專利名稱：離子性液體包覆的酶的制作方法
發(fā)明
背景技術(shù)：
領(lǐng)域本發(fā)明涉及用離子性液體包覆的酶，特別是涉及離子性液體包覆的酶的制備和應(yīng)用，該離子性液體包覆的酶比未包覆的酶具有更好的對映體選擇性，并可以重復(fù)利用而不會明顯失去酶的催化活性。
相關(guān)的現(xiàn)有技術(shù)利用水解酶對外消旋底物進(jìn)行酶動(dòng)力學(xué)分析為制備旋光化合物提供了一種有用的方法。在水解酶中，因?yàn)橹久?脂類水解酶)表現(xiàn)出廣泛的底物特異性而非常有用。脂肪酶尤其在有機(jī)溶劑中離析外消旋醇及其酯中特別有用。然而，它們經(jīng)常表現(xiàn)出不太令人滿意的對映體選擇性，導(dǎo)致分辨性不高。因此，非常必要開發(fā)新的方法來提高脂肪酶的對映體選擇性。
至今已有許多技術(shù)被用來解決對映體選擇性的問題，其中一個(gè)典型的方法是用脂類(Okahata，Y.；Hatano，A.；Ijiro，K.TetrahedronAsymmetry 1995，6，1311)或表面活性劑(Huang，S.Y.；Chang，H.L.；Goto，M.Enzyme Microb.Technol.，1998，22，552)來包覆酶。然而，這些方法相當(dāng)繁雜并會引起酶的活性喪失。
發(fā)明概述本發(fā)明的目的是提供一種相對于未包覆的天然酶而言具有更好的對映體選擇性和可重復(fù)利用性能好的包覆的酶。
本發(fā)明的另一目的是提供一種制備包覆酶的方法，該包覆的酶相對于未包覆的天然酶而言具有更好的對映體選擇性和更好的重復(fù)利用性。
本發(fā)明的再一目的是提供一種利用包覆的酶來制備旋光異構(gòu)體的方法。
為達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供一種離子性液體包覆的酶(本文中，離子性液體被定義為在約150℃或低于150℃的溫度下呈液相的有機(jī)鹽)。
本發(fā)明還提供一種制備離子性液體包覆的酶的方法，其中包括如下步驟將適合于包覆酶的離子性液體在其熔點(diǎn)或熔點(diǎn)之上的溫度下進(jìn)行溶解；將酶與溶解的離子性液體進(jìn)行混合；將所得到的混合物在室溫下冷卻以將包覆在酶上的離子性液體固化。
本發(fā)明還提供一種制備具有高對映體過量(Enantiomeric Excess)的旋光異構(gòu)體的方法，包括用離子性液體包覆的酶將外消旋化合物過量的任意一種對映體進(jìn)行選擇性的反應(yīng)的步驟。
優(yōu)選實(shí)例方案的詳細(xì)描述(發(fā)明詳述)通過下面的詳細(xì)描述，對本發(fā)明的更完整的評價(jià)及本發(fā)明所帶來的許多優(yōu)點(diǎn)將是顯而易見的，并且更易于理解。
本發(fā)明公開了一種離子性液體包覆的酶(ILCE)的制備和在動(dòng)力學(xué)離析外消旋醇中的應(yīng)用。術(shù)語“離子性液體”在本發(fā)明中是指在室溫下呈固相而通常在其約150℃的熔點(diǎn)溫度或低于150℃的熔點(diǎn)溫度下呈液相的有機(jī)鹽。作為酶包覆物質(zhì)的固態(tài)離子性液體(例如1-烷基-3-甲基咪唑鎓六氟磷酸鹽)是從1-甲基咪唑通過兩步驟而合成得到的。
已經(jīng)有許多關(guān)于將離子性液體用作催化反應(yīng)的溶劑的研究(Wasserscheid P.；Wilhelm，K.Angew.Chem.Int.ED.2000，39，3772)，這些研究表明離子性液體作為傳統(tǒng)有機(jī)溶劑的替代品具有廣泛的潛在用途。因?yàn)樗哂蟹悬c(diǎn)高、并且能改善酶的活性和催化劑的選擇性而對環(huán)境有利。對在離子性液體中進(jìn)行生物催化反應(yīng)的研究也表明相對于常規(guī)的有機(jī)溶劑而言，具有諸多優(yōu)點(diǎn)如改善酶活性和對映體選擇性(Kim，K.W.；Song，B.；Choi，M.Y.；Kim，M.J.Org.Lett.2001，3，1507.；Erbeldinger，M.；Mesiano，A.J.；Russell，A.J.Biotechnol.Prog.2000，16，1131；Lau，R.M.；Rantwijk，F(xiàn).van；Seddon，K.R.；Sheldon R A.Org.Lett.2000，2，4189.)。
用于包覆酶的離子性液體在室溫下呈固相，而加熱到熔點(diǎn)或更高溫度時(shí)變成液相。因而，離子性液體在150℃或低于150℃，優(yōu)選在120至150℃之間呈液相。
離子性液體的有機(jī)陽離子可以包括雜環(huán)化合物陽離子，和與其陽離子形成離子鍵的有機(jī)或無機(jī)陰離子。
雜環(huán)化合物由至少一個(gè)選自N、O、S或其組合的雜原子所組成，其中雜原子的數(shù)目優(yōu)選為1到4個(gè)，更優(yōu)選為1到2個(gè)。雜環(huán)化合物的陽離子是可選自咪唑鎓、吡啶鎓、噠嗪鎓(pyridazinium)、嘧啶鎓(pyrimidinium)、吡嗪鎓(pyrazinium)、吡唑鎓(pyrazolium)、噻唑鎓(thiazolium)、噁唑鎓(oxazolium)、三唑鎓(triazolium)和它們的取代化合物的陽離子。
有機(jī)或無機(jī)陰離子可以是下列任何一種雙(全氟乙磺酰)二酰亞胺(bis(perfluoroethyl sulfonyl)imide))(N(C2F5SO2)2-)、雙(三氟代甲磺酰)二酰亞胺(bis(trifluoromethyl sulfonyl)imide)(N(CF3SO2)2-)、甲基三(三氟代甲磺酰)(tris(trifluoromethyl sulfonyl)methide))(C(CF3SO2)2-)、三氟甲烷砜二酰亞胺(trifluoromethane sulfonimide)、三氟代甲砜二酰亞胺(trifluoromethylsulfonimide)、三氟代甲磺酸鹽(trifluoromethyl sulfonate)、AsF6-、ClO4-、PF6-和BF4-。
本發(fā)明所述的離子性液體優(yōu)選自由下列通式1所代表的化合物通式1 其中X選自苯基、取代苯基、異丁烯酰酯、OCOCH3、CO2CH3和CN；Y是BF4或PF6；并且n是2到5的整數(shù)。
取代苯基基團(tuán)是具有至少一個(gè)選自C1-3烷基、C1-3烷氧基、酯、酰胺、羥基、氰基、鹵素或硝基的基團(tuán)所取代的苯基基團(tuán)。
本發(fā)明所述的制備離子性液體包覆的酶(ILCE)的制備方法，包括將適合于包覆酶的離子性液體在其熔點(diǎn)或高于其熔點(diǎn)溫度下進(jìn)行熔解；將酶與溶解的離子性液體混合；將混合物在室溫下冷卻以將包覆在酶上的離子性液體固化。本發(fā)明所述包覆酶是通過與熔化的離子性液體進(jìn)行混合，并冷卻該混合物就可簡單得到。
酶的包覆是通過加熱固體離子性液體到其熔點(diǎn)之上以得到其液相而開始，接著加入酶粉。得到的異源混合物繼而被冷卻以獲得一種固態(tài)溶液。最后，固態(tài)溶液通過刮刀(spatula)研磨制成細(xì)小顆粒。該細(xì)小顆粒作為ILCE可用作外消旋醇分解的催化劑。該ILCE表現(xiàn)出比未被包覆的天然酶的對映體選擇性要好，是后者的1.5-2倍。
適合于包覆酶的離子性液體可以商業(yè)購買獲得或通過任何本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)通常知曉的方法來合成得到。例如，由通式1所表示的1-(3-苯丙)-3-甲基咪唑鎓六氟磷酸鹽可以通過如下反應(yīng)得到用C與1-氯-3-異丙苯(1-chloro-3-phenylpropane)反應(yīng)以獲得1-(3-苯丙)-3-甲基咪唑鎓氯化物，然后用HPF6交換陰離子。
離子性液體的使用量依所使用酶的類型而變化，但優(yōu)選的是每1克酶使用5-20克的離子性液體。當(dāng)離子性液體的用量少于5克時(shí)，包覆效果是不夠的。而當(dāng)離子性液體的用量超過20克時(shí)，每單位重量的被包覆的酶活性減少，因而也不是優(yōu)選的。
可用離子性液體包覆的酶包括，但是不限于方便地用于制備旋光活性化合物的脂肪酶。脂肪酶的典型例子包括蔥頭假單胞菌(Pseudomonascepacia)脂肪酶(LPS)、大西洋假絲酵母(Candida Antarctica)脂肪酶(CAL)、皺摺假絲酵母(Candida rugosa)脂肪酶(CRL)、黑曲霉(Aspergillus niger)脂肪酶(ANL)、Candida cylindracea脂肪酶(CCL)、米赫毛霉(Mucor miehei)脂肪酶、熒光假單胞菌(Pseudomonas fluorecens)脂肪酶(LAK)、無根根霉(Rhizopusarrhizus)脂肪酶、雪白根霉(Rhizopus niveus)脂肪酶、Hog pancreas脂肪酶、解脂假絲酵母(Candida lipolytica)脂肪酶、爪哇毛霉(Mucor javanicus)脂肪酶、Penicillium roqueforti脂肪酶和米赫根毛霉(Rhizomucor miehei)脂肪酶。
利用離子性液體包覆的酶作為一種催化劑，可以通過一種外消旋化合物的一種對映體的對映體選擇性的?；饔脕碇苽渚哂懈邔τ丑w過量(旋光純度)的旋光異構(gòu)體。例如，外消旋醇的對映體，利用離子性液體包覆的脂肪酶有選擇性酰化(酯交換)而獲得具有好的對映體過量的旋光異構(gòu)體的手性酯。
在使用包覆的脂肪酶的外消旋次級醇進(jìn)行光學(xué)離析中，次級醇可以包括，但不限于由以下通式2a，2b，2c和2d所代表的醇
在離子性液體包覆的酶與外消旋化合物反應(yīng)中所用的反應(yīng)溶劑優(yōu)選的是(但不限于)不能溶解離子性液體的甲苯、醚、或己烷，由于溶劑通常不影響酶催化反應(yīng)的產(chǎn)量和對映體選擇性。反應(yīng)溶劑的用量是使一種底物反應(yīng)體的濃度達(dá)到0.2-0.4M的量。
在下文中，本發(fā)明將結(jié)合實(shí)例和對照例進(jìn)行詳細(xì)闡述。然而，這些實(shí)例，不應(yīng)理解為對本發(fā)明范圍的任何限制。
實(shí)施例11-(3-苯丙)-3-甲基咪唑鎓氯的制備0.15摩爾的1-甲基咪唑鎓和0.125摩爾的1-氯-3-苯基丙烷加入到一個(gè)100毫升的圓底長頸瓶中，并且在70℃中攪拌一天，以得到1-(3-苯丙)-3-甲基咪唑鎓氯(1-(3-phenylpropyl)-3-methylimidazolium chloride)(99％產(chǎn)率)。
1H-NMR(CD3CN，δ，300MHz)2.18(m，2H，CH2)，2.64(t，2H，J＝7.4Hz，CH2)，3.90(s，1H，NCH3)，4.27(t，2H，J＝7.1Hz，CH2)，7.18-7.30(m，5H，C6H5)，7.56(s，1H，CH)，7.63(s，1H，CH)，9.94(s，1H，CH)。
(3-苯丙)-3-甲基咪唑鎓六氟磷酸鹽的制備1.2當(dāng)量的HPF6在冰冷條件下被慢慢加入到1-(3-苯丙)-3-甲基咪唑鎓氯中。攪拌30分鐘后，將混合物用二氯甲烷(MC)提取三次。提取物用無水硫酸鈉進(jìn)行干燥，干燥濃縮后以得到1-(3-苯丙)-3-甲基咪唑鎓六氟磷酸鹽(mp 52～53℃，產(chǎn)率78％)。
1H-NMR(CD3CN，δ，300MHz)2.14(m，2H，CH2)，2.56(t，2H，J＝7.4Hz，CH2)，3.80(s，1H，NCH3)，4.14(t，2H，J＝7.2Hz，CH2)，7.19-7.35(m，7H)，δ8.34(s，1H，CH)。
實(shí)施例2甲基-3-(3-苯丙)咪唑鎓六氟磷酸鹽包覆脂肪酶在熔點(diǎn)或更高溫度下熔化1克1-甲基-3-(3-苯丙)咪唑鎓六氟磷酸鹽，加入100毫克的脂肪酶(LPS，來自蔥頭假單胞菌的脂肪酶)。攪拌10分鐘后，將得到的混合物冷卻到室溫以得到1.1克的包覆脂肪酶。
實(shí)施例3包覆脂肪酶(LPS)對外消旋醇的旋光性離析將0.1mmol的由下面的通式2a至2d所表示的外消旋醇，160-400毫克的1-甲基-3-(3-苯丙)咪唑鎓六氟磷酸鹽包覆的脂肪酶(LPS)和0.3毫摩爾的乙烯基醋酸鹽與0.5毫升的甲苯混合，并且將混合物在室溫條件下攪拌。通常，加入離子性液體包覆的酶量比天然酶的用量要多5.5至22倍才能獲得相同的效果。
當(dāng)用薄層層析確定酰化已達(dá)到大約50％時(shí)，將反應(yīng)終止。脂肪酶(LPS)從反應(yīng)混合物過濾，蒸發(fā)溶劑。然后，手性醋酸鹽和未被?；拇嫉膶τ丑w過量通過裝有手性柱(chiral column)的高效液相色譜法來分析測定。
對照實(shí)施例1天然脂肪酶(LPS)對外消旋醇的旋光性離析除了使用16-36毫克天然脂肪酶代替包覆酶(LPS)之外，均按例3的方法進(jìn)行相同的操作。
根據(jù)例3和對照例1制備的手性酯的旋光純度和剩余外消旋醇的量列于表1。
表1

注對映體過量(ee)＝(R-S)/(R+S)正如表1所示，根據(jù)實(shí)施例3的離子性液體包覆的脂肪酶的對映體選擇性優(yōu)于或相當(dāng)于根據(jù)對照實(shí)施例1的天然酶。
實(shí)施例4再生的天然LPS或再生的包覆的LPS的活性包覆的LPS和天然的LPS被重新再用4次，用于離析具有通式2b的外消旋醇并且測定每次重新利用時(shí)它們的酶活性。其結(jié)果示于表2。
表2


注對映體過量(ee)＝(R-S)/(R+S)如表2所示，天然LPS在重復(fù)利用時(shí)，其活性顯著降低(對照實(shí)施例1)，而離子性液體包覆的LPS甚至在重復(fù)利用4次后，其活性和對映體選擇性并沒有實(shí)質(zhì)性降低。
本發(fā)明所述的離子性液體包覆的酶顯著地提高了酶的功能，例如當(dāng)脂肪酶用離子性液體包覆后，提高了它的對映體選擇性和穩(wěn)定性。此外，甚至離子性液體包覆的酶在重復(fù)利用時(shí)，其所獲得的對映體過量、及對映體選擇性和活性基本上沒有退化。包覆的酶用作催化劑在合成手性殺蟲劑、藥物、天然化學(xué)物質(zhì)等中提供所需的手性中間體。
盡管用優(yōu)選實(shí)施方案來詳細(xì)闡明了本發(fā)明，在不偏離本申請所附權(quán)利要求所界定的本發(fā)明的精神和范圍的情況下，所述領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見地可以對本發(fā)明方式做出各種改進(jìn)和替代。
權(quán)利要求
1.被離子性液體包覆的酶，其中離子性液體是一種在約150℃或150℃以下溫度的有機(jī)鹽。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的離子性液體包覆的酶，其中離子性液體包括一種雜環(huán)化合物的有機(jī)陽離子和一種有機(jī)或無機(jī)陰離子。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的離子性液體包覆的酶，其中所述雜環(huán)化合物的有機(jī)陽離子含有選自N、O、S或其組合的1-4個(gè)雜原子。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的離子性液體包覆的酶，其中所述雜環(huán)化合物有機(jī)陽離子選自咪唑鎓、吡啶鎓、噠嗪鎓、嘧啶鎓、吡嗪鎓、吡唑鎓、噻唑鎓、噁唑鎓、三唑鎓、或其取代化合物的陽離子。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的離子性液體包覆的酶，其中所述有機(jī)或無機(jī)陰離子選自雙(全氟乙磺酰)二酰亞胺(N(C2F5SO2)2-)、雙(三氟代甲磺酰)二酰亞胺(N(CF3SO2)2-)、甲基三(三氟代甲磺酰)(C(CF3SO2)2-)、三氟甲烷砜二酰亞胺、三氟代甲砜二酰亞胺、三氟代甲磺酸鹽、AsF6-、ClO4-、PF6-或BF4-。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的離子性液體包覆的酶，其中所述離子性液體為下列通式1所表示的化合物通式1 其中X選自苯基、取代的苯基、異丁烯酰酯、OCOCH3、CO2CH3或CN；Y是BF4或PF6；并且n是2到5的整數(shù)。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的離子性液體包覆的酶，其中所述酶為脂肪酶。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的離子性液體包覆的酶，其中所述脂肪酶選自蔥頭假單胞菌脂肪酶(LPS)、大西洋假絲酵母脂肪酶(CAL)、皺摺假絲酵母脂肪酶(CRL)、黑曲霉脂肪酶(ANL)、Candida cylindracea脂肪酶(CCL)、米赫毛霉脂肪酶、熒光假單胞菌脂肪酶(LAK)、無根根霉脂肪酶、雪白根霉脂肪酶、Hog pancreas脂肪酶、解脂假絲酵母脂肪酶、爪哇毛霉脂肪酶、Penicillium roqueforti脂肪酶或米赫根毛霉脂肪酶。
9.一種制備離子性液體包覆的酶的方法，包括如下步驟將適合包覆該酶的離子性液體在其熔點(diǎn)或更高溫度進(jìn)行熔解，所述離子性液體是一種有機(jī)鹽，它在約150℃或150℃以下溫度呈液相；將該酶與熔解的離子性液體混合；冷卻該混合物以將包覆在該酶上的離子性液體固化。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的方法，其中所述離子性液體是由下列通式1所代表的化合物通式1 其中X選自苯基、取代的苯基、異丁烯酰酯、OCOCH3、CO2CH3或CN；Y是BF4或PF6；并且n是2到5的整數(shù)。
11.一種制備具有高度對映體過量的旋光異構(gòu)體的方法，包括將外消旋化合物中的任一種對映體選擇性地與根據(jù)權(quán)利要求1所述的離子性液體包覆的酶進(jìn)行反應(yīng)的步驟。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種離子性液體包覆的酶，其中離子性液體是一種有機(jī)鹽，它在約150℃或以下溫度呈液相。本發(fā)明的離子性液體包覆的酶能顯著提高酶的功能，例如當(dāng)酶(如脂肪酶)被離子性液體包覆后，其對映體選擇性和穩(wěn)定性均能得到改善。此外，甚至在離子性液體包覆的酶被重復(fù)利用時(shí)，所得到的對映體過量，及酶的對映體選擇性和酶活性也不會退化。包覆的酶用作提供在合成手性殺蟲劑、藥物、天然化學(xué)物質(zhì)等所需的手性中間體的催化劑。
文檔編號C12N9/20GK1498268SQ03800115
公開日2004年5月19日 申請日期2003年1月13日 優(yōu)先權(quán)日2002年1月14日
發(fā)明者金萬柱, 李在官 申請人:Posco公司, 學(xué)校法人浦項(xiàng)工科大學(xué)校