專利名稱：降解氰化物污染木霉菌轉(zhuǎn)化子的篩選與固定化制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種降解氰化物污染木霉菌轉(zhuǎn)化子的篩選與固定化制備方法，從利用限制性內(nèi)切酶介導(dǎo)的基因整合技術(shù)(REMI)得到的木霉菌轉(zhuǎn)化子中，篩選到具有高氰化物降解活性的木霉菌轉(zhuǎn)化子，將其細(xì)胞固定化后應(yīng)用于含氰廢水的處理。
背景技術(shù)：
由于現(xiàn)代工業(yè)發(fā)展對(duì)產(chǎn)業(yè)生態(tài)保護(hù)日益重視，因此有效的處理工業(yè)排放的廢棄物是建立綠色工業(yè)的需要。氰化物作為工礦企業(yè)經(jīng)常釋放的廢棄物中的主要成分，是對(duì)環(huán)境生物毒性最高的化學(xué)污染物之一，并可在水體和土壤中較長(zhǎng)期富集。氰化物毒性機(jī)制至少有三種(1)與二價(jià)或三價(jià)的金屬形成復(fù)合物，(2)在酶解過(guò)程中生成穩(wěn)定的氰或腈衍生物，(3)與酮基團(tuán)形成氰醇。
目前對(duì)于氰化物污染物處理最為常用的就是化學(xué)法，但其價(jià)格昂貴，污泥產(chǎn)量高，在處理過(guò)程中常常引入其他有害試劑，同時(shí)對(duì)于某些金屬氰化物的降解效率非常低。因此，急需一種低成本、高效率的方法來(lái)處理被氰化物污染的廢水和土壤，而生物降解則是最有前景的方法之一。
迄今為止，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)很多微生物都具有降解氰化物的能力，木霉便是其中之一。微生物主要是通過(guò)產(chǎn)生硫氰酸酶和氰水合酶降解游離氰化物。然而在活體微生物處理氰化物過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，其對(duì)氰化物降解活性將受到多方面因素的影響，如與污水或土壤中其他微生物的競(jìng)爭(zhēng)作用，生長(zhǎng)受環(huán)境某種化學(xué)物質(zhì)(離子)的抑制，抗逆能力差等。木霉作為土壤習(xí)居菌長(zhǎng)期以來(lái)一直作為有生防價(jià)值的拮抗性真菌，其生長(zhǎng)速度快，搶占空間時(shí)間短，競(jìng)爭(zhēng)力強(qiáng)，同時(shí)其產(chǎn)生的厚垣孢子對(duì)環(huán)境高溫、高濕，干旱等逆境的抗性高，因此是一種很有實(shí)用價(jià)值的，能兼顧防治農(nóng)作物病害的多功能氰化物降解微生物。然而，目前自然篩選的木霉菌菌株降解活性一般較低，而且篩選的工作量大，很難獲得各方面特性均理想的降解菌株，因此需要利用生物技術(shù)改良野生株，篩選出比野生株氰化物降解酶系活性更高的菌株。
活體降解微生物直接應(yīng)用于污染環(huán)境的修復(fù)受到很多條件限制，因此一般需要經(jīng)過(guò)固定化之后才能更好的發(fā)揮降解效應(yīng)。利用固定化細(xì)胞建立高效的廢水處理系統(tǒng)于20世紀(jì)70年代就已經(jīng)開(kāi)始了，此技術(shù)具有反應(yīng)器生物濃度高，處理能力大，污泥產(chǎn)量少，菌種高純高效，適應(yīng)水質(zhì)和pH變化等優(yōu)點(diǎn)。然而，利用固定化技術(shù)固定微生物，需要解決廢水中各種離子對(duì)固定化細(xì)胞的侵蝕和固定化載體結(jié)構(gòu)易被破壞等問(wèn)題，為此，需要研究如何提高固定化細(xì)胞機(jī)械強(qiáng)度和穩(wěn)定性，并保持固定化細(xì)胞原有的高降解活性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種降解氰化物污染木霉菌轉(zhuǎn)化子的篩選與固定化制備方法，得到的木霉菌轉(zhuǎn)化子能夠有效降解水體中的氰化物。
為實(shí)現(xiàn)這一目的，本發(fā)明首先利用限制性內(nèi)切酶介導(dǎo)基因整合技術(shù)構(gòu)建木霉菌突變株，通過(guò)對(duì)出發(fā)菌株及其轉(zhuǎn)化子間氰化物降解酶系的活性比較分析，篩選出對(duì)氰化物高降解活性的木霉菌轉(zhuǎn)化子，然后在確定了固相化過(guò)程中海藻酸鈉和CaCl2濃度、菌絲包埋量、固定化時(shí)間、降解溫度與時(shí)間等因素的基礎(chǔ)上，使用海藻酸鈉作為載體包埋轉(zhuǎn)化子細(xì)胞，制備固定化細(xì)胞小球。最后檢測(cè)固定化木霉菌轉(zhuǎn)化子對(duì)含氰廢水修復(fù)效應(yīng)。
本發(fā)明的方法具體包括如下步驟1、木霉菌轉(zhuǎn)化子的構(gòu)建采用質(zhì)粒30-40μg、濃度為10U/μl的限制性內(nèi)切酶HindIII10μl、山梨醇緩沖液(1M pH7.5)即STC 200μl，配制成酶-質(zhì)?；旌弦海?。將濃度為106-108/ml的木霉菌原生質(zhì)體懸浮液100μl與配制成的酶-質(zhì)?；旌弦夯靹蚝螅徛尤霛舛葹?0％2ml聚乙二醇即PEG，加入5ml預(yù)冷的STC，4℃下2000rpm離心15分鐘，棄上清，加入3ml液體再生培養(yǎng)基，混勻，倒入無(wú)菌培養(yǎng)皿中，加入15-20ml已溶解好并冷卻到45-55℃的固體再生培養(yǎng)基，20-25℃下放置6小時(shí)后，倒入含300μg/ml潮霉素的水瓊脂10-15ml，平鋪在再生培養(yǎng)基上，2-3天后出現(xiàn)轉(zhuǎn)化子。將轉(zhuǎn)化子培養(yǎng)在含有250μg/ml潮霉素的PDA培養(yǎng)基進(jìn)行二次篩選，對(duì)可以正常生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行5-7代PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)后，再一次將轉(zhuǎn)化子培養(yǎng)在含有250μg/ml潮霉素的PDA培養(yǎng)基上，此時(shí)仍舊能夠正常生長(zhǎng)的就是通過(guò)REMI技術(shù)得到的穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化子，把他們接種到PDA斜面上放在4℃冰箱中保存。
其中，所述液體再生培養(yǎng)基的配制為分別取硫酸銨2.8g，尿素600mg，硫酸鉀4g，無(wú)水氯化鈣600mg，葡萄糖40g，蔗糖100g，MgSO4·10H2O 200mg，F(xiàn)eSO4·7H2O 10mg，ZnSO4·7H2O 1.8mg，MnSO4·H2O 3.2mg，CoCl2·6H2O 4mg加入到800ml水中，調(diào)節(jié)pH值至5.0。固體培養(yǎng)基則在液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上加入18-20g瓊脂粉。
2、轉(zhuǎn)化子的硅膠粒保存通過(guò)對(duì)木霉氰化物降解酶的測(cè)定后，將得到的降解氰化物活性高的木霉菌轉(zhuǎn)化子在28℃條件下置于PDA(馬鈴薯-葡萄糖-瓊脂)培養(yǎng)基培養(yǎng)，平板培養(yǎng)5-7天，使綠色孢子布滿整個(gè)培養(yǎng)皿。取螺旋口玻璃管，放入硅膠粒到玻璃管體積的1/4-1/2，經(jīng)干熱滅菌處理后，冷卻，使用前冰浴15-30分鐘。取5％滅菌的脫脂牛奶0.5-2毫升加入培養(yǎng)皿中，水平搖晃，制成孢子懸液。用無(wú)菌移液管或槍吸取0.5-1毫升的孢子懸液，加到已冷卻的玻璃管中的硅膠粒表面，蓋上蓋后，迅速搖動(dòng)，使硅膠粒濕潤(rùn)并粘上孢子，立即放回冰浴。10-20分鐘后，擰緊蓋子放入4℃或-20℃冰箱中保存。
3、菌絲的培養(yǎng)取一粒上述浸潤(rùn)孢子懸液的硅膠粒，放置于倒有PDA的培養(yǎng)基上，培養(yǎng)5-7天后，綠色孢子產(chǎn)生，挑取長(zhǎng)有孢子的菌絲與5ml-6ml無(wú)菌水混合，挑取的孢子量使混合溶液呈綠色即可，用三層擦凈紙過(guò)濾得到濾液；取3ml濾液放入50-100ml PDB(馬鈴薯200g，葡萄糖20g，酵母浸膏15g，加水定容到1000ml)液體培養(yǎng)基，在搖床中，28℃下100-140rpm下培養(yǎng)60-70小時(shí)。將培養(yǎng)好的菌絲，三層擦鏡紙過(guò)濾，并用0.7M的NaCl或無(wú)菌水將菌絲中培養(yǎng)基沖洗干凈，得到綠色的濕菌絲體。
4、固定化小球的制備按2g-3g海藻酸鈉、1g硅藻土置于100ml蒸餾水的比例，將海藻酸鈉、硅藻土置于蒸餾水中，加熱攪拌溶解并濕熱滅菌，配制成海藻酸鈉溶液。
配制質(zhì)量濃度為2-3％的CaCl2溶液，裝于瓶中濕熱滅菌。按每200ml海藻酸鈉溶液中放入濕菌絲5克的比例，將濕菌絲放入滅菌后的海藻酸鈉溶液中攪拌均勻，使用20-50ml注射器吸取菌絲混合液，用針頭將其打入200ml-400ml的上述CaCl2溶液中并勻速攪拌，形成φ3-5mm的小球，之后小球在CaCl2溶液中4℃下固定2-3小時(shí)，過(guò)濾得到固定化小球。用已滅菌的質(zhì)量濃度為0.9％的NaCl溶液沖洗，洗去未結(jié)合的鈣離子。繼續(xù)將小球放入體積濃度為0.1-0.3％的戊二醛溶液中進(jìn)行交聯(lián)30秒-2分鐘。用無(wú)菌水沖洗后，得到制備好的固定化小球，即為固定化木霉菌轉(zhuǎn)化子，4℃保存。
將采用本發(fā)明方法得到的固定化木霉菌轉(zhuǎn)化子加入到含有氰化物的基礎(chǔ)離子培養(yǎng)基中，52ppm和250ppm，500ppm的CN-分別在60小時(shí)，12天，22天后，降解率達(dá)到95％以上，氰化物的殘留濃度均低于國(guó)家檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)。
利用本發(fā)明制備的固定化小球來(lái)降解氰化物，其降解速度比游離細(xì)胞的降解速度要快，而且方便回收，回收的小球在用3％的CaCl2固定2小時(shí)后，又可以用于下一批的氰化物降解實(shí)驗(yàn)。
具體實(shí)施例方式
以下結(jié)合具體的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步描述。
實(shí)施例11、轉(zhuǎn)化子構(gòu)建和獲得采用質(zhì)粒40μg、濃度為10U/μl的限制性內(nèi)切酶HindIII10μl、山梨醇緩沖液(1M pH7.5)即STC 200μl，配制成酶-質(zhì)?；旌弦?，待用。將濃度為106/ml的木霉菌原生質(zhì)體懸浮液100μl與前已配制完成的酶-質(zhì)?；旌弦夯靹蚝螅徛尤霛舛葹?0％2ml聚乙二醇即PEG，加入5ml預(yù)冷的STC，4℃下2000rpm離心15分鐘，棄上清，加入3ml液體再生培養(yǎng)基，混勻，倒入9cm無(wú)菌培養(yǎng)皿中，加入已溶解好的冷卻到45℃，20ml固體再生培養(yǎng)基，25℃下放置6小時(shí)后，倒入含300μg/ml潮霉素的水瓊脂10ml，平鋪在再生培養(yǎng)基上，2天后出現(xiàn)轉(zhuǎn)化子。將轉(zhuǎn)化子培養(yǎng)在含有250μg/ml潮霉素的PDA培養(yǎng)基進(jìn)行二次篩選，對(duì)可以正常生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行7代PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)后，再一次將轉(zhuǎn)化子培養(yǎng)在含有250μg/ml潮霉素的PDA培養(yǎng)基上，此時(shí)仍舊能夠正常生長(zhǎng)的就是通過(guò)REMI技術(shù)得到的穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化子，把它們接種到PDA斜面上放在4℃冰箱中保存。
其中，所述液體再生培養(yǎng)基的配制為分別取硫酸銨2.8g，尿素600mg，硫酸鉀4g，無(wú)水氯化鈣600mg，葡萄糖40g，蔗糖100g，MgSO4·10H2O 200mg，F(xiàn)eSO4·7H2O 10mg，ZnSO4·7H2O 1.8mg，MnSO4·H2O 3.2mg，CoCl2·6H2O 4mg加入到800ml水中，調(diào)節(jié)pH值至5.0；固體培養(yǎng)基則在液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上加入18-20g瓊脂粉。
2、TkA8轉(zhuǎn)化子篩選與硅膠粒保存將REMI技術(shù)得到的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行降解氰化物酶系活性篩選后，得到了T30轉(zhuǎn)化子TkA8。將TkA8在PDA上28℃培養(yǎng)6天后，使綠色孢子長(zhǎng)滿整皿。之前的準(zhǔn)備工作中，將硅膠粒裝滿螺旋口玻璃管的1/3，配制5％脫脂奶粉50ml，并濕熱滅菌。開(kāi)始硅膠粒菌種保存前，先將硅膠粒管冰浴30分鐘。取出已培養(yǎng)好的TkA8，在培養(yǎng)皿中放入1ml的5％無(wú)菌脫脂奶粉，晃動(dòng)培養(yǎng)皿，制成孢子懸液，吸取0.5ml的孢子懸液入在冰浴中的硅膠粒管中，迅速拿出劇烈搖動(dòng)，以保證所有硅膠粒上都粘有孢子即可，再將其放回冰浴中，15分鐘后取出，放入-20℃冰箱保存。
3、TkA8轉(zhuǎn)化子菌絲的培養(yǎng)取出TkA8轉(zhuǎn)化子硅膠粒一顆，放在已倒好PDA的培養(yǎng)皿中央，28℃溫箱中培養(yǎng)7天后，接種鉤挑出1/3皿上長(zhǎng)有孢子的菌絲，與5ml無(wú)菌水混合，過(guò)濾后得到孢子懸液，取3ml于50ml PDB(馬鈴薯200g，葡萄糖20g，酵母浸膏15g，加水定容到1000ml)液體培養(yǎng)基中，28℃，轉(zhuǎn)速140rpm，培養(yǎng)70小時(shí)。之后，菌絲通過(guò)放了三層擦凈紙布氏漏斗過(guò)濾得到，用0.7M的NaCl的滅菌溶液洗去菌絲中的培養(yǎng)基。
4、固定化細(xì)胞小球的制備固定化細(xì)胞制備前，先稱取6g海藻酸鈉和2g硅藻土溶于200ml水中，溶解過(guò)程中要加熱攪拌，配制質(zhì)量濃度為3％CaCl2溶液400ml，所用溶液均濕熱滅菌。另外配制體積濃度為0.3％400ml戊二醛溶液待用。將滅菌的海藻酸鈉-硅藻土200ml倒入400ml的燒杯中，稱取10g TkA8濕菌絲體(濕菌絲體∶海藻酸鈉-硅藻土＝1∶20)于其中，放入轉(zhuǎn)子攪拌，直至菌絲分布均勻。取無(wú)菌注射器，吸取海藻酸鈉-硅藻土-菌絲混合物，使用12號(hào)針頭將菌絲混合物注射入3％CaCl2溶液中，同時(shí)不斷攪拌CaCl2溶液，小球瞬時(shí)形成。將200ml的菌絲海藻酸鈉混合物都制備成小球后，讓它們?cè)贑aCl2溶液中，4℃條件下固定2小時(shí)，過(guò)濾得到固定化小球，用0.9％NaCl溶液沖洗去多余的鈣離子后，將小球在4℃的0.3％戊二醛溶液中交聯(lián)1分鐘，過(guò)濾用無(wú)菌水洗凈。得到待用的固定化小球。游離菌絲與包埋入菌絲的海藻酸鈣小球的比例約為1∶18。
稱取10克固定化小球于基礎(chǔ)離子培養(yǎng)基中，固定化小球的重量與基礎(chǔ)離子培養(yǎng)基的體積之比為1∶7.5，并加入終濃度為52微克/毫升CN-氰化鉀溶液，180轉(zhuǎn)/分振蕩培養(yǎng)60小時(shí)后測(cè)定CN-濃度，降解率達(dá)到95％。
將已降解完全的培養(yǎng)基中的固定化小球取出，無(wú)菌水洗凈后，放入3％CaCl2溶液中，4℃固定2小時(shí)，得到的小球可以繼續(xù)利用降解含氰溶液，降解效率為新鮮制備的小球的92％，并且可以循環(huán)使用6次以上。
實(shí)施例21、轉(zhuǎn)化子構(gòu)建和獲得采用質(zhì)粒30μg、10U/μl的限制性內(nèi)切酶HindIII10μl、山梨醇緩沖液(1MpH7.5)即STC 200μl，配制成酶-質(zhì)?；旌弦?，待用。將濃度為106/ml的木霉菌原生質(zhì)體懸浮液100μl與前已配制完成的酶-質(zhì)?；旌弦夯靹蚝螅徛尤霛舛葹?0％2ml聚乙二醇即PEG，加入5ml預(yù)冷的STC，4℃下2000rpm離心15分鐘，棄上清，加入3ml液體再生培養(yǎng)基，混勻，倒入9cm無(wú)菌培養(yǎng)皿中，加入已溶解好的冷卻到55℃，15ml固體再生培養(yǎng)基，25℃下放置6小時(shí)后，倒入含300μg/ml潮霉素的水瓊脂10ml，平鋪在再生培養(yǎng)基上，3天后出現(xiàn)轉(zhuǎn)化子。將轉(zhuǎn)化子培養(yǎng)在含有250μg/ml潮霉素的PDA培養(yǎng)基進(jìn)行二次篩選，對(duì)可以正常生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行5代PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)后，再一次將轉(zhuǎn)化子培養(yǎng)在含有250μg/ml潮霉素的PDA培養(yǎng)基上，此時(shí)仍舊能夠正常生長(zhǎng)的就是通過(guò)REMI技術(shù)得到的穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化子，把它們接種到PDA斜面上放在4℃冰箱中保存。
2、TkB5轉(zhuǎn)化子篩選與硅膠粒保存將REMI技術(shù)得到的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行降解氰化物酶系活性篩選后，得到了T30轉(zhuǎn)化子TkA8。將TkA8在PDA上28℃培養(yǎng)6天后，使綠色孢子長(zhǎng)滿整皿。之前的準(zhǔn)備工作中，將硅膠粒裝滿螺旋口玻璃管的1/3，配制5％脫脂奶粉50ml，并濕熱滅菌。開(kāi)始硅膠粒菌種保存前，先將硅膠粒管冰浴30分鐘。取出已培養(yǎng)好的TkA8，在培養(yǎng)皿中放入1ml的5％無(wú)菌脫脂奶粉，晃動(dòng)培養(yǎng)皿，制成孢子懸液，吸取0.5ml的孢子懸液入在冰浴中的硅膠粒管中，迅速拿出劇烈搖動(dòng)，以保證所有硅膠粒上都粘有孢子即可，再將其放回冰浴中，15分鐘后取出，放入-20℃冰箱保存。
3、TkB5轉(zhuǎn)化子菌絲體的培養(yǎng)取出TkB5轉(zhuǎn)化子硅膠粒二顆，放在已倒好PDA的培養(yǎng)皿中，28℃溫箱中培養(yǎng)5天后，接種鉤挑出1/2皿菌絲，與5ml無(wú)菌水混合，過(guò)濾后得到孢子懸液，取5于100ml PDB液體培養(yǎng)基中，28℃，轉(zhuǎn)速140rpm，培養(yǎng)60小時(shí)后，菌絲通過(guò)放了三層擦凈紙布氏漏斗過(guò)濾得到，用無(wú)菌水將殘留的培養(yǎng)基沖洗干凈。
4、固定化小球的制備固定化小球制備前，先稱取3g海藻酸鈉和1克硅藻土溶于100毫升水中，溶解過(guò)程中要加熱攪拌，配制3％CaCl2溶液200毫升，所用溶液均濕熱滅菌。另外配制0.3％戊二醛200ml溶液待用。將滅菌的海藻酸鈉-硅藻土100毫升倒入200毫升的燒杯中，稱取5g TkB5濕菌絲體放于其中，攪拌至菌絲分布均勻。取具12號(hào)針頭的無(wú)菌注射器，吸取海藻酸鈉-硅藻土-菌絲混合物，注入3％CaCl2溶液中，不斷攪拌，小球瞬時(shí)形成。將200毫升的菌絲小球加入CaCl2溶液，4℃條件下固定3小時(shí)，過(guò)濾得到固定化小球，用0.9％NaCl溶液沖洗去多余的鈣離子后，將小球在4℃的0.3％戊二醛溶液中交聯(lián)2分鐘，過(guò)濾用無(wú)菌水洗凈，即得到待用的固定化小球。
稱取12.5g制備好的固定化小球放入100ml pH6.5的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，加入500ppm CN-終濃度的氰化鉀，28℃，140轉(zhuǎn)/分，振蕩培養(yǎng)。在22天后，培養(yǎng)基中的KCN濃度的濃度可降解到0.2ppm。
權(quán)利要求
1.一種降解氰化物污染木霉菌轉(zhuǎn)化子的篩選與固定化制備方法，其特征在于包括以下步驟1)木霉菌轉(zhuǎn)化子的構(gòu)建采用質(zhì)粒30-40μg、10U/μl的限制性內(nèi)切酶HindIII10μl、STC山梨醇緩沖液200μl，配制成酶-質(zhì)?；旌弦?；將濃度為106-108/ml的木霉菌原生質(zhì)體懸浮液100μl與配制成的酶-質(zhì)?；旌弦夯靹蚝?，緩慢加入濃度為60％2ml聚乙二醇，加入5ml預(yù)冷的STC，4℃下2000rpm離心15分鐘，棄上清，加入3ml液體再生培養(yǎng)基，混勻，倒入無(wú)菌培養(yǎng)皿中，加入15-20ml已溶解好并冷卻到45-55℃的固體再生培養(yǎng)基，20-25℃下放置6小時(shí)后，倒入含300μg/ml潮霉素的水瓊脂10-15ml，平鋪在再生培養(yǎng)基上，2-3天后出現(xiàn)轉(zhuǎn)化子；將轉(zhuǎn)化子培養(yǎng)在含有250μg/ml潮霉素的PDA培養(yǎng)基進(jìn)行二次篩選，對(duì)正常生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行5-7代PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)后，再一次將轉(zhuǎn)化子培養(yǎng)在含有250μg/ml潮霉素的PDA培養(yǎng)基上，將仍能正常生長(zhǎng)的穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化子接種到PDA斜面上，放在4℃冰箱中保存；其中，所述液體再生培養(yǎng)基的配制為分別取硫酸銨2.8g，尿素600mg，硫酸鉀4g，無(wú)水氯化鈣600mg，葡萄糖40g，蔗糖100g，MgSO4·10H2O 200mg，F(xiàn)eSO4·7H2O 10mg，ZnSO4.7H2O 1·8mg，MnSO4.H2O 3·2mg，CoCl2·6H2O 4mg加入到800ml水中，調(diào)節(jié)pH值至5.0；固體培養(yǎng)基則在液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上加入18-20g瓊脂粉；2)轉(zhuǎn)化子的硅膠粒保存將經(jīng)降解酶活性測(cè)定后得到的降解氰化物活性高的木霉菌轉(zhuǎn)化子在28℃條件下置于PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)，平板培養(yǎng)5-7天，使綠色孢子布滿整個(gè)培養(yǎng)皿，取螺旋口玻璃管，放入硅膠粒到玻璃管體積的1/4-1/2，經(jīng)干熱滅菌處理后，冷卻，使用前冰浴15-30分鐘；取5％滅菌的脫脂牛奶0.5-2毫升加入培養(yǎng)皿中，水平搖晃，制成孢子懸液；用無(wú)菌移液管或槍吸取0.5-1毫升的孢子懸液，加到已冷卻的玻璃管中的硅膠粒表面，蓋上蓋后，迅速搖動(dòng)，使硅膠粒濕潤(rùn)并粘上孢子，立即放回冰浴，10-20分鐘后，擰緊蓋子放入4℃或-20℃冰箱中保存；3)菌絲的培養(yǎng)取一粒上述浸潤(rùn)孢子懸液的硅膠粒，放置于倒有PDA的培養(yǎng)基上，培養(yǎng)5-7天后產(chǎn)生綠色孢子，挑取長(zhǎng)有孢子的菌絲與5-6ml無(wú)菌水混合使混合溶液呈綠色，然后過(guò)濾，取3ml濾液放入50-100ml PDB液體培養(yǎng)基，在搖床中，28℃、100-140rpm下培養(yǎng)60-70小時(shí)；將培養(yǎng)好的菌絲過(guò)濾，并用0.7M的NaCl或無(wú)菌水將菌絲中培養(yǎng)基沖洗干凈，得到綠色的濕菌絲體；4)固定化小球的制備按2g-3g海藻酸鈉、1g硅藻土置于100ml蒸餾水的比例，將海藻酸鈉、硅藻土置于蒸餾水中，加熱攪拌溶解并濕熱滅菌，配制成海藻酸鈉溶液；配制質(zhì)量濃度為2-3％的CaCl2溶液，裝于瓶中濕熱滅菌，按每200ml海藻酸鈉溶液中放入濕菌絲5克的比例，將濕菌絲放入滅菌后的海藻酸鈉溶液中攪拌均勻，使用20-50ml注射器吸取菌絲混合液，用針頭將其打入200ml-400ml的上述CaCl2溶液中并勻速攪拌，形成φ3-5mm的小球，之后小球在CaCl2溶液中4℃下固定2-3小時(shí)，過(guò)濾得到固定化小球；用已滅菌的質(zhì)量濃度為0.9％的NaCl溶液沖洗后，繼續(xù)將小球放入體積濃度為0.1-0.3％的戊二醛溶液中進(jìn)行交聯(lián)30秒-2分鐘，用無(wú)菌水沖洗后，得到制備好的固定化小球，即為固定化木霉菌轉(zhuǎn)化子，4℃保存。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種降解氰化物污染木霉菌轉(zhuǎn)化子的篩選與固定化制備方法，首先利用限制性內(nèi)切酶介導(dǎo)基因整合技術(shù)構(gòu)建木霉菌突變株，通過(guò)對(duì)出發(fā)菌株及其轉(zhuǎn)化子間氰化物降解酶系的活性比較分析，篩選出對(duì)氰化物高降解活性的木霉菌轉(zhuǎn)化子，然后在確定了固相化過(guò)程中海藻酸鈉和CaCl
文檔編號(hào)C12N15/80GK1916157SQ20061003090
公開(kāi)日2007年2月21日 申請(qǐng)日期2006年9月7日 優(yōu)先權(quán)日2006年9月7日
發(fā)明者陳捷, 周曉英, 劉力行, 陳云鵬 申請(qǐng)人:上海交通大學(xué)