專利名稱：弓形蟲復(fù)合多表位基因的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種寄生蟲——弓形蟲的復(fù)合多表位基因及其在制備診斷和預(yù)防弓形蟲病的藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
弓形蟲是一種細胞內(nèi)寄生原蟲，可引起人獸共患的弓形蟲病。此蟲呈世界性分布，估計全世界成年人中至少有1/3的人感染，但多為隱性感染。弓形蟲作為一種條件致病因素，在許多條件下，特別在免疫系統(tǒng)受損或抑制的情況下，可引起廣泛的臨床癥狀，如弓形蟲性腦炎、弓形蟲性視網(wǎng)膜脈絡(luò)膜炎、弓形蟲性腹膜炎等，嚴(yán)重者可導(dǎo)致死亡。如AIDS病患者中有6～10％患有弓形蟲病，AIDS病人所患腦炎中有70％由弓形蟲引起。孕婦也容易感染弓形蟲，并可通過胎盤屏障傳給嬰兒，導(dǎo)致流產(chǎn)、畸胎、死胎，幸存者也常遺留智能低下等嚴(yán)重后遺癥。因而開展弓形蟲病研究，特別是弓形蟲疫苗及新型診斷方法的研制，對許多疾病的防治及優(yōu)生優(yōu)育是迫切需要的。
弓形蟲生活史中有速殖子、緩殖子、裂殖子、配子體、卵囊等形態(tài)階段，其中與致病有關(guān)的主要是速殖子和緩殖子期。弓形蟲條件性致病的中心環(huán)節(jié)是速殖子和緩殖子的互相轉(zhuǎn)換。速殖子代謝旺盛、增殖迅速，引起的急性期感染如受到免疫系統(tǒng)或藥物的抑制，可轉(zhuǎn)換為慢性期；否則，便可導(dǎo)致多器官、多臟器的感染，引發(fā)各種臨床癥狀，以至死亡。緩殖子代謝、增殖緩慢，所引起的慢性期感染主要是以包囊的形式潛伏在腦、視網(wǎng)膜、肌肉等細胞中，待宿主機體免疫力下降時，就轉(zhuǎn)換為速殖子，形成急性期感染。
弓形蟲在人、羊等中間宿主體內(nèi)，可以急性期的速殖子和慢性期的緩殖子兩種形式存在，二者的表型截然不同，前者臨床癥狀明顯，后者則呈現(xiàn)正常帶蟲者狀態(tài)。二者的基因型也有許多不同，都含有一些期特異性抗原，如弓形蟲主要表面抗原(Major Surface Antigen，SAG1)就只存在于速殖子期；而P22抗原則只存在于緩殖子；也有一些抗原兩期都存在，如棒狀體蛋白2(ROP2)。目前對弓形蟲疫苗的研究，多針對速殖子的主要表面抗原，其對急性感染效果尚可，但對慢性感染則幾乎沒什么作用。實驗表明弓形蟲主要表面抗原(速殖子期特異性抗原)基因免疫小鼠，結(jié)果對速殖子的攻擊感染具有良好的保護作用，但對緩殖子期蟲體(包囊)卻沒有明顯作用。同樣道理，用期特異性抗原構(gòu)建的診斷方法，也只能檢知某些期的弓形蟲感染。
多表位抗原基因(Multi-epitope Gene，MG)是將多個抗原表位的編碼基因拼接在一起，其免疫效果常相當(dāng)于多個單一抗原的累加。多表位抗原基因是疫苗研制的一個發(fā)展方向。對于寄生蟲來說，更是如此。由于寄生蟲多變的抗原構(gòu)成、復(fù)雜的生活史，使得針對單一抗原的疫苗的保護作用都不太理想，MG疫苗的引入，則可望在一定程度上解決這個問題。MG已在瘧原蟲的疫苗研究中已得到了初步應(yīng)用。目前，關(guān)于弓形蟲多表位抗原基因的研究，國內(nèi)外尚未見報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是為了合成具有多個弓形蟲期特異抗原表位及破傷風(fēng)抗毒素T細胞表位的復(fù)合基因片段，其表達產(chǎn)物和復(fù)合基因本身可用作診斷弓形蟲病及研制弓形蟲疫苗。
弓形蟲主要表面抗原(SAG1)是弓形蟲速殖子期特異性抗原，弓形蟲棒狀體蛋白(Rhoptry)2是一種速殖子和緩殖子都存在的共同抗原，弓形蟲致密顆?？乖?Granule antigen，GRA)是速殖子和緩殖子共有的分泌排泄抗原。根據(jù)弓形蟲SAG1、ROP2、GRA等的氨基酸序列，確定抗原表位序列及對人和鼠都有很強免疫增強作用的破傷風(fēng)抗毒素T表位序列，并根據(jù)計算機蛋白質(zhì)模型構(gòu)建，插入適宜及適量的軟性氨基酸脯氨酸和/或甘氨酸，以維持各片段相對獨立的空間構(gòu)像，構(gòu)成的氨基酸序列如下例NNVARCSYGADSTLGPVPGGGPPQQRAAHVPVPDFSQPGGGPCNEKSFKDILPKLTENPWQPGGGPTDPGDVVIEELFNRIPETSVPGGGPFNNFTVSFWLRVPKVSASHLE其中，該序列含T和(或)B細胞表位的四個弓形蟲抗原片段和一個破傷風(fēng)毒素片段SAG1(138-154)NNVARCSYGADSTLGPVSAG1(238-256)CNEKSFKDILPKLTENPWQROP2(197-216)TDPGDVVIEELFNRIPETSVGRA2C15片段 PQQRAAHVPVPDFSQTTP30(破傷風(fēng)毒素片段)FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE其中，在不同的片段之間插入不同數(shù)量的軟性氨基酸脯氨酸和/或甘氨酸，以維持各片段的獨立空間構(gòu)象，如PGGGP氨基酸序列。
本發(fā)明的多肽中的氨基酸序列中可插入其它氨基酸序列，也可以在該序列的頭、尾部加入其它氨基酸序列。
根據(jù)哺乳動物偏愛的密碼子，確定核苷酸序列，對應(yīng)于上述氨基酸多肽序列，核苷酸序列分別是SAG1(138-154)SEQ ID No.1 aacaacgtggccaggtgctcctacggcgccgacagcaccctgggcccagtgSAG1(238-256)SEQ ID No.2 tgcaacgagaagtccttcaaggacatcctgcccaagctgaccgagaacccatggcagROP2(197-216)SEQ ID No.3 accgaccctggtgacgtggtcatcgaagagctgttcaaccgcatccccgagaccagcgtcGRA2C15 SEQ ID No.4 cctcagcagcgcgccgcccacgtgcctgtgcccgacttcagccagTTP30SEQ ID No.5 ttcaacaacttcaccgtgtccttctggctgcgcgtgcctaaggtgtccgcctcccacctggag整體的核苷酸序列含有以上的以任意順序排列的核苷酸序列，其中在不同的片段之間插入軟性氨基酸的編碼序列以維持各片段相對獨立的空間構(gòu)象。也可以是上述所述核苷酸序列的90％以上的同源序列。
本發(fā)明的整體的核苷酸序列可以在復(fù)合基因的頭尾分別加上密碼子atg起始和終止密碼子包括tga或tgg或tag以及適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶酶切位點，如ggatcc、ctcgag，進一步確定核苷酸序列。
本發(fā)明的弓形蟲多表位基因采用β-乙腈亞磷酸胺化學(xué)合成法，使用全自動DNA合成儀進行一次性合成。該合成方法為本技術(shù)領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。將該基因克隆到真核表達載體如質(zhì)粒pCR II-TOPO，進行序列測定。
本發(fā)明的弓形蟲復(fù)合多表位基因的載體可以是以下原核細胞載體pET28，pET30，pET32，pRSETA，pRSETB，pRSETC等，也可以是以下真核細胞載體pGFP，pEGFP，pGFP-N1，pGFP-C1，pCDNA3，pCRII-TOPO等，也可以是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的其它載體，載體中含有本發(fā)明所述的基因序列。
本發(fā)明的載體的宿主細胞可以是原核細胞如大腸桿菌，也可以是真核細胞。
將本發(fā)明的復(fù)合基因克隆入真核表達載體(如pCDNA3)(包括90％以上的同源基因)，作為基因疫苗，對小鼠起到了很好的保護效果，可用來作為基因疫苗在動物的弓形蟲病預(yù)防上加以推廣。
將本發(fā)明的復(fù)合基因克隆入原核表達載體(如pRSETB)(包括90％以上的同源基因)，導(dǎo)入大腸桿菌表達系統(tǒng)，獲取了具有抗原活性的目的蛋白。該蛋白用于診斷試劑盒的包被抗原，能夠特異性地檢測出弓形蟲感染陽性血清。
本發(fā)明因含有編碼弓形蟲多個蟲期、多個抗原的表位以及對人和鼠都有很強免疫增強作用的破傷風(fēng)毒素的T細胞表位，因而其本身及其表達產(chǎn)物都可用來制備診斷和預(yù)防保護弓形蟲的急慢性感染的藥物，而以往的單一抗原是達不到這樣效果的。
具體實施例方式
下面的具體實施例將更全面地描述本發(fā)明，這些實施例是說明性的而非限制性的。
實施例一含抗原表位多肽的確定本復(fù)合基因所編碼的五個多肽片段的確定是基于(1)這些片段分別屬于弓形蟲不同的期特異性抗原；(2)這些片段已經(jīng)實驗證明或經(jīng)計算機軟件分析，具有B和/或T細胞表位。本復(fù)合基因分別編碼弓形蟲速殖子期特異性抗原(SAG1)的兩個表位片段(NNVARCSYGADSTLGPV和CNEKSFKDILPKLTENPWQ)、速殖子和緩殖子期共有抗原ROP2和GRA2的各一個表位片段(DPGDVVIEELFNRIPETSV和PQQRAAHVPVPDFSQ)以及破傷風(fēng)毒素的一個表位片段(FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE)，后者對人和鼠都有很強的免疫增強作用。
實施例二氨基酸序列的確定根據(jù)計算機蛋白質(zhì)模型構(gòu)建，確定上述片段的排列順序并在不同表位間插入適宜及適量的軟性氨基酸PGGGP以維持各表位獨立的空間構(gòu)像，從而確定氨基酸序列如下NNVARCSYGADSTLGPVPGGGPPQQRAAHVPVPDFSQPGGGPCNEKSFKDILPKLTENPWQPGGGPTDPGDVVIEELFNRIPETSVPGGGP FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE實施例三 核苷酸序列的確定依據(jù)以上氨基酸序列，選擇哺乳動物偏愛的密碼子，并在頭尾分別加上起始和終止密碼子以及適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶酶切位點，從而確定核苷酸序列如下ctcgaggcaatgggaaacaacgtggccaggtgctcctacggcgccgacagcaccctgggcccagtgcctggtggtggaccacctcagcagcgcgccgcccacgtgcctgtgcccgacttcagccagcctggtggtggtccatgcaacgagaagtccttcaaggacatcctgcccaagctgaccgagaacccatggcagccaggtggaggtccaaccgaccctggtgacgtggtcatcgaagagctgttcaaccgcatccccgagaccagcgtcccaggaggaggtcctttcaacaacttcaccgtgtccttctggctgcgcgtgcctaaggtgtccgcctcccacctggagtgaggatcc實施例四 復(fù)合基因的合成、克隆與測序鑒定將以上弓形蟲多表位復(fù)合基因的核苷酸序列，采用β-乙腈亞磷酸化學(xué)合成法，使用全自動DNA合成儀，可交由美國Invitrogen公司一次性合成，可自行合成，并克隆到質(zhì)粒pCRII-TOPO，經(jīng)酶切和序列測定證實合成的復(fù)合基因片段與原始設(shè)計序列完全一致。
實施例五含復(fù)合基因之原核重組表達載體的構(gòu)建及鑒定將合成并鑒定后的弓形蟲多表位基因亞克隆入原核表達載體?？紤]到表達產(chǎn)物的應(yīng)用，選取了含有能夠表達polyHis、從而便于將表達產(chǎn)物過柱純化的載體pRSETB。該質(zhì)粒載體在含有強啟動子T7的宿主菌BL21(DE3)中，能高效表達目的蛋白。簡述如下以堿裂解法提取轉(zhuǎn)化有原核表達載體質(zhì)粒pRSETB，以Nco I將其酶切至完全線性化后，對其進行酚氯仿抽提純化，補平，再以足量EcoR I酶切，電洗脫法回收載體片段；堿裂解法提取含有目的基因片段的T載體質(zhì)粒pCRII-TOPO-MG，以Sac I將其完全酶切，補平，酚氯仿抽提純化，再以不足量的EcoR I對完全線性化的質(zhì)粒進行酶切，通過電洗脫法收集目的基因小片段并對其進行純化。在T4 DNA Ligase和T4DNA Ligase 10x Buffer連接體系中，于16℃連接24小時。
參照分子克隆實驗指南(第二版，Sambrook J，et al，金冬雁等譯，55)，以CaCl2法制備中間宿主菌JM109感受態(tài)細胞，具體如下挑取一JM109單菌落接種于2ml的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振搖(200rpm)培養(yǎng)過夜。次日將此過夜培養(yǎng)物以1∶100的比例加入到8ml的LB液體培養(yǎng)基中，于37℃繼續(xù)振搖(200rpm)2-3h，至對數(shù)生長期(肉眼可觀察到細菌呈霧狀物)。冰浴10min后，4℃離心3000rpm，5min，棄上清，將管于滅菌紗布上倒置1min，使痕量培養(yǎng)液流盡，以原體積1/2的冰預(yù)冷的0.1MCaCl2(即4ml)重懸沉淀，冰浴15min。4℃離心3000rpm，5min，棄上清，倒置1min，以原體積1/20的冰預(yù)冷的0.1MCaCl2(即400ul)輕輕重懸細胞沉淀，置于4℃，30min后即可用于轉(zhuǎn)化。
于上述50ul感受態(tài)細胞中加入連接產(chǎn)物2ul(同時作兩組對照加空載體質(zhì)粒作陽性對照，不加任何質(zhì)粒的感受態(tài)細胞作陰性對照)，輕輕旋轉(zhuǎn)以混勻內(nèi)容物，冰浴30min。置42℃水浴90sec，不要搖動。快速轉(zhuǎn)移到冰水中放置1-2min，使細胞冷卻，加200ul不含任何抗生素的LB液體培養(yǎng)基，用水浴將培養(yǎng)基加溫到37℃后，將管轉(zhuǎn)移到37℃搖床，溫和振搖(100rpm)45min使細菌復(fù)蘇。各組分別取50ul菌液涂于含有氨芐青霉素(100ug/ml)的LB固體培養(yǎng)基平板上，于37℃孵箱放置30min后，倒置培養(yǎng)過夜(8-12h)。
從含平板上隨機挑取轉(zhuǎn)化有連接體系的單菌落，接種于2ml含有氨芐青霉素(100ug/ml)的LB液體培養(yǎng)基中，37℃、250rpm振搖過夜。同前，以堿裂解法提取質(zhì)粒，溶于30ul TE中，取3ul進行1％瓊脂糖電泳，較空載體質(zhì)粒pRSETB泳動慢者，疑為重組質(zhì)粒，遂以EcoRI對其進行酶切，切出目的基因片段者(約400bp)，即為重組質(zhì)粒(pRSETB-MG)。
實施例六含復(fù)合基因之原核重組表達載體之工程菌的誘導(dǎo)表達同上以氯化鈣法制備工程菌BL21(DE3)的感受態(tài)細胞，將鑒定好的重組質(zhì)粒pRSETB-MG轉(zhuǎn)化該大腸桿菌細胞。接種轉(zhuǎn)化有重組質(zhì)粒的單菌落(pRSETB-MG/BL21)及相應(yīng)的載體對照質(zhì)粒(pRSETB/BL21)于2ml含有氨芐青霉素(100u/ml)的LB液體培養(yǎng)基中，37℃、250rpm振搖過夜，次日以1∶100的比例轉(zhuǎn)種于100ml同上的LB液體培養(yǎng)基中，同樣條件培養(yǎng)2h后，加入IPTG至終濃度為1mM，繼續(xù)培養(yǎng)3h。8000rpm離心30sec收集菌體，棄上清，-20℃保存。結(jié)果復(fù)合基因在原核表達系統(tǒng)中得到了分子量約為14.4KD的表達產(chǎn)物，只含空載質(zhì)粒對照菌未顯示此帶。該表達產(chǎn)物以包涵體形式存在。
實施例七復(fù)合基因表達產(chǎn)物的純化將40ml細菌培養(yǎng)物重懸于10ml包涵體分離液(50mmol/L Tris.ClpH8.0；1mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)；0.2mg/ml溶菌酶，懸液于液氮和37℃水浴中反復(fù)凍融5次，樣品以12,000r/min離心15min，小心傾去上清，保留沉淀，以包涵體洗滌液(1mol/lUrea，0.5％TritonX-100，50mmol/L Tris.Cl pH8.0，1mmol/L EDTA)洗包涵體沉淀2-3次，最后以12,000r/min離心15min收集包涵體，以1ml8M尿素將其于37℃水浴1小時，變性處理后進行SDS-PAGE鑒定，結(jié)果表明純化效果好。
實施例八復(fù)合基因表達產(chǎn)物的活性鑒定將誘導(dǎo)表達后的菌體連同對照菌變性處理后進行SDS-PAGE、轉(zhuǎn)印，轉(zhuǎn)印后的PVDF膜于含0.3％Tween 20的TBS中室溫封閉1小時，與一抗(以TTBS按1∶50稀釋后的S13)4℃孵育過夜，用10ml TTBS于室溫洗滌3次，每次10min；與含1％milk、經(jīng)1∶20000稀釋的二抗(Goat-Anti-mouse IgG-Ap)于37℃輕輕搖動1小時，如上洗三遍，將膜浸入Developing Buffer(0.1M NaCl，0.05M MgCl2，0.1M Tris.Cl，pH9.5)中平衡15分鐘放入現(xiàn)配的BCIP/NBT顯色液中，避光顯色，待有特異性條帶出現(xiàn)時，加入dH2O終止反應(yīng)。將膜置于濾紙上，待干后，掃描結(jié)果。結(jié)果表明多表位基因所表達的產(chǎn)物能被抗弓形蟲的單克隆抗體S13所特異識別。
實施例九 弓形蟲復(fù)合多表位基因的表達產(chǎn)物對弓形蟲感染的檢測(ELISA、DIPSTICK)將純化的多表位基因表達產(chǎn)物作為包被抗原，以ELISA法對124份已通過免疫印跡檢測的血清進行檢測，具體如下用重組抗原包被96孔板(1μg/孔)，4℃過夜，然后以封閉液(含1％無脂奶粉、0.05％Tween 20的PBS)于室溫封閉1h后，洗3次(洗液為含0.05％Tween 20的PBS)。每孔加100μl待檢血清(原血清用含1％無脂奶粉的PBS按1∶100稀釋)，室溫孵育1h后，洗滌(20mmol/L Tris.Cl，500mmol/L NaCl，0.05％Tween-20，pH7.4)，每孔加入100μl羊抗人HRP標(biāo)記的二抗，室溫孵育1h，同上洗3次，每孔加入100μl鄰苯二銨顯色20min，加入1M NaOH終止顯色，于酶標(biāo)儀上測定OD(492)值。同免疫印跡檢測的結(jié)構(gòu)比較。結(jié)果如表1所示
表1 124份血清Immunblot和ELISA測試結(jié)果Immunoblot ELISASamples NumberPositive Negative Positive NegativePregnancy 40436 5 35CNS Patients 92 7 3 6Organ Transplants 52 3 2 3Serum from Denmark20911 9 11Normal Serum50446 5 45Total124 21 103 24100免疫印跡結(jié)果被視為檢測的黃金標(biāo)準(zhǔn)。本實驗中，ELISA和免疫印跡檢測的陽性符合率為87.5％(21/24)，不符合率為12.5％(3/24)；陰性符合率為100％(100/100)，表明基于弓形蟲多表位復(fù)合基因的ELISA特異性檢測與免疫印跡檢測結(jié)果趨于一致。
隨后以多表位基因表達產(chǎn)物用于膠體金標(biāo)記Dipstick測試實驗，依據(jù)孔健、胡旭初等的技術(shù)路線(孔健，蔣先敏，蔡慶，等主編。免疫診斷新技術(shù)及其在臨床診斷試劑開發(fā)中的應(yīng)用。衛(wèi)生部北京生物制品研究所，2000；胡旭初，李明，王萍，等。一種新型免疫快速檢測技術(shù)-dipstick免疫膠體金技術(shù)。中華流行病學(xué)雜志，1998；19204-207)操作步驟，具體如下a.直徑20～30nm膠體金的制備取10％氯金酸0.1ml，加100ml雙蒸水加熱煮沸，一次快速加入37℃預(yù)溫的1％檸檬酸三鈉2ml，待溶液由藍逐步變?yōu)樽霞t色，繼續(xù)煮沸3～5分鐘，冷卻后，0.2M碳酸鉀調(diào)節(jié)pH至8.0～8.2，0.45μm濾膜過濾，分光光度計測OD530在0.8～1.2之間。
b.最適蛋白質(zhì)標(biāo)記濃度測定取9支試管，各加入1.0ml上述制備的膠體金溶液。將鼠抗人IgG用0.01MPB(pH7.0)分別稀釋成500μg/ml、400μg/ml、300μg/ml、250μg/ml、200μg/ml、150μg/ml、100μg/ml、50μg/ml、0μg/ml，各取0.1ml按順序加入上述膠體金溶液中。5分鐘后于每試管中再加入10％氯化鈉水溶液0.1ml，混勻室溫靜置。于2小時后觀察試管顏色的變化，未加入蛋白(對照管)及加入蛋白量不足以穩(wěn)定膠體金的試管呈現(xiàn)由紅變藍的聚沉現(xiàn)象。而加入蛋白量達到或超過最低穩(wěn)定量的試管則保持紅色不變。取含蛋白量最低的紅色膠體金試管，其蛋白濃度即為穩(wěn)定1ml膠體金的最適濃度，實際用量為其量的110％。
c.取鼠抗人IgG 72μl，用雙蒸水稀釋至1ml，在磁力攪拌條件下緩慢加到上述制備的80ml膠體金溶液中，室溫攪拌30分鐘，加10％BSA 3.2ml，室溫攪拌5分鐘，再加10％PEG 1.6ml，室溫攪拌5分鐘。取1ml膠體金-抗體結(jié)合物按上述方法進行穩(wěn)定性試驗。膠體金-抗體結(jié)合物于4℃ 15000rpm離心60分鐘，沉淀溶于8ml保存液中，用0.45μm濾膜過濾備用。
d.膠體金標(biāo)記Dipstick試紙條的制作長為6cm的雙面膠帶的一面貼于塑料薄片上，沿雙面膠帶的邊將塑料薄片剪下，濾膜的反面(不均勻面)平貼于雙面膠帶的另一面上，長度約3cm，其上貼厚濾紙；剪切成約5mm寬的試劑條。純化的弓形蟲多表位抗原和羊抗鼠IgG溶于碳酸鹽包被緩沖液(pH9.6)，濃度分別為200μg/ml和3mg/ml，取0.5μl在膜上用加樣槍點樣，羊抗鼠IgG線距吸水紙層0.3～0.5cm，為對照線，多表位抗原線在抗體線下約0.5cm。點樣后用1％牛血清白蛋白碳酸鹽包被緩沖液20μl/條封閉，自然晾干。用塑料袋密封置于4℃保存。
e.膠體金標(biāo)記二抗最佳稀釋倍數(shù)的確立對保存的膠體金標(biāo)記二抗原液用稀釋液分別稀釋4、6、8、10、12倍作為使用液，以弓形蟲病人混合血清和正常人混合血清為檢測對象，摸索其最佳的稀釋倍數(shù)。
f.弓形蟲多表位抗原分子建立的Dipstick快速診斷法的初步測試取弓形蟲病人混合血清和正?；旌涎甯?0μl用0.02MPB(pH7.0)稀釋至50μl，加入反應(yīng)盤，將已包被抗原抗體的Dipstick條垂直放于反應(yīng)盤上，待血清全部吸入條上時加100μl膠體金標(biāo)記鼠抗人IgG使用液，吸干后再加0.02M PB100μl洗滌，即可清晰看到反應(yīng)結(jié)果。陽性反應(yīng)為出現(xiàn)上下兩個紅色斑點，陰性反應(yīng)只有上面一個紅色的對照斑點。結(jié)果能特異地檢測出弓形蟲陽性感染血清。
實施例十復(fù)合基因真核表達載體的構(gòu)建及鑒定以Apa I切pCDNA3，補平，再以Xho I切，純化收集大片段；以EcoR I切PCRII-TOPO-MG，補平，再以Xho I切，純化收集小片段。于16℃連接24小時，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，挑選克隆提取質(zhì)粒，以BamH I切，有小片段者為陽性克隆。將含有陽性質(zhì)粒的菌株保種。
實施例十一 弓形蟲復(fù)合多表位基因?qū)π∈蟮拿庖弑Ｗo作用大量提取復(fù)合基因真核表達質(zhì)粒pCDNA3-MG，具體方法如下將過夜培養(yǎng)的含目的質(zhì)粒的JM109100ml，以5000rpm室溫離心10分鐘，徹底去上清；加入2ml Solution I，用槍頭或振蕩器充分懸浮細菌；3加入2ml SolutionII，立即上下顛倒5～10次，冰上放置2分鐘；3加入8.6ml SolutionIII，立即上下顛倒5～10次，使之充分中和，冰上放置2分鐘；10,000rpm高速離心10分鐘；將UNIQ-200柱放入50ml收集管，將上述的上清轉(zhuǎn)移到柱中，室溫放置5分鐘，8000rpm離心2～5分鐘；取下UNIQ-200柱，棄去收集管中的廢液，重復(fù)上述步驟，將剩余上清全部轉(zhuǎn)移帶到NIQ-200，離心；以5ml Wash Solution洗UNIQ-200柱兩次，離心后，將柱放入干凈的50ml離心管中，向柱中央加500μl Elution Buffer，室溫放置2分鐘，8000rpm離心2分鐘，收集DNA溶液，保存?zhèn)溆谩?br> 同時制備載體質(zhì)粒pCDNA3，以作為對照。同時設(shè)脂質(zhì)體(Lipofectin)對照和生理鹽水對照。
將DNA與Lipofectin以5∶1的比例混合，以5μg DNA/只的劑量對小鼠進行股四頭肌肌肉注射，每兩周尾靜脈采血一次，血量不少于300μl，以免疫印跡法測得免疫組小鼠具有特異性抗體水平，于第六周對小鼠進行蟲體(速殖子)攻擊感染實驗，結(jié)果證明弓形蟲多表位基因疫苗對小鼠的弓形蟲感染具有良好的免疫保護效果。
權(quán)利要求
1.一種弓形蟲復(fù)合多表位表因，為一次性合成的基因，含有任意順序的下列四個弓形蟲抗原片斷的編碼序列和一個破傷風(fēng)毒素片段的編碼序列，或其90％以上的同源序列抗原片段 多肽 基因SAG1(138-154) NNVARCSYGADSTLGPV SEQ ID No.1SAG1(238-256) CNEKSFKDILPKLTENPWQ SEQ ID No.2ROP2(197-216) TDPGDVVIEELFNRIPETSVSEQ ID No.3GRA2C15片段 PQQRAAHVPVPDFFQ SEQ ID No.4破傷風(fēng)毒素片段FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE SEQ ID No.5其中在不同的片段之間插入軟性氨基酸的編碼序列以維持各片段相對獨立的空間構(gòu)象。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的弓形蟲多表位基因，其特征在于在復(fù)合基因頭尾分別加上啟始密碼子atg，終止密碼子tga或tgg或tag及適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶酶切位點。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的弓形蟲復(fù)合多表位基因，其特征在于軟性氨基酸為脯氨酸和/或甘氨酸。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或3所述的弓形蟲復(fù)合多表位基因，其特征在于軟性氨基酸序列為PGGGP。
5.一種如權(quán)利要求1所述的弓形蟲復(fù)合多表位基因，其特征在于該基因序列為5’ctcgaggcaatgggaaacaacgtggccaggtgctcctacggcgccgacagcaccctgggcccagtgcctggtggtggaccacctcagcagcgcgccgcccacgtgcctgtgcccgacttcagccagcctggtggtggtccatgcaacgagaagtccttcaaggacatcctgcccaagctgaccgagaacccatggcagccaggtggaggtccaaccgaccctggtgacgtggtcatcgaagagctgttcaaccgcatccccgagaccagcgtcccaggaggaggtcctttcaacaacttcaccgtgtccttctggctgcgcgtgcctaaggtgtccgcctcccacctggagtgaggatcc3’
6.一種弓形蟲復(fù)合多表位基因表達多肽，其特征在于它含有以下氨基酸序列片段NNVARCSYGADSTLGPVPGGGPPQQRAAHVPVPDFSQPGGGPCNEKSFKDILPKLTENPWQPGGGPTDPGDVVIEELFNRIPETSVPGGGPFNNFTVSFWLRVPKVSASHLE
7.一種載體，其特征在于它含有權(quán)利要求1所述的基因序列。
8.一種含如權(quán)利要求7所述載體的宿主細胞。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的宿主細胞，其特征在于該細胞是大腸桿菌。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的宿主細胞，其特征在于該細胞是真核細胞。
11.權(quán)利要求1所述的基因用于制備診斷和預(yù)防弓形蟲的急慢性感染的藥物。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種弓形早復(fù)合多表位基因、其表達產(chǎn)物多肽、其載體、宿主細胞，該基因是一次性合成制備而來，用于制備診斷和預(yù)防弓形蟲的急慢性感染的藥物。
文檔編號C12N15/30GK1407105SQ01127850
公開日2003年4月2日 申請日期2001年9月13日 優(yōu)先權(quán)日2001年9月13日
發(fā)明者陳曉光, 楊培梁, 馮明釗 申請人:中國人民解放軍第一軍醫(yī)大學(xué)