。

發(fā)明內容本發(fā)明即是為了提供一種育種目標明確、效率高、合成赤霉素的能力強的赤霉基因工程菌，以及這種工程菌的制備方法與應用。
為達到發(fā)明目的本發(fā)明采用的技術方案是一種赤霉基因工程菌，所述的赤霉基因工程菌通過如下方法得到利用PCR技術分別擴增赤霉素合成的限速酶基因cps/ks和強啟動子Pgpd或PtrpC，并將它們克隆到能在絲狀真菌中表達的目標質粒的相應位點，得到有強啟動子驅動的cps/ks基因超表達載體，超表達載體再轉化入赤霉菌，即得到所述的赤霉基因工程菌。
所述的赤霉菌為藤倉赤霉。
所述的目標質粒為下列之一①pCB1004 ②pCB1003 ③pCSN43 ④pCSN44 ⑤pSH75⑥pBARGEM5-1 ⑦pBARGEM7-1 ⑧pBARKS1⑨pBARGEM7-2 ⑩pBARMTE1制備所述的赤霉基因工程菌的方法，所述的方法如下利用PCR技術分別擴增赤霉素合成的限速酶基因cps/ks和強啟動子Pgpd或PtrpC，并將它們克隆到目標質粒中的相應位點，得到有強啟動子驅動的cps/ks基因超表達載體，所述的超表達載體再轉化入赤霉菌，即得到所述的赤霉基因工程菌。
具體的，所述的方法按如下步驟進行(1)PCR擴增Pgpd或PtrpC后將Pgpd或PtrpC克隆至目標質粒，得到重組質粒；(2)PCR擴增赤霉素合成酶基因cps/ks，PCR產物經凝膠回收后克隆至目標質粒的相應位點，即啟動子Pgpd或PtrpC之后，得到cps/ks基因超表達載體；(3)赤霉菌接種培養(yǎng)5～15天后，洗下孢子轉接至液體培養(yǎng)基在20～25℃100～300rpm培養(yǎng)24～48小時；(4)步驟(3)所得培養(yǎng)液過濾后離心得孢子沉淀，水洗后用0.1M醋酸鋰溶液制成孢子混懸液；(5)取步驟(2)所得超表達載體，加入至孢子混懸液中，加入亞精胺至4mM，4℃溫育30min后，加入40％PEG8000和0.1M醋酸鋰4℃繼續(xù)溫育1h；(6)步驟(5)孢子混懸液用37℃水浴熱激5min，將孢子水洗后接種到PDA平板上，20～25℃培養(yǎng)16～24h；(7)往步驟(6)PDA平板上覆蓋一層含潮霉素100～200mg/L的1％瓊脂培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)5～10天，即得所述的赤霉基因工程菌。
進一步，所述的方法按如下步驟進行(1)PCR擴增Pgpd后將Pgpd克隆至目標質粒，得到重組質粒；(2)PCR擴增赤霉素合成酶基因cps/ks，PCR產物經凝膠回收后克隆至目標質粒上Pgpd位點之后，得到cps/ks基因超表達載體；(3)赤霉菌接種到PDA培養(yǎng)基，20～25℃培養(yǎng)5～15天后，用無菌水洗下孢子，轉接到YpSs液體培養(yǎng)基，20～25℃、100～300rpm振蕩培養(yǎng)24～48小時；(4)步驟(3)所得培養(yǎng)液過濾后4000rpm離心5分鐘得孢子沉淀，用無菌水水洗2～4次后，用0.1M醋酸鋰溶液制成孢子混懸液；(5)取步驟(2)所得超表達載體，加入至孢子混懸液中，加入亞精胺至4mM，4℃溫育30min后，加入40％PEG8000和0.1M醋酸鋰4℃繼續(xù)溫育1h；(6)37℃水浴熱激5min，將孢子用無菌水洗1～3次，接種到PDA平板上，20～25℃培養(yǎng)16～24h；(7)往步驟(6)PDA平板上覆蓋一層含潮霉素100～200mg/L的1％瓊脂培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)5～10天，即得所述的赤霉基因工程菌。
特別的，所述的方法按如下步驟進行
(1)PCR擴增質粒pAN7-1上的強啟動子Pgpd，將Pgpd通過限制酶Not I/BamH I克隆至質粒pCB1004的相應位點，得到重組質粒pCB1004Pgpd；(2)PCR擴增藤倉赤霉中的赤霉素合成酶基因cps/ks，PCR產物經凝膠回收后通過限制酶BamH I/Xho I克隆至pCB1004Pgpd的Pgpd位點之后，得到cps/ks基因超表達載體pCB1004Pgpd+cps/ks，簡寫為pCBcps；(3)赤霉菌接種到PDA培養(yǎng)基，24℃培養(yǎng)10天后，用無菌水洗下孢子，轉接到YpSs液體培養(yǎng)基，24℃、200rpm振蕩培養(yǎng)36小時；(4)步驟(3)所得培養(yǎng)液過濾后4000rpm離心5分鐘得孢子沉淀，用無菌水水洗3次后，用0.1M醋酸鋰溶液制成孢子混懸液；(5)取步驟(2)所得超表達載體pCBcps，加入至孢子混懸液中，加入亞精胺至4mM，4℃溫育30min后，加入40％PEG8000和0.1M醋酸鋰4℃繼續(xù)溫育1h；(6)37℃水浴熱激5min，將孢子用無菌水洗2次，接種到PDA平板上，24℃培養(yǎng)20h；(7)往步驟(6)PDA平板上覆蓋一層含潮霉素100mg/L的1％瓊脂培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)5～10天，即得所述的赤霉基因工程菌。
所述的赤霉基因工程菌應用于制備赤霉素。
所述的應用是將所述的赤霉基因工程菌以5～20％接種量接種到發(fā)酵培養(yǎng)基，在25～35℃、200～300rpm條件下發(fā)酵7～9天后，經分離純化得到所述的赤霉素。
通常，是將所述的赤霉基因工程菌以菌碟或孢子懸液接入種子培養(yǎng)基在25～35℃下培養(yǎng)24～48小時后，以5～20％接種量轉入發(fā)酵培養(yǎng)基，在25～35℃、150～300rpm條件下發(fā)酵7～9天后，經分離純化得到所述的赤霉素。
本發(fā)明中所述培養(yǎng)基可為一切可用于培養(yǎng)赤霉菌的常規(guī)培養(yǎng)基。本發(fā)明中所用培養(yǎng)基如下PDA培養(yǎng)基(g/l)馬鈴薯，200；蔗糖，20；瓊脂粉，15(1％PDA培養(yǎng)基中瓊脂粉為10)；pH自然。在121℃下滅菌18分鐘。
YpSs液體培養(yǎng)基(g/L)酵母提取物，4；可溶性淀粉，15；KH2PO4，1；MgSO4·7H2O，0.5；pH自然。在121℃下滅菌18分鐘。
種子培養(yǎng)基花生餅粉，1.5％；糊精，1％；MgSO4·7H2O，0.1％；葡萄糖，1.5％；KH2PO4，0.1％；PH自然。在121℃下滅菌18分鐘。
發(fā)酵培養(yǎng)基玉米粉，1.5％；葵花油，6％；(NH4)2SO4，0.05％；KH2PO4，0.1％；pH自然。在121℃下滅菌18分鐘。
赤霉素類物質是植物生長調節(jié)劑，它有多種同系物，目前在自然界中已發(fā)現(xiàn)有一百多種，根據發(fā)現(xiàn)的早晚，這些同系物被命名為A1(GA1)、GA2、GA3、GA4、GA5……。目前已實現(xiàn)大量生產的是GA3，其結構式如下 本發(fā)明中所指赤霉素即為GA3。
本發(fā)明所述的赤霉基因工程菌及其制備與應用的有益效果主要體現(xiàn)在(1)運用基因工程技術對赤霉菌進行改良，育種目標明確、效率高；(2)所得工程菌合成赤霉素的能力強，比工程菌的出發(fā)赤霉菌菌株提高了40％以上。


圖1為實施例1構建的超表達載體pCBcps圖譜，hyg為潮霉素抗性基因；CamR為氯霉素抗性基因；圖2為GA3標準樣品HPLC分析結果圖譜，GA3保留時間16.965min；圖3為非工程菌GA3的HPLC分析結果圖譜，GA3保留時間16.898min；圖4為實施例3所得基因工程菌GA3的HPLC分析結果圖譜，GA3保留時間16.665min。
具體實施方式
下面結合具體實施例對本發(fā)明進行進一步描述實施例1超表達載體的構建步驟(1)將強啟動子Pgpd從質粒pAN7-1(Punt et al.1987 Gene 56117-124)上用PCR擴增，通過限制酶Not I/BamH I克隆至載體pCB1004(Carroll et al.1994 Fungal Genet.Newsl.4122)的相應位點，形成重組質粒pCB1004Pgpd。強啟動子Pgpd也可來自其它含該序列的任何DNA或直接合成。啟動子除Pgpd外，還可用PtrpC等在絲狀真菌中組成性表達的啟動子。用于構建cps/ks基因超表達載體的質粒除pCB1004外，還可用能在絲狀真菌中表達的質粒如pCSN43、pCSN44、pCB1004、pCB1003、pSH75、pMYX100、pMSN1和pAN26等。
(2)根據G.fujikuroi的赤霉素合成酶基因cps/ks(GeneBank登錄號AJ810802)的序列設計引物(正向引物GGGGATCCGCCGTACGTATGAAACACACCT，下劃線的序列為限制酶BamH I切點；反向引物CCCTCGAGTACATATCAAAATTACCAGCT，下劃線的序列為限制酶Xho I切點)，利用PCR技術擴增編碼區(qū)序列。PCR反應條件94℃變性5min；接著進行32個循環(huán)，參數(shù)是94℃，1min；55℃，30sec和72℃，2min；最后在72℃延伸5min。
(3)PCR產物經凝膠回收后，用限制酶BamH I/Xho I克隆至pCB1004Pgpd的相應位點，形成cps/ks基因超表達載體pCB1004Pgpd+cps/ks，簡寫為pCBcps，其圖譜見圖1。
實施例2超表達載體的構建步驟(1)將強啟動子PtrpC從質粒PZPnat1上用PCR擴增，通過限制酶XbaI/BamH I克隆至載體pBARKS1的相應位點，形成重組質粒pBARtrpC。
(2)根據G.fujikuroi的赤霉素合成酶基因cps/ks(GeneBank登錄號AJ810802)的序列設計引物(正向引物GGGGATCCGCCGTACGTATGAAACACACCT，下劃線的序列為限制酶BamH I切點；反向引物CCCTCGAGTACATATCAAAATTACCAGCT，下劃線的序列為限制酶Xho I切點)，利用PCR技術擴增編碼區(qū)序列。PCR反應條件94℃變性5min；接著進行32個循環(huán)，參數(shù)是94℃，1min；55℃，30sec和72℃，2min；最后在72℃延伸5min。
(3)PCR產物經凝膠回收后，用限制酶BamH I/Xho I克隆至pBARtrpC的相應位點，形成cps/ks基因超表達載體p BARKS1ptrpC+cps/ks，簡寫為pBARcps。
實施例3工程菌的獲得步驟(1)將藤倉赤霉接種到PDA培養(yǎng)基平板，24℃培養(yǎng)10天；(2)用無菌水洗下孢子，轉接到YpSs液體培養(yǎng)基100mL，24℃、200rpm振蕩培養(yǎng)36小時；(3)將培養(yǎng)液過濾后4000rpm離心5分鐘得孢子沉淀，用無菌去離子水洗三次；(4)用200μl的0.1M醋酸鋰溶液懸浮孢子；(5)取實施例1所得質粒pCBcps 5μl(濃度2μl/μl)，加入到孢子懸浮液中，再加入亞精胺使其終濃度為4mM，4℃溫育30min；(6)加入150μl 40％PEG8000的0.1M醋酸鋰溶液，4℃繼續(xù)溫育1h；(7)37℃水浴熱激5分鐘，將孢子用無菌去離子水洗兩次，接到PDA平板上，24℃培養(yǎng)20h；
(8)在PDA平板上覆蓋一層1％瓊脂培養(yǎng)基(含潮霉素100mg/l)繼續(xù)培養(yǎng)5-10天，長出菌落后轉接到PDA培養(yǎng)基(含潮霉素100mg/l)上，重復繼代篩選6次，保存菌株。
PDA培養(yǎng)基(g/l)馬鈴薯，200；蔗糖，20；瓊脂粉，15；pH自然。在121℃下滅菌18分鐘。
實施例3赤霉素合成能力對比實驗將實施例2所得赤霉工程菌在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)7天后，接入種子培養(yǎng)基50mL中，在30℃、240rpm搖床培養(yǎng)36小時。然后以10％的接種量轉入發(fā)酵培養(yǎng)基，250ml三角瓶裝30ml發(fā)酵培養(yǎng)基，在30℃、240rpm發(fā)酵8天；發(fā)酵液經單層濾紙過濾后將濾液pH調至2.0，濾液經0.45μm微孔濾膜過濾，所得樣品進行高效液相色譜分析。
采用上述相同方法對工程菌的出發(fā)菌藤倉赤霉菌進行相應處理，所得樣品進行高效液相色譜分析。
用反相高效液相色譜儀分析赤霉素GA3產量。高效液相色譜儀為島津SPD-10A VP(UV-VIS)型，用浙江大學色譜工作站分析。流動相組成為30％甲醇，0.01M磷酸，用氫氧化鉀調節(jié)pH至3。檢測波長206nm，流速1ml/min。用Sigma公司的赤霉素GA3作標準樣品，標準樣品溶于流動相，濃度為(mg/ml)0.1，0.5，0.75，1。根據標準物色譜峰的保留時間定性。作峰面積-赤霉素濃度的標準曲線，根據標準曲線對樣品中赤霉素進行定量。進樣量20μl。
PDA培養(yǎng)基(g/l)馬鈴薯，200；蔗糖，20；瓊脂粉，15(1％PDA培養(yǎng)基中瓊脂粉為10)；pH自然。在121℃下滅菌18分鐘。
種子培養(yǎng)基花生餅粉，1.5％；糊精，1％；MgSO4·7H2O，0.1％；葡萄糖，1.5％；KH2PO4，0.1％；PH自然。在121℃下滅菌18分鐘。
發(fā)酵培養(yǎng)基玉米粉，1.5％；葵花油，6％；(NH4)2SO4，0.05％；KH2PO4，0.1％；pH自然。在121℃下滅菌18分鐘。
GA3標準樣品HPLC分析結果圖譜見圖2；非基因工程藤倉赤霉菌GA3的HPLC分析結果圖譜見圖3；實施例2所得基因工程菌GA3的HPLC分析結果圖譜見圖4；混合樣高效液相色譜圖分析結果見表1表1
實施例4工程菌的獲得步驟(1)將藤倉赤霉接種到PDA培養(yǎng)基平板，22℃培養(yǎng)15天；(9)用無菌水洗下孢子，轉接到YpSs液體培養(yǎng)基100mL，20℃、100rpm振蕩培養(yǎng)48小時；
(10)將培養(yǎng)液過濾后4000rpm離心5分鐘得孢子沉淀，用無菌去離子水洗三次；(11)用0.3mL的0.1M醋酸鋰溶液懸浮孢子；(12)取實施例2所得質粒pBARcps 5μl(濃度2μg/μl)，加入到孢子懸浮液中，再加入亞精胺至4mM，4℃溫育30min；(13)加入200μL含40％PEG8000的0.1M醋酸鋰溶液，4℃繼續(xù)溫育1h；(14)37℃水浴熱激5分鐘，將孢子用無菌水洗兩次，接到PDA平板上，20℃培養(yǎng)24h；(15)在PDA平板上覆蓋一層1％瓊脂培養(yǎng)基(含潮霉素150mg/l)繼續(xù)培養(yǎng)7天，長出菌落后轉接到PDA培養(yǎng)基(含潮霉素150mg/l)上，重復繼代篩選6次，保存菌株。
PDA培養(yǎng)基(g/l)馬鈴薯，200；蔗糖，20；瓊脂粉，15；pH自然。
在121℃下滅菌18分鐘。
實施例6赤霉素合成將實施例5所得工程菌接入種子培養(yǎng)基50mL中，在29℃、240rpm搖床培養(yǎng)40小時。然后以10％的接種量轉入發(fā)酵培養(yǎng)基，250ml三角瓶裝30ml發(fā)酵培養(yǎng)基，在30℃、240rpm發(fā)酵8天；發(fā)酵液經單層濾紙過濾后將濾液pH調至2.0，濾液經0.45μm微孔濾膜過濾，所得樣品進行高效液相色譜分析。采用上述相同方法對工程菌的出發(fā)菌藤倉赤霉菌株進行相應處理，所得樣品進行高效液相色譜分析。
用反相高效液相色譜儀分析赤霉素GA3產量。高效液相色譜儀為島津SPD-10AVP(UV-VIS)型，用浙江大學色譜工作站分析。流動相組成為30％甲醇，0.01M磷酸，用氫氧化鉀調節(jié)pH至3。檢測波長206nm，流速1ml/min。結果顯示工程菌中GA3含量比出發(fā)菌提高了49.8％。
PDA培養(yǎng)基(g/l)馬鈴薯，200；蔗糖，20；瓊脂粉，15；pH自然。在121℃下滅菌18分鐘。
種子培養(yǎng)基花生餅粉，1.5％；糊精，1％；MgSO4·7H2O，0.1％；葡萄糖，1.5％；KH2PO4，0.1％；PH自然。在121℃下滅菌18分鐘。
發(fā)酵培養(yǎng)基玉米粉，1.5％；葵花油，6％；(NH4)2SO4，0.05％；KH2PO4，0.1％；pH自然。在121℃下滅菌18分鐘。
權利要求
1.一種赤霉基因工程菌，其特征在于所述的赤霉基因工程菌通過如下方法得到利用PCR擴增或限制酶克隆或化學合成技術克隆赤霉素合成的限速酶基因cps/ks和強啟動子Pgpd或PtrpC，并將它們克隆到能在絲狀真菌中表達的目標質粒中相應位點，得到有強啟動子驅動的cps/ks基因超表達載體，超表達載體再轉入赤霉菌，即得到所述的赤霉基因工程菌。
2.如權利要求1所述的赤霉基因工程菌，其特征在于所述的赤霉菌為藤倉赤霉。
3.如權利要求2所述的赤霉基因工程菌，其特征在于所述的目標質粒為下列之一①pCB1004 ②pCB1003 ③pCSN43 ④pCSN44 ⑤pSH75⑥pBARGEM5-1 ⑦pBARGEM7-1 ⑧pBARKS1⑨pBARGEM7-2 ⑩pBARMTE1。
4.制備如權利要求1～3之一所述的赤霉基因工程菌的方法，其特征在于所述的方法如下利用PCR擴增或限制酶克隆或化學合成技術克隆赤霉素合成的限速酶基因cps/ks和強啟動子Pgpd或PtrpC，并將它們克隆到目標質粒中的相應位點，得到強啟動子驅動的cps/ks基因超表達載體，所述的超表達載體再轉化入赤霉菌，即得到所述的赤霉基因工程菌。
5.如權利要求4所述的赤霉基因工程菌的制備方法，其特征在于所述的方法按如下步驟進行(1)PCR擴增Pgpd或PtrpC后將Pgpd或PtrpC克隆至目標質粒，得到重組質粒；(2)PCR擴增赤霉素合成酶基因cps/ks，PCR產物經凝膠回收后克隆至目標質粒的相應位點，得到cps/ks基因超表達載體；(3)赤霉菌接種培養(yǎng)5～15天后，洗下孢子轉接至液體培養(yǎng)基20～25℃100～300rpm培養(yǎng)24～48小時；(4)步驟(3)所得培養(yǎng)液過濾后離心得孢子沉淀，水洗后用0.1M醋酸鋰溶液溶解得孢子混懸液；(5)取步驟(2)所得超表達載體，加入至孢子混懸液中，再加入亞精胺至4mM，4℃溫育30min后，加入40％PEG8000和0.1M醋酸鋰4℃繼續(xù)溫育1h；(6)步驟(5)孢子混懸液用37℃水浴熱激5min，將孢子水洗后接種到PDA平板上，20～25℃培養(yǎng)16～24h；(7) 往步驟(6)PDA平板上覆蓋一層含潮霉素100～200mg/L的1％瓊脂培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)5～10天，即得所述的赤霉基因工程菌。
6.如權利要求5所述的赤霉基因工程菌的制備方法，其特征在于所述的方法按如下步驟進行(1)PCR擴增Pgpd后將Pgpd克隆至目標質粒，得到重組質粒；(2)PCR擴增赤霉素合成酶基因cps/ks，PCR產物經凝膠回收后克隆至目標質粒上Pgpd位點之后，得到cps/ks基因超表達載體；(3)赤霉菌接種到PDA培養(yǎng)基，20～25℃培養(yǎng)5～15天后，用無菌水洗下孢子，轉接到YpSs液體培養(yǎng)基，20～25℃、100～300rpm振蕩培養(yǎng)24～48小時；(4)步驟(3)所得培養(yǎng)液過濾后4000rpm離心5分鐘得孢子沉淀，用無菌水水洗2～4次后，用0.1M醋酸鋰溶液制成孢子混懸液；(5)取步驟(2)所得超表達載體，加入至孢子混懸液中，再加入亞精胺至4mM，4℃溫育30min后，加入40％PEG8000和0.1M醋酸鋰4℃繼續(xù)溫育1h；(6)37℃水浴熱激5min，將孢子用無菌水洗1～3次，接種到PDA平板上，20～25℃培養(yǎng)16～24h；(7)往步驟(6)PDA平板上覆蓋一層含潮霉素100～200mg/L的1％瓊脂培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)5～10天，即得所述的赤霉基因工程菌。
7.如權利要求5所述的赤霉基因工程菌的制備方法，其特征在于所述的方法按如下步驟進行(1)PCR擴增質粒pAN7-1上的強啟動子Pgpd，將Pgpd通過限制酶Not I/BamH I克隆至質粒pCB1004的相應位點，得到重組質粒pCB1004Pgpd；(2)PCR擴增藤倉赤霉中的赤霉素合成酶基因cps/ks，PCR產物經凝膠回收后通過限制酶BamH I/Xho I克隆至pCB1004Pgpd的相應位點，得到cps/ks基因超表達載體pCB1004Pgpd+cps/ks，簡寫為pCBcps；(3)赤霉菌接種到PDA培養(yǎng)基，24℃培養(yǎng)10天后，用無菌水洗下孢子，轉接到YpSs液體培養(yǎng)基，24℃、200rpm振蕩培養(yǎng)36小時；(4)步驟(3)所得培養(yǎng)液過濾后4000rpm離心5分鐘得孢子沉淀，用無菌水水洗3次后，用0.1M醋酸鋰溶液溶解得孢子混懸液；(5)取步驟(2)所得超表達載體pCBcps，加入至孢子混懸液中，再加入亞精胺至4mM，4℃溫育30min后，加入40％PEG8000和0.1M醋酸鋰4℃繼續(xù)溫育1h；(6)37℃水浴熱激5min，將孢子用無菌水洗2次，接種到PDA平板上，24℃培養(yǎng)20h；(7)往步驟(6)PDA平板上覆蓋一層含潮霉素100mg/L的1％瓊脂培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)5～10天，即得所述的赤霉基因工程菌。
8.如權利要求1～3之一所述的赤霉基因工程菌應用于制備赤霉素。
9.如權利要求7所述的赤霉基因工程菌在制備赤霉素中的應用，其特征在于所述的應用是將所述的赤霉基因工程菌以5～20％接種量接種到發(fā)酵培養(yǎng)基，在25～35℃、200～300rpm條件下發(fā)酵7～9天后，經分離純化得到所述的赤霉素。
10.如權利要求8述的赤霉基因工程菌在制備赤霉素中的應用，其特征在于所述的應用是將所述的赤霉基因工程菌以菌碟或孢子懸液等接入種子培養(yǎng)基在25～35℃下培養(yǎng)24～48小時后，以5～20％接種量轉入發(fā)酵培養(yǎng)基，在25～35℃、150～300rpm條件下發(fā)酵7～9天后，經分離純化得到所述的赤霉素。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種赤霉基因工程菌，所述的赤霉基因工程菌通過如下方法得到利用PCR技術分別擴增赤霉素合成的限速酶基因cps/ks和強啟動子Pgpd或PtrpC，并將它們克隆到能在絲狀真菌中表達的目標質粒的相應位點，得到有強啟動子驅動的cps/ks基因超表達載體，超表達載體再轉化入赤霉菌，即得到所述的赤霉基因工程菌。本發(fā)明運用基因工程技術對赤霉菌進行改良，育種目標明確、效率高；所得工程菌合成赤霉素的能力強，比工程菌的出發(fā)赤霉菌菌株提高了40％以上。
文檔編號C12N15/09GK1654630SQ20041008230
公開日2005年8月17日 申請日期2004年12月30日 優(yōu)先權日2004年12月30日
發(fā)明者朱廷恒, 王渭霞, 裘娟萍 申請人:浙江工業(yè)大學