專利名稱：弓形蟲IgG抗體膠體金免疫層析檢測試劑條及制備方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及一種弓形蟲IgG抗體檢測試劑，尤其是涉及一種采用膠體金免疫層析技術(shù)(immunochromatography)進行的弓形蟲IgG抗體快速檢測試劑條及其制備方法。
背景技術(shù)：
弓形蟲病(Toxoplasmosis)是剛地弓形蟲(Toxoplasmagondii)引起的一種嚴重危害人類健康的人獸共患寄生蟲病，其病原體弓形蟲可寄生在人及多種動物的有核細胞內(nèi)，人群及動物普遍易感。該病廣泛分布于世界各地，據(jù)統(tǒng)計全球約有10億人被弓形蟲感染([1]奚琳琳，李威.弓形蟲致病機理，毒力及基因型研究進展[J].中國病原生物學雜志，2009，4(11) :859-861.)。弓形蟲病在我國分布很廣泛，全國各省、市、自治區(qū)均有弓形蟲感染的報道，我國正常人群平均感染率在4% 9%左右([2]劉敏，陳曉光.中國人群弓形蟲病的流行特征分析[J].寄生蟲與醫(yī)學昆蟲學報，2010，17(3) :131-134)，特殊人群如腫瘤患者、精神病患者、先天缺陷嬰幼兒、免疫抑制、免疫缺陷患者感染率更高。所幸的是極大多數(shù)免疫功能正常的成人或兒童被弓形蟲感染后常無癥狀或僅有輕微癥狀，且多能自愈并獲永久免疫力。但先天感染的胎兒、兒童以及免疫缺陷者被感染后，則預后極為嚴重。是造成艾滋病患者死亡的一個重要并發(fā)病。人類免疫缺陷病毒(HIV)感染者約有20% 80% 合并弓形蟲感染，更重要的是它也是造成人類先天畸形、缺陷、智力低下、死胎、早產(chǎn)的重要病原體之一?，F(xiàn)有的弓形蟲病的的診斷方法包括直接從臟器、血液、腦脊液等組織分離弓形蟲進行病原學診斷，需要幾天甚至幾周時間，費時費力，在實際應用中價值不大。臨床上常規(guī)檢測主要是應用各種血清學方法，檢測其特異IgG和IgM ([3]周彬，張玨，王柯，等.弓形蟲 IgG和IgM抗體雙標記時間分辨熒光免疫分析的建立及其初步臨床應用[J].中華檢驗醫(yī)學雜志，2010，33 (010) :957-959)，血清學方法可以診斷先天性、急性和慢性弓形蟲病，但由于大多數(shù)免疫缺陷的人或動物其抗弓形蟲的IgG滴度不會上升或不會出現(xiàn)高的IgM滴度， 所以不能有效地用血清學方法對患有免疫缺陷的人或動物診斷弓形蟲病。另外，在抗原消失相當長時間后血清抗體滴度才會逐步下降，所以也不能應用于治療效果評價。目前，檢測IgG抗體存在較高的假陽性，而IgM抗體檢測普遍靈敏度差等問題([4]韓靖云，劉倩，郭健.弓形蟲感染實驗室診斷的技術(shù)進展[J].檢驗醫(yī)學，2009，24(5) :393-395)。因此，對疾病的早期診斷幫助不大，急需建立一種具有高度敏感性，且價廉、快速、操作簡單、不需特殊設備，更適合于臨床的早期診斷方法。弓形蟲病的診斷與流行病學調(diào)查主要依賴于血清學試驗，正常人體感染弓形蟲多為隱性感染，當機體免疫力下降時，蟲體大量繁殖，侵入除紅細胞外的各組織細胞內(nèi)寄生，造成各種組織的廣泛炎癥，從而出現(xiàn)臨床癥狀。人類感染弓形蟲后能誘導產(chǎn)生特異性抗體。感染早期IgM抗體增高，IgM在感染4個月后逐漸消失，在感染1個月后出現(xiàn)高濃度 IgG 抗體([5]KASPER D C, PRUSA A R, HAYDE Μ, et al. Evaluation of the vitros eciq immunodiagnostic system for detection of anti-toxoplasma immunoglobulin gand immunoglobulin m antibodies for confirmatory testing for acute toxoplasma gondii infection in pregnant women[J]. Journal of clinical microbiology,2009, 47(1) :164-168.)。因此，弓形蟲IgG抗體是弓形蟲病診斷和流行病學調(diào)查的一項重要指標。早期的血清學方法使用弓形蟲循環(huán)抗原。研究和診斷用的弓形蟲循環(huán)抗原是以弓形蟲感染小鼠腹腔獲得，這種方法花費大、獲得的抗原量少且不純(?；煊兴拗鞯鞍?， 因此假陽性也時有發(fā)生。隨著分子生物學技術(shù)的普及及弓形蟲抗原的相繼克隆，將重組抗原應用于弓形蟲實驗已經(jīng)越來越多。目前研究比較多的弓形蟲的表面抗原(SAG1(P30)、 SAG2(P22)、SAG3(P43)、SAG4(P18))、蟲體棒狀體抗原(R0P1、R0P2)、致密顆粒蛋白(GRA1、 GRA7)等([6]熊美華，王秀珍，劉露霞，等.弓形蟲速殖子抗原的提取及蛋白分析[J].中國寄生蟲病防治雜志，2001，14(3) :237-238.)。采用重組DNA技術(shù)制備的重組抗原可以克服完整弓形蟲抗原的缺點，能快速、經(jīng)濟地制備無限量特異重組弓形蟲抗原。弓形蟲抗體檢測方法包括ELISA、Western-blot等，其特異性均較高。然而，面對嚴峻的防制形式，不但需要特異準確的檢測手段，還需要一種更簡便快捷的試劑來篩查，以便為臨床和疾病防控提供對策。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種弓形蟲IgG抗體膠體金免疫層析檢測試劑條及其制備方法。所述弓形蟲IgG抗體膠體金免疫層析檢測試劑條設有載體板、加樣墊、膠體金墊、 硝酸纖維膜(NC膜)、弓形蟲IgG抗體檢測線、對照線和吸收墊；所述加樣墊、膠體金墊、 硝酸纖維膜和吸收墊依次粘貼在載體板上表面，所述加樣墊的一端設在膠體金墊的一端上，膠體金墊的另一端設在硝酸纖維膜的一端上，吸收墊的一端設在硝酸纖維膜的另一端上，弓形蟲IgG抗體檢測線和對照線依次設在硝酸纖維膜上；在弓形蟲IgG抗體檢測線處包被抗人IgG特異性片段Y鏈單克隆抗體，在對照線處包被羊抗弓形蟲抗原SAGl (P30)、 SAG2 (P22)、R0P2 和 GRA7 的 IgG 抗體。所述載體板可采用PVC板。所述弓形蟲IgG抗體膠體金免疫層析檢測試劑條的制備方法，包括以下步驟1)制備弓形蟲重組抗原SAG1(P30)、SAG2(P22)、R0P2和GRA7 采用基因克隆技術(shù)，PCR擴增編碼弓形蟲抗原的DNA，并插入大腸桿菌中使其表達，得弓形蟲重組抗原 SAGl(P30)、SAG2(P22)、R0P2 禾口 GRA7 ；2)硝酸纖維素膜的點樣在硝酸纖維素膜IgG檢測線上包被抗人IgG特異性片段Y鏈單克隆抗體，在硝酸纖維素膜上的對照線處包被羊抗弓形蟲抗原SAGl (P30)、SAG2 (P22)、R0P2和GRA7的IgG抗體，晾干；3)制備膠體金采用檸檬酸三鈉還原方法制備25nm膠體金，取氯金酸ImL加入到IOOmL去離子雙蒸水中，得到的氯金酸濃度為0.01%，置于帶冷凝裝置的燒瓶中加熱至沸騰，磁力加熱攪拌下加入檸檬酸三鈉水溶液2. OmL，繼續(xù)加熱直至溶液呈葡萄酒色為止，冷卻后置于棕色瓶中4°C冰箱保存?zhèn)溆茫?)膠體金與弓形蟲抗原SAGl (P30)、SAG2 (P22)、R0P2和GRA7的標記(1)膠體金與弓形蟲抗原SAGl (P30)的標記取膠體金10ml，用0. lmol/L NaOH調(diào)至 pH5. 4，加 100μ g 5八61( 30)，混勻，放置51^11，加入5%85八 Iml 混勻，4°C、10 000r/min 離心lh，棄上清，將沉淀用TBS緩沖液溶解至10ml，4°C、10 000r/min離心lh，棄上清，沉淀用TBS稀釋至1ml，得膠體金標記的SAGl (P30)抗原；(2)膠體金與弓形蟲抗原SAG2(P22)、R0P2和GRA7的標記方法與步驟(1)相同， 分別得膠體金標記的SAG2 (P22)、R0P2和GRA7抗原；

(3)將膠體金標記的SAGl (P30)抗原、膠體金標記的SAG2 (P22)、膠體金標記的 R0P2抗原和膠體金標記的GRA7抗原混合后，均勻地涂于玻璃纖維膜上，烘干，制備成膠體
金墊；5)制備免疫層析檢測條將加樣墊、膠體金墊、硝酸纖維膜和吸收墊依次粘貼在載體板上表面，加樣墊的一端設在膠體金墊的一端上，膠體金墊的另一端設在硝酸纖維膜的一端上，吸收墊的一端設在硝酸纖維膜的另一端上，弓形蟲IgG抗體檢測線和對照線依次設在硝酸纖維膜上；在弓形蟲IgG抗體檢測線處包被抗人IgG特異性片段γ鏈單克隆抗體，在對照線處包被羊抗弓形蟲抗原SAGl (P30)、SAG2 (P22)、R0P2和GRA7的IgG抗體，用切條機切成條狀，得弓形蟲 IgG抗體膠體金免疫層析檢測試劑條。在步驟2)中，所述抗人IgG特異性片段γ鏈單克隆抗體的濃度可為1 4mg/mL， 羊抗弓形蟲抗原SAGl (P30)、SAG2 (P22)、R0P2和GRA7的IgG抗體由抗SAGl (P30)抗體、抗 SAG2(P22)抗體、抗R0P2抗體和GRA7抗體可按體積比1 1 1 1混合，其終濃度可為 1 4mg/mL ；二者點樣量可為1 μ L/cm。在步驟3)中，所述檸檬酸三鈉的百分比濃度可為2%。在步驟4)中，所述將膠體金標記的SAGl (P30)抗原、膠體金標記的SAG2 (P22)抗原、膠體金標記的R0P2抗原和膠體金標記的GRA7抗原混合，最適膠體金標記的膠體金標記的SAGl (P30)抗原、膠體金標記的SAG2(P22)抗原、膠體金標記的R0P2抗原和膠體金標記的GRA7抗原混合體積比可按1 (0.2 5) (0. 2 5) (0. 2 5)混合；所述烘干的溫度可為37°C。本發(fā)明提供了一種采用膠體金免疫層析技術(shù)建立弓形蟲IgG抗體快速檢測試劑條，可用于全血、血清、血漿及腦脊液等標本中弓形蟲IgG抗體的檢測。該檢測方法所需的標本量極小，不需要特殊儀器，肉眼直接判讀結(jié)果，且檢測簡便快速，特異性強，靈敏度高， 準確可靠，成本低，應用廣泛。


圖1為本發(fā)明所述弓形蟲IgG抗體膠體金免疫層析檢測試劑條實施例的結(jié)構(gòu)組成示意圖。圖2為實驗結(jié)果模式示意圖。在圖2中，A為使用前的示意圖，B為無效試驗(產(chǎn)品質(zhì)量問題)，C為陰性結(jié)果，D為弓形蟲-IgG陽性結(jié)果；6為弓形蟲IgG抗體檢測線，7為對照線。
具體實施例方式以下實施例將結(jié)合附圖對本發(fā)明作進一步的說明。參見圖1，本發(fā)明所述弓形蟲IgG抗體膠體金免疫層析檢測試劑條實施例設有載體板1、加樣墊2、膠體金墊3、硝酸纖維膜(NC膜)4、弓形蟲IgG抗體檢測線6、對照線7和吸收墊8。所述加樣墊2、膠體金墊3、硝酸纖維膜4和吸收墊8依次粘貼在載體板1上表面， 加樣墊2的一端設在膠體金墊3的一端上，膠體金墊3的另一端設在硝酸纖維膜4的一端上，吸收墊8的一端設在硝酸纖維膜4的另一端上，弓形蟲IgG抗體檢測線6和對照線7依次設在硝酸纖維膜4上；在弓形蟲IgG抗體檢測線處包被抗人IgG特異性片段γ鏈單克隆抗體，在對照線處包被羊抗弓形蟲抗原SAGl (P30)、SAG2 (P22)、R0P2和GRA7的IgG抗體。所述載體板采用PVC板。所述弓形蟲IgG抗體膠體金免疫層析檢測試劑條的制備方法，包括以下步驟1)制備弓形蟲重組抗原 SAGl (P30)、SAG2 (P22)、R0P2 和 GRA7 采用基因克隆技術(shù)，PCR擴增編碼弓形蟲抗原的DNA，并插入大腸桿菌中使其表達，得弓形蟲重組抗原SAGl (P30)、SAG2 (P22)、R0P2和GRA7。2)硝酸纖維素膜的點樣在硝酸纖維素膜IgG檢測線上包被抗人IgG特異性片段Y鏈單克隆抗體，在對照線處包被羊抗弓形蟲抗原SAGl (P30)、SAG2 (P22)、R0P2和GRA7 IgG抗體，晾干；所述抗人IgG特異性片段、鏈單克隆抗體的濃度為l ^ig/mL，羊抗弓形蟲抗原SAG1(P30)、 SAG2 (P22)、R0P2 和 GRA7 的 IgG 抗體由抗 SAGl (P30)-IgG 抗體、抗 SAG2(P2^-IgG 抗體、抗 R0P2-IgG抗體和抗GRA7-IgG抗體按體積比1 :1:1: 1混合，其終濃度為1 ％ig/mL ； 二者點樣量為1 μ L/cm。3)制備膠體金采用檸檬酸三鈉還原方法制備25nm膠體金，取1 %氯金酸ImL加入到IOOmL去離子雙蒸水中，得到的氯金酸濃度為0.01%，置于帶冷凝裝置的燒瓶中加熱至沸騰，磁力加熱攪拌下加入檸檬酸三鈉水溶液2. OmL，繼續(xù)加熱直至溶液呈葡萄酒色為止，冷卻后置于棕色瓶中4°C冰箱保存?zhèn)溆?；所述檸檬酸三鈉的濃度為2%。4)膠體金與弓形蟲抗原SAGl (P30)、SAG2 (P22)、R0P2和GRA7的標記膠體金與弓形蟲抗原SAGl (P30)的標記取膠體金10ml，用0. lmol/L NaOH調(diào)至 pH5. 4，加 IOOyg SAGl (P30)，混勻，放置 5min，加入 5% BSA Iml 混勻，4°C、10 000r/min 離心lh，棄上清，將沉淀用TBS緩沖液溶解至10ml，4°C、10 000r/min離心lh，棄上清，沉淀用 TBS稀釋至1ml，得膠體金標記的SAGl (P30)抗原； 膠體金與弓形蟲抗原SAG2 (P22)、R0P2和GRA7的標記同上操作，分別得膠體金標記的 SAG2 (P22)、R0P2 和 GRA7 抗原；將膠體金標記的SAGl (P30)抗原、膠體金標記的SAG2 (P22)、膠體金標記的R0P2抗原和膠體金標記的GRA7抗原混合后，均勻地涂于玻璃纖維膜上，烘干，制備成膠體金墊；將膠體金標記的SAGl (P30)抗原、膠體金標記的SAG2 (P22)抗原、膠體金標記的 R0P2抗原和膠體金標記的GRA7抗原以體積比(0 5) (0 5) (0 5) (0 5)混合后，均勻地涂于玻璃纖維膜上，在37°C烘干，制備成膠體金墊，密封備用。5)制備免疫層析檢測條 將加樣墊、膠體金墊、硝酸纖維膜和吸收墊依次粘貼在載體板上表面，加樣墊的一端設在膠體金墊的一端上，膠體金墊的另一端設在硝酸纖維膜的一端上，吸收墊的一端設在硝酸纖維膜的另一端上，弓形蟲IgG抗體檢測線和對照線依次設在硝酸纖維膜上；在弓形蟲IgG抗體檢測線處包被抗人IgG特異性片段γ鏈單克隆抗體，在對照線處包被羊抗弓形蟲抗原SAGl (P30)、SAG2 (P22)、R0P2和GRA7的IgG抗體，用切條機切成條狀，得弓形蟲 IgG抗體膠體金免疫層析檢測試劑條。以下給出采用弓形蟲IgG抗體膠體金免疫層析檢測試劑條檢測患者的臨床標本取待檢標本(全血、血清、血漿、腦脊液)5 40yL，加樣于弓形蟲IgG抗體膠體金免疫層析檢測試劑條樣品處，滴加100 μ L生理鹽水，靜置20min觀察結(jié)果。只在檢測條對照區(qū)有一紫紅色條帶出現(xiàn)，則判為陰性；在檢測區(qū)(T)及對照區(qū)均有一紫紅色條帶出現(xiàn)，則判為陽性；加樣檢測后，檢測區(qū)和對照區(qū)均不出現(xiàn)紫紅色條帶，為無效結(jié)果(見圖2)。以下給出弓形蟲IgG抗體膠體金免疫層析檢測試劑條的性能檢定1)外觀檢查白色包被反應膜平整、干凈無污染斑點、無裂縫，膠帶無開膠，無切斜現(xiàn)象。2)陽性標本符合率用弓形蟲-IgG陽性的不同滴度的陽性參比血清各50份采用弓形蟲IgG抗體膠體金免疫層析檢測試劑條檢定，計算陽性符合率。陽性參比血清的確定采用ELISA(進口試劑)法確定的臨床標本。3)陰性標本符合率用50份陰性參比血清檢定，計算陰性符合率。陰性參比血清的確定采用ELISA(進口試劑)法確定的臨床標本。4)批內(nèi)差異同一批次弓形蟲IgG抗體膠體金免疫層析檢測試劑條，用特征性血清檢測，要求陽性血清檢測結(jié)果顯示色帶的顏色深淺一致，陰性血清檢測的結(jié)果陰性。5)批間差異不同批次弓形蟲IgG抗體膠體金免疫層析檢測試劑條，用特征性血清檢測，要求陽性血清檢測結(jié)果顯示色帶的顏色深淺一致，陰性血清檢測的結(jié)果陰性。6)干擾試驗檢測結(jié)果不受標本溶血(η = 50)、脂血(η = 50)和黃疸(η = 50) 的干擾。血清(或血漿)來自本申請人的臨床標本。7)交叉反應采用本弓形蟲IgG抗體膠體金免疫層析檢測試劑條，進行系統(tǒng)性紅斑狼瘡(η = 30)、類風濕病(η = 30)、免疫性肝炎(η = 30)等自身免疫系統(tǒng)疾病的檢測， 未發(fā)現(xiàn)交叉反應。自身免疫系統(tǒng)疾病的血清來自本申請人的臨床確診患者。8)穩(wěn)定性檢測應用Arrhenius法則，將弓形蟲IgG抗體膠體金免疫層析檢測試劑條放置37°C 20天后檢測，以上各項指標無顯著變化，確保成品在室溫干燥條件下保存， 有效期為18個月。本發(fā)明的檢測在一條弓形蟲IgG抗體膠體金免疫層析檢測試劑條上進行，通過以下兩種方式實現(xiàn)弓形蟲IgG抗體的檢測方式一利用膠體金免疫層析技術(shù)，在硝酸纖維素膜上IgG檢測線和對照線處分別包被抗人IgG特異性片段Y鏈單克隆抗體和羊抗弓形蟲抗原SAG1(P30)、SAG2(P22)、 R0P2和GRA7 IgG抗體。將已純化的金標記的弓形蟲重組抗原SAGl (P30)、SAG2 (P22)、R0P2 和GRA7以一定的比例混合后預包被在玻璃纖維紙上，干燥處理，制備成金膠體墊，再輔以恰當?shù)募訕訅|，組合弓形蟲IgG抗體膠體金免疫層析檢測試劑條(組裝方式見圖1)。檢測陽性樣本時，樣本中弓形蟲IgG抗體與膠體金標記的重組抗原SAG1(P30)、SAG2(P22)、 R0P2和GRA7結(jié)合形成免疫復合物。由于層析作用，復合物沿吸收墊的吸水紙方向向前移動。經(jīng)過檢測線時，①弓形蟲-IgG類免疫復合物與預包被的抗人IgG單克隆抗體結(jié)合形成“Au-SAGl (P30)(和/或SAG2 (P22)、和/或R0P2、和/或GRA7)-特異性抗弓形蟲IgG抗體-抗人IgG單克隆抗體-固相材料”夾心物而凝聚顯色；②游離金標抗原則在對照線處與羊抗弓形蟲抗原(SAG1 (P30)、SAG2 (P22)、R0P2和GRA7)抗體結(jié)合而富集顯色。陰性標本則僅在對照線處顯色。方式二，將方式一的包被抗原、抗體對調(diào)在硝酸纖維素膜上IgG檢測線和對照線處分別包被弓形蟲重組抗原(SAG1 (P30)、SAG2 (P22)、R0P2和GRA7組合)和羊抗鼠IgG抗體，將金標記的抗人IgG特異性片段γ鏈單克隆抗體預包被在玻璃纖維紙上。以下給出具體實施例。實施例1在硝酸纖維素膜(NC膜)IgG檢測線上包被抗人IgG特異性片段γ鏈單克隆抗體， 在對照線處包被羊抗弓形蟲抗原(SAG1 (Ρ30)、SAG2 (Ρ22)、R0P2和GRA7)抗體，室溫晾干， 密封室溫保存?zhèn)溆?。其中，抗人IgG特異性片段Y鏈單克隆抗體的濃度為lmg/mL，羊抗弓形蟲抗原(SAG1 (P30)、SAG2 (P22)、R0P2和GRA7) IgG抗體由羊抗弓形蟲抗原(SAG1 (P30)、 SAG2 (P22)、R0P2 和 GRA7) IgG 抗體由抗 SAGl (P30) -IgG 抗體、抗 SAG2 (P22) -IgG 抗體、抗 R0P2-IgG抗體和抗GRA7-IgG抗體按體積比1 :1:1: 1混合，其終濃度為lmg/mL ；二者點樣量為1 μ L/cm。將已純化的金標記的弓形蟲重組抗原SAGl (P30)、SAG2 (P22)、R0P2和GRA7以體積比1 1 1 1混合后，均勻地涂于玻璃纖維紙上，在37°c烘干，制備成金膠體墊，密封備用。將固相化的纖維膜與膠體金結(jié)合的玻璃纖維、吸水紙等按一定順序，通過PVC不干膠底板組合在一起，用切條機切成一定寬度檢測條。把弓形蟲IgG抗體膠體金免疫層析檢測試劑條與干燥劑一起裝入鋁箔袋中，機器封口，密封保存。取待檢標本血清10 μ L，加樣于弓形蟲IgG抗體膠體金免疫層析檢測試劑條加樣區(qū)，同時滴加100 μ L生理鹽水，靜置20min觀察結(jié)果。只在弓形蟲IgG抗體膠體金免疫層析檢測試劑條對照區(qū)有一紫紅色條帶出現(xiàn)，則判為陰性；在檢測區(qū)及對照區(qū)均有一紫紅色條帶出現(xiàn)，則判為陽性；加樣檢測后，檢測區(qū)和對照區(qū)均不出現(xiàn)紫紅色條帶，為無效結(jié)果。(見圖2)實施例2與實施例1相似，區(qū)別在于金膠體墊僅由SAGl (P30)、R0P2和GRA7組成，不含有 SAG2 (P22)。結(jié)果判斷與實施例1相同。實施例3與實施例1相似，區(qū)別在于金膠體墊僅由SAG2 (P22)、R0P2和GRA7組成，不含有 SAGl (P30)。結(jié)果判斷與實施例1相同。實施例4與實施例1相似，區(qū)別在于待檢標本為腦脊液標本，結(jié)果判斷與實施例1相同。實施例4
性能驗證試驗按實施例1的方案制備弓形蟲IgG抗體膠體金免疫層析檢測試劑條，然后進行性能驗證。1)外觀檢查白色包被反應膜平整、干凈無污染斑點、無裂縫，膠帶無開膠，弓形蟲IgG抗體膠體金免疫層析檢測試劑條寬度在3士0. 1mm，無切斜現(xiàn)象。2)陽性標本符合率50份經(jīng)ELISA(進口試劑)檢測確定的弓形 蟲-IgG陽性參比血清，采用發(fā)明的弓形蟲IgG抗體膠體金免疫層析檢測試劑條檢出弓形蟲-IgG陽性50份， 陽性標本符合率100%。3)陰性標本符合率50份ELISA(進口試劑)確定的陰性參比血清，采用弓形蟲 IgG抗體膠體金免疫層析檢測試劑條檢測未檢出陽性標本，陰性標本符合率100%。4)批內(nèi)差異同一批次弓形蟲IgG抗體膠體金免疫層析檢測試劑條，用特征性陽性血清(ELISA(進口試劑))檢測確定的臨床標本陽性弓形蟲-IgG參比高、中、低血清檢測，相同滴度檢測結(jié)果顯示色帶的顏色深淺一致，陰性血清檢測的結(jié)果陰性。5)批間差異不同批次弓形蟲IgG抗體膠體金免疫層析檢測試劑條，用特征性陽性血清(ELISA(進口試劑))檢測確定的臨床標本陽性弓形蟲-IgG參比高、中、低血清檢測，相同滴度檢測結(jié)果顯示色帶的顏色深淺一致，陰性血清檢測的結(jié)果陰性。6)干擾試驗檢測結(jié)果不受標本溶血(η = 50)、脂血(η = 50)和黃疸(η = 50) 的干擾。7)交叉反應采用本弓形蟲IgG抗體膠體金免疫層析檢測試劑條，進行系統(tǒng)性紅斑狼瘡(η = 30)、類風濕病(η = 38)、免疫性肝炎(η = 40)等自身免疫系統(tǒng)疾病的檢測， 未發(fā)現(xiàn)交叉反應。8)穩(wěn)定性檢測將弓形蟲IgG抗體膠體金免疫層析檢測試劑條放置37°C 20天后檢測，以上各項指標無顯著變化。
權(quán)利要求
1.弓形蟲IgG抗體膠體金免疫層析檢測試劑條，其特征在于設有載體板、加樣墊、膠體金墊、硝酸纖維膜、弓形蟲IgG抗體檢測線、對照線和吸收墊；加樣墊、膠體金墊、硝酸纖維膜和吸收墊依次粘貼在載體板上表面，加樣墊的一端設在膠體金墊的一端上，膠體金墊的另一端設在硝酸纖維膜的一端上，吸收墊的一端設在硝酸纖維膜的另一端上，弓形蟲IgG 抗體檢測線和對照線依次設在硝酸纖維膜上；在弓形蟲IgG抗體檢測線處包被抗人IgG特異性片段Y鏈單克隆抗體，在對照線處包被羊抗弓形蟲抗原SAGl (P30)、SAG2(P22)、R0P2 和GRA7的IgG抗體。
2.如權(quán)利要求1所述的弓形蟲IgG抗體膠體金免疫層析檢測試劑條，其特征在于所述載體板為PVC板。
3.如權(quán)利要求1所述的弓形蟲IgG抗體膠體金免疫層析檢測試劑條的制備方法，其特征在于包括以下步驟1)制備弓形蟲重組抗原SAGl(P30)、SAG2 (P22)、R0P2和GRA7采用基因克隆技術(shù)，PCR擴增編碼弓形蟲抗原的DNA，并插入大腸桿菌中使其表達，得弓形蟲重組抗原 SAGl (P30)、SAG2 (P22)、R0P2 和 GRA7 ；2)硝酸纖維素膜的點樣在硝酸纖維素膜IgG檢測線上包被抗人IgG特異性片段γ鏈單克隆抗體，在對照線處包被羊抗弓形蟲抗原SAGl (P30)、SAG2 (P22)、R0P2和GRA7的IgG抗體，晾干；3)制備膠體金采用檸檬酸三鈉還原方法制備25nm膠體金，取氯金酸ImL加入到IOOmL去離子雙蒸水中，得到的氯金酸濃度為0. 01%，置于帶冷凝裝置的燒瓶中加熱至沸騰，磁力加熱攪拌下加入1 %檸檬酸三鈉水溶液2. OmL,繼續(xù)加熱直至溶液呈葡萄酒色為止，冷卻后置于棕色瓶中4°C冰箱保存?zhèn)溆茫?)膠體金與SAGl (P30)、SAG2 (P22)、ROP2 和 GRA7 的標記(1)膠體金與弓形蟲抗原SAGl(P30)的標記取膠體金10mL，用0. lmol/L NaOH調(diào)至 pH5. 4，加 IOOyg SAGl (P30)，混勻，放置 5min，加入 5% BSA Im L 混勻，4°C、10 000r/min 離心lh，棄上清，將沉淀用TBS緩沖液溶解至10m L，4°C、10 000r/min離心lh，棄上清，沉淀用TBS稀釋至lmL，得膠體金標記的SAGl (P30)抗原；(2)膠體金與弓形蟲抗原SAG2(P22)、R0P2和GRA7的標記方法與步驟(2)相同，得膠體金標記的SAG2 (P22)、R0P2和GRA7抗原；(3)將膠體金標記的SAGl(P30)抗原膠體金標記SAG2(P22)、膠體金標記R0P2和膠體金標記的GRA7抗原混合后，均勻地涂于玻璃纖維膜上，烘干，制備成膠體金墊；5)制備免疫層析檢測條將加樣墊、膠體金墊、硝酸纖維膜和吸收墊依次粘貼在載體板上表面，加樣墊的一端設在膠體金墊的一端上，膠體金墊的另一端設在硝酸纖維膜的一端上，吸收墊的一端設在硝酸纖維膜的另一端上，弓形蟲IgG抗體檢測線和對照線依次設在硝酸纖維膜上；在弓形蟲 IgG抗體檢測線處包被抗人IgG特異性片段γ鏈單克隆抗體，在對照線處包被羊抗弓形蟲抗原SAG1(P30)、SAG2 (P22)、R0P2和GRA7的IgG抗體，用切條機切成條狀，得弓形蟲IgG抗體膠體金免疫層析檢測試劑條。
4.如權(quán)利要求3所述的弓形蟲IgG抗體膠體金免疫層析檢測試劑條的制備方法，其特征在于在步驟2)中，所述抗人IgG特異性片段γ鏈單克隆抗體的濃度為1 ％ig/mL。
5.如權(quán)利要求3所述的弓形蟲IgG抗體膠體金免疫層析檢測試劑條的制備方法，其特征在于在步驟2)中，所述羊抗弓形蟲抗原SAGl (P30)、SAG2 (P22)、R0P2和GRA7的IgG抗體由抗SAGl (P30)抗體、抗SAG2 (P22)、抗R0P2和抗GRA7抗體按體積比1 1 1 1混合，其終濃度為1 細g/mL ；點樣量為1 μ L/cm。
6.如權(quán)利要求3所述的弓形蟲IgG抗體膠體金免疫層析檢測試劑條的制備方法，其特征在于在步驟幻中，所述檸檬酸三鈉的百分比濃度為2 %。
7.如權(quán)利要求3所述的弓形蟲IgG抗體檢測試劑條的制備方法，其特征在于在步驟4)中，所述將膠體金標記的SAGl(P30)抗原、膠體金標記的SAG2(P2》抗原、膠體金標記的 R0P2抗原和膠體金標記的GRA7抗原混合，膠體金標記的SAGl (P30)抗原、膠體金標記的 SAG2 (P22)抗原、膠體金標記的R0P2抗原和膠體金標記的GRA7抗原以體積比1 (0. 2 5) (0. 2 5) (0. 2 5)混合。
8.如權(quán)利要求3所述的弓形蟲IgG抗體膠體金免疫層析檢測試劑條的制備方法，其特征在于在步驟4)中，所述烘干的溫度為37°C。
全文摘要
弓形蟲IgG抗體膠體金免疫層析檢測試劑條及制備方法，涉及一種弓形蟲IgG抗體檢測試劑。提供一種弓形蟲IgG抗體膠體金免疫層析檢測試劑條及其制備方法。試劑條設有載體板、加樣墊、膠體金墊、硝酸纖維膜、弓形蟲IgG抗體檢測線、對照線和吸收墊。制備弓形蟲重組抗原SAG1(P30)、SAG2(P22)、ROP2和GRA7；硝酸纖維素膜的點樣；制備膠體金；膠體金與SAG1(P30)、SAG2(P22)、ROP2和GRA7的標記；制備免疫層析檢測條。該檢測方法所需的標本量極小，不需要特殊儀器，肉眼直接判讀結(jié)果，且檢測簡便快速，特異性強，靈敏度高，準確可靠，成本低，應用廣泛。
文檔編號G01N33/531GK102313811SQ20111027840
公開日2012年1月11日 申請日期2011年9月19日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月19日
發(fā)明者吳統(tǒng)健, 張長弓, 曹鳳玲, 章家新, 郭永煉, 陳桂美 申請人:廈門市仙岳醫(yī)院