專利名稱：siRNA表達系統(tǒng)和利用該系統(tǒng)制備功能性基因擊倒細胞的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及能沉默靶基因表達的體內(nèi)siRNA表達系統(tǒng)，以及使用該表達系統(tǒng)產(chǎn)生擊倒細胞的方法。
背景技術(shù)：
RNA干擾(下文簡稱為“RNAi”)是一種能通過將雙鏈RNA(下文簡稱為“dsRNA”)導(dǎo)入細胞來誘導(dǎo)靶基因mRNA降解，從而使靶基因表達沉默的現(xiàn)象(過程)，其中所述雙鏈RNA含有有義RNA(它具有與靶基因mRNA同源的序列)和反義RNA(它具有與有義RNA互補的序列)。由于RNAi能夠沉默靶基因表達，因此，人們致力于使之成為一種簡單的基因擊倒法，以替代依賴于煩人而無效的同源重組的常規(guī)基因破壞法，或者使之成為一種基因治療的方式。最初，在線蟲中發(fā)現(xiàn)了上述RNAi(Fire，A等，Potent and specificgenetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.Nature391，806-811(1998))。隨后，在包括植物、線蟲、果蠅和原生動物的多種生物體中也觀察到RNAi(Fire，A.RNA-triggered gene silencing.Trends Genet.15，358-363(1999)；Sharp，P.A.RNA interference 2001.Genes Dev.15，485-490(2001)；Hammond，S.M.，Caudy，A.A.& Hannon，G.J.Post-transcriptional gene silencing by double-stranded RNA.Nature Rev.Genet.2，110-119(2001)；Zamore，P.D.RNA interferencelistening to the sound ofsilence.Nat Struct Biol.8，746-750(2001))。在這些生物體中實際導(dǎo)入外源dsRNA可進一步證實靶基因表達的沉默。已將該技術(shù)用作產(chǎn)生擊倒個體的方法。
與上述生物體類似，已嘗試在哺乳動物細胞中導(dǎo)入外源dsRNA以誘導(dǎo)RNAi。然而，此時，由轉(zhuǎn)染的dsRNA引發(fā)的宿主抗病毒感染保護機制發(fā)揮作用，抑制了蛋白質(zhì)的合成，因此未觀察到RNAi。
最近，據(jù)Tuschl等報道，通過用21或22個核苷酸長的短dsRNA替代其它生物體中所用的長dsRNA轉(zhuǎn)導(dǎo)細胞，也可在哺乳動物細胞中誘導(dǎo)RNAi，其中所述短dsRNA具有單鏈2或3個核苷酸的3’突出端(Elbashir，S.M等，Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in culturedmammalian cells.Nature 411，494-498(2001)；Caplen，N.J等，Specific inhibitionof gene expression by small double-stranded RNAs in invertebrate and vertebratesystems.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98，9742-9747(2001))。
如上所述，已成功使用短鏈干擾雙鏈RNA(下文簡稱為“siRNA”)在哺乳動物細胞中誘導(dǎo)了RNAi。為了基于由RNAi誘導(dǎo)的基因沉默來進行功能分析并進行基因治療，必需將siRNA有效導(dǎo)入細胞，并使其在細胞內(nèi)穩(wěn)定維持。
外源siRNA導(dǎo)入細胞的效率根據(jù)細胞類型的不同而不同，在某些細胞中可低至1％至10％。另外，導(dǎo)入哺乳動物細胞的外源siRNA在導(dǎo)入幾天后消失，不具備分析基因功能所需的足夠的穩(wěn)定性。此外，在基因治療中，必需以固定的時間間隔施用siRNA，這會增加患者的生理負擔。
另外，通過導(dǎo)入外源siRNA很難只在特定的組織或特定的發(fā)育/分化時期誘導(dǎo)RNAi。此外，盡管siRNA較小，但與DNA合成相比，RNA合成要昂貴得多，直接由siRNA誘導(dǎo)RNAi并不經(jīng)濟。
由于已測定人類基因組的大部分一級DNA序列，人們開發(fā)出系統(tǒng)而有效的搜索功能基因的方法，可快速闡明基因的功能?；诩毎騻€體的表型變化，可以使用RNAi導(dǎo)致的基因沉默進行系統(tǒng)性的功能基因搜索，以加速發(fā)現(xiàn)和分析新的功能基因。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供能在細胞中更有效、穩(wěn)定和經(jīng)濟地產(chǎn)生RNAi的細胞內(nèi)siRNA表達系統(tǒng)，使用該siRNA表達系統(tǒng)產(chǎn)生擊倒細胞的方法，以及使用該siRNA表達系統(tǒng)搜索功能基因的方法。
考慮到上述問題，本發(fā)明人研究了體內(nèi)siRNA表達系統(tǒng)并成功開發(fā)出此系統(tǒng)。更具體地，本發(fā)明涉及(1)細胞內(nèi)siRNA表達系統(tǒng)，其含有編碼針對靶基因mRNA區(qū)域的反義RNA的反義編碼DNA，編碼針對所述靶基因mRNA相同區(qū)域的有義RNA的有義編碼DNA，以及一個或多個能分別由所述反義和有義編碼DNA表達所述反義和有義RNA的啟動子；(2)根據(jù)(1)的siRNA表達系統(tǒng)，其中由該系統(tǒng)表達的siRNA的最終轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物長度為15至49bp；
(3)根據(jù)(1)的siRNA表達系統(tǒng)，其中由該系統(tǒng)表達的siRNA的最終轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物長度為15至35bp；(4)根據(jù)(1)的siRNA表達系統(tǒng)，其中由該系統(tǒng)表達的siRNA的最終轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物長度為15至30bp；(5)根據(jù)(1)的siRNA表達系統(tǒng)，其中siRNA中兩條RNA鏈配對的雙鏈RNA區(qū)域含有錯配或凸起；(6)根據(jù)(5)的siRNA表達系統(tǒng)，其中錯配的一個核苷酸是鳥嘌呤，另一個是尿嘧啶；(7)根據(jù)(5)的siRNA表達系統(tǒng)，其中siRNA含有1至7個錯配；(8)根據(jù)(5)的siRNA表達系統(tǒng)，其中siRNA含有1至7個凸起；(9)根據(jù)(5)的siRNA表達系統(tǒng)，其中siRNA含有1至7個錯配和凸起；(10)根據(jù)(1)至(9)中任一項的siRNA表達系統(tǒng)，其中所述啟動子是pol II或pol III啟動子；(11)根據(jù)(1)至(10)中任一項的siRNA表達系統(tǒng)，其中所述pol III啟動子是U6啟動子；(12)根據(jù)(1)至(11)中任一項的siRNA表達系統(tǒng)，其中所述啟動子是誘導(dǎo)型啟動子；(13)根據(jù)(1)至(12)中任一項的siRNA表達系統(tǒng)，其中所述啟動子分開位于所述反義和有義編碼DNA的上游；(14)根據(jù)(1)至(13)中任一項的siRNA表達系統(tǒng)，其中所述系統(tǒng)含有下述(a)至(c)中任一種形式的loxP序列以使表達能被控制(a)啟動子含有遠側(cè)序列元件(DSE)和近側(cè)序列元件(PSE)，其間有間隔區(qū)，間隔區(qū)中有兩個loxP序列，一個位于DSE附近，另一個位于PSE附近；(b)啟動子含有DSE和PSE，它們所處的位置能維持啟動子活性，有一個loxP序列位于它們之間，另一個loxP序列位于DSE的上游或PSE的下游；和(c)兩個loxP序列所處的位置使其能干預(yù)反義編碼DNA或有義編碼DNA；(15)根據(jù)(1)至(14)中任一項的siRNA表達系統(tǒng)，其中反義和有義編碼DNA位于相同的載體DNA分子，或分開位于不同的載體DNA分子；(16)根據(jù)(1)至(13)中任一項的siRNA表達系統(tǒng)，其中啟動子位于單位的一側(cè)，在所述單位中，反義和有義編碼DNA經(jīng)由接頭以相反方向連接；(17)根據(jù)(16)的siRNA表達系統(tǒng)，其中所述系統(tǒng)含有下述(a)至(d)中任一種形式的loxP序列以使表達能被控制(a)啟動子含有DSE和PSE，其間有間隔區(qū)，間隔區(qū)中有兩個loxP序列，一個位于DSE附近，另一個位于PSE附近；(b)啟動子含有DSE和PSE，它們所處的位置能維持啟動子活性，有一個loxP序列位于它們之間，另一個loxP序列位于DSE的上游或PSE的下游；(c)兩個loxP序列所處的位置使其能干預(yù)反義編碼DNA或有義編碼DNA；和(d)兩個loxP所處的位置使其能干預(yù)含有終止序列(如TTTTT)的接頭；(18)根據(jù)(16)或(17)的siRNA表達系統(tǒng)，其中反義和有義編碼DNA位于載體分子中；(19)根據(jù)(15)或(18)的siRNA表達系統(tǒng)，其中所述載體是質(zhì)粒載體；(20)根據(jù)(15)或(18)的siRNA表達系統(tǒng)，其中所述載體是病毒載體；(21)根據(jù)(15)或(18)的siRNA表達系統(tǒng)，其中所述載體是啞鈴形DNA載體；(22)維持根據(jù)(1)至(21)中任一項的siRNA表達系統(tǒng)的細胞；(23)根據(jù)(22)的細胞，其中所述細胞是哺乳動物細胞；(24)維持根據(jù)(1)至(21)中任一項的siRNA表達系統(tǒng)的單個生物體；(25)含有根據(jù)(1)至(21)中任一項的siRNA表達系統(tǒng)的組合物；(26)根據(jù)(25)的組合物，其中所述組合物是藥物組合物；(27)產(chǎn)生靶基因表達沉默的細胞的方法，其中所述方法包括下述步驟將根據(jù)(1)至(21)中任一項的siRNA表達系統(tǒng)導(dǎo)入細胞，選擇導(dǎo)入了所述siRNA表達系統(tǒng)的細胞；(28)細胞內(nèi)siRNA文庫表達系統(tǒng)，其含有編碼siRNA的雙鏈DNA和兩個彼此相對放置的啟動子，所述雙鏈DNA含有與表達的siRNA等長的任意序列，并位于兩個啟動子之間，所述啟動子能由所述雙鏈DNA的各條鏈表達彼此互補的RNA；(29)細胞內(nèi)siRNA文庫表達系統(tǒng)，其含有莖-環(huán)siRNA產(chǎn)生單位和能在所述單位的任一側(cè)表達莖-環(huán)siRNA的啟動子，在所述單位中，反義編碼DNA和與所述反義編碼DNA互補的有義編碼DNA經(jīng)由接頭以相反的方向連接；
(30)根據(jù)(28)或(29)的siRNA文庫表達系統(tǒng)，其中系統(tǒng)所表達的siRNA最終轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的長度為15至49bp；(31)根據(jù)(28)或(29)的siRNA文庫表達系統(tǒng)，其中系統(tǒng)所表達的siRNA最終轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的長度為15至35bp；(32)根據(jù)(28)或(29)的siRNA文庫表達系統(tǒng)，其中系統(tǒng)所表達的siRNA最終轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的長度為15至30bp；(33)根據(jù)(28)至(32)中任一項的siRNA文庫表達系統(tǒng)，其中siRNA中兩條RNA鏈配對的雙鏈RNA區(qū)域含有錯配或凸起；(34)根據(jù)(28)至(33)中任一項的siRNA文庫表達系統(tǒng)，其中所述啟動子是pol II或pol III啟動子；(35)根據(jù)(28)至(33)中任一項的siRNA文庫表達系統(tǒng)，其中所述啟動子是誘導(dǎo)型啟動子；(36)根據(jù)(28)至(33)中任一項的siRNA文庫表達系統(tǒng)，其中系統(tǒng)所表達的siRNA由隨機RNA鏈組成；(37)根據(jù)(28)至(33)中任一項的siRNA文庫表達系統(tǒng)，其中所述系統(tǒng)為多個siRNA表達載體的集合，其中每個載體靶向一種含有編碼區(qū)和/或非編碼區(qū)的基因序列；(38)根據(jù)(28)至(33)中任一項的siRNA文庫表達系統(tǒng)，其中系統(tǒng)所表達的siRNA由任何cDNA或基因組DNA的DNA片段所編碼的RNA鏈組成，所述片段與表達的siRNA等長；(39)根據(jù)(28)至(38)中任一項的siRNA文庫表達系統(tǒng)的集合，其中所述集合中的每個系統(tǒng)表達不同的siRNA；(40)搜索功能基因的方法，所述方法包括下述步驟(a)在細胞中導(dǎo)入根據(jù)(28)至(38)中任一項的siRNA文庫表達系統(tǒng)或根據(jù)(39)的siRNA文庫表達系統(tǒng)的集合；(b)選擇已導(dǎo)入所述siRNA文庫表達系統(tǒng)或所述集合的細胞；和(c)分析所選擇細胞的表型；(41)根據(jù)(40)的搜索功能基因的方法，其中所述方法還包括下述步驟根據(jù)經(jīng)表型分析發(fā)現(xiàn)表型有所改變的細胞中編碼siRNA的DNA序列來篩選功能基因；和(42)選擇高活性siRNA的方法，所述方法包括下述步驟
(a)在細胞中導(dǎo)入根據(jù)(28)至(38)中任一項的siRNA文庫表達系統(tǒng)或根據(jù)(39)的siRNA文庫表達系統(tǒng)的集合，和(b)測定已導(dǎo)入所述siRNA文庫表達系統(tǒng)或所述集合的細胞中特定基因或蛋白質(zhì)的表達水平。
一方面，本發(fā)明涉及細胞內(nèi)siRNA表達系統(tǒng)。該siRNA表達系統(tǒng)含有編碼針對靶基因mRNA區(qū)域的反義RNA的反義編碼DNA，編碼針對靶基因mRNA相同區(qū)域的有義RNA的有義編碼DNA，以及一個或多個能分別由反義和有義編碼DNA表達反義和有義RNA的啟動子。
“siRNA”指的是短鏈干擾RNA，它是對哺乳動物細胞無毒的短的雙鏈RNA。據(jù)Tuschl等(文獻同上)報道，長度不局限于21至23bp。對siRNA的長度沒有特別的限制，只要它不顯示毒性即可。“siRNA”的長度可以是例如15至49bp，優(yōu)選為15至35bp，更優(yōu)選為21至30bp?；蛘?，所表達siRNA的最終轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的雙鏈RNA部分的長度可以是例如15至49bp，優(yōu)選為15至35bp，更優(yōu)選為21至30bp。siRNA中兩條RNA鏈配對的雙鏈RNA部分不局限于完全配對，也可含有由錯配(對應(yīng)的核苷酸不互補)、凸起(一條鏈上缺乏對應(yīng)的互補核苷酸)等引起的未配對部分。未配對部分的含量應(yīng)以不干擾siRNA形成為宜。本文所用“凸起”優(yōu)選含有1至2個未配對的核苷酸，siRNA中兩條RNA鏈配對的雙鏈RNA區(qū)域優(yōu)選含有1至7個，更優(yōu)選為1至5個凸起。另外，siRNA中兩條RNA鏈配對的雙鏈RNA區(qū)域優(yōu)選含有1至7個，更優(yōu)選為1至5個本文所用“錯配”。在優(yōu)選的錯配中，一個核苷酸是鳥嘌呤，另一個核苷酸是尿嘧啶。該錯配是編碼有義RNA的DNA中C至T，G至A的突變或其組合引起的，但也不局限于此。另外，在本發(fā)明中，siRNA中兩條RNA鏈配對的雙鏈RNA區(qū)域可同時含有凸起和錯配，優(yōu)選它們的總數(shù)可達1至7，更優(yōu)選為1至5。
所述未配對部分(錯配或凸起等)可抑制下文所述的反義和有義編碼DNA之間的重組，并能使下文所述的siRNA表達系統(tǒng)變得穩(wěn)定。另外，盡管難以對siRNA中兩條RNA鏈配對的雙鏈RNA區(qū)域內(nèi)不含未配對部分的莖環(huán)DNA進行測序，但通過如上文所述導(dǎo)入錯配或凸起即可進行測序。另外，在配對的雙鏈RNA區(qū)域含有錯配或凸起的siRNA所具備的優(yōu)點是在大腸桿菌或動物細胞中能穩(wěn)定存在。
siRNA的末端結(jié)構(gòu)可以是平端或粘端(突出端)，只要siRNA能因其RNAi作用而導(dǎo)致靶基因表達沉默即可。據(jù)Tuschl等(文獻同上)報道，粘端(突出端)結(jié)構(gòu)不僅限于3’突出端，也可以包括5’突出端結(jié)構(gòu)，只要它能誘導(dǎo)RNAi作用即可。另外，突出端核苷酸的數(shù)目不限于已報道的2或3個，而可以是任何數(shù)目，只要突出端能誘導(dǎo)RNAi作用即可。例如，突出端由1至8個，優(yōu)選2至4個核苷酸組成。在本文中，將具有粘端結(jié)構(gòu)的siRNA的總長度表示為配對雙鏈部分的長度和兩端含有突出單鏈的配對物長度的總和。例如，當雙鏈RNA部分為19bp，兩端突出4個核苷酸時，可將總長度表示為23bp。另外，由于該突出序列對靶基因的特異性低，因此它不必與靶基因序列互補(反義)或相同(有義)。另外，只要siRNA能保持其對靶基因的基因沉默作用，siRNA可在例如，其一端的突出部分含有低分子量RNA(可以是天然RNA分子，如tRNA、rRNA或病毒RNA，或人工RNA分子)。
此外，“siRNA”的末端結(jié)構(gòu)必須是如上所述的兩端切斷結(jié)構(gòu)，它可具有莖-環(huán)結(jié)構(gòu)，其中雙鏈RNA一側(cè)的末端由接頭RNA連接。雙鏈RNA區(qū)域(莖-環(huán)部分)的長度可以是例如15至49bp，優(yōu)選為15至35bp，更優(yōu)選為21至30bp?；蛘?，作為所表達siRNA的最終轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的雙鏈RNA區(qū)域的長度是例如15至49bp，優(yōu)選為15至35bp，更優(yōu)選為21至30bp。另外，對接頭的長度沒有特別的限制，只要它的長度不會妨礙莖部分配對即可。例如，為了使莖部分穩(wěn)定配對，并抑制編碼該部分的DNA之間發(fā)生重組，接頭部分可具有三葉草tRNA結(jié)構(gòu)。即使接頭長度妨礙了莖部分的配對，也可以例如構(gòu)建接頭部分以使其包含內(nèi)含子，使內(nèi)含子在將前體RNA加工至成熟RNA的過程中被切下，從而使莖部分能夠配對。對于莖-環(huán)siRNA而言，不具有環(huán)結(jié)構(gòu)的RNA的任一端(頭或尾)可具有低分子量RNA。如上所述，該低分子量RNA可以是天然RNA分子，如tRNA、rRNA或病毒RNA，或人工RNA分子。
術(shù)語“靶基因”指的是因本發(fā)明系統(tǒng)所表達的siRNA而使其表達被沉默的基因，可以任意選擇靶基因。例如，優(yōu)選的靶基因是序列已知、但功能有待闡明的基因，以及其表達被認為是疾病誘因的基因。靶基因可以是其基因組序列尚未被完全闡明的基因，只要已測定出該基因mRNA中長度至少為15個核苷酸或更長的部分序列即可，所述長度是能結(jié)合siRNA一條鏈(反義RNA鏈)的長度。因此，即使未測定出全長序列，仍可將序列已闡明的基因已表達序列標志(EST)和mRNA的一部分選為“靶基因”。
“反義RNA”是具有與靶基因mRNA互補的序列的RNA鏈，據(jù)認為，它可通過結(jié)合靶基因mRNA來誘導(dǎo)RNAi。“有義RNA”具有與反義RNA互補的序列，它與其互補反義RNA退火以形成siRNA。用RNA合成儀可常規(guī)合成這些反義和有義RNA。在本發(fā)明中，使用siRNA表達系統(tǒng)，分別由編碼反義和有義RNA的DNA(反義和有義編碼DNA)胞內(nèi)表達這些RNA。
為了分別由反義和有義編碼DNA表達反義和有義RNA，本發(fā)明的siRNA表達系統(tǒng)含有“啟動子”。可任意選擇啟動子的類型、數(shù)目和位置，只要它能表達反義和有義編碼DNA即可。一種siRNA表達系統(tǒng)的簡單構(gòu)建方法是形成串聯(lián)表達系統(tǒng)，其中啟動子位于反義和有義編碼DNA的上游。該串聯(lián)表達系統(tǒng)能產(chǎn)生兩端具有上述切斷結(jié)構(gòu)的siRNA。在莖-環(huán)siRNA表達系統(tǒng)(莖表達系統(tǒng))中，反義和有義編碼DNA被安放在相反的方向，由接頭DNA連接這些DNA以構(gòu)建出一個單位。啟動子與該單位的一側(cè)連接以構(gòu)建出莖-環(huán)siRNA表達系統(tǒng)。本文對接頭DNA的長度和序列沒有特別的限制，接頭DNA可具有任何長度和序列，只要其序列不是終止序列，而其長度和序列不會妨礙如上所述成熟RNA產(chǎn)生過程中的莖部分的配對即可。例如，編碼上述tRNA等的DNA可用作接頭DNA。
對串聯(lián)和莖-環(huán)這兩種表達系統(tǒng)而言，5’末端可具有能促進由啟動子起始的轉(zhuǎn)錄的序列。更具體地，對串聯(lián)siRNA而言，在反義和有義編碼DNA的5’末端添加能促進由啟動子起始的轉(zhuǎn)錄的序列，即可改善siRNA產(chǎn)生的效率。對莖-環(huán)siRNA而言，可在上述單位的5’末端添加所述序列。只要不妨礙siRNA所致的靶基因沉默，所述序列的轉(zhuǎn)錄物可在與siRNA結(jié)合的狀態(tài)下被使用。如果該狀態(tài)妨礙了基因沉默，優(yōu)選使用修整工具(例如下文所述的核酶)對轉(zhuǎn)錄物進行修整。
在上述串聯(lián)或莖表達系統(tǒng)中，可以使用pol II或pol III啟動子，條件是所述啟動子能由上述DNA產(chǎn)生相應(yīng)的RNA。優(yōu)選使用適于表達短RNA，如siRNA的pol III啟動子。Pol III啟動子包括U6啟動子、tRNA啟動子、逆轉(zhuǎn)錄病毒LTR啟動子、腺病毒VA1啟動子、5Sr RNA啟動子、7SK RNA啟動子、7SL RNA啟動子和H1 RNA啟動子。U6啟動子在RNA的3’末端添加了4個尿苷核苷酸，因此，通過為反義和有義編碼DNA的5’末端序列提供0、1、2、3或4個腺嘌呤，可以不受阻礙地將最終產(chǎn)生的siRNA的3’突出端變成4、3、2、1或0個核苷酸。當使用其它啟動子時，可以隨意改變3’突出端核苷酸的數(shù)目。
使用pol III啟動子時，為了僅表達短RNA并適當終止轉(zhuǎn)錄，優(yōu)選在有義和反義編碼DNA的3’末端進一步提供終止子。可以使用任何終止序列，只要它能終止由啟動子啟動的轉(zhuǎn)錄即可?？梢允褂糜?個或更多個連串的腺嘌呤核苷酸組成的序列，能形成回文結(jié)構(gòu)的序列等。
Pol II啟動子包括巨細胞病毒啟動子、T7啟動子、T3啟動子、SP6啟動子、RSV啟動子、EF-1α啟動子、β-肌動蛋白啟動子、γ-球蛋白啟動子和SRα啟動子。Pol II啟動子產(chǎn)生的RNA不象pol III啟動子產(chǎn)生的那樣短，而是有些長。因此，當使用pol II啟動子時，必須使用通過自我-加工裂解RNA的手段，如核酶來截短有些長的RNA，從而產(chǎn)生反義或有義RNA。使用核酶產(chǎn)生反義或有義RNA的單位可具有下述結(jié)構(gòu)。如圖2A所示，反義或有義RNA產(chǎn)生單位具有反義或有義編碼DNA，編碼其5’和3’-末端處被核酶識別的RNA序列的區(qū)域(識別序列編碼區(qū))，以及編碼5’-和3’-末端裂解核酶以切下識別序列的區(qū)域，所述區(qū)域位于各個識別序列編碼區(qū)的外面并與之鄰近。所述反義和有義RNA產(chǎn)生單位可以串聯(lián)并可操作地連接于同一pol II啟動子的下游(圖2B)，也可以分開并可操作地連接于各自啟動子的下游(圖2C)。盡管圖2B顯示了兩個單位串聯(lián)連接的例子，但必要時也可以在反義和有義RNA產(chǎn)生單位之間插入任意的間隔序列，以調(diào)節(jié)各個單位所表達的兩個RNA之間的距離，從而使核酶易于對RNA起作用。
裂解反義和有義編碼DNA的5’-和3’-末端的核酶可以是錘頭核酶(Biochem.Biophys.Res.Commun.，Vol.186，PP.1271-1279(1992)；Proc.Natl.Acad.Sci.USA，Vol.90，pp.11302-11306(1993))。錘頭核酶可具有任何其它序列，只要它們能自我-加工即可(BIO medica，Vol.7，pp.89-94(1992))。另外，核酶不限于錘頭核酶，也可以使用例如發(fā)夾核酶、HDV核酶和得自四膜蟲的核酶，條件是它們能自我-加工(Gene，Vol.122，pp.85-90(1992))。核酶識別序列是能被5’-和3’-裂解核酶識別的序列。例如，錘頭核酶裂解NUH序列(N是A，G，C或U，而H是A，C或U)的磷酸二酯鍵。盡管可以使用任何核苷酸組合，但優(yōu)選使用“GUC”作為3’-方向最有效的裂解序列。因此，當使用錘頭核酶時，可將NUH，優(yōu)選為GUC用作識別序列。圖2D顯示了一例產(chǎn)生反義和有義RNA的mRNA構(gòu)建過程，其中在反義和有義RNA的5’-和3’-末端添加了該錘頭核酶和識別序列GUC的組合。在圖2D中，為了形成2-核苷酸突出端，使反義和有義RNA的5’-末端為“C”。當需形成3-核苷酸突出端時，5’-末端不限于“C”。在圖2D所示的構(gòu)建過程中，在3’-方向添加序列GUC。
如果將誘導(dǎo)型啟動子用作本發(fā)明的啟動子，就可以在任何合乎需要的時機表達siRNA。所述誘導(dǎo)型啟動子包括四環(huán)素-誘導(dǎo)型U6啟動子(Ohkawa，J.&Taira，K.Control of the functional activity of an antisense RNA by atetracycline-responsive derivative of the human U6 snRNA promoter.Hum.Gene Ther.11，577-585(2000)；Fig.12)。另外，可以使用組織特異性啟動子或DNA重組系統(tǒng)，如Cre-loxP系統(tǒng)組織-特異性地誘導(dǎo)siRNA表達。
另外，除了可以使用能被藥物誘導(dǎo)的啟動子和如上所述的啟動子外，還可以使用例如重組酶來控制siRNA產(chǎn)生。實施例中將會描述使用CRE-loxP重組酶系統(tǒng)的例子(圖17)。在啟動子中，遠側(cè)序列元件(DSE)和近側(cè)序列元件(PSE)之間有間隔區(qū)，在間隔區(qū)中，有一個loxP序列位于DSE附近，而另一個loxP序列位于PSE附近。通常，由于DSE和PSE之間存在距離，啟動子活性處于關(guān)閉狀態(tài)以抑制siRNA表達。CRE蛋白對此表達系統(tǒng)的作用誘使位于DSE和PSE附近的loxP序列之間發(fā)生重組，導(dǎo)致loxP序列之間DNA的置換。然后，DSE和PSE彼此靠近以將啟動子活性開啟為表達siRNA的狀態(tài)。該實施例描述了siRNA產(chǎn)生系統(tǒng)，其中通過CRE的作用將啟動子活性變換為開啟狀態(tài)。與之形成對照的是也可以構(gòu)建通過CRE的作用抑制siRNA表達的系統(tǒng)(未顯示)。例如，在能維持啟動子活性的前提下將一個loxP放置在DSE和PSE之間，而將另一個loxP放置在DSE上游或PSE下游。當缺乏Cre蛋白時，啟動子活性處于開啟狀態(tài)，而當存在Cre蛋白時，通過loxP之間的重組替換了DSE或PSE，從而將啟動子活性變換至關(guān)閉狀態(tài)，導(dǎo)致siRNA產(chǎn)生受到抑制。盡管這是一個在啟動子區(qū)域放置loxP的例子，但也可以提供兩個loxP，以通過提供CRE蛋白干預(yù)反義或有義編碼DNA，從而抑制siRNA的產(chǎn)生。
另外，對莖-環(huán)siRNA表達系統(tǒng)而言，可以在接頭部分提供兩個loxP以干預(yù)終止序列(如TTTTT)。無需CRE蛋白，由啟動子起始的轉(zhuǎn)錄即可終止于接頭部分的終止序列，導(dǎo)致siRNA產(chǎn)生受到抑制。CRE蛋白誘使loxP之間發(fā)生重組以置換終止序列，導(dǎo)致反義和有義編碼DNA轉(zhuǎn)錄以產(chǎn)生莖-環(huán)siRNA(參見圖28)。
含有上述“啟動子”、“反義編碼DNA”和“有義編碼DNA”的siRNA表達系統(tǒng)可被整合至染色體中以在細胞內(nèi)表達反義和有義RNA，從而產(chǎn)生siRNA。優(yōu)選使用攜有表達系統(tǒng)的載體將siRNA表達系統(tǒng)導(dǎo)入靶標，例如細胞中以有效地轉(zhuǎn)運系統(tǒng)?？筛鶕?jù)欲轉(zhuǎn)染的靶標，如細胞來選擇可用于本發(fā)明的載體，對于哺乳動物細胞而言，所述載體包括如逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、腺病毒載體、腺-伴隨病毒載體、痘苗病毒載體、慢病毒載體、皰疹病毒載體、甲病毒載體、EB病毒載體、乳頭瘤病毒載體和泡沫病毒載體的病毒載體，以及包括陽離子脂質(zhì)體、配體DNA復(fù)合物，基因槍等的非-病毒載體(Y.Niitsu等，Molecular Medicine 351385-1395(1998))，但并不局限于此。也可優(yōu)選使用啞鈴-形DNA(Zanta M.A等，Gene deliverya single nuclear localizationsignal peptide is sufficient to carry DNA to the cell nucleus.Proc Natl Acad SciUSA.1999 Jan 5；96(1)91-6)、經(jīng)修飾后具有核酶抗性的DNA或裸露的質(zhì)粒(Liu F，Huang L.Improving plasmid DNA-mediated liver gene transfer byprolonging its retention in the hepatic vasculature.J.Gene Med.2001 Nov-Dec；3(6)569-76)作為病毒載體的替代品。如下文所述的實施例所示，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)通過使本發(fā)明的siRNA表達系統(tǒng)包含于啞鈴-形DNA中，即可有效沉默靶基因的表達。因此，在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，優(yōu)選使用包含在啞鈴-形DNA分子中的siRNA表達系統(tǒng)。啞鈴-形DNA可與抗體、肽等連接以便其導(dǎo)入細胞。
可在相同載體或不同載體中表達反義和有義RNA。例如，通過在反義和有義編碼DNA的上游連接能表達短RNA的啟動子，如pol III啟動子以形成反義和有義RNA表達盒，并將該表達盒以相同方向或相反方向插入載體，即可制備出由相同載體表達反義和有義RNA的結(jié)構(gòu)。圖1A顯示了這種結(jié)構(gòu)的一個例子，其中以相同的方向插入了表達盒。也可以按圖1B所示構(gòu)建表達系統(tǒng)，其中反義和有義編碼DNA被放置在方向相反的不同鏈上以進行配對。該結(jié)構(gòu)可含有一段雙鏈DNA，所述DNA含有反義和有義RNA編碼鏈(編碼siRNA的DNA)，以及位于兩端的彼此相對放置的啟動子，從而由各條DNA鏈表達反義和有義RNA。此時，為了避免在有義和反義RNA的下游添加過量的序列，優(yōu)選在每條鏈(編碼反義和有義RNA的鏈)的3’末端放置終止子。終止子可以是4個或更多個連串腺嘌呤(A)核苷酸的序列。在該回文結(jié)構(gòu)表達系統(tǒng)中，優(yōu)選使用兩個不同的啟動子。對本文而言，在如圖1A所示的表達系統(tǒng)中，產(chǎn)生了兩端具有切斷結(jié)構(gòu)的siRNA。
另外，作為另一種可替換的能表達上述莖-環(huán)siRNA的結(jié)構(gòu)，也可以形成一種單位，其中反義和有義編碼DNA經(jīng)由接頭以相反方向被放置在相同DNA鏈上，再將所得單位連接至單個啟動子的下游。此時，表達的次序不必局限于“編碼反義RNA的DNA-＞接頭-＞編碼有義RNA的DNA”，也可以是“編碼有義RNA的DNA-＞接頭-＞編碼反義RNA的DNA”。由具有這種結(jié)構(gòu)的表達系統(tǒng)產(chǎn)生的RNA具有莖-環(huán)結(jié)構(gòu)，其中接頭部分形成環(huán)，其兩側(cè)的有義和反義RNA配對(莖結(jié)構(gòu))。然后，該回文結(jié)構(gòu)中的環(huán)部分被胞內(nèi)酶裂解，從而產(chǎn)生siRNA。在這種情況下，可如上文所述選擇莖部分的長度，接頭的長度和類型等。
在圖2所示的使用核酶的系統(tǒng)中，可將圖2B所示的系統(tǒng)插入載體，或?qū)D2C所示的兩個表達盒以相同方向或相反方向插入相同載體。也可在單個載體中包含能表達多個siRNA(針對不同靶基因mRNA的siRNA，針對相同靶基因mRNA的不同靶位點的siRNA，或針對相同靶基因mRNA的相同靶位點的siRNA)的系統(tǒng)。
通過在反義和有義編碼DNA的上游連接例如能表達短RNA的pol III啟動子以構(gòu)建反義和有義RNA表達盒，并將該表達盒導(dǎo)入不同載體，即可構(gòu)建出在不同載體中表達反義和有義RNA的系統(tǒng)。另外，通過將圖2C所示的兩個表達盒導(dǎo)入不同載體，可以構(gòu)建出使用核酶的表達系統(tǒng)。
必要時，也可以使載體進一步攜有能選擇出被載體轉(zhuǎn)染的細胞的序列，如選擇標記。選擇標記的例子包括如新霉素抗性基因、潮霉素抗性基因、嘌呤霉素抗性基因的藥物抗性標記；以酶活性為指示劑來選擇的標記，如半乳糖苷酶；以熒光發(fā)射為指示劑來選擇的標記，如GFP；以細胞表面抗原，如EGF受體、B7-2和CD4作為指示劑來選擇的標記等。選擇標記僅能選擇被載體轉(zhuǎn)染的細胞，即被siRNA表達系統(tǒng)轉(zhuǎn)染的細胞。因此，可以改善將外源siRNA片段常規(guī)轉(zhuǎn)運至細胞的低轉(zhuǎn)染效率，只有表達siRNA的細胞才能被濃縮。另外，使用載體可延長siRNA表達系統(tǒng)的維持時間。諸如逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的載體誘使系統(tǒng)整合至染色體中，從而使細胞中的siRNA表達系統(tǒng)能穩(wěn)定提供siRNA。
本發(fā)明涉及維持上述siRNA表達系統(tǒng)的細胞。被此siRNA表達系統(tǒng)轉(zhuǎn)導(dǎo)的細胞優(yōu)選為哺乳動物細胞，因為siRNA能在哺乳動物細胞中誘導(dǎo)RNAi，而在一般情況下難以誘導(dǎo)RNAi。另外，也優(yōu)選難以維持長-鏈dsRNA長期穩(wěn)定表達的細胞，如植物細胞作為被本發(fā)明的siRNA表達系統(tǒng)轉(zhuǎn)導(dǎo)的細胞。然而，本發(fā)明所用的上述細胞并不特別地限于哺乳動物和植物細胞，也可以是例如其它非哺乳類動物的細胞、酵母細胞、真菌細胞等。
可根據(jù)細胞任意選擇將上述siRNA表達系統(tǒng)導(dǎo)入上述細胞的方法。例如，為了轉(zhuǎn)導(dǎo)哺乳動物細胞，可選擇下述方法磷酸鈣法(Virology，Vol.52，p.456(1973))，電穿孔(Nucleic Acids Res.，Vol.15，p.1311(1987))，脂質(zhì)轉(zhuǎn)染法(J.Clin.Biochem.Nutr.，Vol.7，p.175(1989))，病毒感染-介導(dǎo)法(Sci.Am.，p.34，March(1994))，基因槍法等。可通過電穿孔法(Nature，Vol.319，p.791(1986))，聚乙二醇法(EMBO J.，Vol.3，p.2717(1984))，微粒槍法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，Vol.85，p.8502(1988))，農(nóng)桿菌-介導(dǎo)法(Nucleic Acids Res.，Vol.12，p8711(1984))等對植物細胞進行轉(zhuǎn)導(dǎo)。
通過已知技術(shù)可選擇被上述siRNA表達系統(tǒng)轉(zhuǎn)導(dǎo)的細胞，所述技術(shù)如使用特異于siRNA表達系統(tǒng)的DNA序列作為探針或引物的雜交和PCR。然而，當在含有選擇標記的載體中維持siRNA表達系統(tǒng)時，由于標記可用作指示劑，故可用表型進行選擇。
被siRNA表達系統(tǒng)轉(zhuǎn)導(dǎo)的細胞變成擊倒細胞，其中靶基因的表達被沉默。在本文中，“擊倒細胞”包括靶基因表達被完全抑制的細胞，以及靶基因表達未被完全抑制，只是有所降低的細胞。通過缺失或修飾靶基因或其調(diào)節(jié)區(qū)，可以常規(guī)產(chǎn)生擊倒細胞。與之形成對照的是，通過將本發(fā)明的siRNA表達系統(tǒng)導(dǎo)入細胞，并選擇轉(zhuǎn)導(dǎo)細胞，使用siRNA表達系統(tǒng)能簡單地產(chǎn)生靶基因表達受抑制的細胞，而無需對染色體上的靶基因進行任何修飾。本發(fā)明的擊倒細胞可用作研究工具，用于對靶基因進行功能分析，而作為靶基因的致病基因已沉默的細胞可用作疾病模型細胞等。另外，通過將上述siRNA表達系統(tǒng)導(dǎo)入生殖細胞，并由維持該系統(tǒng)的生殖細胞產(chǎn)生各個生物體，即可產(chǎn)生靶基因擊倒動物和疾病模型動物等。
對使用上述siRNA表達系統(tǒng)產(chǎn)生靶基因擊倒動物的方法沒有特別的限制，可以使用任何已知方法。例如，將siRNA表達載體注射至通過使F1雌性小鼠(如CBA/JxC57BL/6J)與雄性小鼠(如C57BL/6J)交配而獲得的受精卵內(nèi)。從由上述受精卵發(fā)育而成的小鼠的尾部獲得外周血DNA，使用表達載體的一部分作為探針，對所述DNA進行基因組Southern印跡分析，從而鑒定出染色體中整合有siRNA表達載體的陽性祖代動物。使上述祖代小鼠與C57BL/6J或F1(CBA/JxC57BL/6J)雜合小鼠重復(fù)回交以獲得它們的后代小鼠。然后，進行基因組Southern印跡和PCR分析以鑒定出基因重組為陽性的后代。
另外，盡管上文主要描述了將siRNA表達系統(tǒng)導(dǎo)入哺乳動物的情形，但該系統(tǒng)也可用于植物。由于細胞傳代過程中dsRNA的損失，將常規(guī)的雙鏈RNA直接導(dǎo)入植物細胞所誘導(dǎo)的RNAi難以維持RNAi作用。通過使用本發(fā)明的RNA表達系統(tǒng)將siRNA產(chǎn)生系統(tǒng)整合至植物細胞的染色體中，就可以在植物細胞中維持RNAi作用。也可以由這些細胞產(chǎn)生能穩(wěn)定維持RNAi作用的轉(zhuǎn)基因植物。通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法即可產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物。
本發(fā)明還涉及含有上述siRNA表達系統(tǒng)的組合物。由于本發(fā)明的siRNA表達系統(tǒng)能使用siRNA來抑制任何所需靶基因的表達，因此，該系統(tǒng)能使致病基因沉默?？蓪iRNA表達系統(tǒng)用作添加有適當載體的藥物組合物等。
本發(fā)明的另一個實施方案涉及細胞內(nèi)表達siRNA文庫的系統(tǒng)。本發(fā)明的“siRNA文庫”所表達的siRNA由含有以任意次序排列的腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶或尿嘧啶，并且與表達的siRNA等長的RNA鏈，或由與表達的siRNA等長的(隨機)cDNA或基因組DNA片段所編碼的RNA鏈組成。在本文中，如上所述的siRNA也被稱為“隨機siRNA”。即本文所用的“隨機siRNA”由任何序列，或由任何選自特定cDNA序列、特定cDNA文庫中所包含的序列或基因組序列的序列組成。上述siRNA表達系統(tǒng)能沉默特定靶基因的表達，同時，還可使用該實施方案的系統(tǒng)，通過表達siRNA文庫和沉默任意基因，例如功能和序列未知的基因來搜索新的功能基因。一例siRNA文庫表達系統(tǒng)具有圖1B所示結(jié)構(gòu)。該系統(tǒng)含有編碼雙鏈siRNA的DNA，其中編碼隨機反義RNA的DNA和與編碼有義RNA的DNA互補的DNA配對(下文稱之為“siRNA編碼DNA”)，還含有兩個彼此相對放置的啟動子，所述啟動子干預(yù)siRNA編碼DNA并能分開表達反義RNA或有義RNA。
除了含有任何序列，或任何選自特定cDNA序列、特定cDNA文庫中所包含的序列或基因組序列的序列外，上述“隨機siRNA”與上述siRNA表達系統(tǒng)相同，并且由鏈足夠短從而對哺乳動物細胞不顯示毒性的雙鏈RNA組成。據(jù)Tuschl等(文獻同上)報道，短鏈長度不限于21至23bp，還可以是例如15至49bp，優(yōu)選為15至35bp，更優(yōu)選為21至30bp，只要它不表現(xiàn)出毒性即可。另外，上述隨機siRNA的末端結(jié)構(gòu)可以是平端或粘端(突出端)，只要它們能通過RNAi作用沉默靶基因即可。另外，粘端(突出端)結(jié)構(gòu)不僅包括3’-突出端，還包括5’-突出端，只要它們能誘導(dǎo)上述RNAi效應(yīng)即可。另外，突出端核苷酸的數(shù)目不限于2或3，可以是能誘導(dǎo)RNAi效應(yīng)的任何數(shù)目，例如1至8個核苷酸，優(yōu)選為2至4個核苷酸。此外，如上所述，siRNA可在其一端的突出端含有低分子量RNA。另外，如上所述，由siRNA文庫表達系統(tǒng)表達的siRNA可在RNA配對的雙鏈RNA區(qū)域含有錯配或凸起，或兩種兼?zhèn)洹?br> 此外，siRNA文庫表達系統(tǒng)不限于上述結(jié)構(gòu)(具有兩個彼此相對放置、干預(yù)siRNA編碼DNA的啟動子)，還可具有能表達莖-環(huán)siRNA的結(jié)構(gòu)。即，本發(fā)明還包括這樣一種結(jié)構(gòu)，其中啟動子連接在單位(下文稱之為“莖-環(huán)siRNA文庫產(chǎn)生單位”)的上游，所述單位是通過用接頭DNA以相反方向連接編碼反義RNA的DNA(例如任何隨機序列，或任何選自特定cDNA序列、特定cDNA文庫中所包含的序列或基因組序列的序列)和編碼與上述反義RNA互補的有義RNA的DNA而形成的。圖18顯示了一例制備上述莖-環(huán)siRNA文庫產(chǎn)生單位的方法。即，使用DNA合成儀等合成單鏈DNA，其含有編碼具有隨機序列的反義RNA的DNA(反義編碼DNA)，在其3’末端還含有能形成任意回文結(jié)構(gòu)的序列。制備與該單鏈DNA的5’方向互補的引物，使引物與其退火以在單鏈DNA的3’末端形成回文結(jié)構(gòu)。使DNA聚合酶和DNA連接酶作用于該結(jié)構(gòu)以合成與反義編碼DNA互補的有義編碼DNA鏈，同時形成莖部分伸長的回文結(jié)構(gòu)。通過變性處理使該回文結(jié)構(gòu)成為單鏈，使用與反義編碼DNA和有義編碼DNA兩側(cè)序列互補的引物進行PCR，以產(chǎn)生含有莖-環(huán)siRNA文庫產(chǎn)生單位的雙鏈DNA。必要時，用限制性酶等修整含有莖-環(huán)siRNA文庫產(chǎn)生單位的雙鏈DNA的一條鏈，將如此獲得的雙鏈DNA連接至適當啟動子的下游以產(chǎn)生莖-環(huán)siRNA文庫表達系統(tǒng)。
由上述莖-環(huán)siRNA文庫表達系統(tǒng)產(chǎn)生莖-環(huán)siRNA。在如上所述的該莖-環(huán)siRNA中，所產(chǎn)生的雙鏈RNA部分(莖部分)的長度可以是例如15至49bp，優(yōu)選為15至35bp，更優(yōu)選為21至30bp。另外，對接頭的長度和序列沒有特別的限制，只要它們不會妨礙莖部分配對即可，可將低分子量RNA，如三葉草tRNA用作接頭。
上述“隨機反義編碼DNA”由任何序列組成，所述序列可任意選自例如由四個核苷酸“A，G，C和T”任意組合而形成的、與表達的siRNA等長的序列。或者，“隨機反義編碼DNA”由任何選自特定cDNA序列、特定cDNA文庫中所包含的序列或基因組序列的序列組成。本文可用的啟動子可以是pol II或pol III啟動子。優(yōu)選使用適于表達短RNA，如siRNA的pol III啟動子。另外，兩個啟動子可以相同或不同，考慮到表達效率，優(yōu)選啟動子是不同的啟動子。此時可以使用的pol II和pol III啟動子的例子與上文所述的相同。
另外，當使用pol III啟動子時，為了在表達互補的短RNA之后適當?shù)亟K止轉(zhuǎn)錄，優(yōu)選如圖1B所示，在啟動子和編碼siRNA的DNA之間提供終止子?？梢允褂萌鐖D1B所示的由4個或更多個連串腺嘌呤組成的序列，本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何終止子等。
當使用誘導(dǎo)型啟動子時，可在預(yù)定的時機表達siRNA文庫。因此，可以分析在生物體特定的發(fā)育/分化階段起作用的基因。另外，使用具有組織-特異性轉(zhuǎn)錄活性的啟動子能誘導(dǎo)siRNA的組織-特異性表達，從而能分析特定組織中的功能基因。此時可以使用的誘導(dǎo)型啟動子和組織-特異性啟動子與上文所述的相同。上述siRNA文庫表達系統(tǒng)可作為DNA插入物整合至細胞染色體中。為了有效導(dǎo)入細胞等，優(yōu)選在載體中維持siRNA文庫表達系統(tǒng)。本文可用的“載體”與上文所述的相同。也可通過將能夠表達多個siRNA的siRNA文庫表達系統(tǒng)導(dǎo)入單個載體，來改善篩選功能基因的效率。必要時，攜有siRNA文庫表達系統(tǒng)的載體可進一步含有選擇標記等。此時可用的選擇標記與上文所述的相同。因此，使用選擇標記能選擇出被攜有siRNA文庫表達系統(tǒng)的載體轉(zhuǎn)染的細胞，從而改善篩選功能基因的效率。
本發(fā)明siRNA表達系統(tǒng)的另一個實施方案是由多個siRNA表達載體集合而成的siRNA文庫表達系統(tǒng)，各個載體靶向含有編碼區(qū)和/或非-編碼區(qū)的基因序列。
也可以集中能表達不同siRNA的siRNA文庫表達系統(tǒng)并構(gòu)建集合。例如，可以構(gòu)建siRNA編碼DNA和莖-環(huán)siRNA文庫表達系統(tǒng)，以產(chǎn)生RNA鏈作為由此集合表達的siRNA，所述RNA鏈含有由四個核苷酸“A，G，C和U”任意組合而形成的、與表達的siRNA等長的序列。或者，siRNA編碼DNA可含有任何cDNA片段，或任何選自任何cDNA文庫中所包含的序列或基因組序列的序列。因此，使用含有多個siRNA文庫表達系統(tǒng)的集合能更有效地搜索功能基因。
可以使用上述隨機siRNA文庫表達系統(tǒng)或這些siRNA文庫表達系統(tǒng)的集合，通過下述步驟進行搜索功能基因的方法將siRNA文庫表達系統(tǒng)或上述siRNA文庫表達系統(tǒng)集合導(dǎo)入細胞，選擇被上述siRNA文庫表達系統(tǒng)或集合轉(zhuǎn)導(dǎo)的細胞，并分析如此選擇的細胞的表型。
如上所述，可根據(jù)細胞的類型來改變將siRNA文庫表達系統(tǒng)等導(dǎo)入細胞的方法。具體地說，將所述系統(tǒng)導(dǎo)入哺乳動物細胞的方法可選自磷酸鈣法(Virology，Vol.52，p.456(1973))、電穿孔法(Nucleic Acids Res.，Vol.15，p.1311(1987))、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染法(J.Clin.Biochem.Nutr.，Vol.7，p.175(1989))、病毒感染轉(zhuǎn)導(dǎo)法(Sci.Am.p.34，March(1994))、基因槍法等，而通過電穿孔法(Nature Vol.319，p.791(1986))、聚乙二醇法(EMBO J.Vol.3，p.2717(1984))、微粒槍法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA Vol.85，p.8502(1988))、農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法(NucleicAcids Res.Vol.12，p.8711(1984))等可將所述系統(tǒng)導(dǎo)入植物細胞。
當將siRNA文庫表達系統(tǒng)等導(dǎo)入攜有選擇標記的載體時，可通過收集具有選擇標記所致表型的細胞，來選擇被所述系統(tǒng)或集合轉(zhuǎn)導(dǎo)的細胞。當載體不含選擇標記時，可通過使用siRNA文庫表達系統(tǒng)所共有的特定序列為探針或引物，用已知的雜交方法、PCR等檢測轉(zhuǎn)導(dǎo)細胞以選擇出轉(zhuǎn)導(dǎo)細胞。
選擇出被上述siRNA文庫表達系統(tǒng)或集合轉(zhuǎn)導(dǎo)的細胞之后，通過比較轉(zhuǎn)導(dǎo)細胞與未被siRNA文庫表達系統(tǒng)或集合轉(zhuǎn)導(dǎo)的對照細胞的表型來分析轉(zhuǎn)導(dǎo)細胞的表型。這些表型不僅限于細胞表面表現(xiàn)出的表型，還包括例如細胞內(nèi)的變化等。
經(jīng)上述分析被認為具有表型變化的細胞可含有能沉默任何功能基因的siRNA文庫表達系統(tǒng)。因此，為了篩選功能基因，可基于編碼該細胞中所含siRNA的DNA序列構(gòu)建探針和引物，并將它們用于雜交或PCR以進行功能基因的克隆。也可基于編碼siRNA的DNA序列進行功能基因的數(shù)據(jù)庫檢索。
本發(fā)明siRNA表達系統(tǒng)的作用一般會根據(jù)靶基因的靶位點的位置而發(fā)生很大變化。例如，當靶向HIV時，siRNA有望通過靶向引發(fā)位點獲得高的基因沉默作用。甚至在優(yōu)選靶位點未知的情況下，本發(fā)明的siRNA文庫表達系統(tǒng)也是有效的。即，作為搜索被siRNA有效降解的mRNA最佳靶位點的系統(tǒng)，本發(fā)明的上述siRNA文庫表達系統(tǒng)十分有用。本發(fā)明提供了選擇高活性siRNA的方法，其包括下述步驟將本發(fā)明的siRNA文庫表達系統(tǒng)或所述siRNA文庫表達系統(tǒng)的集合導(dǎo)入細胞，并測定被siRNA文庫表達系統(tǒng)或其集合轉(zhuǎn)導(dǎo)的細胞中特定基因或蛋白質(zhì)的表達水平。通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法，如Northern印跡雜交或Western印跡雜交，可以容易地測定任何所需基因或蛋白質(zhì)的表達水平。
導(dǎo)入本發(fā)明的siRNA表達系統(tǒng)和siRNA文庫表達系統(tǒng)的細胞不特別地限于哺乳動物細胞，可以包括其它動物、植物、酵母、真菌等的細胞。
本發(fā)明的siRNA表達文庫可用于例如搜索與病毒感染相關(guān)的基因。將siRNA表達文庫導(dǎo)入細胞，用病毒感染該細胞，并檢查存活細胞，籍此可以容易地鑒定出與病毒感染相關(guān)的基因。使用含有人40,000個cDNA的siRNA表達文庫能夠鑒定出所有與病毒感染相關(guān)的基因。隨機化的siRNA表達文庫或基因組片段的siRNA表達文庫能鑒定出基因而不是cDNA?？梢月?lián)合使用這兩個文庫。


圖1描述了使用U6啟動子的siRNA表達系統(tǒng)以及利用該系統(tǒng)產(chǎn)生siRNA的方法。(A)顯示了siRNA的產(chǎn)生過程。兩個U6啟動子產(chǎn)生有義和反義短RNA，RNA的3’-末端添加有4個尿苷(U)。如此表達的有義和反義RNA退火形成具有4-核苷酸3’突出端的siRNA雙鏈體。(B)顯示了回文結(jié)構(gòu)型siRNA表達系統(tǒng)，其含有編碼siRNA的雙鏈DNA以及位于兩端的啟動子，所述DNA含有有義和反義編碼DNA，由所述啟動子起始表達有義和反義RNA。
圖2描述了一例使用核酶產(chǎn)生siRNA表達系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)。
圖3描述了當將針對EGFP的siRNA表達系統(tǒng)導(dǎo)入表達潮霉素/EGFP的細胞時，所述系統(tǒng)的EGFP基因沉默作用。左側(cè)的一組實驗(A，D，G和J)顯示了潮霉素/EGFP的表達；中間的一組實驗(B，E，H和K)顯示了DsRed的表達；右側(cè)的一組實驗(C，F(xiàn)，I和L)顯示了潮霉素/EGFP和DsRed合并表達的結(jié)果。
圖4描述了當將針對sea pansy(腎海鰓屬(Renilla))或螢火蟲螢光素酶的siRNA表達系統(tǒng)導(dǎo)入具有螢光素酶活性的HeLa S3細胞時，所述系統(tǒng)的基因沉默作用。在圖4a中，縱坐標值指的是基于腎海鰓螢光素酶活性歸一化的、導(dǎo)入了針對螢火蟲螢光素酶的siRNA表達系統(tǒng)的細胞的螢光素酶活性，或基于螢火蟲螢光素酶活性歸一化的、導(dǎo)入了針對腎海鰓螢光素酶的siRNA表達系統(tǒng)的細胞的螢光素酶活性。圖4b顯示了當在細胞中導(dǎo)入不同量的針對每種螢光素酶的siRNA表達系統(tǒng)時，siRNA表達系統(tǒng)對螢火蟲或腎海鰓螢光素酶活性的濃度-依賴型沉默作用。
圖5描述了使用一系列針對相同靶基因(螢火蟲螢光素酶)上的不同靶位點的siRNA或siRNA表達系統(tǒng)的基因沉默作用。圖5a顯示了當將針對不同靶位點的siRNA表達載體導(dǎo)入細胞時，所述載體的基因沉默作用。圖5b顯示了將不同濃度的針對不同靶位點的外源siRNA直接導(dǎo)入細胞時所獲得的結(jié)果。
圖6a描述了不同長度的siRNA 3’突出端的基因沉默作用。圖6b顯示了針對兩個靶基因或兩個靶位點的siRNA表達系統(tǒng)的基因沉默作用。在圖6b中，基于引入作為內(nèi)部對照的β-半乳糖苷酶活性歸一化螢光素酶活性的值。
圖7描述了siRNA表達系統(tǒng)沉默內(nèi)源性β-連環(huán)蛋白基因的能力。A，B和C實驗組是被針對β-連環(huán)蛋白(catenin)的siRNA表達載體(pHygEGFP/iβ-連環(huán)蛋白)轉(zhuǎn)導(dǎo)的組，而D，E和F實驗組是被空載體(pHygEGFP)轉(zhuǎn)導(dǎo)的組。用抗-β-連環(huán)蛋白的抗體染色所有的組。左側(cè)的實驗組(A和D)顯示了潮霉素/EGFP的表達；中間的實驗組(B和E)顯示了β-連環(huán)蛋白的表達；而右側(cè)的實驗組(C和F)顯示了這兩個表達的合并圖像。
圖8描述了串聯(lián)和莖-環(huán)siRNA之間RNAi作用的比較。siRNA表達載體pU6tandem19和pU6stem19分別是串聯(lián)和莖-環(huán)。Cont.表示對照(空白載體)。
圖9描述了多個siRNA表達載體的基因沉默作用。
圖10描述了含有得自巨細胞病毒的啟動子(CMV啟動子)和tRNA啟動子的siRNA表達載體的基因沉默作用。
圖11描述了含有錯配或凸起的雙鏈siRNA的RNAi誘導(dǎo)作用。
圖12圖解描述了Tet-ON系統(tǒng)的原理。當缺乏四環(huán)素時，四環(huán)素阻抑蛋白與U6啟動子結(jié)合，導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄被抑制，而當存在四環(huán)素時，四環(huán)素阻抑蛋白與四環(huán)素結(jié)合，從而從U6啟動子上釋放下來，轉(zhuǎn)錄得以起始。
圖13圖解描述了具有四環(huán)素-誘導(dǎo)型啟動子的siRNA表達載體的RNAi誘導(dǎo)作用。U6Teti表示在U6啟動子中含有四環(huán)素操縱序列的siRNA表達載體，U6i表示不含該序列的siRNA表達載體。
圖14圖示了含有修整核酶的RNA轉(zhuǎn)錄物中的自動裂解。
圖15圖示了修整核酶的自我-加工導(dǎo)致的siRNA產(chǎn)生。核苷酸裂解發(fā)生在黑箭頭所示的位置以產(chǎn)生siRNA。
圖16是顯示RNA自我-加工所導(dǎo)致的siRNA產(chǎn)生的電泳圖。箭頭表示對應(yīng)于21nt siRNA的條帶。
圖17圖示了一例使用Cre-lox系統(tǒng)控制siRNA表達的結(jié)構(gòu)。
圖18圖示了制備莖-環(huán)siRNA文庫表達系統(tǒng)的例子。
圖19圖示了制備siRNA文庫表達系統(tǒng)的例子。
①顯示了具有長度為19至29bp的去磷酸化平端的隨機DNA片段。
②表示在其兩端與5’-磷酸化發(fā)夾型DNA接頭1連接的隨機DNA片段①。
圖20是圖19的延續(xù)。
③顯示了Bst DNA聚合酶所致的自Nick位點起的鏈置換。
④表示與DNA接頭2連接的片段③。
圖21是圖20的延續(xù)。
⑤顯示了Bst DNA聚合酶所致的自Nick位點起的鏈置換。
⑥表示AscI對⑤的裂解。
圖22是圖21的延續(xù)。
⑦表示siRNA文庫表達預(yù)-文庫。
⑧顯示了BspMI對siRNA文庫表達預(yù)-文庫的裂解。
當在有義和反義編碼DNA之間插入環(huán)序列TTCG時，裂解進行至圖23的步驟⑧-2。
⑨表示通過用Klenow片段平端化，除去DNA接頭1并進行自身-連接而獲得的已完成的siRNA文庫表達系統(tǒng)。
圖23是圖22的延續(xù)。
⑧-2表示在⑧中的有義和反義編碼DNA之間插入環(huán)序列TTCG的情況。用BsgI裂解siRNA文庫表達預(yù)-文庫。
⑧-3顯示了用BspMI裂解siRNA文庫表達預(yù)-文庫。BsgI的裂解位點不會被BspMI進攻。
⑨-2表示通過用T4 DNA聚合酶平端化，除去DNA接頭1并進行自身-連接而獲得的已完成的siRNA文庫表達系統(tǒng)。
圖24圖示了約20至25bp長的EGFP cDNA片段的制備。具有去磷酸化平端、約20至25bp長的隨機EGFP cDNA片段終產(chǎn)物可用作圖19①中的隨機DNA片段。
圖25圖示了克隆載體的制備。啟動子是人U6啟動子或人tRNA啟動子。使用BspMI和Klenow制備含有U6啟動子的克隆載體，使用BseRI和T4DNA聚合酶制備含有tRNA啟動子的克隆載體。
圖26為顯微圖，顯示了用共聚焦顯微鏡觀察EGFP熒光強度的結(jié)果。
圖27圖示了轉(zhuǎn)染后24和48小時測定的pUC18、U6 GFP25 siRNAlib-loop-、U6 GFP25 siRNA lib TTCG、tRNA GFP25 siRNA lib loop-和tRNAGFP25 siRNA lib TTCG中的相對EGFP熒光強度。
圖28圖示了含有兩個loxP的莖-環(huán)siRNA表達系統(tǒng)，所述loxP能干預(yù)含有終止序列的接頭部分。
圖29圖示了siRNA表達腺病毒載體的基因沉默作用。
圖30圖示了siRNA表達HIV載體的基因沉默作用。
圖31圖示了siRNA表達啞鈴-型載體的基因沉默作用。
圖32圖示了在siRNA的雙鏈RNA區(qū)域含有錯配或凸起的siRNA表達系統(tǒng)的基因沉默作用。每個序列前方括號中的數(shù)字表示SEQ ID NO。
實施本發(fā)明的最佳模式[實施例1]使用siRNA表達載體誘導(dǎo)RNAi檢測siRNA表達載體是否能沉默編碼外源性潮霉素/EGFP融合蛋白的靶基因。
潮霉素/EGFP表達載體(pHygEGFP)和內(nèi)部對照DsRed表達載體(pDsRed2)購自Clontech。使用攜有人U6啟動子的質(zhì)粒pU6(Ohkawa，J.& Taira，K.Control of the functional activity of an antisense RNA by a tetracycline-responsivederivative of the human U6 snRNA promoter.Hum Gene Ther.11，577-585(2000))構(gòu)建siRNA表達載體。用DNA合成儀合成含有編碼潮霉素/EGFP有義和反義RNA部分的DNA的片段，將所述片段直接亞克隆至pU6中U6啟動子的下游。為了將這些合成片段插2pU6中U6啟動子的下游，在亞克隆所用載體的U6啟動子下游提供一個BspMI識別位點，在更下游的位置再提供一個BspMI位點。用BspMI裂解之后，形成4-核苷酸粘端。通過插入末端與所述粘端互補的合成有義編碼DNA，構(gòu)建出能表達有義RNA的載體。
按照類似的方法合成編碼反義RNA的DNA(19個核苷酸)，并直接亞克隆至pU6中U6啟動子的下游。
從載體上切下含有U6啟動子的反義RNA表達盒，插入含有有義RNA表達盒的pU6載體以構(gòu)建siRNA表達載體(pU6iHyg/EGFP)。在本文中，由于據(jù)報道在使用U6啟動子時，在表達的mRNA的3’-末端添加有4個尿苷(U)，由siRNA表達載體表達并在細胞內(nèi)形成的siRNA在兩個3’-末端都具有4個核苷酸的突出端。即，該siRNA表達載體表達23個核苷酸長的siRNA，所述siRNA具有19個核苷酸的雙鏈體，并在其兩個3’末端具有4-核苷酸突出端(圖1A)。
通過脂質(zhì)轉(zhuǎn)染法(使用Lipofectamine 2000)，用上述pHygEGFP(1g)、pDsRed2(0.5g)和pU6iHyg/EGFP(1g)共轉(zhuǎn)染人HeLa S3細胞。轉(zhuǎn)染后48小時，將細胞置于37℃，在聚焦顯微鏡下觀察。作為對照實驗，使用pU6替代siRNA表達載體進行類似操作。
在圖3中，上方的實驗組描述了使用pU6的對照實驗的結(jié)果，而下方的實驗組顯示出導(dǎo)入pU6iHyg/EGFP所獲得的結(jié)果。如圖3中間一欄所示，在被作為內(nèi)部對照的、能發(fā)射紅色熒光的pDsRed轉(zhuǎn)導(dǎo)的細胞中，對照和pU6iHyg/EGFP-轉(zhuǎn)導(dǎo)組之間的熒光強度沒有顯著差異，表明這兩個實驗組之間的載體轉(zhuǎn)移效率沒有差別，而且，siRNA表達載體對基因表達沒有表現(xiàn)出非-特異性的基因沉默作用。另一方面，如圖3左邊一欄所示，因pHygEGFP而發(fā)射綠色熒光的細胞數(shù)目減少，而與對照組相比，在pU6iHyg/EGFP-轉(zhuǎn)導(dǎo)組中，綠色熒光細胞的熒光強度也有所降低。類似地，如圖3右邊一欄所示，甚至當紅色和綠色熒光合并時，與對照相比，在siRNA表達載體-轉(zhuǎn)導(dǎo)細胞中，綠色-熒光細胞以及因紅色和綠色合并所致的黃色熒光細胞的數(shù)目也有所減少。這些結(jié)果證實導(dǎo)入siRNA表達載體能誘導(dǎo)RNAi，導(dǎo)致靶基因沉默。另外，使用小鼠COS7細胞進行類似分析的結(jié)果顯示pDsRed的表達一點也不受影響，而pHygEGFP的表達被特異性沉默(未顯示)。
定量測定siRNA表達載體的基因沉默活性為了定量測定RNAi作用，按下述分析針對螢火蟲和腎海鰓螢光素酶基因(作為另一報道基因)的siRNA的基因表達沉默活性。
在添加有10％胎牛血清的Dulbecco改進的Eagle培養(yǎng)基中培養(yǎng)HeLa S3和COS7細胞。將各自的經(jīng)培養(yǎng)細胞(3×104個細胞/孔)置于48-孔培養(yǎng)板的每個孔中。為了進行螢光素酶報道基因分析，通過使用Lipofectamine 2000(LifeTechnologies)的脂質(zhì)轉(zhuǎn)染法，用RSV-腎海鰓螢光素酶表達載體(pRL-RSV)15(30ng)、螢火蟲螢光素酶表達載體pGL3(Promega)(30ng)和不同量的針對螢火蟲或腎海鰓螢光素酶轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的siRNA表達載體共轉(zhuǎn)染每個孔中的細胞。
圖4顯示了HeLa S3細胞中的螢光素酶分析結(jié)果。圖4A表示導(dǎo)入固定量(300ng)的siRNA表達載體所獲得的結(jié)果，表明導(dǎo)入siRNA可以沉默相應(yīng)的靶基因表達。另外，在用僅表達有義或反義RNA的質(zhì)粒進行的螢光素酶活性分析中，兩種質(zhì)粒對螢火蟲和腎海鰓螢光素酶的表達一點也不起作用。圖4B顯示了導(dǎo)入不同量siRNA所獲得的結(jié)果。針對螢火蟲螢光素酶基因的siRNA表達載體劑量-依賴型地降低螢火蟲螢光素酶的活性，而不會影響腎海鰓螢光素酶的活性。另一方面，在用針對腎海鰓螢光素酶基因的siRNA表達載體轉(zhuǎn)染的細胞中，腎海鰓螢光素酶的活性呈劑量-依賴型降低。這些結(jié)果清楚地表明使用U6啟動子的siRNA表達系統(tǒng)能特異性地、有效地沉默靶基因。
靶位點-依賴型基因沉默接著，檢測針對相同轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中的不同靶位點的siRNA表達載體是否具有不同的基因沉默作用。在此分析中，在類似于實施例2的條件下，將針對螢火蟲螢光素酶轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物上的4個不同靶位點的各個siRNA表達載體，以及用作內(nèi)部對照的螢火蟲螢光素酶表達載體和腎海鰓螢光素酶表達載體一起共轉(zhuǎn)染至HeLa S3細胞。針對4個不同靶位點的siRNA表達載體中的有義和反義編碼DNA的序列如下所示螢火蟲螢光素酶位點O有義鏈5’-GCTATGAAACGATATGGGC-3’(SEQID NO1)；位點O反義鏈5’-GCCCATATCGTTTCATAGC-3’(SEQ ID NO2)；位點A有義鏈5’-GTTCGTCACATCTCATCTAC-3’(SEQ ID NO3)；位點A反義鏈5’-GTAGATGAGATGTGACGAA-3’(SEQ ID NO4)；位點B有義鏈5’-GTGCGCTGCTGGTGCCAAC-3’(SEQ ID NO5)；位點B反義鏈5’-GTTGGCACCAGCAGCGCAC-3’(SEQ ID NO6)；位點C有義鏈5’-ATGTACACGTTCGTCACAT-3’(SEQ ID NO7)；位點C反義鏈5’-ATGTGACGAACGTGTACAT-3’(SEQ ID NO8)；對照腎海鰓螢光素酶(具有核苷酸突出端的有義鏈)5’-GTAGCGCGGTGTATTATAC-3’(SEQ ID NO9)；
(具有核苷酸突出端的反義鏈)5’-GTATAATACACCGCGCTAC-3’(SEQ ID NO10)。
如圖5A所示，根據(jù)靶位點的不同，螢光素酶基因沉默活性也有所不同。即，針對位點B的siRNA表達載體的基因沉默活性最高，使得螢火蟲螢光素酶活性降低至對照的14％。針對位點A、C和D的siRNA表達載體使酶表達水平分別降低至對照的44％、38％和36％。此時，針對位點O的siRNA表達載體與兩個對照表達載體Hyg-U6siRNA和pU6類似，未顯示出基因表達沉默活性。
還檢測了上述取決于靶位點的基因沉默活性差異是僅由靶位點的差異導(dǎo)致的，還是由各個siRNA轉(zhuǎn)錄效率的差異所引起的。為了進行檢測，分別合成上述有義和反義RNA寡核苷酸。這些siRNA寡核苷酸的序列如下螢火蟲螢光素酶位點O有義鏈5’-GCUAUGAAACGAUAUGGGCUU-3’(SEQ ID NO11)；位點O反義鏈5’-GCCCAUAUCGUUUCAUAGCUU-3’(SEQ ID NO12)；位點A有義鏈5’-GUUCGUCACAUCUCAUCUACUU-3’(SEQ IDNO13)；位點A反義鏈5’-GUAGAUGAGAUGUGACGAAUU-3’(SEQ ID NO14)；位點B有義鏈5’-GUGCGCUGCUGGUGCCAACUU-3’(SEQ ID NO15)；位點B反義鏈5’-GUUGGCACCAGCAGCGCACUU-3’(SEQ ID NO16)；位點N有義鏈5’-AUGUACACGUUCGUCACAUUU-3’(SEQ ID NO17)；位點N反義鏈5’-AUGUGACGAACGUGUACAUUU-3’(SEQ ID NO18)；對照腎海鰓螢光素酶(具有核苷酸突出端的有義鏈)5’-GUAGCGCGGUGUAUUAUACUU-3’(SEQ ID NO19)；(具有核苷酸突出端的反義鏈)5’-GUAUAAUACACCGCGCUACUU-3’(SEQ ID NO20)。
使用394型RNA合成儀(Applied Biosystems)合成上述RNA寡核苷酸。使合成的RNA脫保護，通過變性的丙烯酰胺凝膠電泳進行純化。從凝膠中洗脫之后，將各個RNA級分上樣于NAP-10柱(Pharmacia)，用不含核糖核酸酶的水洗脫以脫鹽。真空干燥所得洗脫物，并重新懸浮于退火緩沖液(pH6.8的磷酸-緩沖生理鹽水(PBS)，2mM MgCl2)。然后，為了退火RNA寡核苷酸，制備10μM RNA，95℃保溫1分鐘，然后冷卻至70℃，再在2小時內(nèi)緩慢冷卻至4℃。按照與上文所述類似的方法，將所得siRNA寡核苷酸導(dǎo)入HeLa S3細胞以檢測螢光素酶活性(圖5B)。
除了針對位點O的siRNA寡核苷酸表現(xiàn)出的微弱基因沉默活性外，由針對各個靶位點的siRNA寡核苷酸所致的螢光素酶基因沉默分布圖表現(xiàn)出的模式類似于導(dǎo)入1和0.1nM siRNA表達載體時所獲得的相應(yīng)模式。這些結(jié)果表明基因沉默活性的差異不是由每個siRNA表達效率的差異引起的，而是取決于靶位點(如它們的二級結(jié)構(gòu))的差異和RNA結(jié)合蛋白的存在。
siRNA 3’突出端長度的影響U6啟動子產(chǎn)生的siRNA的3’-末端具有4個尿苷核苷酸突出端。另一方面，據(jù)Elbashir等報道，在使用果蠅(Drosphila)的體外實驗中，當3’突出端長于2至3個核苷酸時，siRNA的基因沉默效率會降低(Elbashir，S.M.，Lendeckel，W.& Tuschl，T.RNA interference is mediated by 21-and 22-nucleotide RNAs.Genes Dev.15，188-200(2001))。因此，我們檢查了上述siRNA的4-核苷酸3’突出端是否會影響siRNA誘導(dǎo)RNAi的效率。通過類似于上述實施例3的化學合成制備針對上述腎海鰓螢光素酶轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物上的相同靶位點的siRNA寡核苷酸，所述siRNA寡核苷酸具有3’突出端，該突出端的尿苷核苷酸數(shù)目被設(shè)置為2，3或4。通過脂質(zhì)轉(zhuǎn)染法，將這些針對腎海鰓螢光素酶轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的siRNA寡核苷酸，以及作為內(nèi)部對照的螢火蟲螢光素酶表達載體以不同的濃度導(dǎo)入HeLa S3細胞以檢測螢光素酶活性(圖6A)。
僅用上述內(nèi)部對照不能沉默腎海鰓螢光素酶的表達，但在被上述siRNA寡核苷酸轉(zhuǎn)導(dǎo)的細胞組中，所述表達受到劑量-依賴型抑制。另外，據(jù)觀察，3’突出端的長度由2個核苷酸變?yōu)?個核苷酸，基因沉默活性沒有顯著差異，籍此揭示出由U6啟動子產(chǎn)生的、具有4-核苷酸3’突出端的siRNA也能象具有2-或3-核苷酸突出端的siRNA一樣，有效地沉默靶基因的表達。
多個基因的同時沉默我們檢查了當同時表達兩個包含靶基因的不同基因時，siRNA是否能同時沉默不同的靶基因。構(gòu)建含有兩個針對螢火蟲和腎海鰓螢光素酶的siRNA表達盒的質(zhì)粒，將所述質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至細胞。
將螢火蟲螢光素酶表達載體(30ng)、腎海鰓螢光素酶表達載體(30ng)、表達針對這兩種螢光素酶轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的siRNA的載體(300ng)，連同作為內(nèi)部對照的表達β-半乳糖苷酶的載體(100ng)一起共轉(zhuǎn)染至HeLa S3細胞。作為對照，使用表達針對螢火蟲和腎海鰓螢光素酶轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中的任一種的siRNA的載體進行類似實驗。
如圖6B所示，與導(dǎo)入針對任一種螢光素酶的siRNA表達載體(U6i-Renilla或U6i-Firefly)時的結(jié)果相同，用針對兩種螢光素酶的siRNA表達載體(U6i-Firefly/Renilla)轉(zhuǎn)染能同時將螢火蟲和腎海鰓螢光素酶的表達沉默至相同水平。
如上所述，已闡明通過將多個siRNA表達盒放置在相同質(zhì)粒中以同時表達多個siRNA，可以沉默相應(yīng)的靶基因，而不會在各個啟動子中產(chǎn)生干擾。
內(nèi)源性基因沉默上述所有實施例涉及沉默導(dǎo)入細胞中的外源性基因。在此實驗中，檢查了siRNA表達載體是否能沉默內(nèi)源性基因表達。
將編碼β-連環(huán)蛋白的內(nèi)源性基因選作靶。β-連環(huán)蛋白是束縛于膜上的胞質(zhì)蛋白，已知它是與細胞間粘著中的鈣粘著蛋白相關(guān)的因子，它也是一種重要的癌基因(Peifer，M.& Polakis，P.Wnt signaling in oncogenesis andembryogenesis-a look outside the nucleus.Science 287，1606-1609(2000))。
將含有針對β-連環(huán)蛋白的siRNA表達盒的EGFP表達質(zhì)粒(pEGFP/iβ-連環(huán)蛋白)導(dǎo)入表達β-連環(huán)蛋白的SW480細胞。作為對照，按照類似方法，將不含針對β-連環(huán)蛋白的siRNA表達盒的EGFP表達質(zhì)粒(pEGFP)導(dǎo)入60％鋪滿的細胞。使用如Effectene(Qiagen)或Fugene 6(Roche Molecular Biochemicals)的試劑，將這些質(zhì)粒導(dǎo)入固定于載玻片上的細胞。轉(zhuǎn)導(dǎo)48小時之后，在含有4％低聚甲醛的PBS中固定細胞20分鐘，在0.1％Triton X100中滲透細胞，然后用抗-β-連環(huán)蛋白抗體(UBI)和Cy3-標記的第二抗體對細胞進行染色。使用聚焦顯微鏡分析染色后的細胞熒光(圖7)。
結(jié)果表明與不用質(zhì)粒轉(zhuǎn)導(dǎo)的細胞相比，含有pEGFP/iβ-連環(huán)蛋白的綠色熒光細胞中的β-連環(huán)蛋白表達水平要低得多。另外，在用pEGFP轉(zhuǎn)導(dǎo)的綠色熒光細胞和不用質(zhì)粒轉(zhuǎn)導(dǎo)的細胞中，β-連環(huán)蛋白的表達水平?jīng)]有差別。
比較串聯(lián)和莖-環(huán)siRNA表達載體之間的基因沉默作用本實施例檢查了siRNA表達載體pU6tandem19和siRNA表達載體pU6stem19的基因沉默作用，在前一載體中，編碼有義和反義RNA的DNA被串聯(lián)放置，而后一載體能表達莖環(huán)RNA分子。將上述各個載體表達的siRNA稱為串聯(lián)siRNA和莖-環(huán)siRNA。pU6stem19中轉(zhuǎn)錄的莖-環(huán)siRNA的序列是5’-GTGCGCTGCTGGTGCCAACgugugcuguccGTTGGCACCAGCAGCGCAC-3′(SEQ ID NO21)。通過上述實施例中所述的螢光素酶分析定量測定基因沉默活性。
結(jié)果示于圖8。串聯(lián)和莖-環(huán)siRNA皆能濃度-依賴型地降低螢光素酶活性。這些結(jié)果表明串聯(lián)和莖-環(huán)siRNA表達系統(tǒng)都能有效抑制靶基因的表達。
多種siRNA表達載體的基因沉默作用本實施例檢查了含有多種啟動子的siRNA表達載體的基因沉默作用。在與上述實施例類似的條件下進行螢光素酶分析。使用了下述siRNA表達載體。
●通過人U6啟動子表達串聯(lián)siRNA的載體(pU6tandem19)，●通過人5S rRNA啟動子表達串聯(lián)siRNA的載體(p5Standem19)，●通過人H1啟動子表達串聯(lián)siRNA的載體(pH1tandem19)，和●通過人H1啟動子表達莖-環(huán)siRNA的載體(pH1stem19)。
如圖9所示，本文所用的多種表達載體顯示出螢光素酶抑制活性，這表明siRNA表達載體中可用的啟動子不限于特定的啟動子，可以使用多種啟動子，如人U6啟動子，人5S rRNA啟動子和人H1啟動子。
含有CMV啟動子或tRNA啟動子的siRNA表達載體的基因沉默作用本實施例檢查了含有得自巨細胞病毒的啟動子(CMV啟動子)或tRNA啟動子和修整核酶的siRNA表達載體(分別為pCMV-TRz和ptRNA-TRz)的基因沉默作用。tRNA啟動子轉(zhuǎn)錄物的5’末端添加有tRNA分子。通過修整核酶的作用切下非形成siRNA所必需的3’末端過量RNA分子。
如圖10所示，含有CMV啟動子或tRNA啟動子的siRNA表達載體都能降低螢光素酶活性，這表明優(yōu)選使用CMV啟動子或tRNA啟動子作為本發(fā)明siRNA表達載體中的啟動子，甚至連與諸如5’末端tRNA的分子結(jié)合的表達載體轉(zhuǎn)錄物都具有靶基因沉默作用。
通過含有錯配或凸起的雙鏈siRNA誘導(dǎo)RNAi本實施例檢查了雙鏈siRNA中錯配或凸起的存在對RNAi的作用。在與上述實施例類似的條件下進行螢光素酶分析。實驗中使用了下述RNA序列。
●對照RNA序列5′-GUGCGCUGCUGGUGCCAACCCgugugcuguccGGGUUGGCACCAGCAGCGCAC-3′(SEQ ID NO22)●含有錯配的RNA序列5′-GUGCGCUGuUGGUGuCAACCCgugugcuguccGGGUUGGCACCAGCAGCGCAC-3′(SEQ ID NO23)●含有凸起的RNA序列5′-GUGCGCUGCUGGUGCuCAACCCgugugcuguccGGGUUGGCACCAGCAGCGCAC-3′(SEQ ID NO24)如圖11所示，本文所用的多個表達載體顯示出螢光素酶抑制活性。雙鏈siRNA中錯配或凸起的存在或缺失不會使基因沉默作用產(chǎn)生顯著差異。
另外，本實施例還檢查了多種含有錯配或凸起的siRNA所誘導(dǎo)的RNAi作用。圖32顯示了編碼一條siRNA鏈的DNA序列和由該序列誘導(dǎo)的RNAi作用(螢光素酶活性)。
這些結(jié)果表明甚至連在其雙鏈中含有錯配或凸起的siRNA都能有效抑制靶基因的表達。即，構(gòu)成siRNA雙鏈的每條鏈不必彼此完全互補。
具有四環(huán)素-誘導(dǎo)型啟動子的siRNA表達載體誘導(dǎo)的RNAi能通過四環(huán)素控制RNA啟動子轉(zhuǎn)錄活性的系統(tǒng)(Tet-ON系統(tǒng))是已知的(Ohkawa，J.& Taira，K.Control of the functional activity of an antisense RNA bya tetracycline-responsive derivative of the human U6 snRNA promoter.HumGene Ther.11，577-585(2000))。已將四環(huán)素-抗性轉(zhuǎn)座子的四環(huán)素操縱序列插入該系統(tǒng)所用的人U6啟動子(圖12)。四環(huán)素阻抑蛋白與該序列的結(jié)合導(dǎo)致啟動子活性受抑制。在表達四環(huán)素阻抑蛋白的細胞(HeLa細胞)中，由該啟動子控制轉(zhuǎn)錄的表達載體處于轉(zhuǎn)錄活性受抑制的狀態(tài)?？赡艿脑蚴羌毎械乃沫h(huán)素阻抑蛋白與人U6啟動子結(jié)合，從而抑制轉(zhuǎn)錄活性。當在細胞中添加四環(huán)素(或四環(huán)素衍生物)時，它與四環(huán)素阻抑蛋白結(jié)合以從U6啟動子上釋放出阻抑蛋白，從而導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄激活。
本發(fā)明人構(gòu)建了具有人U6啟動子的siRNA表達載體，所述啟動子中插入了四環(huán)素抗性轉(zhuǎn)座子的四環(huán)素操縱序列，并且使用TetON系統(tǒng)檢查siRNA表達載體的基因沉默作用。在與上述實施例類似的條件下進行螢光素酶分析。
如圖13所示，通過加入四環(huán)素，含有人U6啟動子的siRNA表達載體能降低螢光素酶活性，其中所述啟動子插入了四環(huán)素抗性轉(zhuǎn)座子的四環(huán)素操縱序列。另一方面，不管加還是不加四環(huán)素，不含四環(huán)素操縱序列的siRNA表達載體都能降低螢光素酶活性。這些結(jié)果表明優(yōu)選使用上述四環(huán)素誘導(dǎo)型U6啟動子作為誘導(dǎo)siRNA表達的啟動子。
通過RNA自我-加工產(chǎn)生siRNA在siRNA表達載體中使用pol II啟動子導(dǎo)致稍長RNA的轉(zhuǎn)錄。因此，當使用pol II啟動子時，必需通過例如自我-加工裂解該RNA以產(chǎn)生反義RNA或有義RNA。不管是否實際發(fā)生了自我-加工，都使用含有反義編碼DNA或有義編碼DNA的RNA產(chǎn)生單位(圖2)檢查編碼其5’和3’末端被核酶所識別的RNA序列的區(qū)域(識別序列編碼區(qū))，以及側(cè)翼于該識別序列編碼區(qū)外側(cè)的、編碼裂解識別序列編碼區(qū)的5’和3’末端裂解核酶的區(qū)域。圖14和15圖示了RNA自我-加工。對上述單位的轉(zhuǎn)錄物進行凝膠電泳。
凝膠電泳的結(jié)果示于圖16。在圖16中電泳條帶的左側(cè)，圖示了對應(yīng)于各條帶的RNA分子的推定結(jié)構(gòu)。觀察到幾條對應(yīng)于不同長度RNA的帶，據(jù)認為它們是由RNA自我-加工產(chǎn)生的。還觀察到21個核苷酸長的siRNA帶。這些結(jié)果表明使用如圖2所示的RNA產(chǎn)生單位，因RNA自我-加工作用，導(dǎo)致能有效產(chǎn)生siRNA。
制備靶向EGFP mRNA的siRNA文庫表達系統(tǒng)制備靶向EGFP mRNA隨機位點的siRNA文庫表達系統(tǒng)。圖19至23顯示了制備的概要。
(a)制備約20至25bp EGFP cDNA片段按下述制備“約20至25bp具有去磷酸化平端的隨機EGFP cDNA片段”，所述片段是制備圖19-①所示siRNA表達文庫的起始物質(zhì)。圖24顯示了制備過程的概要。
通過PCR由pEGFP-N1擴增EGFP編碼區(qū)，通過用DNase I處理擴增產(chǎn)物獲得約20至25bp隨機EGFP cDNA片段。為了大規(guī)模制備片段，用Klenow片段使所得片段成為平端，并亞克隆至通過修飾pUC18而構(gòu)建的pSwaI載體。該載體在克隆位點(SwaI識別位點)的上游和下游區(qū)域含有限制性酶BseRI的識別位點，以通過BseRI切下DNA插入物。
用BseRI切下所亞克隆的約20至25bp EGFP cDNA片段。用T4 DNA聚合酶使得經(jīng)BseRI裂解后形成的兩個核苷酸過度粘端成為平端，然后通過CIAP處理使兩端去磷酸化。上述方法產(chǎn)生了大量具有去磷酸化平端的約20至25bp隨機EGFP cDNA片段。
(b)合成具有靶向EGFP mRNA的siRNA的有義編碼DNA和反義編碼DNA的DNA片段將5’-磷酸化發(fā)夾接頭1連接至(a)中制備的“約20至25bp具有去磷酸化平端的EGFP cDNA片段”兩端(圖19-②)。該發(fā)夾接頭含有II型限制性酶BspMI和BsgI的識別位點，使得它們可在連接位點或其附近被裂解。通過使Bst DNA聚合酶與具有發(fā)夾接頭的約20至25bp cDNA片段連接產(chǎn)物的連接位點中存在的Nick位點反應(yīng)，以進行鏈置換反應(yīng)。因此合成了DNA產(chǎn)物，其中約20至25bp EGFP cDNA片段與發(fā)夾接頭以1∶1的比例相互連接(圖20-③)。接著，在該產(chǎn)物的平端側(cè)(EGFP cDNA片段側(cè))連接5’-末端磷酸化DNA接頭2(圖20-④)。該DNA接頭的一個末端存在AAAAA/TTTTT序列，傳遞著終止pol III啟動子轉(zhuǎn)錄的信號，而另一端存在AscI識別位點。僅有AAAAA/TTTTT側(cè)是5’-磷酸化的。
將EGFP cDNA、接頭1和接頭2的連接產(chǎn)物再次與Bst DNA聚合酶反應(yīng)，以進行自連接位點處的Nick位點起的鏈置換反應(yīng)(圖21-⑤)。因此合成了DNA片段，其中編碼siRNA的有義和反義RNA的DNA被串聯(lián)放置，所述siRNA靶向EGFP mRNA。在此片段中，有義編碼DNA和反義編碼DNA之間存在II型限制性酶BspMI和BsgI的識別位點。
(c)克隆具有編碼靶向EGFP mRNA的siRNA的有義和反義RNA的DNA的DNA片段用AscI裂解(b)中合成的、具有編碼靶向EGFP mRNA的siRNA的有義和反義RNA的DNA的DNA片段，以制備具有粘端和平端的DNA片段(圖21-⑥)。為了克隆該片段，構(gòu)建含有人U6啟動子的克隆載體(圖25)。該啟動子的下游存在限制性酶BspMI、BseRI和AscI的識別位點。用BspMI在緊靠啟動子下游的位置裂解之后，用Klenow使裂解位點成為平端，用AscI裂解產(chǎn)物以制備具有粘端和平端的克隆載體。將該載體與具有平端和粘端的DNA片段連接，所述片段具有編碼靶向EGFP mRNA的siRNA的有義和反義RNA的DNA，然后進行克隆(抗-EGFP U6 siRNA表達預(yù)-文庫)(圖22-⑦)。
還構(gòu)建了含有人tRNA-val啟動子的克隆載體(圖25)。人tRNA-val啟動子的下游也類似地存在著限制性酶BspMI、BseRI和AscI的識別位點。通過用BseRI替代BspMI進行裂解來制備該克隆載體。用BseRI在緊靠啟動子下游的位置裂解載體，用T4 DNA聚合酶使裂解位點成為平端，然后用AscI裂解產(chǎn)物，并按類似的方法進行克隆(抗-EGFP tRNA siRNA預(yù)-文庫)。
在siRNA有義和反義編碼DNA之間的BspMI位點裂解siRNA表達預(yù)-文庫質(zhì)粒DNA(圖22-⑧)。用Klenow使裂解片段成為平端并自身-連接以構(gòu)建抗-EGFP siRNA表達文庫，其中啟動子、反義DNA、有義DNA和TTTTT串聯(lián)連接(圖22-⑨)。序列分析證實產(chǎn)生了合乎需要的產(chǎn)物。表1顯示了抗-EGFP U6siRNA表達文庫中編碼siRNA的DNA序列的例子。
表15’-U6啟動子-(反義編碼DNA)(無環(huán))(有義編碼DNA)TTTTTAscI-3’

在表1中，有些情況下反義密碼和有義密碼的方向可以與EGFP mRNA中的相反，這不會影響RNAi誘導(dǎo)。
通過先用BsgI再用BspMI裂解預(yù)-文庫質(zhì)粒DNA(圖23-⑧-2)，用T4 DNA聚合酶使裂解位點成為平端，然后進行自身-連接，構(gòu)建出在反義和有義DNA之間具有siRNA環(huán)序列TTCG的siRNA表達文庫。通過改變發(fā)夾接頭1的序列以及限制性酶的類型和位點，可以隨意改變反義和有義編碼DNA之間的環(huán)序列，并添加啟動子片段、選擇標記等。
評價靶向EGFP mRNA的siRNA文庫表達系統(tǒng)通過脂質(zhì)轉(zhuǎn)染法(Lipofectamine 2000)，將上述抗-EGFP U6 siRNA表達文庫(1g)和pEGFP-N1(0.01g)共轉(zhuǎn)染至人HeLa S3細胞。將細胞置于37℃放48小時，然后在共聚焦顯微鏡下進行觀察。作為對照實驗，使用pUC18(1g)替代siRNA文庫表達系統(tǒng)進行類似的操作。
如圖26所示，與對照組(pUC18-導(dǎo)入組)相比，在用抗-EGFP U6 siRNA文庫表達系統(tǒng)轉(zhuǎn)導(dǎo)的組中，因pEGFP-N1而發(fā)射綠色熒光的細胞數(shù)目有所降低。另外，F(xiàn)ACS分析的結(jié)果揭示出細胞熒光強度的降低(圖27)。這些結(jié)果表明在細胞中導(dǎo)入抗-EGFP U6 siRNA文庫表達系統(tǒng)能誘導(dǎo)RNAi以沉默靶基因。
因此，抗-EGFP U6 siRNA文庫表達系統(tǒng)中會存在能誘導(dǎo)RNAi并沉默靶基因的克隆。
在抗-EGFPtRNA siRNA文庫表達系統(tǒng)中獲得了類似的結(jié)果(圖26和27)。
siRNA表達腺病毒載體和HIV載體的基因沉默作用使用螢光素酶基因(pGL3-ControlPromega)作為評價用的標記基因。使用人U6啟動子串聯(lián)表達siRNA。靶序列是位點B鏈5′-GTGCGCTGCTGGTGCCAAC-3’(SEQ ID NO43)。根據(jù)Mizuguchi等的方法制備腺病毒載體(Nippon Rinsho，58，1544-1553(2000))。
1)將RNAi表達盒摻入穿梭質(zhì)粒盡管得自Clontech的PShuttle序列中存在3個HincII位點，測序的結(jié)果證實I-CeuI和PI-SceI位點之間僅存在一個HincII位點。
用HindIII裂解表達質(zhì)粒(pU6i-FGLB)之后，通過Klenow處理使末端成為平端，然后用EcoRI裂解。將所制備的表達盒(約600bp)摻入已用EcoRI和HincII處理過的穿梭載體(pShuttle)以構(gòu)建pU6i-FGLB/Shuttle。
2)將得自pShuttle的表達盒摻入Ad載體質(zhì)粒并制備Ad載體根據(jù)Mizuguchi等的方法，將RNAi表達盒摻入具有RGD纖維的Ad載體質(zhì)粒(pAdHM15-RGD)，構(gòu)建出pU6-FGLB/RGD。
作為對照，用PacI消化不含插入物的pAdHM15-RGD和pU6-FGLB/RGD之后，使用TransIT293(TaKaRa)進行脂質(zhì)轉(zhuǎn)染法。根據(jù)Mizuguchi等的方法，由觀察到CPE的細胞制備Ad載體。
通過在含有1％BSA的PBS(-)中透析過夜，純化出通過氯化銫超速離心法制備的Ad載體。使用Adeno-X Rapid Titer試劑盒(Clontech)測定純化的Ad載體的滴度。測定出的各個Ad載體的滴度如下RGD/Ad(對照)6.76×10^10ifu/mlU6-FGLB/Ad5.27×10^10ifu/ml3)制備HeLa-S3細胞制備HeLa-S3細胞至密度為5×105個細胞/ml，并按1ml/孔的量接種于6-孔培養(yǎng)板的每個孔中。然后，以Moi為1，10，20，50和100的量在每孔中加入每種Ad載體。24小時之后加入培養(yǎng)基(1.5ml)，然后進行脂質(zhì)轉(zhuǎn)染。
4)對螢光素酶質(zhì)粒進行脂質(zhì)轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)導(dǎo)Ad 24小時之后，用下述各孔組合物中的螢光素酶表達質(zhì)粒對細胞進行脂質(zhì)轉(zhuǎn)染。
在A管中放入Opti-MEM(250μl)，在其中加入pGL3-Control(0.02μg)、pRL-Tk(0.1μg)和pUC19(1.0μg)。在B管中放入Opti-MEM(250μl)，在其中加入LipofectAmine 2000(5μl；Invitrogen)，將混合物置于室溫下放置5分鐘。將B管全量倒入A管，使混合物徹底混合。將所得混合物置于室溫下放置20分鐘之后，全量加入至每孔，37℃保溫48小時。
5)螢光素酶測定使用Dual-Luciferase Reporter Assay System(Promega)進行螢光素酶檢測。
脂質(zhì)轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)48小時，然后用(500μl)將培養(yǎng)板中的每個孔洗滌一次。除去PBS(-)之后，在每個孔中加入1×PLB(500μl)，室溫下放置15分鐘，偶爾振蕩一下培養(yǎng)板以裂解細胞。將細胞裂解物轉(zhuǎn)移至1.5ml管，14000rpm離心1分鐘，將上清液轉(zhuǎn)移至新的1.5ml管(PLB裂解液)。
使用AutoLumatPLUS LB953(Berthold)測定螢光素酶活性。使用PLB裂解液(101)，測定螢火蟲螢光素酶和Renilla螢光素酶10秒鐘的發(fā)光情況。將被對照RGD/Ad轉(zhuǎn)導(dǎo)的細胞的數(shù)值定為100％，基于螢火蟲螢光素酶/Renilla螢光素酶的RLU值來表示各個RNAi表達Ad的相對螢光素酶沉默作用(圖29)。
類似地，如圖30所示，由表達HIV載體觀察到RNAi的螢光素酶抑制作用。
按照與制備siRNA表達腺病毒載體基本上相同的方法，通過將靶向螢火蟲螢光素酶的siRNA表達盒插入HIV穿梭載體制備出siRNA表達HIV載體。在此試驗中，靶序列是位點B鏈5′-GTGCGCTGCTGGTGCCAAC-3’(SEQ IDNO43)，使用了U6啟動子，表達的RNA具有包括5′-GUGCGCUGCUGGUGCCAACCCgugugcuguccGGGUUGGCACCAGCA GCGCAC(SEQ ID NO22)，5′-GUGCGCUGuUGGUGuCAACCCgugugcuguccGGGUUGGCACCAGCAGCGCAC-3′(SEQ ID NO23)和5′-GUGCGuUGuUGGUGuuAAuCCgugugcuguccGGGUUGGCACCAGCAGCGCAC-3′(SEQ ID NO57)的莖-環(huán)。將siRNA表達穿梭質(zhì)粒導(dǎo)入293T細胞之后，通過標準方法收獲病毒顆粒，濃縮，以moi為5至8的量轉(zhuǎn)染至293T細胞。然后，按照與使用腺病毒載體時類似的方法，在螢光素酶活性方面檢查RNAi作用。
siRNA表達啞鈴形載體的基因沉默作用檢查siRNA表達啞鈴形載體的基因沉默作用。使用下述siRNA表達載體，在與上述實施例類似的條件下進行螢光素酶分析。
●使用人U6啟動子、表達莖-環(huán)siRNA的載體(pU6stem)，和●表達siRNA的啞鈴形載體(Dumbbell)如圖31所示，在siRNA表達啞鈴形載體中觀察到螢光素酶沉默作用，這表明啞鈴形載體中維持的siRNA表達系統(tǒng)表現(xiàn)出有效的基因沉默作用。
工業(yè)實用性如上所述，使用細胞內(nèi)siRNA表達系統(tǒng)能沉默功能基因的表達。另外，作為在細胞中導(dǎo)入單個已被轉(zhuǎn)化以維持針對多個靶基因的siRNA表達系統(tǒng)的載體的結(jié)果，多個靶基因的表達也可被沉默。通過使用這種細胞內(nèi)siRNA表達系統(tǒng)，可在細胞內(nèi)部提供siRNA，從而可以進行穩(wěn)定和長期的siRNA表達，也即靶基因沉默。另外，通過使用病毒載體等，可以改善siRNA表達系統(tǒng)轉(zhuǎn)移至細胞的效率，從而在哺乳動物細胞中成功進行RNAi誘導(dǎo)。因此，本發(fā)明的系統(tǒng)能憑借RNAi用于基因治療和擊倒動物的產(chǎn)生。
另外，為了使本發(fā)明的系統(tǒng)應(yīng)用于搜索功能基因的方法，本發(fā)明提供了siRNA文庫表達系統(tǒng)及其集合。使用這些系統(tǒng)等可以使搜索功能基因變得簡單而有效，以致于包括siRNA文庫表達系統(tǒng)的本發(fā)明系統(tǒng)可用于快速闡明功能基因。
序列表<110>多比良和誠(TAIRA，Kazunari)宮岸真(MIYAGISHI，Makoto)<120>siRNA表達系統(tǒng)和利用該系統(tǒng)制備功能性基因擊倒細胞的方法<130>SEN-A0124-US<140>
<141>
<150>JP 2001-363385<151>2001-11-28<150>PCT/JP02/11293<151>2002-10-30<160>57<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成序列<400>1gctatgaaac gatatgggc 19<210>2<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成序列<400>2
gcccatatcg tttcatagc 19<210>3<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成序列<400>3gttcgtcaca tctcatctac 20<210>4<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成序列<400>4gtagatgaga tgtgacgaa 19<210>5<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成序列<400>5gtgcgctgct ggtgccaac 19<210>6<211>19
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成序列<400>6gttggcacca gcagcgcac 19<210>7<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成序列<400>7atgtacacgt tcgtcacat 19<210>8<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成序列<400>8atgtgacgaa cgtgtacat 19<210>9<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成序列
<400>9gtagcgcggt gtattatac 19<210>10<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成序列<400>10gtataataca ccgcgctac 19<210>11<211>21<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成序列<400>11gcuaugaaac gauaugggcu u 21<210>12<211>21<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成序列<400>12gcccauaucg uuucauagcu u 21
<210>13<211>22<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成序列<400>13guucgucaca ucucaucuac uu 22<210>14<211>21<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成序列<400>14guagaugaga ugugacgaau u 21<210>15<211>21<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成序列<400>15gugcgcugcu ggugccaacu u 21<210>16<211>21<212>RNA<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述人工合成序列<400>16guuggcacca gcagcgcacu u 21<210>17<211>21<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成序列<400>17auguacacgu ucgucacauu u 21<210>18<211>21<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成序列<400>18augugacgaa cguguacauu u 21<210>19<211>21<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成序列
<400>19guagcgcggu guauuauacu u 21<210>20<211>21<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成序列<400>20guauaauaca ccgcgcuacu u 21<210>21<211>49<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成序列<400>21gtgcgctgct ggtgccaacg ugugcugucc gttggcacca gcagcgcac 49<210>22<211>53<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成序列<400>22gugcgcugcu ggugccaacc cgugugcugu ccggguuggc accagcagcg cac53
<210>23<211>53<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成序列<400>23gugcgcuguu ggugucaacc cgugugcugu ccggguuggc accagcagcg cac53<210>24<211>54<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成序列<400>24gugcgcugcu ggugcucaac ccgugugcug uccggguugg caccagcagc gcac 54<210>25<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(19)<223>″n″＝堿基a，t，g，或c之一<400>25nnnnnnnnnn nnnnnnnnn 19
<210>26<211>81<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成序列<400>26ttcggcaggt ccggtcgacc ctgcacgcgg ccaaggccga aaaggccgcg gccgcaagca 60ggctcgaccg gacctgccga a 81<210>27<211>119<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(19)<223>″n″＝堿基a，t，g，或c之一<220>
<221>misc_feature<222>(101)..(119)<223>″n″＝堿基a，t，g，或c之一<400>27nnnnnnnnnn nnnnnnnnnt tcggcaggtc cggtcgaccc tgcacgcggc caaggccgaa 60aaggccgcgg ccgcaagcag gctcgaccgg acctgccgaa nnnnnnnnnn nnnnnnnnn 119<210>28<211>39<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成序列<400>28ggctcgagaa gcttggcgcg ccgctcttcg cgccaaaaa39<210>29<211>37<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成序列<400>29tttttggcgc gaagagcggc gcgccaagct tctcgag 37<210>30<211>195<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成序列<220>
<221>misc_feature<222>(39)..(58)<223>″n″＝堿基a，t，g，或c之一<220>
<221>misc_feature<222>(139)..(158)<223>″n″＝堿基a，t，g，或c之一<400>30ggctcgagaa gcttggcgcg ccgctcttcg cgccaaaaan nnnnnnnnnn nnnnnnnntt 60cggcaggtcc ggtcgaccct gcacgcggcc aaggccgaaa aggccgcggc cgcaagcagg 120ctcgaccgga cctgccgaan nnnnnnnnnn nnnnnnnntt tttggcgcga agagcggcgc 180gccaagcttc tcgag 195
<210>31<211>152<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成序列<220>
<221>misc_feature<222>(39)..(55)<223>″n″＝堿基a，t，g，或c之一<220>
<221>misc_feature<222>(137)..(152)<223>″n″＝堿基a，t，g，或c之一<400>31ggctcgagaa gcttggcgcg ccgctcttcg cgccaaaaan nnnnnnnnnn nnnnnttcgg 60caggtccggt cgaccctgct tgcggccgcg gccttttcgg ccttggccgc gtgcagggtc 120gaccggacct gccgaannnn nnnnnnnnnn nn 152<210>32<211>152<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(16)<223>″n″＝堿基a，t，g，或c之一<220>
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<222>(98)..(113)<223>″n″＝堿基a，t，g，或c之一<400>32nnnnnnnnnn nnnnnnttcg gcaggtccgg tcgaccctgc acgcggccaa ggccgaaaag 60gccgcggccg caagcagggt cgaccggacc tgccgaannn nnnnnnnnnn nnntttttgg 120cgcgaagagc ggcgcgccaa gcttctcgag cc 152<210>33<211>142<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成序列<220>
<221>misc_feature<222>(24)..(42)<223>″n″＝堿基a，t，g，或c之一<220>
<221>misc_feature<222>(124)..(142)<223>″n″＝堿基a，t，g，或c之一<400>33cgcgccgctc ttcgcgccaa aaannnnnnn nnnnnnnnnn nnttcggcag gtccggtcga 60ccctgcttgc ggccgcggcc ttttcggcct tggccgcgtg cagggtcgac cggacctgcc 120gaannnnnnn nnnnnnnnnn nn 142<210>34<211>138<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成序列
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<221>misc_feature<222>(1)..(19)<223>″n″＝堿基a，t，g，或c之一<220>
<221>misc_feature<222>(101)..(119)<223>″n″＝堿基a，t，g，或c之一<400>34nnnnnnnnnn nnnnnnnnnt tcggcaggtc cggtcgaccc tgcacgcggc caaggccgaa 60aaggccgcgg ccgcaagcag ggtcgaccgg acctgccgaa nnnnnnnnnn nnnnnnnnnt 120ttttggcgcg aagagcgg 138<210>35<211>43<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成序列<220>
<221>misc_feature<222>(6)..(43)<223>″n″＝堿基a，t，g，或c之一<400>35aaaaannnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnn 43<210>36<211>43<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(38)<223>″n″＝堿基a，t，g，或c之一<400>36nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnntt ttt 43<210>37<211>47<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成序列<220>
<221>misc_feature<222>(6)..(24)<223>″n″＝堿基a，t，g，或c之一<220>
<221>misc_feature<222>(29)..(47)<223>″n″＝堿基a，t，g，或c之一<400>37aaaaannnnn nnnnnnnnnn nnnncgaann nnnnnnnnnn nnnnnnn 47<210>38<211>47<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(19)<223>″n″＝堿基a，t，g，或c之一
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<221>misc_feature<222>(24)..(42)<223>″n″＝堿基a，t，g，或c之一<400>38nnnnnnnnnn nnnnnnnnnt tcgnnnnnnn nnnnnnnnnn nnttttt 47<210>39<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成序列<400>39cccgtgccct ggcccaccct cgtg 24<210>40<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成序列<400>40cacgagggtg ggccagggca cggg 24<210>41<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成序列
<400>41accaggatgg gcaccacccc ggtg 24<210>42<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成序列<400>42caccggggtg gtgcccatcc tggt 24<210>43<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成序列<400>43gtgcgctgct ggtgccaac 19<210>44<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成序列<400>44gtgcgctgct ggtgccaacc c 21
<210>45<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成序列<400>45gtgcgttgtt ggtgttaatc c 21<210>46<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成序列<400>46gtgcgctgct ggtgtcaacc c 21<210>47<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成序列<400>47gtgcggtggt ggtgggaagc c 21<210>48<211>21<212>DNA<213>人工序列
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<223>人工序列的描述人工合成序列<400>48gtgcgttggt ggtggcaacc c 21<210>49<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成序列<400>49gtgcgctcat ggtaccaacc c 21<210>50<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成序列<400>50gtgcgctgct ggtgtcaacc c 21<210>51<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成序列<400>51
gtgcgctgtt ggtgtcaacc c 21<210>52<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成序列<400>52gtgtgttgtt ggtgtcaatc c 21<210>53<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成序列<400>53gtgtgttgtt ggtgttaatt c 21<210>54<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成序列<400>54gtgcgttgtt ggtgtttaat cc 22<210>55<211>23
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成序列<400>55gtgcgctgtc tggtgctcaa ccc 23<210>56<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成序列<400>56gtgtcgctgt ctggtgctca actcc25<210>57<211>53<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成序列<400>57gugcguuguu gguguuaauc cgugugcugu ccggguuggc accagcagcg cac 5權(quán)利要求
1.細胞內(nèi)siRNA表達系統(tǒng)，其含有編碼針對靶基因mRNA的區(qū)域的反義RNA的反義編碼DNA，編碼針對所述靶基因mRNA相同區(qū)域的有義RNA的有義編碼DNA，以及一個或多個能分別由所述反義和有義編碼DNA表達所述反義和有義RNA的啟動子。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的siRNA表達系統(tǒng)，其中由該系統(tǒng)表達的siRNA的最終轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物長度為15至49bp。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的siRNA表達系統(tǒng)，其中由該系統(tǒng)表達的siRNA的最終轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物長度為15至35bp。
4根據(jù)權(quán)利要求1的siRNA表達系統(tǒng)，其中由該系統(tǒng)表達的siRNA的最終轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物長度為15至30bp。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的siRNA表達系統(tǒng)，其中siRNA中兩條RNA鏈配對的雙鏈RNA區(qū)域含有錯配或凸起。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的siRNA表達系統(tǒng)，其中所述錯配中的一個核苷酸是鳥嘌呤，另一個是尿嘧啶。
7.根據(jù)權(quán)利要求5的siRNA表達系統(tǒng)，其中siRNA含有1至7個錯配。
8.根據(jù)權(quán)利要求5的siRNA表達系統(tǒng)，其中siRNA含有1至7個凸起。
9.根據(jù)權(quán)利要求5的siRNA表達系統(tǒng)，其中siRNA含有1至7個錯配和凸起。
10.根據(jù)權(quán)利要求1至9中任一項的siRNA表達系統(tǒng)，其中所述啟動子是polII或polIII啟動子。
11.根據(jù)權(quán)利要求1至10中任一項的siRNA表達系統(tǒng)，其中所述polIII啟動子是U6啟動子。
12.根據(jù)權(quán)利要求1至11中任一項的siRNA表達系統(tǒng)，其中所述啟動子是誘導(dǎo)型啟動子。
13.根據(jù)權(quán)利要求1至12中任一項的siRNA表達系統(tǒng)，其中所述啟動子分開位于所述反義和有義編碼DNA的上游。
14.根據(jù)權(quán)利要求1至13中任一項的siRNA表達系統(tǒng)，其中所述系統(tǒng)含有下述(a)至(c)中任一種形式的loxP序列以便可以控制表達(a)所述啟動子含有遠側(cè)序列元件DSE和近側(cè)序列元件PSE，其間有間隔區(qū)，間隔區(qū)中有兩個loxP序列，一個位于DSE附近，另一個位于PSE附近；(b)所述啟動子含有DSE和PSE，它們處在維持啟動子活性的位置，有一個loxP序列位于它們之間，另一個loxP序列位于DSE的上游或PSE的下游；和(c)兩個loxP序列處在干預(yù)反義編碼DNA或有義編碼DNA的位置。
15.根據(jù)權(quán)利要求1至14中任一項的siRNA表達系統(tǒng)，其中反義和有義編碼DNA位于相同的載體DNA分子中，或分開位于不同的載體DNA分子中。
16.根據(jù)權(quán)利要求1至13中任一項的siRNA表達系統(tǒng)，其中啟動子位于單位的一側(cè)，在所述單位中，反義和有義編碼DNA經(jīng)由接頭以相反方向連接。
17.根據(jù)權(quán)利要求16的siRNA表達系統(tǒng)，其中所述系統(tǒng)含有下述(a)至(d)中任一種形式的loxP序列以便可以控制表達(a)啟動子含有DSE和PSE，其間有間隔區(qū)，間隔區(qū)中有兩個loxP序列，一個位于DSE附近，另一個位于PSE附近；(b)啟動子含有DSE和PSE，它們處在維持啟動子活性的位置，有一個loxP序列位于它們之間，另一個loxP序列位于DSE的上游或PSE的下游；(c)兩個loxP序列處在干預(yù)反義編碼DNA或有義編碼DNA的位置；和(d)兩個loxP的排列導(dǎo)致可以干預(yù)含有終止序列的接頭。
18.根據(jù)權(quán)利要求16或17的siRNA表達系統(tǒng)，其中反義和有義編碼DNA位于載體分子中。
19.根據(jù)權(quán)利要求15或18的siRNA表達系統(tǒng)，其中所述載體是質(zhì)粒載體。
20.根據(jù)權(quán)利要求15或18的siRNA表達系統(tǒng)，其中所述載體是病毒載體。
21.根據(jù)權(quán)利要求15或18的siRNA表達系統(tǒng)，其中所述載體是啞鈴形DNA載體。
22.一種細胞，其維持著根據(jù)權(quán)利要求1至21中任一項的siRNA表達系統(tǒng)。
23.根據(jù)權(quán)利要求22的細胞，其中所述細胞是哺乳動物細胞。
24.單個生物體，其維持著根據(jù)權(quán)利要求1至21中任一項的siRNA表達系統(tǒng)。
25.一種組合物，其含有根據(jù)權(quán)利要求1至21中任一項的siRNA表達系統(tǒng)。
26.根據(jù)權(quán)利要求25的組合物，其中所述組合物是藥物組合物。
27.產(chǎn)生靶基因表達沉默的細胞的方法，其中所述方法包括下述步驟將根據(jù)權(quán)利要求1至21中任一項的siRNA表達系統(tǒng)導(dǎo)入細胞，選擇導(dǎo)入了所述siRNA表達系統(tǒng)的細胞。
28.細胞內(nèi)siRNA文庫表達系統(tǒng)，其含有編碼siRNA的雙鏈DNA和兩個彼此相對放置的啟動子，所述雙鏈DNA含有與表達的siRNA等長的任意序列，并位于兩個啟動子之間，所述啟動子能由所述雙鏈DNA的各條鏈表達彼此互補的RNA。
29.細胞內(nèi)siRNA文庫表達系統(tǒng)，其含有莖-環(huán)siRNA產(chǎn)生單位和能在所述單位的任一側(cè)表達莖-環(huán)siRNA的啟動子，在所述單位中，反義編碼DNA以及與所述反義編碼DNA互補的有義編碼DNA經(jīng)由接頭以相反的方向連接。
30.根據(jù)權(quán)利要求28或29的siRNA文庫表達系統(tǒng)，其中所述系統(tǒng)所表達的siRNA最終轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的長度為15至49bp。
31.根據(jù)權(quán)利要求28或29的siRNA文庫表達系統(tǒng)，其中所述系統(tǒng)所表達的siRNA最終轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的長度為15至35bp。
32.根據(jù)權(quán)利要求28或29的siRNA文庫表達系統(tǒng)，其中系統(tǒng)所表達的siRNA最終轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的長度為15至30bp。
33.根據(jù)權(quán)利要求28至32中任一項的siRNA文庫表達系統(tǒng)，其中siRNA中兩條RNA鏈配對的雙鏈RNA區(qū)域含有錯配或凸起。
34.根據(jù)權(quán)利要求28至33中任一項的siRNA文庫表達系統(tǒng)，其中所述啟動子是polII或polIII啟動子。
35.根據(jù)權(quán)利要求28至33中任一項的siRNA文庫表達系統(tǒng)，其中所述啟動子是誘導(dǎo)型啟動子。
36.根據(jù)權(quán)利要求28至33中任一項的siRNA文庫表達系統(tǒng)，其中所述系統(tǒng)所表達的siRNA由隨機RNA鏈組成。
37.根據(jù)權(quán)利要求28至33中任一項的siRNA文庫表達系統(tǒng)，其中所述系統(tǒng)為多個siRNA表達載體的集合，其中每個載體靶向一種含有編碼區(qū)和/或非編碼區(qū)的基因序列。
38.根據(jù)權(quán)利要求28至33中任一項的siRNA文庫表達系統(tǒng)，其中系統(tǒng)所表達的siRNA由任何cDNA或基因組DNA的DNA片段所編碼的RNA鏈組成，所述片段與表達的siRNA等長。
39.一種集合，其是根據(jù)權(quán)利要求28至38中任一項的siRNA文庫表達系統(tǒng)的集合，其中所述集合中的每個系統(tǒng)表達不同的siRNA。
40.搜索功能基因的方法，所述方法包括下述步驟(a)在細胞中導(dǎo)入根據(jù)權(quán)利要求28至38中任一項的siRNA文庫表達系統(tǒng)或根據(jù)權(quán)利要求39的siRNA文庫表達系統(tǒng)的集合；(b)選擇已導(dǎo)入所述siRNA文庫表達系統(tǒng)或所述集合的細胞；和(c)分析所選擇細胞的表型。
41.根據(jù)權(quán)利要求40的搜索功能基因的方法，其中所述方法還包括下述步驟根據(jù)經(jīng)表型分析發(fā)現(xiàn)表型有所改變的細胞中編碼siRNA的DNA序列來篩選功能基因。
42.選擇高活性siRNA的方法，所述方法包括下述步驟(a)在細胞中導(dǎo)入根據(jù)權(quán)利要求28至38中任一項的siRNA文庫表達系統(tǒng)或根據(jù)權(quán)利要求39的siRNA文庫表達系統(tǒng)的集合，和(b)測定已導(dǎo)入所述siRNA文庫表達系統(tǒng)或所述集合的細胞中具體基因或蛋白質(zhì)的表達水平。
全文摘要
本發(fā)明的體內(nèi)siRNA表達系統(tǒng)是能在細胞內(nèi)表達短鏈干擾(si)RNA的系統(tǒng)，所述系統(tǒng)含有編碼靶向靶基因mRNA任何區(qū)域的反義和有義RNA的反義和有義編碼DNA，還含有一個或多個能分別由反義和有義編碼DNA表達反義和有義RNA的啟動子。
文檔編號C12N15/11GK1617929SQ0282763
公開日2005年5月18日 申請日期2002年11月28日 優(yōu)先權(quán)日2001年11月28日
發(fā)明者多比良和誠, 官岸真 申請人:株式會社東京大學Tlo