專利名稱：疏水酯類殺蟲劑和毒素的降解的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及降解疏水酯類殺蟲劑和毒素的酶和方法。本發(fā)明尤其涉及在污染環(huán)境和園藝物品的擬除蟲菊酯殘留的生物除污中，如α-羧酸酯酶等昆蟲酯酶及其突變體的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
擬除蟲菊酯構(gòu)成了化學(xué)殺蟲劑的一種主要類型。它們是天然除蟲菊酯的合成類似物，產(chǎn)生于除蟲菊屬植物(Tanacetum cinerariifolium)的花卉中。將它們的結(jié)構(gòu)改變生產(chǎn)出的化合物保留了天然產(chǎn)物內(nèi)在的對脊椎動物的適度毒性，但是作為殺蟲劑卻更為穩(wěn)定和有效。自它們被引入的三十年來，它們已經(jīng)上升到全世界殺蟲劑銷售額的10-20％，且在可預(yù)見的將來，預(yù)計它們將繼續(xù)占有牢固的市場份額。目前它們在很多國家廣泛地用于農(nóng)業(yè)的生產(chǎn)和加工體系，并已經(jīng)導(dǎo)致了從棉花和園藝直到羊毛的不同商品范圍的殘留事件的發(fā)生。
擬除蟲菊酯的殘留不合乎需要地污染了環(huán)境和大量商品。它們不合乎需要是因?yàn)樗麄冏鳛闅⑾x劑對于無脊椎動物的很寬的作用范圍，以及它們對脊椎動物的顯著毒性，雖然它們通常被認(rèn)為是對哺乳動物最安全的殺蟲劑之一。特殊的敏感區(qū)域包括被污染的土壤，被下游灌溉者使用或僅允許流出農(nóng)田的再循環(huán)的灌溉廢水和園藝輸出品中超出允許水平的殘留。家畜工業(yè)也存在殺蟲劑污染商品的問題，這些污染由它們自己直接使用的殺蟲劑或由它們依賴的農(nóng)作物和飼料副產(chǎn)物帶來。從食品加工廠、地毯染料浴和動物浸沾生產(chǎn)中產(chǎn)生的加工廢物、也被殺蟲劑殘留污染，有時非常嚴(yán)重。從而需要用生物除污策略以消除或減少這些殺蟲劑殘留。
一種被提議的生物除污策略涉及使用能固定化或降解殺蟲劑殘留的酶。例如，這種酶可以在污染水流動的生物反應(yīng)器中被使用，或在收獲后經(jīng)過滅蟲的水果、蔬菜或動物產(chǎn)品的洗滌溶液中使用，以減少殺蟲劑殘留的水平和保留時間。降解殺蟲劑殘留的適當(dāng)?shù)拿赴▉碜约?xì)菌、脊椎動物和有機(jī)磷酸酯(OP)抗性昆蟲的OP水解酶。水解酶需要快速降解殺蟲劑殘留。
在銅綠蠅(Lucilia cuprina)中的有機(jī)磷酸酯抗性由編碼羧酸酯酶E3基因的兩種不同的突變體導(dǎo)致。兩種突變體酶的底物特異性不同，但是它們都可以使兩種主要的OP亞型解毒。來自L.cuprina的E3基因由Newcomb等(1997)克隆成功，結(jié)合使用DNA測序、桿狀病毒表達(dá)和體外誘變，這些工作者鑒別了兩種抗性突變體。一種是在活性位點(diǎn)的氧離子空穴區(qū)域上137位殘基的Gly被Asp取代(Newcomb等，1997)。另一種是在底物結(jié)合區(qū)域上251位殘基Trp被Leu取代(Campbell等，1998)，這使得馬拉硫磷羧酸酯酶活性增強(qiáng)并獲得了OP水解酶活性。
需要能夠用來生物除污的方法和酶，可應(yīng)用在例如被疏水酯類殺蟲劑或毒素污染的土壤、糧食和水樣品。
發(fā)明概述本發(fā)明目前發(fā)現(xiàn)昆蟲酯酶及它們的突變體能夠水解疏水酯類殺蟲劑或毒素，如擬除蟲菊酯。昆蟲酯酶和它們的突變體顯示了一定程度的手性特異性，其因突變體的不同而異。因此有可能提供一系列能夠降解疏水酯類殺蟲劑和毒素的昆蟲酯酶或其突變體，它們能單獨(dú)或共同起作用，作為有效的用作如擬除蟲菊酯等疏水酯類殺蟲劑和毒素的生物除污劑。
因此，第一方面，本發(fā)明提供了一種除去或減少樣品中疏水酯類殺蟲劑或毒素濃度的方法，該方法包括將昆蟲酯酶或其突變體與樣品接觸。
在第一方面的優(yōu)選實(shí)施方案中，昆蟲酯酶是酶的多基因家族的羧基/膽堿酯酶中的一員。較優(yōu)選地，昆蟲酯酶是一種羧酸酯酶。更優(yōu)選地，昆蟲酯酶是在這一多基因家族中形成亞進(jìn)化枝的α-羧酸酯酶簇中的一員(Oakeshott等，1999)。形成這一亞進(jìn)化枝的酯酶至少包括能從昆蟲雙翅目，半翅目和膜翅目中分離出的α-羧酸酯酶。在這一亞進(jìn)化枝中發(fā)現(xiàn)的特異性酶包括，但不限于，E3或EST23酯酶。然而，來源于其它昆蟲種的E3和EST23同源酯酶也可用于本發(fā)明的方法。
優(yōu)選地，α-羧酸酯酶可以從雙翅目種中分離出來。因此，優(yōu)選用于本發(fā)明的α-羧酸酯酶實(shí)例是E3酯酶(SEQ ID NO1)，它獲自Luciliacuprina，或EST23酯酶(SEQ ID NO2)，它獲自黑腹果蠅(Drosophilamelanogaster)。
在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，突變體昆蟲酯酶在活性位點(diǎn)的氧離子空穴、?；Y(jié)合口袋或陰離子位點(diǎn)區(qū)域或其任何組合處有突變。
在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，α-羧酸酯酶的突變體選自如下組成的組E3G137R、E3G137H、E3W251L、E3W251S、E3W251G、E3W251T、E3W251A、E3W251L/F309L、E3W251L/G137D、E3W251L/P250S、E3F309L、E3Y148F、E3E217M、E3F354W、E3F354L和EST23W251L。優(yōu)選地，α-羧酸酯酶的突變體為E3W251L、E3F309L、E3W251L/F309L或EST23W251L。
在第-方面另一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，α-羧酸酯酶或其突變體的序列選自如下構(gòu)成的組i)示于SEQ ID NO1的序列，ii)示于SEQ ID NO2的序列，和iii)能夠水解疏水酯類殺蟲劑或毒素的與i)或ii)有至少40％相同性的序列。更優(yōu)選地，該多肽至少與i)或ii)具有至少50％的相同性，更優(yōu)選為至少60％的相同性，更優(yōu)選為至少70％的相同性，更優(yōu)選為至少80％的相同性，更優(yōu)選為至少90％的相同性，更優(yōu)選為至少95％的相同性，甚至優(yōu)選地至少97％的相同性。
正如普通技術(shù)人員所知，第一方面的方法可以用一種以上的昆蟲酯酶或其突變體進(jìn)行。特殊的情況是不同的昆蟲酯酶或其突變體對于疏水酯類殺蟲劑或毒素的不同立體異構(gòu)體具有不同的水解活性。
疏水酯類殺蟲劑或毒素可以是任何具有疏水性質(zhì)、包含酯基并對活的生物體具有一定程度的毒性的分子。特別優(yōu)選的疏水酯類殺蟲劑或毒素是擬除蟲菊酯。該擬除蟲菊酯可以是I型擬除蟲菊酯或II型擬除蟲菊酯。優(yōu)選地，該I型擬除蟲菊酯選自如下構(gòu)成的組1S/1R反芐氯菊酯，1S/1R順芐氯菊酯，順NRDC157 1S和順NRDC1567 1R。優(yōu)選地，II類擬除蟲菊酯是溴氰菊酯。
優(yōu)選地，樣品是土壤樣品，水劑樣品或生物樣品。優(yōu)選的生物樣品包括從如種子、蔬菜或水果的植物中獲得的物質(zhì)，以及從如肉的動物中獲得的物質(zhì)。
優(yōu)選地，該方法施用于包含液體的環(huán)境。
該樣品可通過任何適當(dāng)?shù)氖侄闻c昆蟲酯酶或其突變體接觸。包括將昆蟲酯酶或其突變體直接加入到樣品中，帶有或不帶有載體或賦形劑等。該昆蟲酯酶或其突變體也可以以宿主細(xì)胞的形式加入，典型地為微生物，如可以表達(dá)編碼昆蟲酯酶或其突變體的多核苷酸的細(xì)菌或真菌。
昆蟲酯酶或其突變體也可以以固定到一個聚合的多孔載體上的聚合的海綿或泡沫而被提供，該泡沫或海綿含有昆蟲酯酶或其突變體。
優(yōu)選地，該多孔載體含有聚氨酯。
在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，海綿或泡沫進(jìn)一步包含埋置的或結(jié)合到多孔載體內(nèi)或表面的碳。
設(shè)想本發(fā)明方法中表面活性劑的使用可以從任何如樣品中的沉淀物中釋放疏水酯類殺蟲劑和/或毒素。從而增加了本發(fā)明方法的有效性。因此，在另一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，該方法包括在疏水酯類殺蟲劑或毒素與昆蟲酯酶接觸時存在表面活性劑。更優(yōu)選地，該表面活性劑是生物表面活性劑。
而且，通過將樣品與產(chǎn)生昆蟲酯酶或它們突變體的轉(zhuǎn)基因植物接觸，樣品中的疏水酯類殺蟲劑或毒素也可以被降解。
第二方面，本發(fā)明實(shí)質(zhì)上提供了一種純化的多肽，它是一種昆蟲酯酶的突變體，其中一種或多種突變是位于選自包含氧離子空穴、?；Y(jié)合口袋和陰離子位點(diǎn)構(gòu)成的一組酯酶的區(qū)域內(nèi)，其中該昆蟲酯酶突變體能水解疏水酯類殺蟲劑或毒素，條件是該昆蟲酯酶突變體不是E3W251L、E3W251S、E3W251G或E3G137D。
優(yōu)選地，該昆蟲酯酶是α-羧酸酯酶。
優(yōu)選地，該多肽選自如下的組i)具有SEQ ID NO1的突變體，和ii)具有SEQ ID NO2的突變體，其中所述突變體與SEQ ID NO′s1或2中的至少一種具有40％的相同性。更優(yōu)選地，該突變體至少與SEQ ID NO′s1或2中的至少一種具有80％的相同性。更優(yōu)選地，該突變體與SEQ ID NO′s1或2中的至少一種具有90％的相同性。
優(yōu)選地，所述突變是點(diǎn)突變。
優(yōu)選地，所述多肽選自如下構(gòu)成的組E3G137R、E3G137H、E3W251T、E3W251A、E3W251L/F309L、E3W251L/G137D、E3W251L/P250S、E3F309L、E3Y148F、E3E217M、E3F354W、E3F354L、EST23W251L。
第三方面，本發(fā)明提供了一種融合多肽，它包括第二方面的多肽與至少一種其它的多肽序列融合。
本發(fā)明第四方面提供了一種編碼第二或第三方面的多肽的分離出的多核苷酸。
本發(fā)明的第五方面提供了一種復(fù)制和/或表達(dá)第四方面的多核苷酸所用的載體。
第六方面，本發(fā)明提供了一種用第五方面的載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞。
第七方面，本發(fā)明提供了一種水解一種疏水酯類殺蟲劑或毒素的組合物，該組合物含有基于第二或第三方面的多肽，以及一種或多種可接受的載體。
第八方面，本發(fā)明提供了一種生產(chǎn)和選擇可水解疏水酯類殺蟲劑或毒素的酶的方法，該方法包括(i))在昆蟲酯酶或已經(jīng)被突變的昆蟲酯酶中引入一種或多種突變，，以及(ii)確定突變的昆蟲酯酶水解疏水酯類殺蟲劑或毒素的能力。
優(yōu)選地，一種或多種突變增強(qiáng)了水解能力和/或改變了酯酶的立體專一性。
這樣的一種或多種突變可以通過多種本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的技術(shù)被引入。這些技術(shù)包括，但不限于，定向誘變，無規(guī)突變誘變，或使用體外進(jìn)化技術(shù)中的DNA改組技術(shù)，每種技術(shù)都在編碼昆蟲酯酶或已經(jīng)突變的昆蟲酯酶的多核苷酸上進(jìn)行。
在第八方面優(yōu)選的實(shí)施方案中，昆蟲酯酶是α-羧酸酯酶。更優(yōu)選地，該α-羧酸酯酶是E3或EST23酯酶。更優(yōu)選地，該α-羧酸酯酶具有選自如下組的序列i)示于SEQ ID NO1的序列，ii)示于SEQ ID NO2的序列，和iii)與i)或ii)至少40％相同的序列。更優(yōu)選地，該多肽與i)或ii)有至少50％的相同性，更優(yōu)選至少60％的相同性，更優(yōu)選至少70％的相同性，更優(yōu)選至少80％的相同性，更優(yōu)選至少90％的相同性，更優(yōu)選至少95％的相同性，甚至更優(yōu)選至少97％的相同性。
優(yōu)選地，酯酶的一種或多種突變位于一個選自如下區(qū)域組成的組的區(qū)域，包含氧離子空穴，?；Y(jié)合口袋和陰離子位點(diǎn)。
在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，已經(jīng)突變的昆蟲酯酶選自如下組成的組E3G137R、E3G137H、E3W251L、E3W251S、E3W251G、E3W251T、E3W251A、E3W251L/F309L、E3W251L/G137D、E3W251L/P250S、E3F309L、E3Y148F、E3E217M、E3F354W、E3F354L和EST23W251L。
在第八方面更優(yōu)選的實(shí)施方案中，突變是點(diǎn)突變。
第九方面，本發(fā)明提供了一種基于第八方面的方法所獲得的酶。
在整個說明書中，詞語“包括”被理解為意指包括一定的成分、完整物或步驟，或一組成分、完整物或步驟，但不是被排除在外的其它任何的成分、完整物或步驟，或其它組的成分、完整物或步驟。
本發(fā)明下文通過非限制性的實(shí)施例以及參考附圖來描述。
附圖簡述

圖1E3的氨基酸排序(SEQ ID NO1)和電鰩(Torpedocalifornica)乙酰膽堿酯酶的氨基酸排序(SEQ ID NO3)?；钚晕稽c(diǎn)周圍的絲氨酸和Gly137、Trp251和Phe309殘基的序列以粗體顯示并加下劃線。
圖2在?；磻?yīng)中LcE3羧酸酯酶活性位點(diǎn)的假定構(gòu)型。
圖3在含有桿狀病毒表達(dá)酯酶的細(xì)胞提取物中進(jìn)行的滴定實(shí)驗(yàn)的代表性結(jié)果。
圖41R/S順反式芐氯菊酯，1R/S順反式NRDC157和順式溴氰菊酯的四種立體異構(gòu)體的分子結(jié)構(gòu)。
圖5用E3W251L水解順式和反式芐氯菊酯(0.5μM)的情況。序列檢索表
SEQ ID NO1-銅綠蠅(Lucilia cuprina)E3α-羧酸酯酶的氨基酸序列SEQ ID NO2-黑腹果蠅(Drosophila melanogaster)EST23α-羧酸酯酶的氨基酸序列。
SEQ ID NO3-電鰩(Torpedo californica)乙酰膽堿酯酶的部分氨基酸序列。
發(fā)明詳述通用技術(shù)除非另外說明，本發(fā)明利用的重組DNA技術(shù)是標(biāo)準(zhǔn)操作方法，是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。該技術(shù)的描述和說明可見于文獻(xiàn)，如J.Perbal，A Practical Guide to Molecular Cloning，John Wiley and Sons(1984)，J.Sambrook等，分子克隆實(shí)驗(yàn)指南，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版(1989)，T.A.，Brown(編輯)，Essential Molecular BiologyA Practical Approach，卷1和2，IRL出版(1991)，D.M.Glover和B.D.Hames(編輯)，DNA CloningA Practical Approach，卷1-4，IRL出版(1995和1996)，和F.M.Ausubel等(編輯)，Current Protocols in Molecular Biology，Greene Pub.Associates和Wiley-Interscience(1988，包括直到現(xiàn)在所有的更新資料)，所有的都引入并在此作為參考。
擬除蟲菊酯擬除蟲菊酯是除蟲菊殺蟲劑的合成類似物。例如，擬除蟲菊酯包括(每種情況的常用名與The Pesticide Manual(第12版)一致)芐氯菊酯、腈二氯苯醚菊酯、溴氫菊酯、氯氰菊酯、α-氯氰菊酯、溴氰菊酯、醚菊酯、氯氟胺氰戊菊酯、殺滅菊酯、氟氯氰菊酯、氟酯菊酯、氟胺氰菊酯、乙氰菊酯、氯氟氰菊酯、七氟苯菊酯、氟氯菊酯、四氟菊酯、己體氟氰菊酯和氟溴醚菊酯。
I型擬除蟲菊酯化合物(如芐氯菊酯)與II型擬除蟲菊酯化合物的不同之處在于，II型化合物在苯氧基芐基部分的α-碳原子上具有氰基基團(tuán)。II型擬除蟲菊酯的一些實(shí)例為氯氰菊酯、溴氰菊酯和腈二氯苯醚菊酯。
能用本發(fā)明的方法水解的擬除蟲菊酯殺蟲劑的實(shí)例包括但不限于如下這些化合物3-苯氧基芐基(1RS)-順，反-3-(2，2-二氯乙烯基)-2，2-二甲基環(huán)丙烷羧酸鹽[芐氯菊酯]，α-氰基-3-苯氧基芐基-1-(4-乙氧苯基)-2，2-二氯環(huán)丙烷羧酸鹽[乙氰菊酯]，(RS)-α-氰基-3-苯氧基芐基(RS)-2-(4-氯苯)-3-異戊酸鹽[殺滅菊酯]，(S)-α-氰基-3-苯氧基苯基(S)-2-(4-氯苯)異戊酸鹽[高氰戊菊酯]，α-氰基-3-苯氧基芐基(S)-2-(4-2氟甲氧苯基)異戊酸鹽[氟氰戊菊酯]，α-氰基-3-苯氧基芐基2-(2-氯-4-三氟甲基苯氨)異戊酸鹽[氟胺氰菊酯]，(RS)-α-氰基-3-苯氧基芐基2，2，3，3-四甲基環(huán)丙烷羧酸鹽[甲氰菊酯]，3-苯氧基芐基(1R)-順，反-菊酸鹽[d-擬除蟲菊酯]，(RS)-α-氰基-3-苯氧基芐基(1R)-順，反-菊酸鹽-[cyfenothrin]，(RS)3-烯丙基-2-甲基-4-環(huán)氧戊基-2-烯炔基(1RS)-順，反-菊酸鹽[丙烯除蟲菊]，α-氰基-3-苯氧基芐基(1R)-順，反-3-苯氧基芐基(1R)-順，反-3-(2，2-二氯乙烯基)-2，2-二甲基環(huán)丙烷羧酸鹽[氯氰菊酯]，(S)-α-氰基-3-苯氧基芐基(1R)-順-3-(2，2-二溴乙烯基)-2，2-二甲基環(huán)丙烷羧酸鹽[溴氰菊酯]，(S)-α氰基-3-苯氧基芐基(1R)-順-2，2-二甲基-3-(1，2，2，2-溴乙基)環(huán)丙烷羧酸鹽[氟胺氰菊酯]，3，4，5，6-四氫化亞氨甲基(1RS)-順，反-菊酸鹽[胺菊酯]，5-苯基-3-氟-3-呋喃甲基(1RS)-順，反-菊酸鹽[滅蟲菊]，α-氰基-4-氟-3-苯氧基芐基(1R，反)-2，2-二甲基-3-(2，2-二氯乙烯基)環(huán)丙烷羧酸鹽[氟氯氰菊酯]。
多肽通過“基本上純化”，我們認(rèn)為多肽已經(jīng)從在自然狀態(tài)與它結(jié)合的大部分的脂類、核苷酸、其它多肽和其它污染分子中分離出來。
多肽的相同性百分比由GAP(Needleman和Wunsh，1970)分析(GCG程序)確定，其中參數(shù)gap creation penalty＝5，gap extensionpenalty＝0.3。被分析的序列長度至少為15個氨基酸時，GAP分析就在參與測試的兩個序列的至少為15個氨基酸的區(qū)域進(jìn)行測試。更優(yōu)選地，被分析的序列長度至少為50個氨基酸時，GAP分析就在參與測試的兩個序列的至少為50個氨基酸的區(qū)域進(jìn)行測試。更優(yōu)選地，被分析的序列長度至少為100個氨基酸時，GAP分析就在參與測試的兩個序列的至少為100個氨基酸的區(qū)域進(jìn)行測試。更優(yōu)選地，被分析的序列長度至少為250個氨基酸時，GAP分析就在參與測試的兩個序列的至少為250個氨基酸的區(qū)域進(jìn)行測試。甚至更優(yōu)選地，被分析的序列長度至少為500個氨基酸時，GAP分析就在參與測試的兩個序列的至少為500個氨基酸的區(qū)域進(jìn)行測試。
此處使用的術(shù)語“它們的突變體”是指天然存在的昆蟲酯酶的突變體，相比于它們起源的天然存在的昆蟲酯酶，它們保留了至少一些對疏水酯類殺蟲劑或毒素的水解活性。優(yōu)選地，該突變體與它們起源的天然存在的昆蟲酯酶相比，具有增強(qiáng)的活性和/或改變了的立體專一性。
天然存在的昆蟲酯酶的氨基酸序列突變體可通過向本發(fā)明的核苷酸中引入適當(dāng)?shù)暮塑账嶙兓?、或通過體外合成所需多肽來準(zhǔn)備。這種突變體包括，例如缺失、插入或代換該氨基酸序列中的殘基?？梢允褂萌笔А⒉迦牒痛鷵Q的組合以得到最終的構(gòu)建體，提供具有需要的特性最終的蛋白產(chǎn)品。
在設(shè)計的氨基酸序列突變體時，突變位點(diǎn)的位置和突變種類依賴于被修飾的特性。在尤為優(yōu)選的實(shí)施方案中，自然界存在的昆蟲酯酶經(jīng)突變增強(qiáng)了它們水解疏水酯類殺蟲劑或毒素尤其是擬除蟲菊酯的能力。該突變位點(diǎn)可以單獨(dú)或連續(xù)的被修飾，如通過(1)首先用保守氨基酸備品取代，然后根據(jù)得到的結(jié)果用更多基本的選擇取代，(2)去掉靶殘基，或(3)插入其它與指定位點(diǎn)相鄰的其他殘基。這些突變體的實(shí)例包括E3G137R、E3G137H、E3W251L、E3W251S、E3W251G、E3W251T、E3W251A、E3W251L/F309L、E3W251L/G137D、E3W251L/P250S、E3F309L、E3Y148F、E3E217M、E3F354W、E3F354L和EST23W251L。
用于本發(fā)明的突變體也可以通過使用DNA改組技術(shù)(Patten等，1997)獲得。DNA改組是一種循環(huán)重組和突變的方法，它通過隨機(jī)斷裂相關(guān)的基因庫，隨后通過無引物PCR將片段重新組裝來完成。通常，DNA改組提供了一種建立多核苷酸文庫的方法，在這種情況下可以從中選擇或篩選出編碼能夠水解疏水酯類殺蟲劑或毒素的酶的多核苷酸序列，同時可以對選定的酶的立體專一性進(jìn)行篩選。
氨基酸序列缺失部分通常在約1至30個殘基之間變動，更優(yōu)選地在約1至10個殘基之間，典型地在約1至5個鄰接的殘基之間。
取代突變體的多肽分子中至少有一個氨基酸殘基被去除，而在該位置上插入一個不同的殘基。最感興趣的取代突變位點(diǎn)包括被鑒別為活性或結(jié)合位點(diǎn)的識別位點(diǎn)。其它感興趣的位點(diǎn)是那些從不同菌株或菌種中獲得的相同的特定殘基。這些位置對于生物活性是重要的。這些位點(diǎn)，尤其是當(dāng)該位點(diǎn)所在的序列中還存在至少三個其它相同保守位點(diǎn)時，都以相對保守的方式被取代。這種保守的取代在表1的標(biāo)題“典型取代”下顯示。
此外，如果需要，非天然的氨基酸或化學(xué)氨基酸類似物可作為取代物或附加物被引入到昆蟲酯酶或其突變體中。這種氨基酸包括，但不限于，普通氨基酸的D型異構(gòu)體、2，4-二氨基丁酸、α-氨基異丁酸、4-氨基丁酸、2-氨基丁酸、6-氨基己酸、2-氨基異丁酸、3-氨基丙酸、鳥氨酸、正亮氨酸、正纈氨酸、羥脯氨酸、肌氨酸、瓜氨酸、高瓜氨酸、半光氨酸、t-丁基甘氨酸、t-丁基丙氨酸、苯基甘氨酸、環(huán)己基丙氨酸、β-丙氨酸、氟-氨基酸，被標(biāo)識的氨基酸如β-甲基氨基酸、Cα-甲基氨基酸、Nα-甲基氨基酸和通常的氨基酸類似物。
本發(fā)明涉及的方面還包括昆蟲酯酶或其類似物，在它們合成期間或合成后進(jìn)行了不同的修飾，例如，通過生物素化、芐基化、糖基化、乙?；⒘姿峄?、由已知保護(hù)/封閉基團(tuán)的衍生作用、蛋白水解的切割作用、連接到抗體分子或其它細(xì)胞配體上等。這些修飾可以用來增加本發(fā)明多肽的穩(wěn)定性和/或生物活性。
表1
昆蟲酯酶及它們的突變體可以以各種方式生產(chǎn)，包括生產(chǎn)和回收天然蛋白質(zhì)，生產(chǎn)和回收重組蛋白質(zhì)，以及化學(xué)合成蛋白質(zhì)。在一個實(shí)施方案中，一種編碼昆蟲酯酶或它們突變體的分離多肽是通過在有效生產(chǎn)并回收多肽的條件下培養(yǎng)能表達(dá)該多肽的細(xì)胞來生產(chǎn)的。優(yōu)選的培養(yǎng)細(xì)胞是本發(fā)明的重組細(xì)胞。有效的培養(yǎng)條件包括，但不限于允許蛋白生產(chǎn)的有效培養(yǎng)基、生物反應(yīng)器、溫度、pH和氧氣條件。有效的培養(yǎng)基指適合培養(yǎng)一種可以產(chǎn)生本發(fā)明多肽的細(xì)胞的任何培養(yǎng)基。這種培養(yǎng)基典型地包括一種水性介質(zhì)，其中含有可吸收的碳源、氮源和磷酸鹽，以及適當(dāng)鹽、礦物質(zhì)、金屬和其它營養(yǎng)物質(zhì)，如維生素。產(chǎn)生昆蟲酯酶或它們突變體的細(xì)胞，可在傳統(tǒng)的發(fā)酵生物反應(yīng)器、搖瓶、試管、微量滴定器和培養(yǎng)皿中培養(yǎng)。培養(yǎng)在適于重組細(xì)胞的溫度、pH和氧含量下進(jìn)行。這些培養(yǎng)條件是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以確定的。
多核苷酸術(shù)語“分離的多核苷酸”是指一種從與它的天然態(tài)聯(lián)合或連接的多核苷酸序列中分離出的多核苷酸序列。而且，術(shù)語“多核苷酸”此處可以與術(shù)語“核酸分子”交替地使用。
多核苷酸相同性的百分?jǐn)?shù)由GAP(Needleman和Wunsch，1970)分析(GCG程序)來確定，其中參數(shù)gap creation penalty＝5，gapextension penalty＝0.3。被分析的序列長度至少為45個氨基酸時，GAP分析就在被測試的兩個序列的至少為45個氨基酸的區(qū)域進(jìn)行測試。更優(yōu)選地，被分析的序列長度至少為150個氨基酸時，GAP分析就在被測試的兩個序列的至少為150個氨基酸的區(qū)域進(jìn)行測試。更優(yōu)選地，被分析的序列長度至少為300個氨基酸時，GAP分析就在被測試的兩個序列的至少為300個氨基酸的區(qū)域進(jìn)行測試。
重組載體重組載體可用來表達(dá)本發(fā)明方法中使用的昆蟲酯酶或其突變體。而且，本發(fā)明的另一個實(shí)施方案中包括將包含至少一種本發(fā)明的分離多核苷酸分子的重組載體，其插入到能輸送多核苷酸分子到宿主細(xì)胞的任何載體中。這種載體含有異源的多核苷酸序列，它們是非天然發(fā)現(xiàn)的與編碼昆蟲酯酶或它們突變體的多核苷酸相鄰的多核苷酸序列，它們優(yōu)選來源于除了酯酶來源的菌種之外的菌種。這些載體可以是RNA或DNA，原核的或真核的，典型的載體是病毒或質(zhì)粒。
一種重組載體的類型包括可以將編碼昆蟲酯酶或它們突變體的多核苷酸有效地連接到一種表達(dá)載體上。短語“有效地連接”是指將多核苷酸分子以一種方式插入到表達(dá)載體中，使得該分子在轉(zhuǎn)化到宿主細(xì)胞后能夠表達(dá)。此處使用的表達(dá)載體是DNA或RNA載體，它們能夠轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞并有效表達(dá)指定的多核苷酸分子。優(yōu)選地，該表達(dá)載體也能在宿主細(xì)胞內(nèi)復(fù)制。表達(dá)載體可以是原核的或真核的，并且典型的是病毒或質(zhì)粒。本發(fā)明的表達(dá)載體包括作用(即直接基因表達(dá))到本發(fā)明重組細(xì)胞的任何載體，包括細(xì)菌、真菌、體內(nèi)寄生物、節(jié)肢動物、其它動物和植物細(xì)胞。本發(fā)明優(yōu)選的表達(dá)載體可以直接在細(xì)菌、酵母、節(jié)肢動物和哺乳動物細(xì)胞中進(jìn)行基因表達(dá)，更優(yōu)選可以在此處公開的更多的細(xì)胞類型中進(jìn)行基因表達(dá)。
本發(fā)明的表達(dá)載體含有調(diào)整序列，如轉(zhuǎn)錄控制序列、翻譯控制序列、復(fù)制起點(diǎn)和其它與重組細(xì)胞一致的調(diào)控序列，它們控制本發(fā)明多核苷酸分子的表達(dá)。特別地，包含編碼昆蟲酯酶或它們突變體的多核苷酸的表達(dá)載體包括轉(zhuǎn)錄控制序列。轉(zhuǎn)錄控制序列是控制起始、延伸和終止轉(zhuǎn)錄的序列。特別重要的轉(zhuǎn)錄控制序列是那些控制轉(zhuǎn)錄起始的序列，如啟動子、增強(qiáng)子、操縱基因和阻抑物序列。適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)錄控制序列包括可以對本發(fā)明的至少一種重組細(xì)胞起作用的任何控制序列。各種這樣的轉(zhuǎn)錄控制序列是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。優(yōu)選的轉(zhuǎn)錄控制序列包括那些對細(xì)菌、酵母、節(jié)肢動物和哺乳動物細(xì)胞起作用的序列，例如，但不限于tac、lac、trp、trc、oxy-pro、omp/lpp、rrnB、λ噬菌體、T7噬菌體、T7lac、T3噬菌體、SP6噬菌體、SP01噬菌體、金屬硫蛋白、α-交配因子、Pichia醇氧化酶、α-病毒亞基因組啟動子(如Sindbis病毒亞基因組啟動子)、抗生素抗性基因、桿狀病毒、玉米穗蟲(Heliothis zea)昆蟲病毒、牛痘病毒、皰疹病毒、北美浣熊痘病毒、其它痘病毒、腺病毒、巨細(xì)胞病毒(如中間早期啟動子)、猴腎病毒40、逆轉(zhuǎn)錄病毒、肌動蛋白、反轉(zhuǎn)錄病毒長末端重復(fù)、勞氏肉瘤病毒、熱休克、磷酸鹽和硝酸鹽轉(zhuǎn)錄控制基因、以及能控制原核或真核細(xì)胞基因表達(dá)的其它序列。另外的適當(dāng)轉(zhuǎn)錄控制基因包括組織特異性啟動子和增強(qiáng)子。
編碼昆蟲酯酶或它們突變體的多核苷酸也可以(a)含有分泌信號(即信號片斷核酸序列)使得表達(dá)出的昆蟲酯酶或它們突變體能從產(chǎn)生該多肽的細(xì)胞中分泌出來，和/或(b)含有融合序列。合適的信號片斷實(shí)例包括能指導(dǎo)昆蟲酯酶或它們突變體分泌的任何信號片斷。優(yōu)選的信號片斷包括，但不限于，組織纖溶酶原激活物(t-PA)、干擾素、白介素、生長激素、組織相容性和病毒包膜糖蛋白信號片斷，以及天然的信號序列。此外，編碼昆蟲酯酶或它們突變體的多核苷酸可以結(jié)合到指導(dǎo)編碼蛋白成為蛋白體的融合片斷上，如遍在蛋白融合片斷。
宿主細(xì)胞本發(fā)明的另一個實(shí)施方案包括重組細(xì)胞，它由一個或多個編碼昆蟲酯酶或它們突變體的多核苷酸轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞組成。向細(xì)胞轉(zhuǎn)化多核苷酸分子可以通過多核苷酸插入到細(xì)胞的任何方法獲得。轉(zhuǎn)化技術(shù)包括，但不限于，轉(zhuǎn)染、電穿孔、顯微注射、脂轉(zhuǎn)染、吸附和原生質(zhì)體融合。一個重組細(xì)胞可以保持單細(xì)胞或可以生長成為組織、器官或一種多細(xì)胞生物。編碼昆蟲酯酶或它們突變體的轉(zhuǎn)化多核苷酸可以保持在染色體外，或在轉(zhuǎn)化(即重組)細(xì)胞內(nèi)整合到一個或多個染色體位點(diǎn)上，以這樣的方式使得它們能夠保持表達(dá)能力。
適合轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞包括可以被編碼昆蟲酯酶或它們突變體的多核苷酸轉(zhuǎn)化的任何細(xì)胞。本發(fā)明的宿主細(xì)胞能內(nèi)源性地(即天然地)產(chǎn)生昆蟲酯酶或它們突變體，或者在用至少一種編碼昆蟲酯酶或它們突變體的多核苷酸轉(zhuǎn)化后，能產(chǎn)生這種蛋白。本發(fā)明的宿主細(xì)胞可以是能產(chǎn)生至少一種昆蟲酯酶或它們突變體的任何細(xì)胞，包括細(xì)菌、真菌(包括酵母)、寄生蟲、節(jié)肢動物、動物和植物細(xì)胞。更優(yōu)選的宿主細(xì)胞包括桿菌、分枝桿菌、酵母、節(jié)肢動物和哺乳動物細(xì)胞。更優(yōu)選的宿主細(xì)胞包括沙門氏菌屬、埃希氏菌屬、桿菌屬、李司忒氏菌屬、酵母菌屬、夜蛾、分枝桿菌屬、粉紋夜蛾、BHK(幼年倉鼠腎)細(xì)胞，MDCK細(xì)胞(為犬皰疹病毒培養(yǎng)的正常犬腎細(xì)胞系)、CRFK細(xì)胞(為貓皰疹病毒培養(yǎng)的正常貓腎細(xì)胞系)、CV-1細(xì)胞(非洲猴腎細(xì)胞系，用于例如培養(yǎng)北美浣熊痘病毒)、COS(如COS-7)細(xì)胞和Vero細(xì)胞。尤其優(yōu)選的宿主細(xì)胞是大腸桿菌，包括大腸桿菌K-12變種；傷寒沙門氏菌；鼠傷寒沙門氏菌，包括減毒株；草地夜蛾；粉紋夜蛾；BHK細(xì)胞；MDCK細(xì)胞；CRFK細(xì)胞；CV-1細(xì)胞；COS細(xì)胞；Vero細(xì)胞和非成瘤性的鼠成肌細(xì)胞G8細(xì)胞(如ATCC CRL 1246)。其它合適的哺乳動物宿主細(xì)胞包括其它腎細(xì)胞系，其它成纖維細(xì)胞系(如人、鼠或小雞胚成纖維細(xì)胞系)，骨髓瘤細(xì)胞系，中國倉鼠卵巢細(xì)胞，鼠NIH/3T3細(xì)胞，LMTK細(xì)胞和/或HeLa細(xì)胞。
通過操縱重組DNA技術(shù)可用來提高轉(zhuǎn)化多核苷酸分子的表達(dá)，如宿主細(xì)胞中多核苷酸分子的拷貝數(shù)，多核苷酸分子的轉(zhuǎn)錄效率，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物翻譯的效率，翻譯后修飾的效率。用于增加編碼昆蟲酯酶或它們突變體的多肽表達(dá)的重組體技術(shù)包括，但不限于，可操作性將多核苷酸分子連接到多拷貝數(shù)質(zhì)粒，將多核苷酸分子整合到一個或多個宿主細(xì)胞染色體上，向質(zhì)粒中附加載體穩(wěn)定性序列，代換或修飾轉(zhuǎn)錄控制信號(如啟動子、操縱基因、增強(qiáng)子)，代換或修飾翻譯控制信號(如核糖體結(jié)合部位、Shine-Dalgarno序列)，修飾本發(fā)明的多核苷酸分子與宿主細(xì)胞的密碼子選擇相符，去除轉(zhuǎn)錄不穩(wěn)定的序列。
組合物用于本發(fā)明或者含有本發(fā)明多肽的組合物，包括賦形劑，此處也指“可接受的載體”。賦形劑是可以被處理的動物、植物、植物或動物材料、或環(huán)境(包括土壤或水樣品)可進(jìn)行處理的任何材料。這種賦形劑的例子包括水、鹽水、Ringer’s溶液、葡萄糖溶液、Hank’s溶液和其它生理平衡鹽溶液。非水載體，如固態(tài)油、芝麻油、油酸乙酯或甘油三酯都可以使用。其它有用的劑型包括含有粘度增強(qiáng)劑的懸浮液，如羧甲基纖維素鈉、山梨醇或葡聚糖。賦形劑液可含有微量添加劑，如增強(qiáng)等滲壓性和化學(xué)穩(wěn)定性的物質(zhì)。緩沖液的例子包括磷酸緩沖液、碳酸氫鹽緩沖液和Tris緩沖液，而防腐劑的例子包括硫柳汞或o-甲酚，福爾馬林和苯甲醇。賦形劑也可用于增加組分的半衰期，例如，但不限于，聚合控釋載體、生物可降解的植入物、脂質(zhì)體、細(xì)菌、病毒、其它細(xì)胞、油、酯和乙二醇。
此外，昆蟲酯酶或其突變體可被供給到一組分中，該組分可增加疏水酯類殺蟲劑或毒素的降解率和/或降解度，或可增加多肽的穩(wěn)定性。例如，昆蟲酯酶或其突變體可被固定化到聚氨酯底物上(Gordon等，1999)，或包裹到適當(dāng)?shù)闹|(zhì)體上(Petrikovics等，2000a和b)。與昆蟲酯酶或其突變體結(jié)合的組分中含有如通常在滅火中使用的泡沫等物質(zhì)(LeJeune等，1998)。
如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的，WO0064539公開了昆蟲酯酶或其突變體能夠容易地在海綿或泡沫中使用的方法，它們的內(nèi)容在此處完全引入。
本發(fā)明的一個實(shí)施方案是一種控釋劑型，它能將含有昆蟲酯酶或它們突變體的組分緩慢釋放到動物、植物、動物或植物材料或環(huán)境(包括土壤和水樣品)中。如此處所用，控釋劑型配方是在一種控釋載體中包含昆蟲酯酶或其突變體。合適的控釋載體包括，但不限于，生物相容聚合物、其它聚合基質(zhì)、膠囊、微囊劑、微粒、大丸劑、滲透泵、擴(kuò)散裝置、脂質(zhì)體、脂球(liposphere)和透皮輸送體系。優(yōu)選的控釋劑型是生物降解的(即生物可侵蝕的)。
本發(fā)明優(yōu)選的控釋劑型能將昆蟲酯酶或其突變體釋放到用疏水酯類殺蟲劑或毒素噴射區(qū)域的土壤或水中。該劑型優(yōu)選釋放1至12個月的時間段。本發(fā)明優(yōu)選的控釋劑型能有效處理優(yōu)選至少約1個月，更優(yōu)選至少約3個月，甚至更優(yōu)選至少約6個月，甚至更優(yōu)選至少約9個月，甚至更優(yōu)選至少約12個月。
昆蟲酯酶或它們突變體(或表達(dá)昆蟲酯酶或它們突變體的宿主細(xì)胞)的濃度要必須產(chǎn)生有效降解疏水酯類殺蟲劑或毒素的組分，該濃度的選擇取決于被凈化樣品的性質(zhì)、樣品中疏水酯類殺蟲劑或毒素的濃度和組分的配方。組分中昆蟲酯酶或它們突變體(或表達(dá)昆蟲酯酶或它們突變體的宿主細(xì)胞)的有效濃度可用本領(lǐng)域技術(shù)人員所了解的實(shí)驗(yàn)方法容易地確定。
表面活性劑可以理解本發(fā)明方法中表面活性劑的使用可以從任何樣品的沉淀中釋放出疏水酯類殺蟲劑和/或毒素，從而能增加本發(fā)明方法的有效性。
表面活性劑是具有親水和疏水(通常是碳水化合物)部分的兩性分子，它在液相的具有不同的極性和氫鍵的界面之間進(jìn)行優(yōu)先分配，如油/水或空氣/水界面。這種性質(zhì)使得表面活性劑能減少表面和界面的張力，并在碳?xì)浠衔锶芙馑蛩芙馓細(xì)浠衔锏牡胤叫纬晌⑷?。表面活性劑具有許多有用的性質(zhì)，包括分散性狀。
生物表面活性劑是一組由微生物合成的結(jié)構(gòu)上不同的表面活性分子。這些分子在水溶液和碳水混合物中減少了表面和界面的張力。與化學(xué)表面活性劑相比，生物表面活性劑具有幾個優(yōu)點(diǎn)，例如更低的毒性、更高的生物降解能力、更好的環(huán)境相容性、更高起泡沫的能力、在極端溫度、PH和鹽度下的高選擇性和特異性，以及從再生資源中被合成的能力。
用于本發(fā)明生物除污方法的生物表面活性劑包括，但不限于糖脂如鼠李糖脂(來源于，如綠濃桿菌)、海藻糖脂(來源于，如紅球菌屬)、槐糖脂(來源于，如球擬酵母屬)和纖維二糖脂(來源于，如玉米黑粉菌，Ustilago zeae)；脂肽和脂蛋白如serrawettin(來源于，如粘質(zhì)沙雷氏桿菌)、枯草菌表面活性劑(來源于，如枯草桿菌)、枯草菌蛋白酶(來源于，如枯草桿菌)、短桿菌肽(來源于，如短桿菌)和多粘菌素(來源于，如多粘芽孢桿菌)；脂肪酸、中性脂質(zhì)和磷脂；聚合表面活性劑如乳化膠(來源于，如乙酸鈣不動桿菌)、生物分散劑(來源于，如乙酸鈣不動桿菌)、甘露聚糖脂蛋白(來源于，如熱帶念珠菌)、脂乳化劑(來源于如解脂假絲酵母Candida lypolytica)、PA蛋白(來源于，如銅綠假單孢菌)；以及微粒生物表面活性劑如來源于乙酸鈣不動桿菌A.calcoaceticus的泡囊和纖毛。
轉(zhuǎn)基因植物術(shù)語“植物”是指整體植物、植物器官(如葉、莖、根等)、種子、植物細(xì)胞等等。預(yù)備用于本發(fā)明實(shí)驗(yàn)的植物包括單子葉植物和雙子葉植物。典型的單子葉植物包括小麥、大麥、黑麥、雜交麥、燕麥、稻等等。
本發(fā)明范圍內(nèi)的轉(zhuǎn)基因植物包括植物(以及所述植物的部分和細(xì)胞)和已經(jīng)用重組DNA技術(shù)進(jìn)行基因修飾的它們的后代，它們i)使得昆蟲酯酶或其突變體在期望的植物或植物器官中產(chǎn)生。
一些技術(shù)可以將外源基因材料引入到植物細(xì)胞中。這種技術(shù)包括加速包裹在微粒上的基因材料直接進(jìn)入到細(xì)胞內(nèi)(參見，如US4945050和US 5141131)。植物可以利用農(nóng)桿菌技術(shù)進(jìn)行轉(zhuǎn)化(參見，如US 5177010，US 5104310，US 5004863，US 5159135)。電穿孔技術(shù)也被用于轉(zhuǎn)化植物(參見，如WO 8706614，US 5472869，5384253，WO 9209696和WO 9321335)。除了許多轉(zhuǎn)化植物的技術(shù)，與外源基因相連的組織類型也可以改變。這種組織包括，但不限于胚胎組織、I和II型胼胝體組織、胚軸、分生組織等等。幾乎所有的植物組織可以在發(fā)育和/或分化期間使用文中所描述的適當(dāng)技術(shù)來轉(zhuǎn)化。
許多適合穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的植物細(xì)胞或適合建立轉(zhuǎn)基因植物的載體已經(jīng)被描述于如，Pouwels等，Cloning VectorsA Laboratory Manual，1985，增刊1987；Weissbach和Weissbach，Methods for Plant MolecularBiology，Academic Press，1989；以及Gelvin等，Plant MolecularBiology Manual，Kluwer Academic Press，1990。典型地，植物表達(dá)載體包括，例如一種或多種由5’和3’調(diào)節(jié)序列和主要可選擇的標(biāo)示進(jìn)行轉(zhuǎn)錄控制的克隆植物基因。這種植物表達(dá)載體也含有啟動子調(diào)節(jié)區(qū)域(如控制誘導(dǎo)或構(gòu)成的調(diào)節(jié)區(qū)域，環(huán)境或發(fā)育的調(diào)節(jié)，或細(xì)胞或組織特異性表達(dá))，轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，核糖體結(jié)合部位和RNA加工信號，轉(zhuǎn)錄終止位點(diǎn)和/或聚腺苷酸化信號。
植物啟動子的實(shí)例包括，但不限于核酮糖-1，6-二磷酸羧化酶小亞基、β-伴球蛋白啟動子、云扁豆蛋白啟動子、ADH啟動子、熱激啟動子和組織特異性啟動子。啟動子也可以包括能提高轉(zhuǎn)錄效率的特定的增強(qiáng)子序列元件。典型的增強(qiáng)子包括但不限于Adh-內(nèi)含子1和Adh-內(nèi)含子6。
組成型啟動子在所有細(xì)胞類型和所有時間指導(dǎo)連續(xù)基因表達(dá)(如肌動蛋白，泛素，CaMV 35S)。組織特異性啟動子負(fù)責(zé)特異細(xì)胞和組織類型如葉子或種子中的基因表達(dá)(例如玉米蛋白、油質(zhì)蛋白、napin、ACP、球蛋白等等)，并且這些啟動子也可以被使用。在某些植物發(fā)育的特定時期，啟動子也可像在植物組織和器官中一樣的活性。這種啟動子的例子包括但不限于花粉特異性、胚胎特異性、玉米須特異性、棉纖維特異性、根特異性、種子胚乳特異性啟動子等等。
在某種情況下，需要使用誘導(dǎo)型啟動子。一種誘導(dǎo)型啟動子負(fù)責(zé)在特異信號下進(jìn)行相應(yīng)的基因表達(dá)，如物理刺激(熱激基因)；光(RUBP羧化酶)；激素(Em)；代謝產(chǎn)物和應(yīng)激反應(yīng)。其它作用于植物的轉(zhuǎn)錄或翻譯元件也可使用。
除了植物啟動子之外，各種來源的啟動子可以有效地用于植物細(xì)胞來表達(dá)外源基因。例如，細(xì)菌源的啟動子、如章魚堿合酶啟動子、胭脂堿合酶啟動子、甘露堿合酶啟動子；病毒源的啟動子、如花椰菜花葉病毒(35S和19S)等等都可使用。
以下為說明目的提供的實(shí)施例的意圖并不以任何方式限制或限定本發(fā)明。
實(shí)施例實(shí)施例1突變體構(gòu)建E3酶氨基酸序列和一種脊椎動物的乙酰膽堿酯酶(TcAChE，它的三維結(jié)構(gòu)是已知的；Sussman等，1991)的排列示于圖1。E3和EST23突變體使用Stratagene的QuickChangeTM定點(diǎn)突變試劑盒來構(gòu)建，并根據(jù)改變的殘基的數(shù)量和所改變的性質(zhì)來命名。例如，E3W251L是野生型酶(即E3WT)中在251位置的Trp殘基被Leu取代的E3突變體。
E3和EST23酶使用如Newcomb等(1997)所描述的桿狀病毒的表達(dá)系統(tǒng)來表達(dá)，但使用HyQ SFX-昆蟲無血清培養(yǎng)基(HyClone)來增加表達(dá)。在0.1M的磷酸緩沖液，PH為7.0，含有0.05％TritonX-100的條件下通過溶解細(xì)胞每ml 108個細(xì)胞來制備細(xì)胞提取物。然后用熒光分析法滴定提取物得到酯酶分子的數(shù)量，熒光分析根據(jù)被二乙香豆磷酸酯(dECP)酶磷酸化的初始釋放的香豆素(一種發(fā)熒光的化合物)。
圖2說明了酰化反應(yīng)中E3活性部位的假定構(gòu)型(基于脊椎動物AChE的三維結(jié)構(gòu))。我們已經(jīng)檢驗(yàn)了七個E3殘基中相應(yīng)于已知的AChE活性部位的三個清楚的亞部位區(qū)域的突變體。它們是氧離子空穴(E3殘基137)，陰離子部位(E3殘基148，217和354)以及?；Y(jié)合口袋(E3殘基250，251和309)。在Jarv命名法中(1984)，陰離子部位和?；Y(jié)合口袋相應(yīng)于p1和p2亞部位。
氧離子空穴中的突變在TcAChE中，氧離子空穴包括Gly118、Gly119和Ala201，它們相應(yīng)于E3中的Gly136，Gly137和Ala219。這些殘基在整個羧基/膽堿酯酶多基因族中高度保守(Oakeshott等，1999)，并且對于來自一些膽堿酯酶和脂肪酶的X射線結(jié)晶的研究，為氧離子空穴結(jié)構(gòu)的保守性提供了實(shí)驗(yàn)的證據(jù)(Cygler和Schrag，1997)，雖然一些脂肪酶在界面活化期間結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變(Derewenda等，1992)。在催化期間由羧基底物的羰氧基作為第一次過渡態(tài)，它們對于穩(wěn)定氧化陰離子形成起作用，也提供了相應(yīng)結(jié)構(gòu)上的證據(jù)(Grochulski等，1993；Martinez等，1994)。這種穩(wěn)定性通過與肽鏈上三個主要?dú)埢纬蓺滏I網(wǎng)絡(luò)而獲得(Ordentlich等，1998)。最近，Koellner等(2000)也已經(jīng)顯示AChE氧離子空穴的兩個Gly殘基通過氫鍵與浸入的“結(jié)構(gòu)”水分子的結(jié)合，這種結(jié)合在催化反應(yīng)中一直保留，因此被認(rèn)為起到潤滑劑作用，以促進(jìn)活性部位的底物和產(chǎn)物傳遞。
除了自然發(fā)現(xiàn)于OP抗性L.cuprina中的G137D，E3的Gly137進(jìn)而有三種突變。首先，在G137E突變中，Glu被其它氨基酸取代。其次突變體G137H通過在同一位置進(jìn)行突變而被構(gòu)建，因?yàn)镠is在中性PH下(pKa，對于Asp和Glu約6.5比4.4)也是非質(zhì)子化的，并且發(fā)現(xiàn)當(dāng)His在人丁酰膽堿酯酶中的氧離子空穴內(nèi)取代任一Gly時，給予了酶一些OP水解性能(Broomfield等，1999)。最后Arg(pKa約12)在位置137被取代，以檢驗(yàn)可能性最強(qiáng)的基本取代的有效性。
在酰基結(jié)合口袋的突變結(jié)構(gòu)上表征膽堿脂酶的?；Y(jié)合口袋主要由四個非極性殘基組成，其中的三個通常是芳香族的。它們一起構(gòu)成了強(qiáng)疏水袋以供給結(jié)合底物的?；糠帧＿@四個殘基在TcAChE中為Trp233，Phe288，Phe290和Val400相應(yīng)于在E3中的Trp251，Val307，Phe309和Phe422。類似的疏水殘基的排列在大部分羧基/膽堿脂酶的部位是保守的(Oakeshott等，1993；Robin等，1996；Yao等，1997；Harel等，2000)。在膽堿脂酶和大部分羧酸酯酶的殘基233/251的Trp和290/309的Phe尤其非常保守，盡管在一些脂酶和少數(shù)羧酸酯酶中是Leu或Ile。與TcAChE的Phe288相應(yīng)的殘基典型地是膽堿酯酶的支鏈脂肪族氨基酸，優(yōu)選為長鏈如丁酰膽堿。這包括哺乳動物丁酰膽堿脂酶和一些具有類似丁酰膽堿酯酶底物特異性的昆蟲乙酰膽堿酯酶。在乙酰結(jié)合口袋中，支鏈脂肪族氨基酸似乎為適應(yīng)更大的乙?；鶊F(tuán)提供了更大的空間。
通過在一些膽堿酯酶中的288/307和290/309的突變研究證實(shí)了它們在確定?；鶊F(tuán)身份的底物特異性方面起了關(guān)鍵作用。如果在人AchE中在任一位置用更小的殘基如Ala取代Phe，那么在使用了具有比自然?；?硫代)膽堿底物更大的?；鶊F(tuán)如丙基-或丁基-(硫代)膽堿時會改善酶的動力學(xué)(Ordentlich等，1993)。對于來自黑腹果蠅(D.Melanogaster)和家蠅(Musca domestica)的AchE，它們290/309的天然突變與用更大的極性的Tyr替代的OP抗性的目標(biāo)部位相比，對乙酰膽堿和OP都具有相對更低的反應(yīng)性(Fournier等，1992；Walsh等，2001)。對于黑腹果蠅的AchE，用更小的Leu取代Phe殘基實(shí)現(xiàn)了預(yù)期的OP的靈敏度的提高，驚奇的是，用其它小的殘基如Gly，Ser或Val卻不會如此(Villatte等，2000)。
Trp233/251在膽堿酯酶的突變研究中很少被關(guān)注，但是我們在E3早期研究發(fā)現(xiàn)再用更小的Leu殘基取代會增加對如馬拉硫磷這種具有較大酰基部分的羧酸酯的反應(yīng)性，或增加對于OP的反應(yīng)性(Campbell等，1998a，b；Devonshire等，2002)。Gly的突變也已經(jīng)在來自黃蜂(Anisopteromalus calandrae)的同源物中被發(fā)現(xiàn)，這種突變顯示其具有增強(qiáng)的馬拉硫磷羧酸酯酶(MCE)動力學(xué)特性(Zhu等，1999)，而發(fā)現(xiàn)來自家蠅(M.Domestica)的同源物中Ser的突變可能與馬拉硫磷抗性相關(guān)(Claudianos等，2002)。關(guān)于OP水解酶的活性，Devonshire等(2002)認(rèn)為這種突變的特殊益處在于有利于在反應(yīng)進(jìn)行的第二步水解階段時實(shí)現(xiàn)必要的磷的反轉(zhuǎn)。值得注意的是Devonshire等(2002)發(fā)現(xiàn)，E3W251L對于OP水解酶活性的kcat值dMUP于dECP比高一個數(shù)量級，因?yàn)樗鼛в斜萪ECP的二乙基磷酸基團(tuán)的更小的二甲基磷酸基團(tuán)。這意味著即使在具有較大?；耐蛔凅w中的反轉(zhuǎn)也會保持嚴(yán)密的立體約束。
我們已經(jīng)對E3的W251和F309殘基、以及與W251接近的P250進(jìn)行了突變。除了先前表征的天然W251L突變體，我們現(xiàn)在已經(jīng)分析在W251S、W251G、W251T和W251A用四種其它的小氨基酸進(jìn)行代換。W251L和P250S的雙重突變的分析顯示，M.demesnes中在250和251位置分別突變?yōu)镾er和Leu時，這種E3同源天然突變體具有高的MCE活性。F309L作為唯一檢驗(yàn)的F309代換，其AchE產(chǎn)物應(yīng)具有增強(qiáng)的MCE和OP的水解活性。F309L被單獨(dú)分析并用W251L作為雙重突變體。
陰離子部位的突變膽堿酯酶的陰離子部位有時稱為第四結(jié)合部位(對應(yīng)于乙酰膽堿內(nèi)的季銨)，或在Jarv的原始命名法(1984)中稱為p1亞部位。它主要涉及Trp84，Glu 199和Phe 330，也涉及Phe 331和Tyr 130(TcAChE命名法)。除了Glu199之外，它是一個高度疏水的部位。Glu199直接與催化的Ser200鄰接。在膽堿酯酶和更小的范圍如許多羧酸酯酶中，關(guān)鍵的殘基是高度保守的(Oakeshott等，1993；Ordentlich等，1995；Robin等，1996；Claudianos等，2002)。除了Trp84(圖1的序列排列顯示E3缺失了相應(yīng)于AchE殘基74-85的殘基)，E3在相應(yīng)的位置(分別為217，354和148)上與TcAChE具有相同的殘基。有趣地，在一些脂肪酶和特定的羧酸酯酶中，Glu199的等效物是Gln，并且Phe330的等效物是Leu，這些酶的底物已知具有小的離去基團(tuán)(Thomas等，1999；Campbell等，2001；Claudianos等，2002)。
對于陰離子部位在膽堿酯酶催化中的作用，結(jié)構(gòu)和突變研究已經(jīng)提供了詳細(xì)的描述。關(guān)鍵殘基在活性部位的底部形成了部分氫鍵網(wǎng)絡(luò)，Tyr 130和Glu 199也與結(jié)構(gòu)水分子共價接觸(Ordentlich等，1995；Koellner等，2000)。當(dāng)?shù)孜锱c酯酶活性部位咽喉處的外圍結(jié)合部位結(jié)合時，陰離子部位發(fā)生了構(gòu)象變化，新的構(gòu)象適應(yīng)于底物的膽堿(離去)基團(tuán)，并使它的羰基碳原子容易與催化的Ser200之間的相互作用(Shafferman等，1992；Ordentlich等，1995；1996)。因此，該部位首先主要起作用于酶?；磻?yīng)步驟，尤其是形成非共價過渡態(tài)的步驟(Nair等，1994)。關(guān)鍵殘基的突變主要影響Km而不是kcat。膽堿離去基團(tuán)的相互作用主要通過非極性和π-電子相互作用來調(diào)節(jié)，主要涉及Trp 84和Phe 330(Ordentlich等，1995)。
對OP抑制劑的研究暗示膽堿酯酶的陰離子部位也適應(yīng)于它們的離去基團(tuán)，但是也有部分部位(主要是Glu 199和Tyr 130；也可能是Ser226)影響磷酸酶反應(yīng)性的一些證據(jù)(Qian和Kovach，1993；也參見Ordentlich等，1996；Thomas等，1999)。
很少有對相應(yīng)于AchE陰離子部位的羧酸酯酶部位的突變分析，但是一個有趣的例外涉及黑腹果蠅的EST6，它在Glu199的等效處為His。該His被Glu取代的突變體顯示對各種羧酸酯酶底物的減少的活性，但是獲得了一些乙酰硫膽堿的水解活性(Myers等，1993)。蚜蟲(Myzus persicae)的E4羧酸酯酶，在該位置為Met，且該酶不通常與OP起反應(yīng)(Devonshire和Moores，1982)。然而目前還不清楚是否就是Met引起了OP的水解活性。類似地，Y148F代換是家蠅的OP抗性菌株(也即G137D)E3同源體中幾個已標(biāo)明的記錄之一，但是是否這種改變直接導(dǎo)致了OP水解酶活性還是未知的(Claudianos等，1999)。
在E3中的Y148，E217和F354的殘基現(xiàn)在已經(jīng)被突變。E217M和Y148F突變被用來檢測是否在上述桃蚜(M.persicae)和家蠅的酶中相應(yīng)的突變直接引起它們的OP反應(yīng)性。在G137D雙突變體中也檢測了Y148F，因?yàn)檫@種突變在抗性家蠅中被同時發(fā)現(xiàn)。F354被發(fā)現(xiàn)在該位置上可以突變成較小的Leu殘基和較大的Trp殘基，Leu通常在脂肪酶的同樣位置被發(fā)現(xiàn)。
實(shí)施例2酶滴定每種表達(dá)脂肪酶分別在微量培養(yǎng)板1-4列的四個100μl反應(yīng)器中進(jìn)行空白孔含有0.025％的Triton X-100，0.1M pH7.0的磷酸緩沖液；空白底物在0.025％的Triton X-100，0.1M pH7.0的磷酸緩沖液中含有100μM的dECP；空白細(xì)胞含有50μl細(xì)胞提取物，與1∶1的0.1M pH7.0的磷酸緩沖液混合；滴定反應(yīng)含有50μl的細(xì)胞提取物，與1∶1的含有200μM dECP的0.1M pH7.0的磷酸緩沖液混合。
除了dECP(在緩沖液中以200μM的濃度新鮮制備)外的所有成分被置于孔中。一些酶同時在培養(yǎng)板中被測定，通過同時在每列的第二和第四個孔下添加dECP來開始反應(yīng)。為隨后的計算，記錄下第一次讀數(shù)的間隔(典型地為1分鐘)。
在進(jìn)一步計算之前用所有讀數(shù)減去培養(yǎng)板空白孔的平均值(A)。各種細(xì)胞提取物的預(yù)實(shí)驗(yàn)顯示，它們在460nm處發(fā)熒光，將它們加入分析產(chǎn)物如7-羥基香豆素的溶液時39(±7)％的熒光熄滅。滴定反應(yīng)的熒光值(D)在減去細(xì)胞提取物的內(nèi)在熒光之后，由于存在這種熄滅現(xiàn)象應(yīng)對其進(jìn)行相應(yīng)校正(C)。最后，減去視為所有在培養(yǎng)板中同時進(jìn)行檢測的空白底物(B)以得到校正的因酶釋放的香豆素引起的熒光。這些校正對于以非常低水平表達(dá)脂肪酶的細(xì)胞系(＜1pmol/ul提取物)是非常重要的。
充分校正的數(shù)據(jù)被繪制成進(jìn)展曲線，平衡斜率外推到起始時間并通過與抑制劑(在10-20分鐘100μM濃度的dECP產(chǎn)生足夠飽和的所有這些酶的酯酶催化部位)的化學(xué)計量比的相互作用來確定酯酶數(shù)量。根據(jù)所有培養(yǎng)板的反應(yīng)制備7-羥基香豆素的校正曲線，并用于計算酶和生成產(chǎn)物的摩爾濃度。
圖3顯示了在含有表達(dá)酯酶的桿狀病毒的細(xì)胞提取物中進(jìn)行的代表性的滴定實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。
實(shí)施例3芐氯菊酯水解測定檢測表達(dá)酶的芐氯菊酯水解活性，通過對酸-標(biāo)記化合物使用放射分配檢測或?qū)σ掖疾糠种械哪切?biāo)記進(jìn)行基于TLC的檢測(Devonshire等Moores，1982)。檢測方法特征包括保持芐氯菊酯濃度低于它在水溶液中的公開溶解度(0.5μM)，洗滌劑(用于從表達(dá)它的昆蟲細(xì)胞中提取酶)的濃度低于臨界膠束濃度(對Triton X-100為0.02％)，檢測快速進(jìn)行(即10-30分鐘之內(nèi))以使底物粘到檢測試管的壁上(玻璃試管用來減小粘性)為最小。在這種芐氯菊酯濃度下，酶沒有被底物飽和，所以Km值不能確定。然而特異性常數(shù)(kcat/Km)可以精確地算出每種酶的芐氯菊酯活性，從而可以在低底物濃度下直接比較它們的有效性。將芐氯菊酯的順反式異構(gòu)體進(jìn)行分離會提高分析能力。
(a)分離芐氯菊酯的順和反式異構(gòu)體商業(yè)制備的芐氯菊酯包括四種立體異構(gòu)體1S順式，1R順式，1S反式，1R反式(圖4)。在硅石上預(yù)先的薄層色譜法(TLC)被用來分離異構(gòu)體成為兩種對映異構(gòu)體對1S/1R順式和1S/1R反式。對映異構(gòu)體不能進(jìn)一步拆分。酶制劑然后用來檢測每個對映異構(gòu)體對的水解。
(b)測試方案在擬除蟲菊酯的酸部分進(jìn)行放射性標(biāo)記該檢測(Devonshire和Moores，1982)適用于芐氯菊酯異構(gòu)體。它利用帶有放射性標(biāo)記的底物與酯酶進(jìn)行反應(yīng)，然后提取未變化的底物到有機(jī)溶劑中，測量水相中的放射性環(huán)丙烷羧化物陰離子?；谝郧暗慕?jīng)驗(yàn)，最好的提取方式為使用2∶1(體積比)的甲醇和氯仿的混合物。當(dāng)以適當(dāng)比例將檢測培養(yǎng)物等分試樣與隨后單相的緩沖液、甲醇和氯仿的混合物進(jìn)行混合時，達(dá)到了終止酶反應(yīng)和保證擬除蟲菊酯完全溶解的目的。隨后加入過量的氯仿和緩沖劑，超過了與甲醇一起保持相層的能力，將有機(jī)相除去且在水相中檢測產(chǎn)物。詳細(xì)的，該過程如下所述。
磷酸緩沖液(0.1M，pH7.0)被加入到放射性標(biāo)記的芐氯菊酯(在丙酮中50μM)中以得到1μM的溶液，然后加入等量適當(dāng)溶解在同一緩沖液中的表達(dá)酯酶并開始檢測。預(yù)備工作已經(jīng)制定出培養(yǎng)中的洗滌劑(用于從獲得的細(xì)胞中提取酯酶的Triton X-100)的濃度必須低于它的CMC(0.02％的臨界膠束濃度)，以避免親脂性的擬除蟲菊酯分配到膠束中而成為不能利用的酶。典型地，檢測的最終體積為500-1000μl，底物和丙酮濃度分別為0.5M和1％。在30℃溫度下，30秒至10分鐘范圍的時間間隔內(nèi)，移取100μl的培養(yǎng)等分試樣，加入到含有300μl的2∶1比例的甲醇氯仿混合物中并渦旋-混合。既可以在培養(yǎng)結(jié)束時或也可在延長的取樣間隔過程中將該試管置于室溫下直到一批可以進(jìn)一步同時加工。加入50μl緩沖液和100μl的氯仿之后，化合物被渦旋-混合、離心并且將較低的有機(jī)相用500μl的Hamilton注射器移取并棄掉。在進(jìn)一步加入100μl氯仿后，重復(fù)提取，然后上層的200μl水相被移取(用細(xì)尖移液管)進(jìn)行閃爍計數(shù)。關(guān)鍵要避免移走任何有機(jī)相。由于水相的最終體積是260μl(包括一些甲醇)，因此在最初的100μl等分試樣中產(chǎn)生的總數(shù)需要校正。在擬除蟲菊酯的醇部分進(jìn)行放射性標(biāo)記i)芐氯菊酯的I型擬除蟲菊酯-二溴類似物(NRDC157)在氯仿甲醇提取步驟中，這些酯水解時形成的3-苯氧芐醇沒有分配到水相中。因此有必要從硅石上通過TLC分離這種產(chǎn)物(Devonshire和Mooers，1982)。詳細(xì)的，該步驟如下所述。
如對酸標(biāo)記底物一樣進(jìn)行培養(yǎng)。不時從反應(yīng)溶液中移取100μl的等分樣品，該等分樣品通過與200μl的丙酮在-79℃(固態(tài)CO2)立即混合來終止反應(yīng)。然后移取100μl的混合物與3μl非放射性的3-苯氧基芐醇(在丙酮中2％)到LinearQ具溝的硅石F245培養(yǎng)板的載樣區(qū)(Whatman)。在10∶3的甲苯混合物(用蟻酸使之飽和)中用二乙醚顯影后，底物和產(chǎn)物被固定6-7天(證實(shí)對于在UV光下顯示的冷標(biāo)準(zhǔn)3-苯氧芐醇具有相同的產(chǎn)物遷移率)進(jìn)行放射自顯影。TLC培養(yǎng)板的這些區(qū)域然后浸入Neatan(Merck)并干燥，此后它們從玻璃支撐物上脫落并被轉(zhuǎn)移到小瓶中進(jìn)行閃爍計數(shù)。由于最初的100μl溶液在點(diǎn)樣于硅石上之前用丙酮進(jìn)行了3倍稀釋，所以該計數(shù)應(yīng)該進(jìn)行校正。
ii)II型擬除蟲菊酯-溴氰菊酯異構(gòu)體采用文獻(xiàn)報道的由氰醇水解產(chǎn)物經(jīng)非酶促反應(yīng)快速轉(zhuǎn)變?yōu)樗岬姆椒ㄟM(jìn)行預(yù)備實(shí)驗(yàn)得到3-苯氧安息香酸，采用同上方法用TLC分析培養(yǎng)液。由于TLC檢測比氯仿-甲醇提取步驟需要更長時間，因而采用后者(如上述對酸標(biāo)記擬除蟲菊酯)檢測從這些底物中產(chǎn)生的3-苯氧基苯甲酸鹽陰離子。
對于所有的檢測，形成產(chǎn)物的摩爾數(shù)由已知的放射性標(biāo)記底物的比活性來計算。表達(dá)E3WT酯酶的早期實(shí)驗(yàn)顯示，當(dāng)芐氯菊酯的濃度低于0.5μM時，水解率直接與檢測中1RS順或1RS反芐氯菊酯的濃度成比例，也即沒有Michaelis復(fù)合物的積累。大于0.5μM(即接近公開的芐氯菊酯的水溶性)濃度的檢測會得到不穩(wěn)定的結(jié)果，因此阻礙了Km和kcat的測量。而且，對于外消旋底物，一旦接近50％的底物被水解時水解速度顯著地減慢，這標(biāo)志著兩種對映異構(gòu)體(1R或1S以相等數(shù)量存在的外消旋混合物)中的應(yīng)該只有一種容易水解，與以前公開的來自蚜蟲酯酶的數(shù)據(jù)相符(Devonshire和Moores，1982)。在每對對映異構(gòu)體中，檢測條件因而被調(diào)節(jié)到利于測量更容易水解的那種對映異構(gòu)體。將E3WT勻漿和反芐氯菊酯進(jìn)行連續(xù)培養(yǎng)證實(shí)1S反式異構(gòu)體更易于水解。因?yàn)樵谒星闆r下都無法區(qū)分動力學(xué)參數(shù)，所以利用0.5μM(或?qū)τ谠谕庀孜镏袨?.25μM)時的水解速率，連同通過dECP滴定確定的酯酶摩爾數(shù)來計算特異性常數(shù)(kcat/Km)。關(guān)于底物溶解度和對濃度響應(yīng)比值的相同考慮也適用于所有的酶和底物。
(c)特異性常數(shù)的計算圖5給出了反-和順-芐氯菊酯被E3W251L酶水解的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
當(dāng)?shù)孜餄舛鹊陀?.5uM時(即沒有顯著形成Michaelis復(fù)合物)，芐氯菊酯異構(gòu)體的水解速率直接與所用的底物濃度成比例，因此不可能單獨(dú)的測量參數(shù)Km和kcat。在充分低于Km的濃度下，Michaelis-Menten方程式簡化如下V=kcatKm[S][E]]]>由上述方程式可知，利用起始水解速率(pmol/min，從已知的放射性標(biāo)記底物的比活性計算出)以及檢測中底物濃度和酶的濃度可以計算出特異性常數(shù)(即kcat/Km)。特異性常數(shù)擴(kuò)散限度的最大值是108-109M-1sec-1(Stryer，1981)。
實(shí)施例4馬拉硫磷的水解檢測MCE活性的檢測已經(jīng)由Campbell等(1998)如上公開，那些Km值較低的酶，對14C馬拉硫磷(25mCi mmol-1)的比活性并沒有減弱。這是一種終端檢測，其中馬拉硫磷被釋放到有機(jī)相，而作為剩余的水解產(chǎn)物即被放射性標(biāo)記的馬拉硫磷羧酸保留在水相中。在50nM至1μM的范圍內(nèi)檢測活性以確定Km和kcat，并使用Enzfitter 1.05軟件(Elsevier-Biosoft)通過非線性回歸分析，利用輸出的圖表顯示Michaelis-Menten動力學(xué)參數(shù)的任意偏差。特性常數(shù)由Km和kcat值直接計算。
實(shí)施例5E3和EST23變異體的芐氯菊酯水解活性表2總結(jié)了利用順-和反-芐氯菊酯作為底物的18個E3和3個EST23突變體的動力學(xué)數(shù)據(jù)。酶的馬拉硫磷水解活性也給出作為對照。在每種情況下，數(shù)據(jù)代表了來自每個1S/1R順式和1S/1R反式異構(gòu)體對中水解最快的對映異構(gòu)體的水解(如上所述)。
在OP敏感的麗蠅中發(fā)現(xiàn)的E3WT酶和它的EST23黑腹果蠅同源體，表現(xiàn)出顯著的對反式異構(gòu)體特異的芐氯菊酯水解活性。野生型酶表現(xiàn)出對馬拉硫磷至少高一個數(shù)量級的活性(雖然這種高M(jìn)CE活性并沒有給予麗蠅馬拉硫磷抗性，因?yàn)樵撁溉菀妆划a(chǎn)生于蠅體內(nèi)產(chǎn)生的馬拉氧磷抑制；Campbell等，1998)。E3酶活性部位中?；Y(jié)合口袋或陰離子部位區(qū)域的突變體會導(dǎo)致對芐氯菊酯的反式和順式異構(gòu)體活性的顯著增加。芐氯菊酯水解的增加并不主要與芐氯菊酯水解活性的增加相關(guān)。
a)氧離子空穴突變體E3G137D突變體是造成對羊蠅中的二嗪農(nóng)抗性的原因。在這種突變體中，在酶活性部位的氧離子空穴區(qū)域的非常小的脂肪族的中性Gly殘基被一種酸性的Asp取代，從而允許對氧束縛的OP分子的水解。然而，相比較于野生型酶，這種突變(和它的黑腹果蠅同源體)已經(jīng)特定地減少了對反芐氯菊酯的活性。通過用His或Glu取代Gly-137并不會使酶活性增加。然而，用Arg取代Gly-137并不會明顯地影響對順-或反-芐氯菊酯的活性。Arg的線性性質(zhì)使它可以容易地折疊而不會妨礙芐氯菊酯結(jié)合到活性部位。這組突變體的MCE活性特別廣泛地與它們對反芐氯菊酯的活性相關(guān)，說明G137取代對調(diào)節(jié)和穩(wěn)定底物?；鶊F(tuán)的作用。對芐氯菊酯的效果通常比馬拉硫磷的小，但是這與芐氯菊酯具有稍小的?；鶊F(tuán)一致。
b)?；Y(jié)合口袋突變E3W251L突變體通常在活性部位的?；幂^小的脂肪族的Leu取代大的芳香族的Trp殘基，它導(dǎo)致了反-芐氯菊酯水解能力的7倍增加并獲得了充分的順-芐氯菊酯水解能力。該突變體正是羊蠅中獲得馬拉硫磷抗性的原因。該突變體的MCE活性高于野生型酶的2倍。EST23中的W251L效果基本與E3相同。在E3中用七個更小的殘基(以大小減少的順序?yàn)門hr，Ser，Ala和Gly)取代Trp-251也會導(dǎo)致芐氯菊酯水解活性的增加，雖然這些突變體的活性沒有E3W251L中的高。明顯地，立體因素并不是突變體活性的唯一值得考慮的因素。例如，Thr和Ser二者都含有羥基基團(tuán)并且是親水性的。而且，Ala既是脂肪族的和疏水的(像Leu)甚至比Leu更小，但這種突變體對芐氯菊酯的活性與W251L突變體的活性相同。展開W251L突變體(即E3P250S/W251L)的氧離子空穴也減少了它對順-和反-芐氯菊酯的活性，雖然該活性仍然高于野生型的。令人感興趣地注意到，與野生型相比，芐氯菊酯對E3中的W251以及EST23中的W251L的所有突變體的特異性常數(shù)的增加一律對順式異構(gòu)體更為顯著。相對于野生型酶，產(chǎn)生反順的比率至少為20∶1，對于W251突變體僅僅為2-6∶1。由這些菌株提供的酰基袋的額外空間明顯地最有益于水解其它更難水解的順式異構(gòu)體。
E3-251突變體的MCE活性并不與芐氯菊酯的水解活性相關(guān)。在這組突變體中，E3W251G具有將近高于該組其余突變剩余突變體10倍的MCE活性，但它的芐氯菊酯水解活性卻是其中最低的。
將W251L和G137D突變體結(jié)合到同一E3分子中增加了對順式芐氯菊酯的酶活性，并超過野生型水平，但是降低了對反-芐氯菊酯和馬拉硫磷的活性。然而，雙突變體的活性并不象只包括E3W251L突變的突變體那么大(即，突變并不是加和地起作用)。
一些脂酶已知在相應(yīng)于在L.cuprina E3中的Phe309的位置具有Leu殘基。因而該E3F309L突變體的構(gòu)建目的是提供對親脂性底物如擬除蟲菊酯的活性。正如從表2可知，E3F309L突變體對兩種異構(gòu)體的活性都比E3WT更好。它對反-芐氯菊酯的活性甚至比E3W251L更好，雖然其對順式異構(gòu)體的活性不如E3W251L。然而，該突變體的MCE活性小于野生型酶的一半。在同一E3分子上結(jié)合F309L和W251L突變會增加對順-芐氯菊酯的活性并減少對反-芐氯菊酯的活性到E3W251L水平。換句話說，F(xiàn)309L突變對于W251L突變體對芐氯菊酯的活性僅起了非常小的影響，但是降低了它對馬拉硫磷的活性。
c)陰離子部位突變在L.cuprina E3中相應(yīng)于Phe 354的位置，一些脂酶已知具有Leu殘基。然而，在E3中用Leu取代Phe 354并沒有略微增加它對芐氯菊酯的活性，卻大大減少了它對馬拉硫磷的活性。用較大的芳香族殘基Trp取代Phe354反而會將它對順-和反-芐氯菊酯的活性增加3-4倍，但輕微減少了MCE活性?；蛟S有點(diǎn)令人驚奇的是F354W，而非F354L應(yīng)該對特別親脂的芐氯菊酯顯示增加的活性，假定在一些自然存在的脂酶中是Leu取代Phe。
雖然Y148F對MCE活性具有很小的意義，但是它對芐氯菊酯動力學(xué)具有很大的影響，并且該影響與依賴遺傳背景的方向相反。與野生型相比，作為一種單突變體，它顯示出對順和反芐氯菊酯5-6倍增強(qiáng)的活性。作為帶有G137D(它作為單突變體比野生型的值低很多)的雙突變體，它顯示了對反芐氯菊酯活性兩倍的減少，并幾乎消除了對順芐氯菊酯的活性。后面的結(jié)果清楚地揭示了Y148和氧離子空穴在芐氯菊酯水解方面具有強(qiáng)的相互作用。
Glu-217是直接與催化絲氨酸相鄰的殘基，被認(rèn)為在水解反應(yīng)中對穩(wěn)定過渡態(tài)中間體是非常重要的。然而，突變這種殘基成為Met(E3E217M)，正如在蚜蟲M.Persicae的酯酶E4中自然發(fā)現(xiàn)的，對于芐氯菊酯活性具有很小的影響，但卻大大減少了它的MCE活性。
實(shí)施例6水解溴-芐氯菊酯類似物表2也總結(jié)了使用兩個芐氯菊酯的順-二溴乙烯基類似物(NRDC157)針對獲自E3和EST23變體的動力學(xué)數(shù)據(jù)。該芐氯菊酯的二溴類似物的1S順式異構(gòu)體用除E3F309L和F309L/W251L之外的所有酶水解，與1R/1S順式芐氯菊酯同樣有效。這意味著更大的溴原子并沒有明顯地阻礙該底物到達(dá)它的催化中心。雖然E3WT和EST23WT酶的活性對異構(gòu)體之間明顯的差異來說太低，但是除了E3F309L和F309L/W251L的其它酶顯示了10到100倍更快的1S異構(gòu)體的水解活性。對于在環(huán)丙烷環(huán)中的C1的這種構(gòu)型是同樣優(yōu)先的，正如以前對蚜蟲M.persicae中的1S反式芐氯菊酯一樣(Devonshireand Moores，1982)。
F309L在NRDC157動力學(xué)上顯示了驚人的影響。該單突變與野生型相比對1S順式顯示出很小的不同，W251L的雙突變與W251L單突變相比對該異構(gòu)體顯示出更小的活性。然而，1S/1R的優(yōu)先選擇是顛倒的，單突變中比值是0.7∶1，在雙突變中比值是0.4∶1。結(jié)果是對于1R順式的活性在所有給出數(shù)據(jù)中是兩個最高的。雙突變的值事實(shí)上比任何一種單突變都高10倍。
實(shí)施例7通過表達(dá)酶水解II型擬除蟲菊酯表3總結(jié)了通過使用四種溴氰菊酯順式異構(gòu)體獲得了E3和EST23突變體亞型的動力學(xué)數(shù)據(jù)。除了E3W251L和E3F309L之外，溴氰菊酯的1R順式異構(gòu)體(不論是αS或αR)的水解都與1R順NRDC157(可被認(rèn)為在性質(zhì)上是芐氯菊酯和溴氰菊酯之間的中間體，因其具有二溴乙烯基取代但缺少α氰基基團(tuán))等效。與1R順式異構(gòu)體的活性相反，αR構(gòu)象比αS構(gòu)象異構(gòu)體的活性更強(qiáng)。E3W251L和E3F309L對溴氰菊酯的1R順式異構(gòu)體明顯地比NRDC157的相應(yīng)異構(gòu)體的有效性要小。
表2L.cuprina酯酶E3和D.melanogaster EST23的天然和合成變異體對順-和反-芐氯菊酯、馬拉硫磷和芐氯菊酯的兩種二溴乙烯基類似物(NRDC157)的特異性常數(shù)。也顯示了對反和順芐氯菊酯，以及對1S順和1R順NRDG157的特異性常數(shù)的比率。
表2
1不確定
2與對照使用的細(xì)胞提取物獲得的數(shù)值沒有明顯的區(qū)別明顯地，具有最高溴氰菊酯活性的251突變體是W251S，而W251L(對其它兩種擬除蟲菊酯最高)和W251G(對馬拉硫磷最高)在五個251突變體中獲得了最低的溴氰菊酯活性。這意味著適應(yīng)離去基團(tuán)的α氰基部分可能是溴氰菊酯有效水解的主要障礙，足夠阻止野生型E3的任何重要的水解活性。為了對不同的底物實(shí)現(xiàn)酶的底物適應(yīng)，就明顯需要對酶活性部位不同空間位點(diǎn)的利用，對比于W251，在?；诖幂^小的氨基酸取代就特別有利于對αR異構(gòu)體的底物的適應(yīng)。然而，重要的是，空間需要的詳細(xì)資料以及最有效的突變體是對其它擬除蟲菊酯有區(qū)別的。
帶有溴氰菊酯1S順式異構(gòu)體的所有酶的活性驚人地小于缺少α氰基基團(tuán)的NRCC157的相應(yīng)異構(gòu)體。該氰基基團(tuán)的驚人的影響類似于在環(huán)丙烷基團(tuán)的C1的1S構(gòu)型的結(jié)果。除了一些活性最小的突變株，與1S順式異構(gòu)體不同的是通常是這些酶對于αR構(gòu)象的活性大于αS構(gòu)象的活性。
實(shí)施例8-總結(jié)討論總之，通過對于251系列突變體與芐氯菊酯和NRDC157的反應(yīng)結(jié)果，得到了一些有關(guān)E3/EST23中的?；Y(jié)合約束的非常有力而又簡單的結(jié)論。一般地，251取代應(yīng)當(dāng)產(chǎn)生更大的酰基袋，以易于適應(yīng)/穩(wěn)定如馬拉硫磷這些具有的較大的酰基基團(tuán)的底物。這些取代有利于對含有兩個手性活性中心的環(huán)丙烷的所有異構(gòu)體進(jìn)行水解，野生型酶對于反式異構(gòu)體的選擇性非常強(qiáng)，該突變體則可以較好地水解至少部分順式異構(gòu)體的混合物。然而，在順式異構(gòu)體中突變體的改進(jìn)對1S順式異構(gòu)體的選擇性更強(qiáng)。1R順式異構(gòu)體對野生型酶來說是所有表3四種溴氰菊酯順式異構(gòu)體的特異性常數(shù)
1與對照使用的細(xì)胞提取物獲得的數(shù)值沒有明顯的區(qū)別2不確定構(gòu)型中最難利用的，而在突變體中存在同樣的問題。在突變體系列中，動力學(xué)的改善并不能簡單地由側(cè)鏈大小的減少來解釋；最小的取代并不會得到最高的活性，如對于馬拉硫磷。事實(shí)上最好的動力學(xué)在W251L中獲得，雖然Leu含有所有實(shí)驗(yàn)的取代中最大的側(cè)鏈。
相比于相對簡單就可以看出并且很一致的有關(guān)芐氯菊酯和NRDC157的結(jié)論，251系列突變體對溴氰菊酯的結(jié)果十分復(fù)雜且很難解釋。正如所預(yù)期的，它們不但對其它底物提高了動力學(xué)性能，同時對四種順式溴氰菊酯異構(gòu)體的動力學(xué)性能也全面高于野生型酶，但與其它底物相比高于野生型的絕對值很小。然而，關(guān)于1S異構(gòu)體優(yōu)于1R異構(gòu)體的現(xiàn)象在底物為NRDC157時尤其明顯，而在溴氰菊酯數(shù)據(jù)中不明顯。另一方面，所有突變體優(yōu)選αR而非αS異構(gòu)體的傾向十分明顯。一般二者的比值為2∶1，但應(yīng)注意的是它與由野生型EST23顯示的趨勢正相反。乍一看，沒有預(yù)料到這些假定的?；Y(jié)合口袋取代應(yīng)影響αR/αS的立體優(yōu)先選擇，因?yàn)楹笳咴?醇)底物的離去基團(tuán)提供了α-cynano部分。
總的F309L數(shù)據(jù)清楚地顯示了該殘基對擬除蟲菊酯水解動力學(xué)的主要影響。它們與W251系列突變體在同一水平上，基于酰基結(jié)合口袋中提供了更大的空間，預(yù)期其動力學(xué)性能應(yīng)該有所提高，而兩組數(shù)據(jù)也證實(shí)了其動力學(xué)性能的確有所提高。然而，也存在重要的區(qū)別，W251系列對芐氯菊酯的順式和反式異構(gòu)體具有不成比例的活性，而F309L對順NRDC157的1R和1S異構(gòu)體具有不成比例的活性。在兩個部位的取代也顯示了強(qiáng)相互作用，與它們在酰基結(jié)合口袋內(nèi)共有的機(jī)構(gòu)和功能相一致。例如，W251突變體對順芐氯菊酯不成比例的的增強(qiáng)和F309L對1R順NRDC157的不成比例的增強(qiáng)在雙突變體中表現(xiàn)為顯著的特征。251和309突變體在活性方面具有數(shù)量上相似的增強(qiáng)效應(yīng)且在涉及溴氰菊酯水解時具有同樣的立體專一性，該立體專一性的差異用更小的擬除蟲菊酯類也不能被看出。然而，我們證明了在它的離去基團(tuán)添加大體積的?；糠中枰镜幕钚圆课恢車臻g的再分配，以至于較小的擬除蟲菊酯類的明顯立體專一性是盈余的。
本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，如在特定實(shí)施方案中說明的對本發(fā)明所做的許多變異和/或修飾不會脫離本發(fā)明廣泛描述的目的和范圍。目前的實(shí)施方案因而在各個方面被認(rèn)為是說明性的而非限制性的。
上述所有的公開文獻(xiàn)都被完全引入本文。
本發(fā)明說明書中包括的對任何文件、學(xué)術(shù)論文、材料、儀器、文章等的論述僅僅是以提供本發(fā)明完整的上下文為目的。并不因?yàn)樗鼈兊墓_先于本申請的每一個權(quán)利要求的優(yōu)先權(quán)日期存在，而承認(rèn)任何的或所有的這些物質(zhì)成為現(xiàn)有技術(shù)基礎(chǔ)的一部分或成為與本發(fā)明領(lǐng)域相關(guān)的一般常識。
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Zhu，Y.-C.，Dowdy，A.K.and Baker，J.E.(1999)Insect Biochem Molec.Biol.29417-425.
序列表<110>聯(lián)邦科學(xué)技術(shù)研究組織<120>疏水酯類殺蟲劑和毒素的降解<160>3<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>570<212>PRT<213>Lucilia cuprina<400>1Met Asn Phe Asn Val Ser Leu Met Glu Lys Leu Lys Trp Lys Ile Lys1 5 10 15Cys Ile Glu Asn Lys Phe Leu Asn Tyr Arg Leu Thr Thr Asn Glu Thr20 25 30Val Val Ala Glu Thr Glu Tyr Gly Lys Val Lys Gly Val Lys Arg Leu35 40 45Thr Val Tyr Asp Asp Ser Tyr Tyr Ser Phe Glu Gly Ile Pro Tyr Ala50 55 60Gln Pro Pro Val Gly Glu Leu Arg Phe Lys Ala Pro Gln Arg Pro Thr65 70 75 80Pro Trp Asp Gly Val Arg Asp Cys Cys Asn His Lys Asp Lys Ser Val85 90 95Gln Val Asp Phe Ile Thr Gly Lys Val Cys Gly Ser Glu Asp Cys Leu
100 105 110Tyr Leu Ser Val Tyr Thr Asn Asn Leu Asn Pro Glu Thr Lys Arg Pro115 120 125Val Leu Val Tyr Ile His Gly Gly Gly Phe Ile Ile Gly Glu Asn His130 135 140Arg Asp Met Tyr Gly Pro Asp Tyr Phe Ile Lys Lys Asp Val Val Leu145 150 155 160Ile Asn Ile Gln Tyr Arg Leu Gly Ala Leu Gly Phe Leu Ser Leu Asn165 170 175Ser Glu Asp Leu Asn Val Pro Gly Asn Ala Gly Leu Lys Asp Gln Val180 185 190Met Ala Leu Arg Trp Ile Lys Asn Asn Cys Ala Asn Phe Gly Gly Asn195 200 205Pro Asp Asn Ile Thr Val Phe Gly Glu Ser Ala Gly Ala Ala Ser Thr210 215 220His Tyr Met Met Leu Thr Glu Gln Thr Arg Gly Leu Phe His Arg Gly225 230 235 240Ile Leu Met Ser Gly Asn Ala Ile Cys Pro Trp Ala Asn Thr Gln Cys245 250 255Gln His Arg Ala Phe Thr Leu Ala Lys Leu Ala Gly Tyr Lys Gly Glu260 265 270Asp Asn Asp Lys Asp Val Leu Glu Phe Leu Met Lys Ala Lys Pro Gln275 280 285Asp Leu Ile Lys Leu Glu Glu Lys Val Leu Thr Leu Glu Glu Arg Thr290 295 300Asn Lys Val Met Phe Pro Phe Gly Pro Thr Val Glu Pro Tyr Gln Thr305 310 315 320Ala Asp Cys Val Leu Pro Lys His Pro Arg Glu Met Val Lys Thr Ala325 330 335Trp Gly Asn Ser Ile Pro Thr Met Met Gly Asn Thr Ser Tyr Glu Gly340 345 350
Leu Phe Phe Thr Ser Ile Leu Lys Gln Met Pro Met Leu Val Lys Glu355 360 365Leu Glu Thr Cys Val Asn Phe Val Pro Ser Glu Leu Ala Asp Ala Glu370 375 380Arg Thr Ala Pro Glu Thr Leu Glu Met Gly Ala Lys Ile Lys Lys Ala385 390 395 400His Val Thr Gly Glu Thr Pro Thr Ala Asp Asn Phe Met Asp Leu Cys405 410 415Ser His Ile Tyr Phe Trp Phe Pro Met His Arg Leu Leu Gln Leu Arg420 425 430Phe Asn His Thr Ser Gly Thr Pro Val Tyr Leu Tyr Arg Phe Asp Phe435 440 445Asp Ser Glu Asp Leu Ile Asn Pro Tyr Arg Ile Met Arg Ser Gly Arg450 455 460Gly Val Lys Gly Val Ser His Ala Asp Glu Leu Thr Tyr Phe Phe Trp465 470 475 480Asn Gln Leu Ala Lys Arg Met Pro Lys Glu Ser Arg Glu Tyr Lys Thr485 490 495Ile Glu Arg Met Thr Gly Ile Trp Ile Gln Phe Ala Thr Thr Gly Asn500 505 510Pro Tyr Ser Asn Glu Ile Glu Gly Met Glu Asn Val Ser Trp Asp Pro515 520 525Ile Lys Lys Ser Asp Glu Val Tyr Lys Cys Leu Asn Ile Ser Asp Glu530 535 540Leu Lys Met Ile Asp Val Pro Glu Met Asp Lys Ile Lys Gln Trp Glu545 550 555 560Ser Met Phe Glu Lys His Arg Asp Leu Phe565 570<210>2<211>572
<212>PRT<213>Drosophila melanogaster<400>2Met Asn Lys Asn Leu Gly Phe Val Glu Arg Leu Arg Gly Arg Leu Lys1 5 10 15Thr Ile Glu His Lys Val Gln Gln Tyr Arg Gln Ser Thr Asn Glu Thr20 25 30Val Val Ala Asp Thr Glu Tyr Gly Gln Val Arg Gly Ile Lys Arg Leu35 40 45Ser Leu Tyr Asp Val Pro Tyr Phe Ser Phe Glu Gly Ile Pro Tyr Ala50 55 60Gln Pro Pro Val Gly Glu Leu Arg Phe Lys Ala Pro Gln Arg Pro Ile65 70 75 80Pro Trp Glu Gly Val Arg Asp Cys Ser Gln Pro Lys Asp Lys Ala Val85 90 95Gln Val Gln Phe Val Phe Asp Lys Val Glu Gly Ser Glu Asp Cys Leu100 105 110Tyr Leu Asn Val Tyr Thr Asn Asn Val Lys Pro Asp Lys Ala Arg Pro115 120 125Val Met Val Trp Ile His Gly Gly Gly Phe Ile Ile Gly Glu Ala Asn130 135 140Arg Glu Trp Tyr Gly Pro Asp Tyr Phe Met Lys Glu Asp Val Val Leu145 150 155 160Val Thr Ile Gln Tyr Arg Leu Gly Ala Leu Gly Phe Met Ser Leu Lys165 170 175Ser Pro Glu Leu Asn Val Pro Gly Asn Ala Gly Leu Lys Asp Gln Val180 185 190Leu Ala Leu Lys Trp Ile Lys Asn Asn Cys Ala Ser Phe Gly Gly Asp195 200 205
Pro Asn Cys Ile Thr Val Phe Gly Glu Ser Ala Gly Gly Ala Ser Thr210 215 220His Tyr Met Met Leu Thr Asp Gln Thr Gln Gly Leu Phe His Arg Gly225 230 235 240Ile Leu Gln Ser Gly Ser Ala Ile Cys Pro Trp Ala Tyr Asn Gly Asp245 250 255Ile Thr His Asn Pro Tyr Arg Ile Ala Lys Leu Val Gly Tyr Lys Gly260 265 270Glu Asp Asn Asp Lys Asp Val Leu Glu Phe Leu Gln Asn Val Lys Ala275 280 285Lys Asp Leu Ile Arg Val Glu Glu Asn Val Leu Thr Leu Glu Glu Arg290 295 300Met Asn Lys Ile Met Phe Arg Phe Gly Pro Ser Leu Glu Pro Phe Ser305 310 315 320Thr Pro Glu Cys Val Ile Ser Lys Pro Pro Lys Glu Met Met Lys Thr325 330 335Ala Trp Ser Asn Ser Ile Pro Met Phe Ile Gly Asn Thr Ser Tyr Glu340 345 350Gly Leu Leu Trp Val Pro Glu Val Lys Leu Met Pro Gln Val Leu Gln355 360 365Gln Leu Asp Ala Gly Thr Pro Phe Ile Pro Lys Glu Leu Leu Ala Thr370 375 380Glu Pro Ser Lys Glu Lys Leu Asp Ser Trp Ser Ala Gln Ile Arg Asp385 390 395 400Val His Arg Thr Gly Ser Glu Ser Thr Pro Asp Asn Tyr Met Asp Leu405 410 415Cys Ser Ile Tyr Tyr Phe Val Phe Pro Ala Leu Arg Val Val His Ser420 425 430Arg His Ala Tyr Ala Ala Gly Ala Pro Val Tyr Phe Tyr Arg Tyr Asp435 440 445
Phe Asp Ser Glu Glu Leu Ile Phe Pro Tyr Arg Ile Met Arg Met Gly450 455 460Arg Gly Val Lys Gly Val Ser His Ala Asp Asp Leu Ser Tyr Gln Phe465 470 475 480Ser Ser Leu Leu Ala Arg Arg Leu Pro Lys Glu Ser Arg Glu Tyr Arg485 490 495Asn Ile Glu Arg Thr Val Gly Ile Trp Thr Gln Phe Ala Ala Thr Gly500 505 510Asn Pro Tyr Ser Glu Lys Ile Asn Gly Met Asp Thr Leu Thr Ile Asp515 520 525Pro Val Arg Lys Ser Asp Glu Val Ile Lys Cys Leu Asn Ile Ser Asp530 535 540Asp Leu Lys Phe Ile Asp Leu Pro Glu Trp Pro Lys Leu Lys Val Trp545 550 555 560Glu Ser Leu Tyr Asp Asp Asn Lys Asp Leu Leu Phe565 570<210>4<211>576<212>PRT<213>Torpedo californica<400>4Ala Asp Asp Asp Ser Glu Leu Leu Val Asn Thr Lys Ser Gly Lys Val1 5 10 15Met Arg Thr Arg Ile Pro Val Leu Ser Ser His Ile Ser Ala Phe Leu20 25 30Gly Ile Pro Phe Ala Glu Pro Pro Val Gly Asn Met Arg Phe Arg Arg35 4045Pro Glu Pro Lys Lys Pro Trp Ser Gly Val Trp Asn Ala Ser Thr Tyr50 55 60
Pro Asn Asn Cys Gln Gln Tyr Val Asp Glu Gln Phe Pro Gly Phe Pro65 70 75 80Gly Ser Glu Met Trp Asn Pro Asn Arg Glu Met Ser Glu Asp Cys Leu85 90 95Tyr Leu Asn Ile Trp Val Pro Ser Pro Arg Pro Lys Ser Ala Thr Val100 105 110Met Leu Trp Ile Tyr Gly Gly Gly Phe Tyr Ser Gly Ser Ser Thr Leu115 120 125Asp Val Tyr Asn Gly Lys Tyr Leu Ala Tyr Thr Glu Glu Val Val Leu130 135 140Val Ser Leu Ser Tyr Arg Val Gly Ala Phe Gly Phe Leu Ala Leu His145 150 155 160Gly Ser Gln Glu Ala Pro Gly Asn Met Gly Leu Leu Asp Gln Arg Met165 170 175Ala Leu Gln Trp Val His Asp Asn Ile Gln Phe Phe Gly Gly Asp Pro180 185 190Lys Thr Val Thr Leu Phe Gly Glu Ser Ala Gly Arg Ala Ser Val Gly195 200 205Met His Ile Leu Ser Pro Gly Ser Arg Asp Leu Phe Arg Arg Ala Ile210 215 220Leu Gln Ser Gly Ser Pro Asn Cys Pro Trp Ala Ser Val Ser Val Ala225 230 235 240Glu Gly Arg Arg Arg Ala Val Glu Leu Arg Arg Asn Leu Asn Cys Asn245 250 255Leu Asn Ser Asp Glu Asp Leu Ile Gln Cys Leu Arg Glu Lys Lys Pro260 265 270Gln Glu Leu Ile Asp Val Glu Trp Asn Val Leu Pro Phe Asp Ser Ile275 280 285Phe Arg Phe Ser Phe Val Pro Val Ile Asp Gly Glu Phe Phe Pro Thr290 295 300
Ser Leu Glu Ser Met Leu Asn Ala Gly Asn Phe Lys Lys Thr Gln Ile305 310 315 320Leu Leu Gly Val Asn Lys Asp Glu Gly Ser Phe Phe Leu Leu Tyr Gly325 330 335Ala Pro Gly Phe Ser Lys Asp Ser Glu Ser Lys Ile Ser Arg Glu Asp340 345 350Phe Met Ser Gly Val Lys Leu Ser Val Pro His Ala Asn Asp Leu Gly355 360 365Leu Asp Ala Val Thr Leu Gln Tyr Thr Asp Trp Met Asp Asp Asn Asn370 375 380Gly Ile Lys Asn Arg Asp Gly Leu Asp Asp Ile Val Gly Asn His Asn385 390 395 400Val Ile Cys Pro Leu Met His Phe Val Asn Lys Tyr Thr Lys Phe Gly405 410 415Asn Gly Thr Tyr Leu Tyr Phe Phe Asn His Arg Ala Ser Asn Leu Val420 425 430Trp Pro Glu Trp Met Gly Val Ile His Gly Tyr Glu Ile Glu Phe Val435 440 445Phe Gly Leu Pro Leu Val Lys Glu Leu Asn Tyr Thr Ala Glu Glu Glu450 455 460Ala Leu Ser Arg Arg Ile Met His Tyr Trp Ala Thr Phe Ala Lys Thr465 470 475 480Gly Asn Pro Asn Glu Pro His Ser Gln Glu Ser Lys Trp Pro Leu Phe485 490 495Thr Thr Lys Glu Gln Lys Phe Ile Asp Leu Asn Thr Glu Pro Ile Lys500 505 510Val His Gln Arg Leu Arg Val Gln Met Cys Val Phe Trp Asn Gln Phe515 520 525Leu Pro Lys Leu Leu Asn Ala Thr Glu Thr Ile Asp Glu Ala Glu Arg530 535 540Gln Trp Lys Thr Glu Phe His Arg Trp Ser Ser Tyr Met Met His Trp
545 550 555 560Lys Asn Gln Phe Asp Gln Tyr Ser Arg His Glu Asn Cys Ala Glu Leu565 570 57權(quán)利要求
1.一種去除或減少樣品中疏水酯類殺蟲劑或毒素濃度的方法，該方法包含將該樣品與昆蟲酯酶或其突變體相接觸。
2.權(quán)利要求1所述的方法，其中昆蟲酯酶是一種α-羧酸酯酶。
3.權(quán)利要求1所述的方法，其中突變體昆蟲酯酶是一種α-羧酸酯酶，且在酯酶活性部位的氧離子空穴、?；Y(jié)合口袋或陰離子部位區(qū)域或其任何組合區(qū)域具有突變。
4.權(quán)利要求3所述的方法，其中突變體昆蟲酯酶選自如下一組E3G137R、E3G137H、E3W251L、E3W251S、E3W251G、E3W251T、E3W251A、E3W251L/F309L、E3W251L/G137D、E3W251L/P250S、E3F309L、E3Y148F、E3E217M、E3F354W、E3F354L和EST23W251L。
5.權(quán)利要求2或3所述的方法，其中α-昆蟲酯酶或其突變體包括選自如下一組的一個序列i)示于SEQ ID NO1的序列ii)示于SEQ ID NO2的序列和iii)至少與i)或ii)有40％相同性，并且能水解疏水酯類殺蟲劑或毒素的序列。
6.權(quán)利要求6所述的方法，其中所述序列與i)或ii)至少具有80％的相同性。
7.權(quán)利要求6所述的方法，其中所述序列與i)或ii)至少具有90％的相同性。
8.權(quán)利要求1-7中任一所述的方法，其中該方法使用兩種或多種昆蟲酯酶或其突變體。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-8中任一所述的方法，其中疏水酯類殺蟲劑或毒素是一種擬除蟲菊酯。
10.權(quán)利要求9所述的方法，其中擬除蟲菊酯是I型或II型擬除蟲菊酯。
11.權(quán)利要求10所述的方法，其中I型擬除蟲菊酯選自如下組成的組1S/1R反式芐氯菊酯，1S/1R順式芐氯菊酯，NRDC157 1S順式和NRDC157 1R順式。
12.權(quán)利要求10所述的方法，其中II型擬除蟲菊酯是溴氰菊酯。
13.權(quán)利要求1-12任一所述的方法，其中該方法在含有液體的環(huán)境中進(jìn)行。
14.權(quán)利要求1-13任一所述的方法，其中昆蟲酯酶或其突變體直接提供到樣品中。
15.權(quán)利要求1-13任一所述的方法，其中昆蟲酯酶或其突變體通過編碼昆蟲酯酶或其突變體的多核苷酸的表達(dá)，從含有該多核苷酸的宿主細(xì)胞被提供到樣品中。
16.權(quán)利要求1-13任一所述的方法，其中昆蟲酯酶或其突變體以聚合的海綿或泡沫被提供，所述泡沫或海綿含有被固定到聚合的多孔載體上的昆蟲酯酶或其突變體。
17.權(quán)利要求1-16任一所述的方法，其中該方法進(jìn)一步包括當(dāng)疏水酯類殺蟲劑或毒素與昆蟲酯酶或其突變體接觸時，存在表面活性劑。
18.權(quán)利要求17所述的方法，其中表面活性劑是一種生物表面活性劑。
19.一種基本上純化的多肽，它是一種昆蟲酯酶的突變體，其中一種或多種突變位于選自如下組成的組的酯酶區(qū)域內(nèi)氧離子空穴、?；Y(jié)合口袋和陰離子部位，其中突變體昆蟲酯酶能水解疏水酯類殺蟲劑或毒素，附帶條件是昆蟲酯酶不是E3W251L、E3W251S、E3W251G或E3G137D。
20.權(quán)利要求19所述的多肽，其中昆蟲酯酶是α-羧酸酯酶。
21.權(quán)利要求20所述的多肽，選自如下組成的組i)示于SEQ ID NO1的突變體序列，和ii)示于SEQ ID NO2的突變體序列，其中所述突變體與SEQ ID NO1或2的至少一種具有至少40％的相同性。
22.權(quán)利要求21所述的多肽，其中所述突變體與SEQ ID NO1或2的至少一種具有至少80％的相同性。
23.權(quán)利要求21所述的多肽，其中所述突變體與SEQ ID NO1或2的至少一種具有至少90％的相同性。
24.權(quán)利要求19-23中任一所述的多肽，其中所述突變是一種點(diǎn)突變。
25.權(quán)利要求21所述的多肽，包括的序列選自如下組成的組E3G137R、E3G137H、E3W251T、E3W251A、E3W251L/F309L、E3W251L/G137D、E3W251L/P250S、E3F309L、E3Y148F、E3E217M、E3F354W、E3F354L和EST23W251L。
26.一種包含權(quán)利要求19-25任一所述多肽與至少一種其它多肽序列融合的融合多肽。
27.一種編碼權(quán)利要求19-26中的任一多肽的分離多肽。
28.一種復(fù)制和/或表達(dá)權(quán)利要求27所述多核苷酸的載體。
29.一種用權(quán)利要求28所述載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞。
30.一種水解疏水酯類殺蟲劑或毒素的組合物，該組合物包括權(quán)利要求19-26中任一所述的多肽，和一種或多種可接受的載體。
31.一種產(chǎn)生和選擇水解疏水酯類殺蟲劑或毒素的方法，所述方法包括(i)將一種或多種突變體引入到昆蟲酯酶中或已經(jīng)被突變的昆蟲酯酶中，和(ii)確定該突變昆蟲酯酶水解疏水酯類殺蟲劑或毒素的能力。
32.權(quán)利要求31所述的方法，其中一種或多種突變體增強(qiáng)了水解活性和/或改變了酯酶的立體專一性。
33.權(quán)利要求31或32所述的方法，其中昆蟲酯酶是一種α-羧酸酯酶。
34.權(quán)利要求33所述的方法，其中所述α-羧酸酯酶的序列選自如下組成的組i)示于SEQ ID NO1的序列，ii)示于SEQ ID NO2的序列，和iii)與i)或ii)至少有40％相同性的序列。
35.權(quán)利要求34所述的方法，其中所述序列與i)或ii)具有至少80％的相同性。
36.權(quán)利要求34所述的方法，其中所述序列與i)或ii)具有至少90％的相同性。
37.權(quán)利要求31-36任一所述的方法，其中一種或多種突變發(fā)生在選自如下組成的組的酯酶的區(qū)域氧離子空穴、?；Y(jié)合口袋和陰離子部位。
38.權(quán)利要求31-37任一項(xiàng)所述的方法，其中所述突變是點(diǎn)突變。
39.權(quán)利要求31所述的方法，其中已經(jīng)被突變的昆蟲酯酶選自如下組成的組E3G137R、E3G137H、E3W251L、E3W251S、E3W251G、E3W251T、E3W251A、E3W251L/F309L、E3W251L/G137D、E3W251L/P250S、E3F309L、E3Y148F、E3E217M、E3F354W、E3F354L和EST23W251L。
40.一種由權(quán)利要求31-39中任一所述的方法獲得的酶。
全文摘要
本發(fā)明涉及降解疏水酯類殺蟲劑和毒素的酶和方法。本發(fā)明尤其涉及利用昆蟲酯酶或其突變體，在污染環(huán)境和園藝物品的生物除污中除去殘留的酯類殺蟲劑和毒素，如擬除蟲菊酯殘留。
文檔編號C12N5/10GK1617932SQ02827890
公開日2005年5月18日 申請日期2002年2月6日 優(yōu)先權(quán)日2002年2月6日
發(fā)明者羅賓·喬伊絲·拉塞爾, 拉瑪·黑達(dá)里, 艾倫·德文希爾, 蘇珊·簡·多里安, 約翰·格雷厄姆·奧克肖特 申請人:聯(lián)邦科學(xué)技術(shù)研究組織