專利名稱：少根根霉δ的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域和遺傳工程領(lǐng)域，涉及從一種絲狀真菌-根霉屬的少根根霉(Rhizopus arrhizus)中克隆△12-脂肪酸脫氫酶基因，具體講是少根根霉△12-脂肪酸脫氫酶的核苷酸序列及其應(yīng)用。將該基因直接或與不同表達載體連接，轉(zhuǎn)入到細菌、酵母、植物或動物中，利用其編碼△12-脂肪酸脫氫酶產(chǎn)生不飽和脂肪酸。
背景技術(shù)：
△12-脂肪酸脫氫酶屬于一類膜整合酶。到目前為止，由于分離和鑒定膜結(jié)合蛋白的難度很大[MaKeon，1981，酶學(xué)方法，12141-12147；Wang等，1988，植物生理學(xué)生物化學(xué)，26777-792]，因此很難得到包括△12-脂肪酸脫氫酶在內(nèi)的各種膜結(jié)合蛋白性質(zhì)脫氫酶的高級結(jié)構(gòu)，而只能通過對酶的核苷酸序列進行初步研究，或者在異源的受體內(nèi)表達來研究酶的底物特異性。序列比對的結(jié)果表明，編碼△12-脂肪酸脫氫酶的核苷酸序列具有共同的結(jié)構(gòu)特征存在三個組氨酸保守區(qū)His I區(qū)HECGH、His II區(qū)HXXHH和His III區(qū)HVXHH，形成4次跨膜的結(jié)構(gòu)[Kyte et al.，1982，J.Mol.Biol.157105-132]，這些都是維持脫氫酶活性所必需的[Napier JA，Sayanova O，Stobart AK，et al.，1997，Biochem.J.，328717-720]。包括人在內(nèi)的哺乳動物體內(nèi)由于缺少△12-脂肪酸脫氫酶而只能初步合成飽和的和單不飽和脂肪酸，不能合成含兩個和兩個以上雙鍵的多不飽和脂肪酸(polyunsaturated fatty acids，PUFAs)，這些多不飽和脂肪酸必須從食物中獲取。因此，亞油酸(linoleic acid，LA)和α-亞麻酸(α-linoleic acid，ALA)是人體必需脂肪酸。膳食性攝入亞油酸和α-亞麻酸，經(jīng)△6-脂肪酸脫氫酶催化轉(zhuǎn)化成γ-亞麻酸(γ-linoleic acid，GLA)和十八碳四烯酸(Octadecatetraenoic acid，OTA)，它們又在其它相關(guān)酶的催化下可進一步轉(zhuǎn)化成其它長鏈多不飽和脂肪酸(long-chain polyunsaturated fatty acids，LC-PUFAs)[Horrobin DF，1992，Prog Lipid Res.，31163-194]。這些長鏈多不飽和脂肪酸是機體組織生物膜組成成分，起到維持細胞正常功能和增加機體抗逆性的作用，同時也是前列腺素、環(huán)前列腺素和白介素類等具有強烈生理活性的自身調(diào)節(jié)物的前體[Napier JA etal.，1999，Curr.Opin.Plant Biol.，2123-127]，因此包括亞油酸在內(nèi)的多不飽和脂肪酸在保健和醫(yī)療方面有很廣闊的應(yīng)用前景。研究不飽和脂肪酸的合成和它的生理作用成為當前的熱點之一。
對于脂肪酸脫氫酶的生物學(xué)功能，許多實驗室采用了從各種生物體中克隆相關(guān)的基因并轉(zhuǎn)入各種受體中，在受體中觀察受體的脂肪酸改變的方法。目前，已從動物、植物、微生物等不同來源中分離到許多△12-脂肪酸脫氫基因的同源序列，并且證明具有相應(yīng)的生物學(xué)功能。尤其是近幾年來隨著雙功能△12-脂肪酸脫氫酶的發(fā)現(xiàn)(Edgar B.Cahoon etal，2001，THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY.，262637-2643.)和共軛油酸在醫(yī)療保健功能的發(fā)掘，人們的注意力又開始轉(zhuǎn)向?qū)Α?2-脂肪酸脫氫酶的研究上。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的是提供從絲狀真菌根霉屬的少根根霉中分離的編碼△12-脂肪酸脫氫酶的核苷酸序列或其核苷酸序列的片段、類似物或衍生物。從一種絲狀真菌-根霉屬的少根根霉(Rhizopus arrhizus)中克隆△12-脂肪酸脫氫酶基因，具體講是少根根霉△12-脂肪酸脫氫酶的核苷酸序列及其應(yīng)用。將該基因直接或與不同表達載體連接，轉(zhuǎn)入到細菌、酵母、植物或動物中，利用其編碼△12-脂肪酸脫氫酶產(chǎn)生不飽和脂肪酸的方法和應(yīng)用。
本發(fā)明的另一個目的是提供該核苷酸序列所編碼的△12-脂肪酸脫氫酶多肽、或其片段、類似物或衍生物。
本發(fā)明的另一個目的是提供含有該基因核苷酸序列與異源調(diào)節(jié)序列連接，進行功能性表達的重組載體。
本發(fā)明的另一個目的是提供含有該基因核苷酸序列或該基因核苷酸序列與異源調(diào)節(jié)序列連接的重組載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)的宿主細胞及其后代。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種用含有該基因核苷酸序列或該基因核苷酸序列與異源調(diào)節(jié)序列連接的重組載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)的宿主細胞及其后代細胞或該核苷酸序列所編碼的△12-脂肪酸脫氫酶多肽制備不飽和脂肪酸的方法。
本發(fā)明的第一方面，提供的是具有SEQ ID NO1所示的核苷酸序列或該核苷酸序列的片段、類似物和衍生物。
分離的△12-脂肪酸脫氫酶基因的核苷酸序列，它包含一核苷酸序列，該核苷酸序列與選自下組的一種核苷酸序列有至少65％的同源性(1)具有編碼SEQ ID NO2氨基酸序列的活性多肽的核苷酸序列；(2)與核苷酸序列(1)互補的核苷酸序列。準確地，該核苷酸序列具有SEQ ID NO1所示的核苷酸序列。更準確地，該核苷酸序列是選自下組中的一種(a)具有SEQ ID NO1序列中1-1315的序列和(b)具有SEQ ID NO1中65-1234的序列。
在本發(fā)明的第二方面，提供分離的這個核苷酸序列所編碼的多肽，該多肽包含具有SEQ ID NO2氨基酸序列的多肽、或其片段、或其保守性變異多肽、或其衍生類似物。準確地，該多肽是具有SEQ ID NO2氨基酸序列的多肽或其氨基酸變異不超過30％的衍生物。
本發(fā)明的第三方面，提供了含有上述核苷酸序列的重組載體，以及被上述核苷酸序列或重組載體轉(zhuǎn)化的宿主細胞及其后代細胞。
本發(fā)明的第四方面，提供了一種用含有該基因核苷酸序列或該基因核苷酸序列與異源調(diào)節(jié)序列連接的重組載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)宿主細胞及其后代細胞或用該核苷酸序列所編碼的△12-脂肪酸脫氫酶多肽制備不飽和脂肪酸的方法。
本發(fā)明的其他方面由于本文技術(shù)的公開，對本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見的。
如本發(fā)明所用，“分離的”是指物質(zhì)從其原始環(huán)境中分離出來(如果是天然的物質(zhì)，原始環(huán)境即是天然環(huán)境)。例如，活體細胞內(nèi)的天然狀態(tài)下的核苷酸序列和多肽是沒有分離純化的，但同樣的核苷酸序列或多肽如從天然狀態(tài)中與同存在的其它物質(zhì)中分開，則為分離純化的。
如本文所用，“分離的核苷酸序列”是指基本上不含天然與其相關(guān)的其它蛋白、脂類、糖類或其它物質(zhì)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員能用標準的DNA純化技術(shù)純化的。
本發(fā)明提供了一種新的分離的核苷酸序列——編碼少根根霉△12-脂肪酸脫氫酶的核苷酸序列，其基本上是由SEQ ID NO1所示的核苷酸序列組成的，其特征是該序列長為1315bp(堿基)，其中65bp-1234bp為編碼△12-脂肪酸脫氫酶成熟多肽SEQ ID NO2的開放閱讀框；1bp-64bp為5`非轉(zhuǎn)譯區(qū)序列，1235bp-1315bp為3`非轉(zhuǎn)譯區(qū)序列。
本發(fā)明提供了分離的核苷酸序列，該核苷酸序列基本由編碼具有SEQ ID NO2氨基酸序列的活性多肽的核苷酸序列組成。具體地，本發(fā)明的核苷酸序列具有SEQ ID NO1的核苷酸序列。
編碼SEQ ID NO2活性多肽的核苷酸序列包括只有成熟多肽的編碼序列；成熟多肽的編碼序列和各種附加編碼序列；成熟多肽的編碼序列(和任選的附加編碼序列)以及非編碼序列。
術(shù)語“編碼少根根霉△12-脂肪酸脫氫酶的核苷酸序列”是指包括編碼少根根霉△-12脂肪酸脫氫酶多肽的核苷酸序列和包括附加編碼和/或非編碼的核苷酸序列。
本發(fā)明的核苷酸序列可以是DNA形式或是RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因組DNA或人工合成的DNA。DNA可以是單鏈的或是雙鏈的。DNA可以是編碼鏈或非編碼鏈。編碼成熟多肽的編碼區(qū)序列可以與SEQ ID NO2所示的編碼區(qū)序列相同或是簡并的變異體。如本發(fā)明所用，“簡并的變異體”在本發(fā)明中是指編碼具有SEQ ID NO2的蛋白質(zhì)或多肽，但與SEQ ID NO1所示的編碼區(qū)序列有差別的核苷酸序列。
本發(fā)明還包括編碼少根根霉△12-脂肪酸脫氫酶的核苷酸序列的片段、類似物或衍生物。如本發(fā)明所用，術(shù)語“片段”、“類似物”和“衍生物”是指能編碼基本上保持本發(fā)明天然的相同的生物學(xué)功能或活性的多肽的核苷酸序列。
通過本文的闡述，這樣的片段、類似物或衍生物被認為在本領(lǐng)域技術(shù)人員的知識范圍之內(nèi)。
本發(fā)明核苷酸序列的片段、衍生序列或類似序列可以是其中一個或多個核苷酸發(fā)生取代、缺失、插入、倒位的核苷酸序列，即原始分離序列的人工突變體，它還具有所需的酶促功能。還可以是所述的核苷酸序列與脂肪酸生物合成的其它基因的融合序列。
如SEQ ID NO1所示的衍生物或功能性衍生物表示的等位變異體，它在衍生的氨基酸水平具有至少75％的同源性，優(yōu)選至少80％的同源性，特別優(yōu)選85％的同源性，非常特別的優(yōu)選是90％的同源性。所述同源性是基于完整氨基酸片段計算的。由所述的核苷酸序列編碼的氨基酸序列如SEQ ID NO2所示，同源性表示同一性，就是說氨基酸序列至少70％相同。所述的新核苷酸序列在核酸水平上至少具有65％的同源性，優(yōu)選至少70％的同源性，特別優(yōu)選75％的同源性，非常特別的優(yōu)選是80％的同源性。
衍生物還表示SEQ ID NO1所示序列的同系物，如真核同系物、截短的序列，但仍具有所需功能，就是說具有這種蛋白的酶促活性，因此，功能性等同物包括上述序列的的天然變體和人工核苷酸序列。
非編碼的衍生物還表示可用于抑制所述新型蛋白生物合成的反義DNA。所述的反義DNA屬于本發(fā)明的無功能衍生物。如不具備酶促活性的衍生物?？捎帽绢I(lǐng)域的技術(shù)人員熟知生產(chǎn)無功能衍生物的其它方法有共抑制，核糖酶和內(nèi)含子的使用。
本發(fā)明還涉及與上述的序列雜交的核苷酸序列(兩個序列之間具有至少50％的同源性，優(yōu)選至少70％的同源性)，并且，可雜交的核苷酸序列編碼的多肽與SEQ ID NO2所示的成熟多肽有相同的生物學(xué)功能。
本發(fā)明還涉及與以上所描述的序列雜交的核酸片段。如本發(fā)明所用，“核酸片段”的長度至少含10個核苷酸，優(yōu)選是至少20-30個核苷酸，特別優(yōu)選是至少50-60個核苷酸，非常特別的優(yōu)選是至少100個核苷酸以上。核苷酸片段也可用于核酸的擴增技術(shù)(如PCR)以確定和/或分離編碼的核苷酸序列。
本發(fā)明中的多肽和核苷酸序列優(yōu)選以分離的形式提供，更佳地被純化至均質(zhì)。
本發(fā)明中特異核苷酸序列能用多種方法獲得。例如，用本領(lǐng)域熟知的雜交技術(shù)分離核苷酸序列。這些技術(shù)包括但不局限于(1)用探針與基因組或cDNA文庫雜交以檢出同源的核苷酸序列；和(2)表達文庫的抗體篩選以檢出具有共同結(jié)構(gòu)特征的克隆的核苷酸序列片段。
本發(fā)明的DNA片段序列也能用下列方法獲得(1)從基因組DNA分離雙鏈DNA序列；(2)化學(xué)合成DNA序列以獲得所述多肽的雙鏈DNA。
上述提到的方法中，分離基因組DNA最不常用。DNA序列的直接化學(xué)合成是經(jīng)常選用的方法。更經(jīng)常選用的方法是DNA序列的分離。分離感興趣的cDNA的標準方法是從高表達該基因的供體細胞分離mRNA并進行逆轉(zhuǎn)錄，形成質(zhì)粒或噬菌體cDNA文庫。提取mRNA的方法已有多種成熟的技術(shù)，用試劑盒也可從商業(yè)途徑獲得。而構(gòu)建cDNA文庫也是通常的方法。當結(jié)合聚合酶鏈式反應(yīng)技術(shù)(PCR)時，即使極少的表達產(chǎn)物也能克隆。
可用常規(guī)方法從這些cDNA文庫中篩選本發(fā)明的基因，這些方法包括(但不限于)(1)DNA-DNA或DNA-RNA雜交；(2)標志基因功能的出現(xiàn)或消失；(3)測定的轉(zhuǎn)錄本的水平；(4)通過免疫學(xué)技術(shù)測定生物學(xué)活性，來檢測基因表達的蛋白產(chǎn)物。上述方法可單用，也可多種方法聯(lián)合應(yīng)用。在第(1)中方法中，雜交所用的探針是與本發(fā)明的核苷酸序列的任何一部分同源，其長度至少10個核苷酸，優(yōu)選是至少30個核苷酸，特別優(yōu)選是至少50個核苷酸，非常特別的優(yōu)選是至少100個核苷酸。此外，探針的長度通常在2000個核苷酸之內(nèi)，較佳的為1000個核苷酸之內(nèi)。此處所用得探針通常是在本發(fā)明的基因序列信息的基礎(chǔ)上化學(xué)合成的DNA序列。本發(fā)明的基因本身或者片段當然可以用作探針。DNA探針的標記可用放射性同位素，熒光素或酶(如堿性磷酸酶)等。
應(yīng)用PCR技術(shù)擴增DNA/RNA的方法(Saiki et al.，1985，Science，2301350-1354)被優(yōu)選用于獲得本發(fā)明的基因。特別是很難從文庫中得到全長的cDNA時，可優(yōu)選使用RACE法(RACE-cDNA末端快速擴增法)，用于PCR的引物可根據(jù)本文所公開的本發(fā)明的核苷酸序列信息適當?shù)倪x擇，并可用常規(guī)方法合成。可用常規(guī)方法如通過凝膠電泳分離和純化擴增的DNA/RNA片段。
本發(fā)明還提供了一種新的多肽序列-少根根霉△12-脂肪酸脫氫酶的氨基酸序列，其基本上是由SEQ ID NO2所示的氨基酸序列組成。本發(fā)明的多肽可以是重組多肽、天然多肽、合成多肽，優(yōu)選重組多肽。本發(fā)明的多肽可以是天然純化的產(chǎn)物，或是化學(xué)合成的產(chǎn)物，或使用重組技術(shù)從原核或真核宿主(例如，細菌、酵母、高等植物、昆蟲和哺乳動物細胞中產(chǎn)生。
本發(fā)明的多肽包括的△12-脂肪酸脫氫酶的片段、衍生物和類似物。如本發(fā)明所用，術(shù)語“片段”、“類似物”和“衍生物”是指基本上保持本發(fā)明天然的相同的生物學(xué)功能或活性的多肽。本發(fā)明多肽的片段、衍生物或類似物可以是(I)這樣一種，其中一個或多個氨基酸殘基被保守或非保守氨基酸殘基(優(yōu)選的是保守氨基酸殘基)取代、倒位、插入或缺失；或者(II)這樣一種，其中一個或多個氨基酸殘基上的某個基團被其它基團取代包含取代基；或者(III)這樣一種，其中成熟多肽與另一種化合物(比如延長多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合；或者(IV)這樣一種，其中附加的氨基酸序列融合進成熟多肽而形成的多肽序列(如前導(dǎo)序列或分泌序列或用來純化此多肽的序列或蛋白原序列)。
本發(fā)明也涉及含有編碼少根根霉△12-脂肪酸脫氫酶的核苷酸序列和外源性調(diào)節(jié)序列元件結(jié)合進行功能性表達的重組表達載體。術(shù)語“載體”指本領(lǐng)域熟知的細菌質(zhì)粒、噬菌體、酵母質(zhì)粒、植物細胞病毒、哺乳動物細胞病毒如腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒或其它載體。能夠影響基因表達產(chǎn)物的序列元件包括有復(fù)制起始點、啟動子、標記基因和翻譯調(diào)控元件。
可用本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的方法來構(gòu)建含編碼少根根霉△12-脂肪酸脫氫酶的核苷酸序列和合適的轉(zhuǎn)錄/翻譯調(diào)控元件的表達載體。這些方法包括體外重組DNA技術(shù)、DNA合成技術(shù)、體內(nèi)重組技術(shù)等[Sambroook，et al.，Molecular Cloning，a LaboratoryManual，Cold Spring Harbor Laboratory，New York，1989]。所述的編碼少根根霉△12-脂肪酸脫氫酶的核苷酸序列可有效連接到表達載體的恰當啟動子上，以指導(dǎo)mRNA合成。這些啟動子的代表性例子有大腸桿菌的lac或trp啟動子；λ噬菌體的PL啟動子真核啟動子包括CMV早期啟動子、HSV胸苷激酶啟動子、早期和晚期SV40啟動子、反轉(zhuǎn)錄病毒的LTRs和其它一些已知的可控制基因在原核細胞或真核細胞或其病毒中表達的啟動子。表達載體還包括翻譯起始用的核糖體結(jié)合位點和轉(zhuǎn)錄終止子等。在載體中插入增強子序列將會使其在高等真核細胞中的轉(zhuǎn)錄得到增強。增強子是DNA表達的順式作用因子，通常大約有10-300bp，作用于啟動子以增強基因的轉(zhuǎn)錄。如腺病毒增強子。
本發(fā)明還涉及用含有本發(fā)明編碼少根根霉△12-脂肪酸脫氫酶的核苷酸序列的重組載體或直接用編碼少根根霉△12-脂肪酸脫氫酶的核苷酸序列經(jīng)基因工程產(chǎn)生的宿主細胞。本發(fā)明中，編碼少根根霉△12-脂肪酸脫氫酶的核苷酸序列或含有該核苷酸序列的重組載體可轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)入宿主細胞，以構(gòu)成含有該核苷酸序列或重組載體的基因工程化宿主細胞。術(shù)語“宿主細胞”指原核細胞，如細菌細胞；或是低等真核細胞，如酵母細胞；或是高等真核細胞，如哺乳動物細胞。宿主細胞的代表性例子有大腸桿菌；真菌細胞如酵母；植物細胞如油菜、煙草、大豆；昆蟲細胞如果蠅S2或Sf9；動物細胞如CHO、COS或Bowes黑素瘤細胞等。
用本發(fā)明所述的核苷酸序列或含有核苷酸序列的重組載體轉(zhuǎn)化宿主細胞可用本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的方法進行。當宿主為原核生物如大腸桿菌時，能吸收DNA的感受態(tài)細胞可在指數(shù)生長期收集菌體，用CaCl2法處理，所用的步驟在本領(lǐng)域是眾所周知的。也可用MgCl2，電穿孔等方法進行。當宿主是真核生物，可選用DNA轉(zhuǎn)染法、顯微注射、電穿孔、脂質(zhì)體包裝等方法。
本發(fā)明還涉及用上述轉(zhuǎn)基因宿主細胞生產(chǎn)脂肪酸，根據(jù)宿主細胞的不同，用本領(lǐng)域技術(shù)人員所共知的方法生長或培養(yǎng)。比如微生物細胞通常是在0-100℃，優(yōu)選10-60℃，同時還要氧氣。培養(yǎng)基中含有碳源，如葡萄糖，氮源，通常是有機氮的形式，如酵母提取物、氨基酸，或鹽，如硫酸銨，微量元素，如鐵、鎂鹽，如果需要的話還有維生素。在此期間培養(yǎng)基的pH可以保持固定的值，就是說，在培養(yǎng)期間進行控制或不控制。培養(yǎng)可以分批培養(yǎng)、半不連續(xù)培養(yǎng)或連續(xù)培養(yǎng)形式進行。在培養(yǎng)之后，收集細胞，搗碎或直接使用，通過本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法從細胞中提取脂肪酸。
本發(fā)明還涉及一種制備不飽和脂肪酸的方法，該方法是這樣實現(xiàn)的，將具有飽和或不飽和脂肪酸的甘油三酯與SEQ ID NO2一起培養(yǎng)。該方法優(yōu)選是在由能夠攝取或釋放還原性等同物的化合物存在條件下進行的。然后，可以從甘油三酯中釋放脂肪酸。上述方法優(yōu)選可以合成具有12位雙鍵的脂肪酸。
本發(fā)明還涉及用上述方法制備不飽和脂肪酸(特別是少根根霉△12-脂肪酸脫氫酶催化油酸產(chǎn)生的亞油酸)，以及將其應(yīng)用于生產(chǎn)人類食品、動物飼料、化妝品或藥品用途。


圖1、顯示所推測的少根根霉△12-脂肪酸脫氫酶的疏水圖，兩條實線表示推測的兩個疏水域。
圖2、顯示本發(fā)明的少根根霉△12-脂肪酸脫氫酶和卷枝毛霉△12-脂肪酸脫氫酶(AB052087)的氨基酸序列同源性比較圖。
圖3、顯示所構(gòu)建的釀酒酵母表達載體pYRAD12。
圖4A、顯示亞油酸甲基酯標準物的氣相色譜圖。
圖4B、含pYES2.0空載體的轉(zhuǎn)基因酵母的氣相色譜圖。
圖4C、含重組質(zhì)粒pYRAD12的轉(zhuǎn)基因酵母的氣相色譜圖。
具體實施例方式
下面結(jié)合具體的實施例進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不是限制本發(fā)明的范圍。
實施例1 從少根根霉中分離△12-脂肪酸脫氫酶的核苷酸序列根據(jù)劉曉勇等(劉小勇等，1997，提取植物和微生物DNA的SDS-CTAB改進法，北京林業(yè)大學(xué)學(xué)報，100-103。)提供的方法，從培養(yǎng)48小時的少根根霉菌絲體中提取總的DNA，取5μg為模板進行聚合酶鏈式反應(yīng)。根據(jù)所發(fā)表的△12-脂肪酸脫氫酶同源序列的組氨酸保守區(qū)I和III區(qū)氨基酸序列設(shè)計兼并引物(引物1和引物2)，以上述提取的DNA為模板在T-Gradient PCR儀(Biometra公司)上進行PCR擴增，反應(yīng)所用引物、組分和擴增條件如下引物15-CA(TC)GA(AG)TG(TC)GG(I)CA(TC)CA(CAG)-3`引物25`(AG)TG(AG)TGIGCIAC(GA)TGIGT-3`反應(yīng)組分 加入量 終濃度模板DNA5μl緩沖液(10×)(含20mmol/LMgCl2) 5μl1×dNTP(2.5mmol/L)4μl0.4mmol/L引物1(10μmol/L) 1μl0.2μmol/L引物2(10μmol/L) 1μl0.2μmol/LTaqase(5u/μl) 0.5μl 2.5u/反應(yīng)
H2O33.5μl總體積 50μl擴增條件94℃變性3min，再用94℃ 1min；55℃ 1min→72℃ 1min進行30個循環(huán)，最后72℃ 10min。瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果顯示，擴增得到大小約750bp的片段，用UNIQ-10柱式PCR產(chǎn)物純化試劑盒(上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司產(chǎn)品)回收，把回收片段亞克隆到測序載體pGEM-T(Promega公司產(chǎn)品)中；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到用CaCl2法處理的大腸桿菌DH5α，在含氨芐青霉素(終濃度為100μg/ml)的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)過夜；挑取平板上生長的白色菌落，接入含氨芐青霉素(終濃度為100μg/ml)的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜，離心收集菌體按堿裂解法[Sambroook，et al.，1989，Molecular Cloning，a Laboratory Manual，cold Spring Harbor Laboratory，New York，p19-21]提取質(zhì)粒，經(jīng)NcoI和SacI雙酶切和PCR擴增鑒定正確，測序(上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司)。測序結(jié)果顯示所擴增得到的片段大小為730bp，通過其編碼的氨基酸序列在Genbank數(shù)據(jù)庫中用Blast程序(Basic local Alignment seatch tool)[Altschul SFet al，1997，Nucleic Acids Res.253389-3402]進行同源檢索，檢索結(jié)果表明與該片段最相似的同源片段為△12-脂肪酸脫氫酶、(且含有一個46bp的內(nèi)含子)，但并不完全相同，證明所擴增片段為新的潛在脫氫酶基因的片段。
根據(jù)所獲得的部分序列設(shè)計基因特異性引物(引物3和引物4)，利用cDNA末端擴增技術(shù)(Rapid Amplification of cDNA ends，RACE)獲得包含上述片段的基因的3`和5`末端序列。先提取細胞總RNA，用SMRTMRACE cDNA Amplification Kit(Clontech公司產(chǎn)品)反轉(zhuǎn)錄合成第一條cDNA，用基因特異性引物和試劑盒提供的接頭引物，按PCR擴增試劑盒(Clontech公司產(chǎn)品)分別進行3`和5`末端序列的PCR。
引物3(3`RACE)5`-CTGCTCTTACCGTTGACCG-3`，(SEQ ID NO3)引物4(5`RACE)5`-CATCAGCTTGAGGGTCTTTGICGCG-3`(SEQ ID NO4)模板cDNA 2.5μl、緩沖液(10×)5μl、dNTP(50×)1μl、引物3(10μmol/L)1μl、引物4(10μmol/L)1μl、Advantage2 Polymeerase Mix 1μl、H2O 34.5μl擴增條件先95℃變性2min，進入95℃ 30sec；68℃ 3min，共進行30個循環(huán)。PCR擴增產(chǎn)物采用上述相同的方法鑒定、測序。序列分析結(jié)果顯示3`RACE擴增獲得從引物3序列到polyA前共328bp的序列信息，而5`RACE獲得從引物4序列到末端接頭序列之間共567bp的序列信息。用序列分析軟件(DNAMAN Version4.0，Lynnon BioSoft)將三個片段進行拼接并進行分析，得到如SEQ ID NO1所示的核苷酸序列，其中65bp-1234bp(ATG----TAA)為潛在的開放閱讀框，編碼389個氨基酸。兩側(cè)分別為5`非轉(zhuǎn)譯區(qū)(64bp)和3`非轉(zhuǎn)譯區(qū)(81bp)。根據(jù)兩個末端序列，設(shè)計基因特異性引物(引物5和引物6)按3`和5`RACE條件PCR擴增、測序，所的結(jié)果和拼接結(jié)果一致。
引物55`-GGTACCTCACCTCTCTCCCTTCTCT-3`(SEQ ID NO5)；引物65`-GAATTCGAAATTGTATACATTTTATTG-3`(SEQ ID NO6)；實施例2所分離核苷酸序列的同源性搜索將推測△12-脂肪酸脫氫酶的氨基酸序列在Genbank上進行同源性搜索，所得同源序列大部分為編碼△12-脂肪酸脫氫酶的序列，少數(shù)編碼△15-脂肪酸脫氫酶以及其它脫氫酶序列，其中與來源于卷枝毛霉的序列的同源性最高相同性80.05％，(附圖2顯示本發(fā)明的少根根霉△12-脂肪酸脫氫酶和卷枝毛霉△12-脂肪酸脫氫酶(AB052087)的氨基酸序列同源性比較圖。RAD12本發(fā)明的少根根霉△12-脂肪酸脫氫酶，MCD12卷枝毛霉(Mucor circinelloides)△12-脂肪酸脫氫酶；相同的氨基酸在兩個序列之間用單字符氨基酸表示，相似氨基酸用“+”表示)。這說明本發(fā)明的新核苷酸序列所編碼的酶具有潛在△12-脂肪酸脫氫酶功能。
實施例3釀酒酵母重組表達載體的構(gòu)建根據(jù)SEQ ID NO1所示編碼區(qū)序列，設(shè)計出一對基因特異性擴增引物(引物7和引物8)分離其潛在開放閱讀框序列引物75`-CACGGTACCATGGCAACCAAGAGAAATATCAGT-3`(SEQ ID NO7)；引物85`-GGTGAATTCATTATTTTTGTAAAACACAACATC-3`(SEQ ID NO8)；此兩個引物的5`端黑體分別含有KpnI和EcoR1酶切位點。所用的擴增條件和反應(yīng)組分和3`和5`RACE相同，擴增產(chǎn)物的測序結(jié)果顯示和SEQ ID NO1所示64bp-1230bp的序列一致。然后取50μl PCR產(chǎn)物和3μl pYES2.0分別進行雙酶切，反應(yīng)體系如下PCR產(chǎn)物雙酶切反應(yīng)體系 pYES2.0反應(yīng)體系Buffer10μl 1μ1BSA 10μl 1μlTriton10μl 1μl底物 50μl 3μlKpnI 2μl 2μlEcoR1 2μl 2μlH2O 16μl總體積100μl 10μl0.8％的瓊脂糖凝膠回收酶切大片段，并用T4連接酶連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，通過質(zhì)粒提取和PCR篩選陽性克隆，并進行測序鑒定。質(zhì)粒構(gòu)建結(jié)果見附圖3，所構(gòu)建的含有△12-脂肪酸脫氫酶基因的酵母表達命名為pYRAD12。該質(zhì)粒是由pYES2.0(Invitrogen公司)和引物7和引物8的PCR產(chǎn)物構(gòu)建而成。質(zhì)粒和分別經(jīng)KpnI和EcoR1雙酶切后，電泳回收純化，經(jīng)T4DNALigase連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，篩選鑒定出重組質(zhì)例，命名為pYRAD12。
實施例4重組表達載體轉(zhuǎn)化釀酒酵母細胞挑取釀酒酵母菌株INVSc1單菌落于10ml YEPD液體培養(yǎng)基中、30℃搖床過夜培養(yǎng)，檢測菌液的OD600值，取適量菌液稀釋于50ml，使OD600為0.4；繼續(xù)培養(yǎng)2到4h后，2500rpm離心沉淀細胞，以40ml 1×TE重懸菌體，2500rpm離心沉淀細胞，以2ml1×LiAc/0.5×TE懸浮細胞，并在室溫下放置10min，此細胞即為感受態(tài)細胞；取100μl制備好的酵母感受態(tài)細胞，加入1μg重組質(zhì)粒pYRAD12和100μg變性鮭精DNA(Sigma)，混勻，加入700μl 1×LiAc/40％PEG-4000/1×TE并混勻，于30℃溫育30min；然后，加入88μl DMSO混勻，于42℃水浴中熱激7min；離心10s沉淀細胞，加入1ml1×TE懸浮細胞并再次離心沉淀細胞，最后加入100μl重懸細胞，全鋪于SC-Ura(無尿嘧啶)選擇培養(yǎng)基平板，置30℃培養(yǎng)48-72h。
實施例5酵母工程菌的誘導(dǎo)表達挑取SC-Ura(無尿嘧啶)選擇培養(yǎng)基平板上出現(xiàn)的陽性轉(zhuǎn)化，接種于10ml SC-Ura選擇培養(yǎng)基(含2％的葡萄糖)，28℃搖菌過夜培養(yǎng)，以5％的接種量加入含有2％半乳糖的100ml SC-Ura培養(yǎng)基，28℃繼續(xù)培養(yǎng)72h；5000rpm，10min收集菌體，用去離子水洗滌三次，50℃烘干，研碎，取100mg加入5ml 5％的KOH-CH3OH溶液，70℃反應(yīng)4h；反應(yīng)結(jié)束，冷卻到室溫，用6mol/L的鹽酸調(diào)節(jié)溶液的pH值到2.0，加入4ml 14％BF3-CH3OH，70℃反應(yīng)1.5h，合成脂肪酸甲酯；再加入飽和的NaCl溶液10ml，劇烈震蕩混勻，并轉(zhuǎn)移到分液漏斗中，用8ml 1∶4的氯仿∶己烷抽提兩次，合并提取液；加入適量無水Na2SO4干燥提取液，靜置1h，去掉Na2SO4，把含有脂肪酸甲酯的上清液用氮氣吹干，用200μL的正己烷回溶樣品，后用0.45mm的微孔濾膜過濾。
實施例6脂肪酸氣相色譜分析按如下條件進行儀器為島津GC-7A，柱子彈性石英毛細管柱，0.32×30m，固相支持物聚二乙二醇丁二酸酯(Poly-diethylene glycol succinate，DEGS)鍍膜物聚酰亞胺。載氣N2，線速10cm/s。分流比100∶1，氣化室溫度250℃，柱溫180℃，尾吹50ml/min，檢測器氫火焰離子化檢測器。以Sigma公司生產(chǎn)的LA甲酯為標準品，把上述方法制備的脂肪酸甲酯化的樣品，進行GC分析，上樣量為1μl；分析軟件Anstar，分析之星色譜工作站。
色譜分析結(jié)果見附圖4，附圖4顯示亞油酸甲酯標準物(4A)、含pYES2.0空載體的轉(zhuǎn)基因酵母(4B)和含重組質(zhì)粒pYRAD12的轉(zhuǎn)基因酵母(4C)的氣相色譜圖。通過與已知的脂肪酸甲酯標準物的保留時間進行比較鑒別出各個峰。圖4C中保留時間為14.637min對應(yīng)的峰即為少根根霉△12-脂肪酸脫氫酶催化油酸產(chǎn)生的亞油酸。
序列列表SEQUENCE LISTING<110>南開大學(xué)<120>少根根霉△12-脂肪酸脫氫酶的核苷酸序列及其應(yīng)用<130>2004.4.28<160>8<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>1315<212>DNA<213>少根根霉(Rhizopus arrhizus)<400>1tcacctctct cccttctctt ttaataactt ttctctttct agaagaaaga cataattagg60
gataatggca accaagagaa atatcagttc caatgaacca gaaaataagc ctgttatcga120cgaagcagta gcaagaaact gggagattcc tgattttacc atcaaagaaa ttcgtgatgc180tattccttct cactgcttcc gtcgagacac attcagatca ttcacttatg ttattcatga240ttttgctatt atcgccgtct tgggttattt agctacttac attgatcaag ttcattctgc300tgctcttcgc ttgcttttat ggtccttgta ttggactgct caaggtattg ttggtactgg360tgtttgggtt gttggtcacg aatgtggaca tcaagctttc agtccatcca aggccgtcaa420taacagtgtc ggctttgtcc ttcatacact cttattagtt ccttatcact cttggagatt480ctctcactct aagcatcata aagctactgg tcacatgtca aaagaccaag ttttccttcc540caagacaaga gaaaaggttg gtttaccacc tcgcgacaaa gaccctcaag ctgatggtcc600tcatgatgtt cttgacgaaa cacctattgt tgtactttac cgtatgtttc ttatgttctt660gtttggctgg ccattatacc ttttcaccaa tgtcaccggt caagattacc ctggctgggc720ctctcacttc aacccatcct gcgacattta cgaagagggc caatattggg atgtcgtcag780ttcctctgtt ggtgttgttg gcatggtagg tcttttaggt tactgtggtc aaatctttgg840ttccttaaac atgatcaaat actatgttat tccttacttg tgtgttaact tttggcttgt900cttgattact tatttgcaac acactgaccc caaattgcct cactaccgcg agaatgtctg960gaacttccaa cgtggtgctg ctcttaccgt tgaccgttct tacggtgccc ttattaatta 1020tttccaccat cacatttccg acacccacgt cgcccaccac ttcttttcta ctatgcctca 1080ctatcatgct gaagaagcta ctgttcatat caagaaagct cttggtaagc attaccactg 1140tgataatact cctattccca tcgctctttg gaaagtttgg aagagctgta gatttgttga 1200
aagtgaagga gatgttgtgt tttacaaaaa ttaatttcca ttacaccctc ttttcatttt 1260gatatataat actttattct accatctttc cattcaataa aatgtataca atttc1315<210>2<211>389<212>PRT<213>少根霉(Rhizopus arrhizus)<400>2Met Ala Thr Lys Arg Asn Ile Ser Ser Asn Glu Pro Glu Asn Lys Pro1 5 10 15Val Ile Asp Glu Ala Val Ala Arg Asn Trp Glu Ile Pro Asp Phe Thr20 25 30Ile Lys Glu Ile Arg Asp Ala Ile Pro Ser His Cys Phe Arg Arg Asp35 40 45Thr Phe Arg Ser Phe Thr Tyr Val Ile His Asp Phe Ala Ile Ile Ala50 55 60Val Leu Gly Tyr Leu Ala Thr Tyr Ile Asp Gln Val His Ser Ala Ala65 70 75 80Leu Arg Leu Leu Leu Trp Ser Leu Tyr Trp Thr Ala Gln Gly Ile Val85 90 95Gly Thr Gly Val Trp Val Val Gly His Glu Cys Gly His Gln Ala Phe100 105 110Ser Pro Ser Lys Ala Val Asn Asn Ser Val Gly Phe Val Leu His Thr115 120 125Leu Leu Leu Val Pro Tyr His Ser Trp Arg Phe Ser His Ser Lys His130 135 140His Lys Ala Thr Gly His Met Ser Lys Asp Gln Val Phe Leu Pro Lys145 150 155 160
Thr Arg Glu Lys Val Gly Leu Pro Pro Arg Asp Lys Asp Pro Gln Ala165 170 175Asp Gly Pro His Asp Val Leu Asp Glu Thr Pro Ile Val Val Leu Tyr180 185 190Arg Met Phe Leu Met Phe Leu Phe Gly Trp Pro Leu Tyr Leu Phe Thr195 200 205Asn Val Thr Gly Gln Asp Tyr Pro Gly Trp Ala Ser His Phe Asn Pro210 215 220Ser Cys Asp Ile Tyr Glu Glu Gly Gln Tyr Trp Asp Val Val Ser Ser225 230 235 240Ser Val Gly Val Val Gly Met Val Gly Leu Leu Gly Tyr Cys Gly Gln245 250 255Ile Phe Gly Ser Leu Asn Met Ile Lys Tyr Tyr Val Ile Pro Tyr Leu260 265 270Cys Val Asn Phe Trp Leu Val Leu Ile Thr Tyr Leu Gln His Thr Asp275 280 285Pro Lys Leu Pro His Tyr Arg Glu Asn Val Trp Asn Phe Gln Arg Gly290 295 300Ala Ala Leu Thr Val Asp Arg Ser Tyr Gly Ala Leu Ile Asn Tyr Phe305 310 315 320His His His Ile Ser Asp Thr His Val Ala His His Phe Phe Ser Thr325 330 335Met Pro His Tyr His Ala Glu Glu Ala Thr Val His Ile Lys Lys Ala340 345 350Leu Gly Lys His Tyr His Cys Asp Asn Thr Pro Ile Pro Ile Ala Leu355 360 365
Trp Lys Val Trp Lys Ser Cys Arg Phe Val Glu Ser Glu Gly Asp Val370 375 380Val Phe Tyr Lys Asn385<210>3<211>19<212>DNA<213>少根根霉(Rhizopus arrhizus)<400>3ctgctcttac cgttgaccg 19<210>4<211>25<212>DNA<213>少根根霉(Rhizopus arrhizus)<400>4catcagcttg agggtctttg tcgcg 25<210>5<211>25<212>DNA<213>少根根霉(Rhizopus arrhizus)<400>5ggtacctcac ctctctccct tctct 25<210>6<211>27<212>DNA<213>少根根霉(Rhizopus arrhizus)<400>6gaattcgaaa ttgtatacat tttattg27<210>7<211>33<212>DNA<213>少根根霉(Rhizopus arrhizus)<400>7
cacggtacca tggcaaccaa gagaaatatc agt 33<210>8<211>33<212>DNA<213>少根根霉(Rhizopus arrhizus)<400>8ggtgaattca ttatttttgt aaaacacaac atc 3權(quán)利要求
1.一種少根根霉Δ12-脂肪酸脫氫酶的核苷酸序列，其特征在于它是具有SEQ IDNO1所示的核苷酸序列，或該核苷酸序列的片段、類似物或衍生物。
2.按照權(quán)利要求1所的核苷酸序列，其特征在于所述的核苷酸序列是選自編碼具有SEQ ID NO2所示的氨基酸序列，或與該核苷酸序列互補的核苷酸序列；或前述有至少65％相同性的核苷酸序列。
3.一種多肽，其特征在于它是具有SEQ ID NO2所示的氨基酸序列的多肽或其氨基酸變異不超過30％。
4.一種重組表達載體，其特征在于它是由權(quán)利要求1所述的核苷酸序列與質(zhì)粒、病毒或運載體表達載體所構(gòu)建的重組載體。
5.按照權(quán)利要求4所述的重組表達載體，其特征在于它是pYRAD12。
6.一種基因工程化的宿主細胞，其特征在于它是選自于下列一種宿主細胞(a)它是用權(quán)利要求1所述的核苷酸序列轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)的宿主細胞；(b)它是用權(quán)利要求4所述的重組表達載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)的宿主細胞。
7.按照權(quán)利要求6所述的宿主細胞，其特征在于所述的宿主細胞是細菌細胞、真菌細胞、植物細胞或動物細胞，或這些宿主細胞的后代。
8.按照權(quán)利要求6所述的宿主細胞，其特征在于所述的宿主細胞是釀酒酵母細胞。
9.權(quán)利要求1-8任一項用于生產(chǎn)不飽和脂肪酸的應(yīng)用。
10.按照權(quán)利要求9所述的不飽和脂肪酸的應(yīng)用，其特征在于所述的不飽和脂肪酸是亞油酸。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種從少根根霉中分離的編碼△
文檔編號C12N15/86GK1570116SQ20041001923
公開日2005年1月26日 申請日期2004年5月13日 優(yōu)先權(quán)日2004年5月13日
發(fā)明者李明春, 邢來君, 魏東盛, 張欣昕 申請人:南開大學(xué)