專利名稱：：新型熒光報(bào)道分子及其應(yīng)用,包括對(duì)胱天肽酶的測(cè)定的制作方法
背景技術(shù)：
：描述發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明屬于應(yīng)用發(fā)熒光或熒光探針對(duì)酶的細(xì)胞內(nèi)檢測(cè)的領(lǐng)域之中。本發(fā)明涉及新型熒光染料，以及這些染料在制備作為蛋白酶及肽酶底物的新型發(fā)熒光或熒光肽或氨基酸衍生物方面的用途。本發(fā)明尤其涉及新型發(fā)熒光或熒光肽衍生物，它們是與細(xì)胞凋亡有關(guān)的酶如胱天肽酶(caspase)和淋巴細(xì)胞衍生的絲氨酸蛋白酶粒酶B的底物。本發(fā)明也涉及測(cè)定胱天肽酶和其它酶活性的方法，這些酶在來(lái)源于任何健康、病患、感染或癌器官或組織的活或死的全細(xì)胞、細(xì)胞系或組織樣品中參與細(xì)胞凋亡。本發(fā)明也涉及發(fā)熒光或熒光底物在新型測(cè)定系統(tǒng)中用于在化合物集合或化合物文庫(kù)中發(fā)現(xiàn)或檢測(cè)細(xì)胞凋亡抑制劑或誘導(dǎo)劑的應(yīng)用。此外，本發(fā)明涉及發(fā)熒光或熒光底物在測(cè)定癌細(xì)胞對(duì)化療藥治療敏感性方面的應(yīng)用。本發(fā)明也涉及新型發(fā)熒光或熒光肽衍生物，它們是外肽酶(如氨肽酶A和N、甲硫氨酸氨肽酶和二肽基肽酶IV)、內(nèi)膚酶(如鈣激活蛋白酶)、蛋白酶(如HIV蛋白酶、HCMV蛋白酶、HSV蛋白酶、HCV蛋白酶和腺病毒蛋白酶)的底物。相關(guān)技術(shù)生物通過(guò)一種被不同地稱為調(diào)控性細(xì)胞死亡、程序性細(xì)胞死亡或細(xì)胞凋亡的方法來(lái)消除不需要的細(xì)胞。這種細(xì)胞死亡作為動(dòng)物發(fā)育的正常方面，并在組織內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定和老化中發(fā)生(Glucksmann，A.，劍橋哲學(xué)學(xué)會(huì)生物學(xué)綜述(Biol.Rev.CambridgePhilos.Soc.)26:59-86(1951)；Glucksmann，A.，生物學(xué)文獻(xiàn)(ArchivesdeBiologie)76:419-437(1965)；Ellis等人，發(fā)育(Dev.)112:591-603(1991)；Vaux等人，細(xì)胞(Cell)76:777-779(1994))。細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)細(xì)胞數(shù)量、利于形態(tài)發(fā)生、去除有害的或其它異常的細(xì)胞，并消除已經(jīng)行使其功能的細(xì)胞。另外，細(xì)胞凋亡可隨多種生理應(yīng)激反應(yīng)如低氧或局部缺血而發(fā)生(PCT公布申請(qǐng)WO96/20721)。經(jīng)歷調(diào)節(jié)細(xì)胞死亡的細(xì)胞具有多種形態(tài)學(xué)改變，包括質(zhì)膜與核膜起泡、細(xì)胞皺縮(核質(zhì)和細(xì)胞質(zhì)的凝聚)、細(xì)胞器再定位和壓縮、染色質(zhì)凝聚以及凋亡體(包含胞內(nèi)物質(zhì)的膜包圍的顆粒)的產(chǎn)生(Orrenius，S.等人，內(nèi)科學(xué)雜志(J.InternalMedicine)237:529-536(1995))。細(xì)胞凋亡是通過(guò)一種細(xì)胞自殺的內(nèi)源機(jī)制實(shí)現(xiàn)的(Wyllie，A．H.，于《生物學(xué)與病理學(xué)中的細(xì)胞死亡》(CellDeathInBiologyandPathology)，Bowen和Lockshin編，ChapmanandHall(1981)，9-34頁(yè))。由于內(nèi)部或外部信號(hào)細(xì)胞激活其內(nèi)部編碼的自殺程序。該自殺程序是通過(guò)精細(xì)調(diào)節(jié)的遺傳程序的激活而實(shí)現(xiàn)的(Wylie等人，國(guó)際細(xì)胞學(xué)綜述(Int.Rev.Cyt.)68:251(1980)；Ellis等人，細(xì)胞生物學(xué)年述(Ann.Rev.CellBio.)7:663(1991))。凋亡細(xì)胞和凋亡體通常在裂解前被鄰居細(xì)胞或巨噬細(xì)胞識(shí)別并清除。由于這種清除機(jī)制，盡管大量細(xì)胞被清除但不誘發(fā)炎癥(Orrenius，S.，內(nèi)科學(xué)雜志237:529-536(1995))。哺乳動(dòng)物白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)在許多病理過(guò)程中起重要作用，包括慢性及急性炎癥和自身免疫病(Oppenheim，J.H.等人，今日免疫學(xué)(ImmunologyToday)，7,45-56(1986)。IL-1β是作為一種細(xì)胞結(jié)合的前體多肽(前IL-1β)而合成的，它不能結(jié)合IL-1受體，并且無(wú)生物學(xué)活性(Mosley等人，生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem.)262:2941-2944(1987))。通過(guò)抑制前體IL-1β向成熟IL-1β的轉(zhuǎn)化，白細(xì)胞介素-1的活性可受到抑制。IL-1也是一種參與介導(dǎo)多種生物學(xué)反應(yīng)的細(xì)胞因子，包括炎癥、膿毒性休克、創(chuàng)傷愈合、血細(xì)胞生成和某些白血病的發(fā)展(Dinarello，C.A.血液(Blood)77:1627-1652(1991)；diGiovine等人，今日免疫學(xué)11:13(1990))。白細(xì)胞介素-1β轉(zhuǎn)化酶(ICE)是一種負(fù)責(zé)白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)激活的蛋白酶(Thornberry，N．A.等人，自然(Nature)356:768(1992)；Yuan，J.等人，細(xì)胞75:641(1993))。ICE是一種底物特異性半胱氨酸蛋白酶，它切割無(wú)活性的前白細(xì)胞介素-1，產(chǎn)生成熟的IL-1。編碼ICE和CPP32的基因是哺乳動(dòng)物ICE/Ced-3基因家族的成員，該家族目前至少包括12個(gè)成員ICE、CPP32/Yama/Apopain、mICE2、ICE4、ICH1、TX/ICH-2、MCH2、MCH3、MCH4、FLICE/MACH/MCH5、ICE-LAP6和ICEre1Ⅲ。該半胱氨酸蛋白酶家族的蛋白水解活性在介導(dǎo)細(xì)胞死亡中似乎是關(guān)鍵的，其活性位點(diǎn)半胱氨酸殘基對(duì)于ICE介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡是必不可少的(Miura等人，細(xì)胞75:653-660(1993))。該基因家族最近被命名為胱天肽酶(Alnernri，E.S.等人，細(xì)胞87:171(1996))。死亡觸發(fā)物，如腫瘤壞死因子、FAS-配體、氧或養(yǎng)分喪失、病毒、毒素、抗癌藥等等，能以類似于級(jí)聯(lián)(cascade)的方式激活細(xì)胞內(nèi)的胱天肽酶，其中級(jí)聯(lián)上游的胱天肽酶(例如FLICE/MACH/MCH5)能激活級(jí)聯(lián)下游的胱天肽酶(例如CPP-32/Yama/Apopain)。胱天肽酶級(jí)聯(lián)的激活導(dǎo)致細(xì)胞死亡。大量科學(xué)證據(jù)表明，在多種疾病中，當(dāng)不應(yīng)激活時(shí)胱天肽酶級(jí)聯(lián)得到激活。這導(dǎo)致過(guò)度的細(xì)胞自殺和器官衰竭。與胱天肽酶級(jí)聯(lián)的不適當(dāng)激活及隨后細(xì)胞自殺有關(guān)的疾病包括心肌梗死、充血性心力衰竭、自身免疫病、AIDS、病毒感染、腎衰竭、肝衰竭、風(fēng)溫性關(guān)節(jié)炎、局部缺血性中風(fēng)、神經(jīng)變性疾病、動(dòng)脈粥樣硬化等。因此，能阻斷或抑制胱天肽酶級(jí)聯(lián)激活的新藥物的發(fā)現(xiàn)對(duì)大多數(shù)-如果不是全部的話-人體器官系統(tǒng)的退行性疾病的治療將有廣泛影響。也認(rèn)為胱天肽酶在癌癥的發(fā)展和治療中是重要的。有可靠的證據(jù)表明，當(dāng)含有胱天肽酶時(shí)，癌細(xì)胞缺少能激活胱天肽酶級(jí)聯(lián)的部分分子機(jī)器(Los等人，血液，90卷，8號(hào)3118-3129(1997))。這使癌細(xì)胞喪失了經(jīng)歷細(xì)胞自殺的能力，于是細(xì)胞成為無(wú)限增殖的一它們成為癌細(xì)胞。已經(jīng)顯示，化療(抗癌)藥物能通過(guò)再激活休眠的胱天肽酶級(jí)聯(lián)而觸發(fā)癌細(xì)胞經(jīng)歷自殺。這可能是大多數(shù)-如果不是全部的話-已知抗癌藥的作用方式的重要方面(Los等人，血液，90卷，8號(hào)3118-3129(1997)；Friesen等人，自然雜志醫(yī)學(xué)分冊(cè)(Nat.Med.)2:574(1996))?；熕幙赡茉诩せ畈煌愋桶┌Y胱天肽酶系統(tǒng)的能力上有所不同。此外，抗癌藥也可能在激活特定癌癥(例如肺癌)及不同患者中胱天肽酶級(jí)聯(lián)的能力上有所不同。換句話說(shuō)，在如肺癌細(xì)胞對(duì)不同抗癌藥的化學(xué)敏感性方面，患者與患者之間存在差異?？傊?，胱天肽酶級(jí)聯(lián)的過(guò)度激活在多種退行性器官疾病中起重要作用，而無(wú)功能性胱天肽酶系統(tǒng)是癌細(xì)胞的標(biāo)志。抑制或刺激胱天肽酶級(jí)聯(lián)的新藥物可能使許多人類疾病的治療發(fā)生巨大變化，包括傳染病、心血管病、內(nèi)分泌病、腎病、肝病和腦病與免疫系統(tǒng)疾病及癌癥。為了發(fā)現(xiàn)抑制或刺激胱天肽酶級(jí)聯(lián)的藥物，發(fā)展高流通量胱天肽酶激活(HTCA)測(cè)定是必要的。這些HTCA測(cè)定必須能夠測(cè)定活細(xì)胞或全細(xì)胞內(nèi)胱天肽酶級(jí)聯(lián)的激活或抑制。理想地，HTCA測(cè)定應(yīng)能足以通用于測(cè)定任何活細(xì)胞或全細(xì)胞內(nèi)胱天肽酶級(jí)聯(lián)的活性，無(wú)論其來(lái)源如何癌細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞、免疫細(xì)胞、腦細(xì)胞、內(nèi)分泌系統(tǒng)的細(xì)胞、來(lái)自不同器官系統(tǒng)的細(xì)胞或細(xì)胞系、活組織檢查標(biāo)本等。此外，這些HTCA測(cè)定應(yīng)能夠測(cè)定-活細(xì)胞或全細(xì)胞內(nèi)-任何胱天肽酶或參與胱天肽酶級(jí)聯(lián)的任何其它酶的激活或抑制。發(fā)展這些通用的HTCA測(cè)定代表了藥物篩選領(lǐng)域中的極大進(jìn)展。當(dāng)前可應(yīng)用的HTCA測(cè)定不允許對(duì)能激活或抑制胱天肽酶級(jí)聯(lián)的化合物進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)篩選。只有可用的無(wú)細(xì)胞、高流通量篩選測(cè)定能測(cè)定個(gè)別分離的胱天肽酶的活性，或者能測(cè)定例如用滲壓震擾透化處理的死細(xì)胞中胱天肽酶活性的試驗(yàn)(Los等人，血液，90卷，8號(hào)3118-3129(1997))。但是這些酶測(cè)定不能預(yù)測(cè)化合物對(duì)活細(xì)胞中胱天肽酶級(jí)聯(lián)的影響，這是由于下列原因1)無(wú)細(xì)胞測(cè)定，或者使用透化處理的死細(xì)胞的測(cè)定，不能預(yù)測(cè)化合物穿透細(xì)胞膜的能力。這是十分重要的，因?yàn)殡滋祀拿讣?jí)聯(lián)存在于細(xì)胞內(nèi)部。為了成為有活性的，化合物必須不僅能夠調(diào)節(jié)胱天肽酶或其它酶，而且必須能夠穿透完整的細(xì)胞膜。無(wú)細(xì)胞測(cè)定或使用死細(xì)胞的測(cè)定因而不能確定一種化合物是否能用作藥物。2)在無(wú)細(xì)胞測(cè)定中分離的胱天肽酶對(duì)氧化作用和能引起酶氧化的化合物高度敏感。分離的胱天肽酶的這種性質(zhì)使無(wú)細(xì)胞胱天肽酶篩選試驗(yàn)極易出現(xiàn)人為假象，并且阻礙了這些試驗(yàn)對(duì)組合(或其它)化學(xué)文庫(kù)的高流通量篩選的成功應(yīng)用。以前應(yīng)用無(wú)細(xì)胞胱天肽酶測(cè)定的大量篩選嘗試已經(jīng)導(dǎo)致許多氧化胱天肽酶的抑制劑的發(fā)現(xiàn)，但未發(fā)現(xiàn)可用作有效藥物的化合物。其他人也報(bào)道了相似的困難。3)許多細(xì)胞受體、蛋白質(zhì)、細(xì)胞組分和輔因子-其中有很多仍未知-能影響活細(xì)胞中的胱天肽酶級(jí)聯(lián)。無(wú)細(xì)胞胱天肽酶測(cè)定或應(yīng)用透化處理的死細(xì)胞的測(cè)定未考慮這些細(xì)胞受體和輔因子。因此，在無(wú)細(xì)胞或死細(xì)胞胱天肽酶測(cè)定中鑒定的化合物可能在活細(xì)胞中不起作用。另一方面，可能通過(guò)一種細(xì)胞受體或輔因子間接地抑制或刺激胱天肽酶級(jí)聯(lián)的化合物將在無(wú)細(xì)胞或死細(xì)胞胱天肽酶測(cè)定中被漏掉。4)非?？赡艿氖请滋祀拿讣?jí)聯(lián)在來(lái)源于不同器官的細(xì)胞中起不同作用。有越來(lái)越多的證據(jù)表明，影響胱天肽酶級(jí)聯(lián)的受體和輔因子隨細(xì)胞型的不同而不同。利用無(wú)細(xì)胞或死細(xì)胞測(cè)定，鑒定細(xì)胞型或胱天肽酶級(jí)聯(lián)的器官特異性調(diào)節(jié)劑實(shí)際上是不可能的。HTCA測(cè)定系統(tǒng)測(cè)定細(xì)胞內(nèi)胱天肽酶或參與細(xì)胞凋亡的其它任何酶的一種潛在重要應(yīng)用是人類癌癥的化學(xué)敏感性試驗(yàn)。公知人類癌癥對(duì)當(dāng)前市售抗癌藥的敏感性具有遺傳差異例如，一名患者的肺癌細(xì)胞可能對(duì)藥物A敏感，而另一名患者的肺癌可能對(duì)藥物A不敏感，而對(duì)藥物B敏感。不同個(gè)體癌細(xì)胞化學(xué)敏感性的這種藥物遺傳學(xué)差異是一種眾所周知的現(xiàn)象。過(guò)去，試圖在設(shè)計(jì)應(yīng)用一種或多種市售抗癌藥的治療方案之前確定取自個(gè)體患者的癌細(xì)胞的化學(xué)敏感性。然而，化學(xué)敏感性試驗(yàn)未獲得廣泛應(yīng)用，因?yàn)橛嘘P(guān)方法具有一些固有的技術(shù)困難該試驗(yàn)非常耗時(shí)(每次篩選需6天或更長(zhǎng))，并且需要在篩選之前培養(yǎng)細(xì)胞。細(xì)胞培養(yǎng)導(dǎo)致細(xì)胞的克隆選擇，于是培養(yǎng)的細(xì)胞不再代表患者的癌癥。用于快速測(cè)定細(xì)胞內(nèi)胱天肽酶活性的一種HTCA測(cè)定系統(tǒng)能用來(lái)極快速地測(cè)定新切下的癌細(xì)胞的化學(xué)敏感性分布圖。如果該試驗(yàn)具有高流通量，則檢測(cè)取自同一患者如不同轉(zhuǎn)移灶的多個(gè)標(biāo)本的化學(xué)敏感性將是可行的。然后能利用該信息設(shè)計(jì)使用細(xì)胞對(duì)其顯示最大敏感性的市售抗癌藥組合的治療方案。顯然，存在對(duì)HTCA測(cè)定和用于這些測(cè)定的試劑的需要，它們能用于藥物發(fā)現(xiàn)或診斷方法中，來(lái)快速檢測(cè)并測(cè)定化合物的活性，這些化合物能激活或抑制活或死全細(xì)胞內(nèi)部的胱天肽酶級(jí)聯(lián)或參與細(xì)胞凋亡的其它酶。用于這類細(xì)胞測(cè)定的試劑理想地應(yīng)滿足下列條件a)在胱天肽酶或參與細(xì)胞凋亡的其它酶切開(kāi)肽-報(bào)道分子的酰胺鍵后，在肽-報(bào)道分子與報(bào)道分子之間的熒光信號(hào)應(yīng)當(dāng)具有巨大差別，優(yōu)選地肽-報(bào)道分子應(yīng)當(dāng)是無(wú)熒光的，最優(yōu)選地肽-報(bào)道分子應(yīng)當(dāng)是無(wú)熒光且無(wú)色的；b)肽-報(bào)道分子應(yīng)當(dāng)是可透過(guò)細(xì)胞的，因此在分子中應(yīng)當(dāng)有最低數(shù)量的親水基團(tuán)，并且分子大小優(yōu)選地應(yīng)當(dāng)較??；c)一旦肽-報(bào)道分子穿過(guò)細(xì)胞膜之后，優(yōu)選地不能擴(kuò)散到細(xì)胞之外；d)一旦肽釋放后，報(bào)道分子優(yōu)選地不能擴(kuò)散到細(xì)胞之外。與無(wú)細(xì)胞酶測(cè)定相比，在全細(xì)胞中篩選細(xì)胞凋亡抑制劑或誘導(dǎo)劑的方法也能用于篩選胱天肽酶之外的酶的抑制劑。傳統(tǒng)上，首先用無(wú)細(xì)胞酶測(cè)定鑒定酶抑制劑。然后用細(xì)胞培養(yǎng)物進(jìn)行第二次試驗(yàn)，來(lái)估計(jì)完整細(xì)胞中活性化合物的活性?？赏高^(guò)細(xì)胞的發(fā)熒光或熒光底物使得直接在活全細(xì)胞中篩選蛋白酶和肽酶以及其它酶的抑制劑成為可能。相比無(wú)細(xì)胞酶測(cè)定，全細(xì)胞測(cè)定有幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)。其中一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是，在全細(xì)胞測(cè)定中，抑制劑必須要穿過(guò)被檢測(cè)的細(xì)胞。因?yàn)榛罴?xì)胞中的許多蛋白酶受其它蛋白質(zhì)、受體或基因的調(diào)節(jié)，所以應(yīng)用活細(xì)胞的篩選將允許鑒定能通過(guò)結(jié)合活性位點(diǎn)而干擾細(xì)胞蛋白酶的小分子化合物，以及鑒定能通過(guò)干擾轉(zhuǎn)錄、翻譯、生物合成、亞基裝配、細(xì)胞輔因子或信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制(或者對(duì)于病毒蛋白酶，病毒向宿主細(xì)胞的進(jìn)入)而調(diào)節(jié)蛋白酶功能的化合物。此外，在細(xì)胞中存在豐富的氨肽酶，這些氨肽酶能用于對(duì)全細(xì)胞測(cè)定的發(fā)熒光或熒光底物設(shè)計(jì)，其在無(wú)細(xì)胞酶測(cè)定中不起作用。因此，需要發(fā)展全細(xì)胞中的高流通量篩選(HTS)試驗(yàn)和用于這些試驗(yàn)的試劑，以能用于藥物發(fā)現(xiàn)或診斷方法。AGM-1470(也稱作TNP-470)是一種在臨床試驗(yàn)中用于多種癌癥的血管生成抑制劑。最近兩個(gè)獨(dú)立的研究組發(fā)現(xiàn)了AGM-1470的作用機(jī)制(Sin，N.等人，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊(Pro.Natl.Acad.Sci.U.SA.)94:6099-6103(1997)；Griffith，E.C.等人，化學(xué)與生物學(xué)(Chem.Biol.)4:461-471(1997))。他們發(fā)現(xiàn)，AGM-1470及類似物是2型甲硫氨酸氨肽酶(MetAP-2)的抑制劑。對(duì)一系列AGM-1470類似物測(cè)定了內(nèi)皮細(xì)胞增殖抑制及甲硫氨酸氨肽酶活性抑制的能力，發(fā)現(xiàn)兩種活性之間有顯著相關(guān)性。公知血管生成抑制劑能夠選擇性殺傷癌細(xì)胞，因此對(duì)MetAP-2抑制劑的細(xì)胞篩選試驗(yàn)可產(chǎn)生新型抗癌藥。因此MetAP-2的可透過(guò)細(xì)胞的發(fā)熒光或熒光底物能用于內(nèi)皮細(xì)胞中MetAP-2抑制劑的篩選，這將產(chǎn)生新型抗癌劑。最近顯示HIV蛋白酶抑制劑如ritonavir和viracept在對(duì)HIV感染患者的治療中非常有效。這些抑制劑是根據(jù)HIV蛋白酶底物的結(jié)構(gòu)而設(shè)計(jì)的。首先測(cè)定這些抑制劑對(duì)HIV蛋白酶的活性。然后對(duì)活性化合物檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)物中HIV感染的抑制。HIV蛋白酶的可透過(guò)細(xì)胞的發(fā)熒光或熒光底物能用于HIV感染細(xì)胞中HIV蛋白酶抑制劑的篩選，這將加速新型HIV蛋白酶抑制劑的發(fā)現(xiàn)過(guò)程，并產(chǎn)生對(duì)HIV感染的更好的新型療法。由于HIV蛋白酶在病毒復(fù)制后期加工病毒前體蛋白質(zhì)，所以也能用HIV蛋白酶之可透過(guò)細(xì)胞的發(fā)熒光或熒光底物篩選在HIV感染早期抑制基因轉(zhuǎn)錄或翻譯、病毒進(jìn)入或其它關(guān)鍵蛋白質(zhì)的化合物。發(fā)熒光或熒光底物也能用于對(duì)HIV感染的診斷，它可能比當(dāng)前應(yīng)用的方法更靈敏。根據(jù)相同的原理，組織蛋白酶B之可透過(guò)細(xì)胞的發(fā)熒光或熒光底物也能用于組織蛋白酶B抑制劑的篩選。二肽基肽酶IV之可透過(guò)細(xì)胞的發(fā)熒光或熒光底物能用于二肽基肽酶IV抑制劑的篩選。腎素之可透過(guò)細(xì)胞的發(fā)熒光或熒光底物能用于腎素抑制劑的篩選，而腺病毒蛋白酶或其它病毒蛋白酶之可透過(guò)細(xì)胞的發(fā)熒光或熒光底物能用于腺病毒蛋白酶或其它病毒蛋白酶抑制劑的篩選。美國(guó)專利號(hào)4,557,862和4,640,893公開(kāi)了羅丹明110衍生物，它們是具有下式的蛋白酶的熒光底物其中R1和R2相同或不同的，選自氨基酸、氨基酸衍生物、保護(hù)的氨基酸、保護(hù)的氨基酸衍生物和肽。典型的(AA)2-羅丹明和(肽)2-羅丹明是(Z-Arg)2-羅丹明110、(Arg)2-羅丹明110、(Z-Ala-Arg)2-羅丹明110、(Z-Gln-Arg)2-羅丹明110、(Z-Glu-Arg)2-羅丹明110、(Z-Gly-Arg)2-羅丹明110、(Z-Leu-Arg)2-羅丹明110、(Z-Met-Arg)2-羅丹明110、(Z-Phe-Arg)2-羅丹明110、(Z-Pro-Arg)2-羅丹明110、(Z-Trp-Arg)2-羅丹明110、(Z-Val-Arg)2-羅丹明110和(Z-Ile-Pro-Arg)2-羅丹明110。WO96/36729公開(kāi)了用來(lái)測(cè)定代謝活性全細(xì)胞內(nèi)酶活性的化合物或其鹽。據(jù)說(shuō)該試驗(yàn)化合物包含一種離去基團(tuán)和一種指示基團(tuán)。離去基團(tuán)選自氨基酸、肽、糖類、硫酸、磷酸、酯、磷酸酯、核苷酸、多核苷酸、核酸、嘧啶、嘌呤、核苷、脂類及混合物。指示基團(tuán)選自當(dāng)與離去階段連接時(shí)具有第一種狀態(tài)、而當(dāng)用酶從指示基團(tuán)上切除離去基團(tuán)時(shí)具有第二種狀態(tài)的化合物。優(yōu)選的指示化合物據(jù)認(rèn)為是羅丹明110、對(duì)甲氨基酚和熒光素及這些化合物的類似物。該專利申請(qǐng)列出了許多酶和酶的底物。美國(guó)專利5,576,424公開(kāi)了用來(lái)分析細(xì)胞代謝活性的報(bào)道分子的鹵烷基衍生物，其具有通式XR-間隔區(qū)-報(bào)道分子-保護(hù)區(qū)其中-保護(hù)區(qū)是一種選擇的基團(tuán)，可通過(guò)特異性分析物的作用去除，產(chǎn)生不同于底物的報(bào)道光譜特性；報(bào)道分子是這樣一種分子，當(dāng)不再通過(guò)保護(hù)區(qū)-報(bào)道分子鍵與保護(hù)區(qū)結(jié)合時(shí)，其具有不同于底物的光譜特性；間隔區(qū)是一種共價(jià)鍵；XR-是一種鹵烷基部分，它能與細(xì)胞內(nèi)硫醇共價(jià)反應(yīng)，形成一種硫醚共軛物。優(yōu)選的報(bào)道化合物據(jù)認(rèn)為包括羅丹明110、對(duì)甲氨基酚、熒光素等等。發(fā)明概述本發(fā)明涉及具有通式Ⅰx-y-z(Ⅰ)的發(fā)熒光或熒光報(bào)道化合物或其生物學(xué)可接受的鹽或前報(bào)道分子(pro-reporter)(如含羧基氨基酸殘基的甲酯形式)，其中x和z相同或不同，為肽或氨基酸或?；蚱渌Y(jié)構(gòu)，使得通式Ⅰ的化合物成為胱天肽酶的底物，或其它蛋白酶或肽酶或其它酶的底物；當(dāng)x與z相同時(shí)，易分裂鍵只是通式Ⅰ中x-y和y-z鍵之一或兩者均是，或者當(dāng)x與z不同時(shí)，易分裂鍵只是通式Ⅰ中x-y或y-z鍵之一。y是發(fā)熒光或熒光部分。優(yōu)選的化合物表示為通式ⅡR1-(AA)n-Asp-y-Asp-(AA)n-R1(Ⅱ)或其生物學(xué)可接受的鹽或前報(bào)道分子(如含羧基氨基酸殘基的甲酯形式)，其中R1是N端保護(hù)基，如叔丁氧羰基、?；推S氧羰基；每個(gè)AA獨(dú)立地為任何天然或非天然α-氨基酸或β-氨基酸的殘基，或α-氨基酸或β-氨基酸的衍生物；每個(gè)n獨(dú)立地為0-5；y是發(fā)熒光或熒光部分。優(yōu)選的y是羅丹明，包括羅丹明110、羅丹明116和羅丹明19。最優(yōu)選的y是羅丹明110。特別優(yōu)選的化合物表示為通式Ⅲ或其生物學(xué)可接受的鹽或前報(bào)道分子(如含羧基氨基酸殘基的甲酯形式)，其中R1、AA、n如前通式Ⅱ中所述。優(yōu)選的R1是叔丁氧羰基、?；推S氧羰基。優(yōu)選的n值為1-3。本發(fā)明也涉及通式Ⅲ的化合物的制備方法，包括(a)使羅丹明與N-fmoc-L-天冬氨酸β-叔丁酯一起縮合，產(chǎn)生(Fmoc-Asp(OBu-t))2-羅丹明；(b)除去Fmoc基，得到(Asp(OBu-t))2-羅丹明；(c)使(Asp(OBu-t))2-羅丹明與Z-(AA)n縮合，產(chǎn)生(Z-(AA)n-Asp(OBu-t))2-羅丹明；及(d)除去OBu-t保護(hù)基。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，-(AA)n為WEHSEQIDNO:1、YVASEQIDNO:2、LEHSEQIDNO:3、DETSEQIDNO:4、DEVSEQIDNO:5、DEHSEQIDNO:6、VEHSEQIDNO:7、LETSEQIDNO:8、LEVSEQIDNO:9、SHVSEQIDNO:10、DELSEQIDNO:11、DGPSEQIDNO:12、DEPSEQIDNO:13、DGTSEQIDNO:14、DLNSEQIDNO:15、DEESEQIDNO:16、DSLSEQIDNO:17、DVPSEQIDNO:18、DEASEQIDNO:19、DSYSEQIDNO:20、ELPSEQIDNO:21、VEDSEQIDNO:22、IEPSEQIDNO:23或IETSEQIDNO:24，含羧基的氨基酸用OBu-t基保護(hù)，在最后步驟中除去該OBu-t基。在通式Ⅰ范圍內(nèi)的另一組優(yōu)選化合物包括x與z不同的化合物。該組的優(yōu)選化合物包括如下化合物，其中x是一種肽或其它結(jié)構(gòu)，使該化合物成為胱天肽酶的底物，或其它蛋白酶或肽酶或其它酶的底物；并且通式Ⅰ中的x-y鍵在生物學(xué)條件下是易分裂鍵。z是保護(hù)基團(tuán)，通式Ⅰ中的y-z鍵在生物學(xué)條件下不是易分裂鍵。尤其，本發(fā)明的新型發(fā)熒光或熒光報(bào)道化合物具有通式ⅤR1-(AA)n-Asp-y-R6(Ⅴ)或其生物學(xué)可接受的鹽或前報(bào)道分子(如含羧基氨基酸殘基的甲酯形式)，其中R1、AA、n和y如前通式Ⅱ中所述；并且R6是一種保護(hù)基團(tuán)，不是氨基酸或氨基酸的衍生物。尤其，通式Ⅴ的化合物的優(yōu)選實(shí)施方案表示為通式Ⅶ或其生物學(xué)可接受的鹽或前報(bào)道分子(如含羧基氨基酸殘基的甲酯形式)，其中R1、R6、AA和n如前通式Ⅱ及Ⅴ中所述；R2和R3相同或不同，獨(dú)立地為氫、烷基或芳基；并且R4和R5相同或不同，獨(dú)立地為氫或烷基。通式Ⅰ的化合物的另一組優(yōu)選實(shí)施方案表示為通式Ⅷ或其生物學(xué)可接受的鹽或前報(bào)道分子(如含羧基氨基酸殘基的甲酯形式)，其中R1、R6、AA和n如前通式Ⅱ及Ⅴ中所述；m是0-3的整數(shù)；R2和R3相同或不同，獨(dú)立地為氫、烷基或芳基；并且R4和R5相同或不同，獨(dú)立地為氫或烷基。通式Ⅰ的化合物的另一組優(yōu)選實(shí)施方案表示為通式Ⅸ或其生物學(xué)可接受的鹽或前報(bào)道分子(如含羧基氨基酸殘基的甲酯形式)，其中R1、R6、AA和n如前通式Ⅱ及Ⅴ中所述；m是0-3的整數(shù)；R2和R3相同或不同，獨(dú)立地為氫、烷基或芳基；并且R4和R5相同或不同，獨(dú)立地為氫或烷基。本發(fā)明也涉及通式Ⅶ的化合物的制備方法，包括(a)使羅丹明與乙酸酐反應(yīng)，產(chǎn)生通式Ⅵ的N-乙?；?羅丹明；(b)使通式Ⅵ的N-乙?；?羅丹明與N-fmoc-L-天冬氨酸β-叔丁酯一起縮合，產(chǎn)生N-(Fmoc-Asp(OBu-t))-N'-乙?；?羅丹明；(c)除去Fmoc基，得到N-(Asp(OBu-t))-N'-乙?；?羅丹明；(d)使N-(Asp(OBu-t))-N'-乙酰基-羅丹明與Z-(AA)n縮合，產(chǎn)生N-(Z-(AA)n-Asp(OBu-t))-N'-乙酰基-羅丹明；及(e)除去OBu-t保護(hù)基，得到N-(Z-(AA)n-Asp)-N'-乙酰基-羅丹明；或者備擇地(a)使羅丹明與乙酸酐反應(yīng)，產(chǎn)生通式Ⅵ的N-乙酰基-羅丹明；(b)使通式Ⅵ的N-乙?；?羅丹明與Z-(AA)n-Asp(β-OBu-t)縮合，產(chǎn)生N-(Z-(AA)n-Asp(OBu-t))-N'-乙酰基-羅丹明；及(c)除去OBu-t保護(hù)基，得到N-(Z-(AA)n-Asp)-N'-乙?；?羅丹明。在該實(shí)施方案中，(AA)n包括如谷氨酸或天冬氨酸的氨基酸，羧基作為OBu-t基受到保護(hù)，其在最后一步被切除。因此，本發(fā)明也涉及作為羅丹明衍生物的通式Ⅵ的新型熒光染料。這些化合物的制備方法是將保護(hù)基團(tuán)R6引入羅丹明的兩個(gè)氨基之一。通式Ⅵ中的R2HN基提供了附著點(diǎn)，用于與可能的酶底物如N端保護(hù)肽的羧基反應(yīng)，形成肽酰胺鍵。該反應(yīng)將使通式Ⅵ的熒光分子轉(zhuǎn)化為通式Ⅶ-Ⅸ的非熒光肽-報(bào)道分子，后者是蛋白酶或肽酶的底物。蛋白酶或肽酶對(duì)肽-報(bào)道分子中易分裂肽-報(bào)道分子酰胺鍵的切割產(chǎn)生通式Ⅵ或Ⅵ'的熒光化合物。尤其，本發(fā)明的新型熒光染料具有通式Ⅵ或生物學(xué)可接受的鹽，其中R2和R3相同或不同，獨(dú)立地為氫、烷基或芳基；R6是一種保護(hù)基團(tuán)，不是氨基酸或氨基酸衍生物；R4和R5相同或不同，獨(dú)立地為氫或烷基。優(yōu)選的R2和R3是氫、甲基或乙基；優(yōu)選的R4和R5是氫或甲基。本發(fā)明也涉及一種方法，其應(yīng)用通式Ⅰ所代表的報(bào)道化合物測(cè)定活或死全細(xì)胞或組織中胞內(nèi)胱天肽酶的活性或參與細(xì)胞凋亡的其它酶的活性。本發(fā)明也涉及應(yīng)用通式Ⅰ所代表的化合物的方法和此處所述的測(cè)定法，用于測(cè)定試驗(yàn)物質(zhì)對(duì)任何活或死全細(xì)胞或(正?；虬?組織內(nèi)任何胱天肽酶的激活或抑制。通式Ⅰ所代表的化合物是可透過(guò)細(xì)胞的，即，它們能被引入全細(xì)胞或組織標(biāo)本中。這些化合物是發(fā)熒光或熒光的，可以設(shè)計(jì)為對(duì)于任何已知的胱天肽酶或參與細(xì)胞凋亡的其它任何胞內(nèi)酶而言特異的。Thornberry，N.A.等人，生物化學(xué)雜志272:17907(1997)描述了多種胱天肽酶底物和粒酶B底物的最佳序列。這些最佳底物序列示于表1中。表1*這些酶用新的及舊的(括號(hào)中)命名法標(biāo)識(shí)。**用氨基酸的標(biāo)準(zhǔn)單字母縮寫(xiě)表示最佳氨基酸序列。利用Thornberry等人所述的最佳序列，按此處所述的方法能合成特異性胱天肽酶的發(fā)熒光或熒光底物。利用已知或潛在的胱天肽酶天然底物的已知或潛在切割位點(diǎn)肽序列，也能夠設(shè)計(jì)已知或未知胱天肽酶的其它發(fā)熒光或熒光底物。表2描述了對(duì)應(yīng)于可能是胱天肽酶天然底物的蛋白質(zhì)中已知或潛在切割位點(diǎn)的肽序列。表2*用氨基酸的標(biāo)準(zhǔn)單字母縮寫(xiě)表示氨基酸序列。通過(guò)設(shè)計(jì)能由超過(guò)一種的參與胱天肽酶級(jí)聯(lián)的酶所識(shí)別并切割的底物，發(fā)熒光或熒光底物也能用來(lái)同時(shí)測(cè)定超過(guò)一種的酶。用此處所述的測(cè)定法，可以應(yīng)用對(duì)于超過(guò)一種胱天肽酶而言為“混雜的”發(fā)熒光或熒光底物測(cè)定至今仍未知的胱天肽酶的活性。當(dāng)胱天肽酶級(jí)聯(lián)由誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的刺激所激活時(shí)，此處所述的發(fā)熒光或熒光報(bào)道分子被切割，并具有熒光發(fā)射大大增強(qiáng)的反應(yīng)。能用分光熒光法測(cè)定熒光的變化。也能用報(bào)道分子測(cè)定不經(jīng)受凋亡的細(xì)胞中的基線胱天肽酶活性。該方法適用于高流通量或超高流通量篩選試驗(yàn)。該測(cè)定系統(tǒng)是多用途的。下面列出了該測(cè)定系統(tǒng)的多用途性的實(shí)例1．能用該試驗(yàn)就任何胱天肽酶或參與細(xì)胞凋亡的其它任何酶的基線活性篩選細(xì)胞或組織。2．能同樣容易地利用該試驗(yàn)篩選能激活或抑制胱天肽酶級(jí)聯(lián)的化合物。這意味著能用該試驗(yàn)篩選治療退行性疾病的藥物或治療癌癥的藥物。3．能用該試驗(yàn)篩選任何活的或死的細(xì)胞(或細(xì)胞系)中的胱天肽酶級(jí)聯(lián)激活或抑制，這些細(xì)胞來(lái)源于身體的任何器官系統(tǒng)，包括但不限于毛發(fā)、腦、周圍神經(jīng)系統(tǒng)、眼、耳、鼻、口、扁桃體、牙齒、食道、肺、心臟、血液、血管、骨髓、淋巴結(jié)、胸腺、脾、免疫系統(tǒng)、肝、胃、腸道、胰、內(nèi)分泌腺及組織、腎、膀胱、生殖器及生殖腺、關(guān)節(jié)、骨和皮膚。能用該試驗(yàn)篩選在身體任何器官系統(tǒng)的任何與胱天肽酶級(jí)聯(lián)功能失常有關(guān)的疾病中具有潛在用途的藥物。4．能用該試驗(yàn)篩選可直接或間接調(diào)節(jié)胱天肽酶級(jí)聯(lián)的藥物，即，通過(guò)調(diào)節(jié)胱天肽酶本身或通過(guò)調(diào)節(jié)影響胱天肽酶級(jí)聯(lián)的細(xì)胞受體和輔因子來(lái)調(diào)節(jié)。5．能用該試驗(yàn)確定胱天肽酶級(jí)聯(lián)調(diào)節(jié)劑所干擾的作用位點(diǎn)。即，該試驗(yàn)?zāi)苡兄诓槊餍滦碗滋祀拿讣?jí)聯(lián)調(diào)節(jié)藥物作用的分子機(jī)制。本發(fā)明也涉及通式Ⅰ所代表的發(fā)熒光或熒光底物的應(yīng)用，用于發(fā)現(xiàn)新化合物，或已知化合物在減少、預(yù)防或治療凋亡性細(xì)胞死亡為其病因或結(jié)果的疾病方面的新用途。本發(fā)明的應(yīng)用實(shí)例包括篩選在病灶性局部缺血和完全性缺血后能保護(hù)神經(jīng)系統(tǒng)的化合物；篩選能治療神經(jīng)變性疾病的化合物，如阿爾茨海默病、huntington舞蹈病、朊病毒病、帕金森氏癥、多發(fā)性硬化癥、肌萎縮側(cè)索硬化，共濟(jì)失調(diào)、毛細(xì)管擴(kuò)張和脊髓延髓萎縮；篩選能治療心臟病的化合物，包括心肌梗死、充血性心力衰竭和心肌病；篩選能治療視網(wǎng)膜疾病的化合物；篩選治療自身免疫病的化合物，包括紅斑狼瘡、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、Ⅰ型糖尿病、舍格倫綜合征和腎小球腎炎；篩選治療多囊腎病和貧血/紅細(xì)胞生成的化合物；篩選治療免疫系統(tǒng)疾病包括AIDS和SCIDS的化合物；篩選減少或防止移植期間細(xì)胞、組織及器官損傷(例如在骨髓移植過(guò)程中的移植物抗宿主病)的化合物；篩選在工業(yè)生物工程中減少或防止細(xì)胞系死亡的化合物；篩選減少或防止脫毛(毛發(fā)損失)的化合物；以及篩選減少皮膚細(xì)胞成熟前死亡的化合物。本發(fā)明也涉及通式Ⅰ所代表的發(fā)熒光或熒光底物在篩選方法中的應(yīng)用，其中為了具有抗腫瘤或抗癌活性的化合物篩查已知藥物的文庫(kù)或組合或其它化合物文庫(kù)。癌細(xì)胞或細(xì)胞系可來(lái)源于身體任何內(nèi)臟或外部器官系統(tǒng)的任何癌癥，包括但不限于腦、周圍神經(jīng)系統(tǒng)、眼、耳、鼻、口、扁桃體、牙齒、食道、肺、心臟、血液、血管、骨髓、淋巴結(jié)、胸腺、脾、免疫系統(tǒng)、肝、胃、腸道、胰、內(nèi)分泌腺及組織、腎、膀胱、生殖器及生殖腺(例如前列腺)、關(guān)節(jié)、骨和皮膚。本發(fā)明也涉及通式Ⅰ所代表的發(fā)熒光或熒光底物在診斷方法中的應(yīng)用，用于確定取自動(dòng)物或人類的癌細(xì)胞對(duì)化療藥治療的化學(xué)敏感性或抗性。癌細(xì)胞或細(xì)胞系可來(lái)源于身體任何內(nèi)臟或外部器官系統(tǒng)的任何癌癥，包括但不限于腦、周圍神經(jīng)系統(tǒng)、眼、耳、鼻、口、扁桃體、牙齒、食道、肺、心臟、血液、血管、骨髓、淋巴結(jié)、胸腺、脾、免疫系統(tǒng)、肝、胃、腸道、胰、內(nèi)分泌腺及組織、腎、膀胱、生殖器及生殖腺(例如前列腺)、關(guān)節(jié)、骨和皮膚。本發(fā)明尤其涉及檢測(cè)一種或多種細(xì)胞中參與細(xì)胞凋亡級(jí)聯(lián)的酶的方法，包括(a)在一定條件下使一種或多種細(xì)胞與根據(jù)本發(fā)明的報(bào)道化合物接觸，從而使該報(bào)道化合物被一種或多種細(xì)胞吸收，和(b)記錄一種或多種細(xì)胞的熒光，其中與未如此接觸的對(duì)照細(xì)胞或接觸報(bào)道化合物和一種已知競(jìng)爭(zhēng)性酶抑制劑的對(duì)照細(xì)胞相比，一種或多種細(xì)胞內(nèi)熒光在數(shù)值(即增加)或波長(zhǎng)上的變化表明酶的存在。本發(fā)明也涉及一種測(cè)定一種或多種細(xì)胞中參與細(xì)胞凋亡級(jí)聯(lián)的酶活性的方法，包括(a)在一定條件下使一種或多種細(xì)胞與根據(jù)本發(fā)明的報(bào)道化合物接觸，從而使該報(bào)道化合物被一種或多種細(xì)胞吸收，和(b)記錄一種或多種細(xì)胞的熒光，其中與未如此接觸的對(duì)照細(xì)胞或接觸報(bào)道化合物和一種已知競(jìng)爭(zhēng)性酶抑制劑的對(duì)照細(xì)胞相比，一種或多種細(xì)胞內(nèi)熒光在數(shù)值或波長(zhǎng)上的相對(duì)變化是酶活性的量度。本發(fā)明也涉及一種方法，用于確定試驗(yàn)物質(zhì)對(duì)一種或多種試驗(yàn)細(xì)胞中參與細(xì)胞凋亡級(jí)聯(lián)的酶是否有影響，包括(a)在一定條件下使一種或多種試驗(yàn)細(xì)胞與試驗(yàn)物質(zhì)和根據(jù)本發(fā)明的報(bào)道化合物相接觸，從而使報(bào)道化合物被該一種或多種細(xì)胞吸收，而試驗(yàn)物質(zhì)或者與外膜受體相互作用，或者被該細(xì)胞吸收，和(b)記錄試驗(yàn)細(xì)胞的熒光，其中與只接觸報(bào)道化合物、未接觸試驗(yàn)物質(zhì)的對(duì)照細(xì)胞相比，該細(xì)胞內(nèi)熒光在數(shù)值或波長(zhǎng)上的變化表明該試驗(yàn)物質(zhì)對(duì)待檢測(cè)的細(xì)胞凋亡酶具有直接或間接的影響。在本發(fā)明該方面的實(shí)施中，試驗(yàn)細(xì)胞可在接觸根據(jù)本發(fā)明的報(bào)道化合物之前、之后或基本上同時(shí)接觸所述試驗(yàn)物質(zhì)?？捎迷摲椒z查試驗(yàn)物質(zhì)是否刺激或抑制酶活性。本發(fā)明也涉及在第一種試驗(yàn)物質(zhì)的存在下進(jìn)一步使試驗(yàn)細(xì)胞與第二種試驗(yàn)物質(zhì)或試驗(yàn)物質(zhì)的混合物接觸。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，試驗(yàn)細(xì)胞是一種癌細(xì)胞或細(xì)胞系，來(lái)源于需要用化療藥治療的病人，而試驗(yàn)物質(zhì)是一種化療劑或化療劑的混合物。本發(fā)明也涉及一種方法，用于確定患有癌癥的動(dòng)物對(duì)一種或多種化療劑治療的敏感性，包括(a)在一定條件下使取自該動(dòng)物的癌細(xì)胞與一種或多種化療劑及根據(jù)本發(fā)明的報(bào)道化合物相接觸，從而使報(bào)道化合物被癌細(xì)胞吸收，而一種或多種藥劑或者與外膜受體相互作用，或者被該細(xì)胞吸收，和(b)記錄癌細(xì)胞的熒光，其中與只接觸該報(bào)道化合物的對(duì)照細(xì)胞相比，癌細(xì)胞內(nèi)熒光在數(shù)值或波長(zhǎng)上的變化表明該癌細(xì)胞對(duì)一種或多種藥劑是化學(xué)敏感的，并且該動(dòng)物對(duì)該治療敏感。本發(fā)明也涉及一種監(jiān)測(cè)應(yīng)用一種或多種化療藥對(duì)動(dòng)物的治療的方法，包括(a)對(duì)動(dòng)物施用一種或多種化療藥，(b)在一定條件下將施用后采自該動(dòng)物的細(xì)胞與根據(jù)本發(fā)明的報(bào)道化合物接觸，從而使該報(bào)道化合物被該細(xì)胞吸收，和(c)記錄與報(bào)道化合物接觸的細(xì)胞的熒光，與施用前取自該動(dòng)物的對(duì)照細(xì)胞相比，施用后取自該動(dòng)物的細(xì)胞內(nèi)熒光在數(shù)值或波長(zhǎng)上的變化表明該動(dòng)物對(duì)該化療劑敏感。在該實(shí)施方案中，動(dòng)物可能患有凋亡性細(xì)胞死亡是其病因或結(jié)果的一種疾病。本發(fā)明也涉及一種方法，用于確定試驗(yàn)物質(zhì)是否抑制或阻止一種或多種試驗(yàn)細(xì)胞中的細(xì)胞死亡，包括(a)在一定條件下使試驗(yàn)細(xì)胞與試驗(yàn)物質(zhì)及根據(jù)本發(fā)明的報(bào)道化合物相接觸，從而使該試驗(yàn)物質(zhì)或者與外膜受體相互作用或者被該細(xì)胞吸收，而報(bào)道化合物被該細(xì)胞吸收，和(b)記錄試驗(yàn)細(xì)胞的熒光，其中與只接觸報(bào)道化合物的對(duì)照細(xì)胞相比，試驗(yàn)細(xì)胞內(nèi)熒光在數(shù)值或波長(zhǎng)上的變化表明該試驗(yàn)物質(zhì)抑制或阻止細(xì)胞死亡。本發(fā)明也涉及一種方法，用于確定試驗(yàn)物質(zhì)是否引起或增強(qiáng)一種或多種試驗(yàn)細(xì)胞的細(xì)胞死亡，包括(a)在一定條件下使試驗(yàn)細(xì)胞與試驗(yàn)物質(zhì)及根據(jù)本發(fā)明的報(bào)道化合物相接觸，從而使該試驗(yàn)物質(zhì)與外膜受體相互作用或被該細(xì)胞吸收，并且報(bào)道化合物被該細(xì)胞吸收，和(b)記錄試驗(yàn)細(xì)胞的熒光，其中與只接觸報(bào)道化合物的對(duì)照細(xì)胞相比，試驗(yàn)細(xì)胞內(nèi)熒光在數(shù)值或波長(zhǎng)上的變化表明該試驗(yàn)物質(zhì)引起或增強(qiáng)細(xì)胞死亡。本發(fā)明也涉及一種應(yīng)用通式Ⅸ所代表的報(bào)道化合物測(cè)定活全細(xì)胞中胞內(nèi)肽酶和蛋白酶活性的方法，這些酶包括但不限于內(nèi)皮細(xì)胞中的2型甲硫氨酸氨肽酶和HIV感染細(xì)胞中的HIV蛋白酶。本發(fā)明也涉及應(yīng)用通式Ⅸ所代表的化合物的方法和此處所述的測(cè)定法，用來(lái)測(cè)定一種或多種試驗(yàn)化合物對(duì)活全細(xì)胞內(nèi)酶的抑制或激活。通式Ⅸ所代表的報(bào)道化合物是可透過(guò)細(xì)胞的，即，它們能被引入全細(xì)胞中。這些化合物是發(fā)熒光或熒光的，并且能設(shè)計(jì)為對(duì)于已知目的酶如甲硫氨酸氨肽酶或HIV蛋白酶特異的。本發(fā)明也涉及一種檢測(cè)一種或多種細(xì)胞中病毒蛋白酶的方法，包括(a)在一定條件下使該細(xì)胞與根據(jù)本發(fā)明的報(bào)道化合物相接觸，從而使報(bào)道化合物被該細(xì)胞吸收，和(b)記錄該細(xì)胞的熒光，其中與未如此接觸的對(duì)照細(xì)胞相比，該細(xì)胞內(nèi)熒光的變化或增強(qiáng)表明病毒蛋白酶的存在。本發(fā)明也涉及一種測(cè)定一種或多種病毒感染細(xì)胞中病毒蛋白酶活性的方法，包括(a)在一定條件下使一種或多種病毒感染細(xì)胞與根據(jù)本發(fā)明的報(bào)道化合物相接觸，從而使該報(bào)道化合物被一種或多種病毒感染細(xì)胞吸收，和(b)記錄該一種或多種細(xì)胞的熒光，其中與未如此接觸的對(duì)照細(xì)胞相比，一種或多種病毒感染細(xì)胞內(nèi)熒光的變化或增強(qiáng)是病毒蛋白酶活性的量度。本發(fā)明也涉及一種方法，用于確定試驗(yàn)物質(zhì)對(duì)一種或多種病毒感染細(xì)胞中的病毒蛋白酶活性是否有影響，包括(a)在一定條件下使病毒感染的試驗(yàn)細(xì)胞與試驗(yàn)物質(zhì)及根據(jù)本發(fā)明的報(bào)道化合物相接觸，從而使該報(bào)道化合物被感染的試驗(yàn)細(xì)胞吸收，和(b)記錄感染試驗(yàn)細(xì)胞的熒光，與只接觸該報(bào)道化合物的感染對(duì)照細(xì)胞相比較，其中與感染的對(duì)照細(xì)胞相比，感染的試驗(yàn)細(xì)胞內(nèi)熒光的變化或增強(qiáng)表明該試驗(yàn)物質(zhì)對(duì)病毒蛋白酶有影響。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，細(xì)胞是HIV感染的細(xì)胞，病毒蛋白酶是HIV蛋白酶。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，細(xì)胞是腺病毒感染的細(xì)胞，病毒蛋白酶是腺病毒蛋白酶。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，細(xì)胞是HSV感染的細(xì)胞，病毒蛋白酶是HSV蛋白酶。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，細(xì)胞是HCMV感染的細(xì)胞，病毒蛋白酶是HCMV蛋白酶。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，細(xì)胞是HCV感染的細(xì)胞，病毒蛋白酶是HCV蛋白酶。本發(fā)明也涉及一種測(cè)定細(xì)胞內(nèi)蛋白酶或肽酶活性的方法，包括(a)在一定條件下使試驗(yàn)細(xì)胞與根據(jù)本發(fā)明的報(bào)道化合物接觸，從而使報(bào)道化合物被試驗(yàn)細(xì)胞吸收，或者報(bào)道化合物與該細(xì)胞的外膜蛋白酶或肽酶相互作用，和(b)記錄細(xì)胞的熒光，其中與未如此接觸的對(duì)照細(xì)胞相比，試驗(yàn)細(xì)胞內(nèi)熒光的變化或增強(qiáng)是蛋白酶或肽酶活性的量度。本發(fā)明也涉及一種方法，用于確定試驗(yàn)物質(zhì)對(duì)試驗(yàn)細(xì)胞內(nèi)的蛋白酶或肽酶活性是否有影響，包括(a)在一定條件下使試驗(yàn)細(xì)胞與試驗(yàn)物質(zhì)及根據(jù)本發(fā)明的報(bào)道化合物相接觸，從而使報(bào)道化合物被試驗(yàn)細(xì)胞吸收，或者報(bào)道化合物與該細(xì)胞的外膜蛋白酶或肽酶相互作用，和(b)記錄試驗(yàn)細(xì)胞的熒光，與只接觸報(bào)道化合物的對(duì)照細(xì)胞相比較，其中與對(duì)照細(xì)胞相比，試驗(yàn)細(xì)胞內(nèi)熒光的變化或增強(qiáng)表明該試驗(yàn)物質(zhì)對(duì)該蛋白酶或肽酶有影響。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，細(xì)胞是內(nèi)皮細(xì)胞，肽酶是2型甲硫氨酸氨肽酶。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，細(xì)胞是T細(xì)胞，肽酶是二肽基肽酶IV。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，細(xì)胞是神經(jīng)元細(xì)胞，蛋白酶是鈣激活蛋白酶。附圖簡(jiǎn)述圖1A-1F描述用N-辛氧羰基-羅丹明110(圖1A)、N-癸氧羰基-羅丹明110(圖1B)、N-十二烷基氧羰基-羅丹明110(圖1C)、N-己氧羰基-羅丹明110(圖1D)、N-(乙硫基)羰基-羅丹明110(圖1E)和羅丹明110(圖1F)染色的HL-60細(xì)胞的照片。圖2A-2L描述與HL-60對(duì)照(DMSO處理的)裂解物(圖2F、2I和2L)相比，長(zhǎng)春花堿處理的(圖2C、2E、2H和2K)和r-胱天肽酶-3處理的(圖2A、2B、2D、2G和2J)HL-60細(xì)胞裂解物對(duì)胱天肽酶底物裂解的條形圖，底物N-Z-VD-N'-乙氧羰基-R110、N-Z-EVD-N'-乙氧羰基-R110、N-Z-DEVD-N'-乙氧羰基-R110SEQIDNO:5、N-Ac-DEVD-N'-乙氧羰基-R110SEQIDNO:5、N-Ac-DEVD-N'-辛氧羰基-R110SEQIDNO:5、N-Ac-DEVD-N'-己氧羰基-R110SEQIDNO:5和N-Z-DEVD-N'-(乙硫基)羰基-R110SEQIDNO:5。圖3A-3E描述通過(guò)與N-Ac-DEVD-N'-辛氧羰基-R110SEQIDNO:5溫育染色的細(xì)胞的照片。長(zhǎng)春花堿(圖3A)和DMSO(圖3B)處理的HL-60細(xì)胞、在測(cè)定階段加入N-Ac-DEVD-CHOSEQIDNO:5的長(zhǎng)春花堿處理的HL-60細(xì)胞(圖3C)、抗Fas(圖3D)和PBS(圖3E)處理的Jurkat細(xì)胞。圖4描述了一幅圖，顯示抗FAS和PBS處理的Jurkat細(xì)胞對(duì)N-Ac-DEVD-N'-辛氧羰基-R110SEQIDNO:5切割試驗(yàn)的結(jié)果。圖5描述一幅條形圖，顯示胱天肽酶-3、-6、-7及-8對(duì)N-Ac-LEVD-N'-乙氧羰基-R110SEQIDNO:5切割試驗(yàn)的結(jié)果。圖6描述一幅條形圖，為HL-60裂解物對(duì)N-Z-G-N'-辛氧羰基-R110和N-G-N'-辛氧羰基-R110切割試驗(yàn)的結(jié)果。圖7A-B描述用N-Z-G-N'-辛氧羰基-R11O(A)和N-G-N'-辛氧羰基-R110(B)處理的HL-60細(xì)胞的照片。發(fā)明詳述本發(fā)明的發(fā)熒光或熒光底物是具有通式Ⅰx-y-z(Ⅰ)的化合物或其生物學(xué)可接受的鹽或前報(bào)道分子(如含羧基氨基酸殘基的甲酯形式)，其中x與z相同或不同，為肽或氨基酸或酰基或其它結(jié)構(gòu)，使得通式Ⅰ的化合物成為胱天肽酶或其它蛋白酶或肽酶或其它酶的底物；當(dāng)x與z相同時(shí)，易分裂鍵只是通式Ⅰ中x-y和y-z鍵之一或兩者均是，或者當(dāng)x與z不同時(shí)，易分裂鍵只是通式Ⅰ中x-y或y-z鍵之一。y是發(fā)熒光或熒光部分。處于通式Ⅰ范圍之內(nèi)的優(yōu)選化合物包括x與z相同并且與y連接的第一個(gè)氨基酸為Asp的化合物。最優(yōu)選地，x與z相同，并且是胱天肽酶的N端保護(hù)的四肽底物，包括WEHDSEQIDNO:1、YVADSEQIDNO:2、LEHDSEQIDNO:3、DETDSEQIDNO:4、DEVDSEQIDNO:5、DEHDSEQIDNO:6、VEHDSEQIDNO:7、LETDSEQIDNO:8、LEHDSEQIDNO:3、SHVDSEQIDNO:10、DELDSEQIDNO:11、DGPDSEQIDNO:12、DEPDSEQIDNO:13、DGTDSEQIDNO:14、DLNDSEQIDNO:15、DEEDSEQIDNO:16、DSLDSEQIDNO:17、DVPDSEQIDNO:18、DEADSEQIDNO:19、DSYDSEQIDNO:20、ELPDSEQIDNO:21、VEIDSEQIDNO:26、IETDSEQIDNO:24，或者是粒酶B的N端保護(hù)的四肽底物，包括IEPDSEQIDNO:23和VEPDSEQIDNO:27；或者x與z相同，并且是N端保護(hù)的肽，對(duì)應(yīng)于由胱天肽酶四肽底物的1、2或3個(gè)氨基酸組成的羧基端或氨基端片段，包括WEHDSEQIDNO:1、YVADSEQIDNO:2、LEHDSEQIDNO:3、DETDSEQIDNO:4、DEVDSEQIDNO:5、DEHDSEQIDNO:6、VEHDSEQIDNO:7、IETDSEQIDNO:8、LEHDSEQIDNO:3、SHVDSEQIDNO:10、DELDSEQIDNO:11、DGPDSEQIDNO:12、DEPDSEQIDNO:13、DGTDSEQIDNO:14、DLNDSEQIDNO:15、DEEDSEQIDNO:16、DSLDSEQIDNO:17、DVPDSEQIDNO:18、DEADSEQIDNO:19、DSYDSEQIDNO:20、ELPDSEQIDNO:21、VEIDSEQIDNO:26、IETDSEQIDNO:24，及粒酶B的底物包括IEPDSEQIDNO:23和VEPDSEQIDNO:27。處于通式Ⅰ范圍之內(nèi)的優(yōu)選化合物包括其中y是羅丹明110的化合物。尤其，通式Ⅰ的化合物的優(yōu)選實(shí)施方案表示為通式ⅡR1-(AA)n-Asp-y-Asp-(AA)n-R1(Ⅱ)或其生物學(xué)可接受的鹽或前報(bào)道分子(如含羧基氨基酸殘基的甲酯形式)，其中R1是N端保護(hù)基，包括叔丁氧羰基、乙?；推S氧羰基；每個(gè)AA獨(dú)立地為任何天然或非天然α-氨基酸或β-氨基酸的殘基，或α-氨基酸或β-氨基酸的衍生物；每個(gè)n獨(dú)立地為0-5；y是發(fā)熒光或熒光部分。前報(bào)道分子的一個(gè)實(shí)例是組成通式Ⅱ化合物的含羧基氨基酸殘基的甲酯形式。前報(bào)道分子的另一個(gè)實(shí)例是通式Ⅱ化合物的含羧基氨基酸殘基的乙酸基(AM)甲酯形式。已知含羧基化合物的AM酯是細(xì)胞可透性的，并能被細(xì)胞內(nèi)的酯酶水解。一旦水解后，含羧基的化合物即成為不能透過(guò)細(xì)胞的，并且被捕獲于細(xì)胞內(nèi)(Adams等人，美國(guó)化學(xué)學(xué)會(huì)雜志(J.Am.Chem.Soc.)111:7957-7968(1989))。通過(guò)使相應(yīng)的含羧基化合物與乙酸溴甲酯反應(yīng)能制備AM酯。通式I之化合物的特別優(yōu)選實(shí)施方案表示為通式Ⅲ或其生物學(xué)可接受的鹽或前報(bào)道分子(如含羧基氨基酸殘基的甲酯形式)，其中R1、AA、n如前通式Ⅱ中所述。優(yōu)選的R1是叔丁氧羰基、乙酰基和芐氧羰基。優(yōu)選的n值是1-3。在通式Ⅰ范圍內(nèi)的另一組優(yōu)選化合物包括其中x與z不同的化合物。該組的優(yōu)選化合物包括如下化合物，其中x是一種肽或其它結(jié)構(gòu)，使該化合物成為胱天肽酶或其它蛋白酶或肽酶或其它酶的底物；并且通式Ⅰ中的x-y鍵在生物學(xué)條件下為易分裂鍵；z是保護(hù)基團(tuán)，通式Ⅰ中的y-z鍵在生物學(xué)條件下不是易分裂鍵。最優(yōu)選地，x是胱天肽酶的N端保護(hù)的四肽底物，包括:WEHDSEQIDNO:1、YVADSEQIDNO:2、LEHDSEQIDNO:3、DETDSEQIDNO:4、DEVDSEQIDNO:5、DEHDSEQIDNO:6、VEHDSEQIDNO:7、LETDSEQIDNO:8、LEHDSEQIDNO:3、SHVDSEQIDNO:10、DELDSEQIDNO:11、DGPDSEQIDNO:12、DEPDSEQIDNO:13、DGTDSEQIDNO:14、DLNDSEQIDNO:15、DEEDSEQIDNO:16、DSLDSEQIDNO:17、DVPDSEQIDNO:18、DEADSEQIDNO:19、DSYDSEQIDNO:20、ELPDSEQIDNO:21、VEIDSEQIDNO:26、IETDSEQIDNO:24，或者是粒酶B的N端保護(hù)的四肽底物，包括IEPDSEQIDNO:23和VEPDSEQIDNO:27；或者x是N端保護(hù)的肽，對(duì)應(yīng)于由胱天肽酶四肽底物的1、2或3個(gè)氨基酸組成的羧基端或氨基端片段，包括WEHDSEQIDNO:1、YVADSEQIDNO:2、LEHDSEQIDNO:3、DETDSEQIDNO:4、DEVDSEQIDNO:5、DEHDSEQIDNO:6、VEHDSEQIDNO:7、LETDSEQIDNO:8、LEHDSEQIDNO:3、SHVDSEQIDNO:10、DELDSEQIDNO:11、DGPDSEQIDNO:12、DEPDSEQIDNO:13、DGTDSEQIDNO:14、DLNDSEQIDNO:15、DEEDSEQIDNO:16、DSLDSEQIDNO:17、DVPDSEQIDNO:18、DEADSEQIDNO:19、DSYDSEQIDNO:20、ELPDSEQIDNO:21、VEIDSEQIDNO:26、IETDSEQIDNO:24，或粒酶B的底物，包括IEPDSEQIDNO:23和VEPDSEQIDNO:27；或者x是N端保護(hù)的肽，對(duì)應(yīng)于由胱天肽酶四肽底物的1、2、3或4個(gè)氨基酸組成的羧基端或氨基端片段，包括:WEHDSEQIDNO:1、YVADSEQIDNO:2、LEHDSEQIDNO:3、DETDSEQIDNO:4、DEVDSEQIDNO:5、DEHDSEQIDNO:6、VEHDSEQIDNO:7、LETDSEQIDNO:8、LEHDSEQIDNO:3、SHVDSEQIDNO:10、DELDSEQIDNO:11、DGPDSEQIDNO:12、DEPDSEQIDNO:13、DGTDSEQIDNO:14、DLNDSEQIDNO:15、DEEDSEQIDNO:16、DSLDSEQIDNO:17、DVPDSEQIDNO:18、DEADSEQIDNO:19、DSYDSEQIDNO:20、ELPDSEQIDNO:21、VEIDSEQIDNO:26、IETDSEQIDNO:24，和粒酶B的底物，包括IEPDSEQIDNO:23和VEPDSEQIDNO:27，加上對(duì)應(yīng)于胱天肽酶底物P'1-P'2部分的1-2個(gè)氨基酸，包括G、A、GA、GG和AG。尤其，本發(fā)明的新型發(fā)熒光或熒光報(bào)道化合物具有通式ⅤR1-(AA)n-Asp-y-R6(Ⅴ)或其生物學(xué)可接受的鹽或前報(bào)道分子(如含羧基氨基酸殘基的甲酯形式)，其中R1是N端保護(hù)基，包括叔丁氧羰基、乙?；?、辛酰基和芐氧羰基；每個(gè)AA獨(dú)立地為任何天然或非天然α-氨基酸或β-氨基酸的殘基，或α-氨基酸或β-氨基酸的衍生物；n為0-5；y是發(fā)熒光或熒光部分；且R6是一種保護(hù)基團(tuán)，不是氨基酸或氨基酸的衍生物。尤其，本發(fā)明的通式Ⅶ-Ⅸ的新型發(fā)熒光或熒光報(bào)道分子是羅丹明的衍生物，包括羅丹明110、羅丹明116和羅丹明19。這些新型發(fā)熒光或熒光報(bào)道分子的制備方法是，首先將保護(hù)基團(tuán)R4引入羅丹明的兩個(gè)氨基之一中，產(chǎn)生通式Ⅵ的新型熒光染料。剩余的HNR2基與一種有效的酶底物反應(yīng)，產(chǎn)生通式Ⅶ-Ⅸ的發(fā)熒光底物。通過(guò)保護(hù)羅丹明的兩個(gè)氨基之一，與雙重取代的羅丹明如雙肽-羅丹明相比底物的總體積降低。更為重要的是，選擇保護(hù)基團(tuán)使得a)它在生物學(xué)條件下穩(wěn)定且不能水解，于是排除了氨基酸，因?yàn)榧?xì)胞中存在的肽酶能有效地切開(kāi)形成的肽鍵；b)優(yōu)選地不要太龐大(例如較小)，以降低肽-報(bào)道分子的總體積，使得它成為一種較好的酶底物；c)優(yōu)選地在性質(zhì)上是疏水的，以便提高發(fā)熒光或熒光報(bào)道分子的細(xì)胞通透性。優(yōu)選的R6保護(hù)基團(tuán)包括但不限于C2-12烷氧羰基，如甲氧羰基、乙氧羰基、己氧羰基、辛氧羰基、癸氧羰基和十二烷氧羰基；C2-12(烷硫基)羰基，如(乙硫基)羰基、(己硫基)羰基、(辛硫基)羰基；芳烷基氧羰基，如芐氧羰基、C2-12酰基(烷?；?，如乙?；托刘；?、氨基甲酰基，如二甲基氨基甲酰、N-甲基-N-己基氨基甲酰，和烷基、鹵烷基或芳烷基，磺?；缂谆酋；?。特別優(yōu)選的R6保護(hù)基團(tuán)是CH3OCO-、CH3(CH2)pOCO-(p=1-11)、Cbz、Cl3CCH2OCO-和PhCH2CH2OCO-(氨基甲酸酯系列)；Me(OCH2CH2)qOCO-(q=1-4)和CH3(CH2)r(OCH2CH2)sOCO-(r=0-5，s=1-4)(烷氧基烷基氨基甲酸酯系列)；EtSCO-、H3(CH2)5SCO-、CH3(CH2)7SCO-、CH3(CH2)9SCO-和CH3(CH2)tSCO-(t=0-11)(硫代氨基甲酸酯系列)；Ts-、PhSO2-、MeSO2、CH3(CH2)uSO2-(u=0-11)、PhCH2SO2-和CF3SO2-(氨磺酰系列)；Me2NCO-、Et2NCO-和N-Me-N-CH3(CH2)vNCO-(v=0-9)(尿素系列)；和HCO-、H3CO-、CH3(CH2)wCO(W=0-9)、PhCH2CO-和PhCO-(酰胺系列)。最優(yōu)選的R6保護(hù)基團(tuán)含有一種類似于膜脂的疏水基，從而提高發(fā)熒光或熒光報(bào)道分子的細(xì)胞通透性，以及靶向蛋白酶或肽酶切割底物后熒光部分在細(xì)胞中的保留。這些優(yōu)選的R6保護(hù)基團(tuán)包括但不限于CH3(CH2)pOCO-(p=1-11)(氨基甲酸酯系列)；Me(OCH2CH2)qOCO-(q=1-4)和CH3(CH2)r(OCH2CH2)sOCO-(r=0-5，s=1-4)(烷氧基烷基氨基甲酸酯系列)；EtSCO-、CH3(CH2)5SCO-、CH3(CH2)7SCO-和CH3(CH2)9SCO-(硫代氨基甲酸酯系列)；CH3(CH2)tSO2-(t=0-11)(氨磺酰系列)；N-Me-N-CH3(CH2)uNCO-(u=0-9)(尿素系列)；和CH3(CH2)wCO(W=0-9)(酰胺系列)。通式Ⅶ-Ⅸ的新型發(fā)熒光或熒光報(bào)道分子的制備方法是，使通式Ⅵ的新型熒光染料的氨基NHR2與潛在的酶底物如N端保護(hù)肽的羧基反應(yīng)，形成肽酰胺鍵。該反應(yīng)使通式Ⅵ的熒光分子轉(zhuǎn)化為通式Ⅷ-Ⅸ的無(wú)熒光肽-報(bào)道分子，它是蛋白酶或肽酶的底物。因此通式Ⅶ的保護(hù)基團(tuán)R6-N鍵不應(yīng)被切割而肽-報(bào)道分子酰胺鍵在生物學(xué)條件下應(yīng)為易分裂鍵是非常重要的。蛋白酶或肽酶對(duì)通式Ⅶ-Ⅸ的易分裂肽-報(bào)道分子酰胺鍵的酶切產(chǎn)生通式Ⅵ或Ⅵ'的熒光化合物。通式Ⅴ的化合物的特別優(yōu)選實(shí)施方案表示為通式Ⅶ或其生物學(xué)可接受的鹽或前報(bào)道分子(如含羧基氨基酸殘基的甲酯形式)，其中R2和R3相同或不同，獨(dú)立地為氫、烷基或芳基；R6是一種保護(hù)基團(tuán)，不是氨基酸或氨基酸的衍生物；R4和R5相同或不同，獨(dú)立地為氫或烷基；R1是N端保護(hù)基；每個(gè)AA獨(dú)立地為任何天然或非天然α-氨基酸或β-氨基酸的殘基，或α-氨基酸或β-氨基酸的衍生物；n為0-5；易分裂鍵是通式Ⅶ中的Asp-N鍵。優(yōu)選的R2和R3是氫、甲基或乙基；優(yōu)選的R4和R5是氫或甲基。優(yōu)選的氨基酸包括天然氨基酸，包括酪氨酸、甘氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、丙氨酸、絲氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、蘇氨酸、纈氨酸、脯氨酸、賴氨酸、組氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、色氨酸、精氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺和半胱氨酸。非天然氨基酸包括叔丁基甘氨酸和N,N-二甲基谷氨酰胺。前報(bào)道分子的一個(gè)實(shí)例是包含通式Ⅶ化合物的含羧基氨基酸殘基的甲酯形式。前報(bào)道分子的另一個(gè)實(shí)例是通式Ⅶ化合物的含羧基氨基酸殘基的乙酸基甲基(AM)酯形式。通式Ⅰ的化合物的另一組優(yōu)選實(shí)施方案表示為通式Ⅷ或其生物學(xué)可接受的鹽或前報(bào)道分子(如含羧基氨基酸殘基的甲酯形式)，其中R1、R6、AA和n如前通式Ⅱ和Ⅴ中所述；m為0-3的整數(shù)；R2和R3相同或不同，獨(dú)立地為氫、烷基或芳基；而R4和R5相同或不同，獨(dú)立地為氫或烷基。通式Ⅷ的化合物是胱天肽酶或與細(xì)胞凋亡有關(guān)的其它酶的新型發(fā)熒光或熒光底物。當(dāng)m為0時(shí)，Asp與羅丹明之間酰胺鍵的裂解使發(fā)熒光底物轉(zhuǎn)化為通式Ⅵ的熒光染料。當(dāng)m不是0時(shí)，Asp與(AA)m之間酰胺鍵的裂解將使羅丹明與NH2-(AA)m連接。然后細(xì)胞中存在的氨肽酶除去剩余的氨基酸(AA)m，產(chǎn)生通式Ⅵ的熒光染料?？蓪?AA)m設(shè)計(jì)為符合胱天肽酶或凋亡相關(guān)酶底物酶切位點(diǎn)的P'序列。胱天肽酶或凋亡相關(guān)酶的已知底物的P'序列的引入預(yù)計(jì)將提高發(fā)熒光底物的特異性及親和力。由于氨肽酶廣泛存在于細(xì)胞中，所以對(duì)于全細(xì)胞測(cè)定，能在通式Ⅷ的底物設(shè)計(jì)時(shí)插入(AA)m序列。這是全細(xì)胞測(cè)定法優(yōu)于無(wú)細(xì)胞酶測(cè)定法的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)。例如，當(dāng)(AA)m為Gly時(shí)，通式Ⅷ的底物可適用于全細(xì)胞測(cè)定，而在無(wú)細(xì)胞胱天肽酶測(cè)定中則不適用，因?yàn)锳sp-Gly酰胺鍵的裂解將使Gly與羅丹明連接，它是無(wú)熒光的。前報(bào)道分子的一個(gè)實(shí)例是包含通式Ⅷ化合物的含羧基氨基酸殘基的甲酯或乙酯形式。前報(bào)道分子的另一個(gè)實(shí)例是通式Ⅷ化合物的含羧基氨基酸殘基的乙酸基甲基(AM)酯或新戊酸甲基(PM)酯形式。已知含羧基化合物的AM酯是可透過(guò)細(xì)胞的，并能被細(xì)胞內(nèi)的酯酶水解。一旦水解，含羧基化合物即變?yōu)榧?xì)胞不透性的，并被捕獲至細(xì)胞內(nèi)(Adams等人，美國(guó)化學(xué)學(xué)會(huì)雜志111:7957-7968(1989))。通過(guò)使相應(yīng)的含羧基化合物與乙酸溴甲酯反應(yīng)能制備AM酯。通式Ⅰ的化合物的再另一組優(yōu)選實(shí)施方案表示為通式Ⅸ或其生物學(xué)可接受的鹽或其前報(bào)道分子(如含羧基氨基酸殘基的甲酯形式)，其中R1、R6、AA和n如前通式Ⅱ和Ⅴ中所述；m為0-3的整數(shù)；R2和R3相同或不同，獨(dú)立地為氫、烷基或芳基；而R4和R5相同或不同，獨(dú)立地為氫或烷基。優(yōu)選的R1是叔丁氧羰基、乙?；?、辛?；?、十二烷?；推S氧羰基。優(yōu)選的n為1-4。優(yōu)選的R2和R3為氫、甲基或乙基。優(yōu)選的R4和R5為氫或甲基。優(yōu)選的R6保護(hù)基包括但不限于C2-12烷氧羰基，如甲氧羰基、乙氧羰基、己氧羰基、辛氧羰基、癸氧羰基和十二烷氧羰基；C2-12(烷硫基)羰基，如(乙硫基)羰基、(己硫基)羰基、(辛硫基)羰基；芳基烷氧羰基，如芐氧羰基；C2-12?；?烷?；?，如乙酰基和辛?；?；氨基甲?；缍谆被柞；-甲基-N-己基氨基甲?；缓屯榛?、鹵烷基或芳烷基磺?；缂谆酋；?。在通式Ⅸ中，(AA)n設(shè)計(jì)為一種氨基酸或肽，它作為p側(cè)序列被特異性肽酶或蛋白酶識(shí)別，并能被靶向肽酶或蛋白酶酶切。(AA)m設(shè)計(jì)為一種氨基酸或肽，它作為P'側(cè)序列被特異性肽酶或蛋白酶識(shí)別，并能被細(xì)胞中存在的氨肽酶去除。當(dāng)R1是N端保護(hù)基如叔丁氧羰基、Cbz或乙?；鶗r(shí)，通式Ⅸ的化合物是內(nèi)肽酶(如組織蛋白酶D)或蛋白酶(如HIV蛋白酶)的底物；當(dāng)R1是H時(shí)，通式Ⅸ的化合物是外肽酶(如甲硫氨酸氨肽酶)的底物。特別將通式Ⅸ的化合物設(shè)計(jì)為2型甲硫氨酸氨肽酶(MetAP-2)的底物。最近兩個(gè)研究小組(Griffith，E.C.等人，化學(xué)與生物學(xué)4:461-471(1997)和Sin，N.等人，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊94:6099-6103(1997))鑒定MetAP-2為血管生成抑制劑AGM-1470-目前經(jīng)受臨床試驗(yàn)的一種抗癌藥-的常見(jiàn)目標(biāo)。MetAP-2是一種雙功能酶，它也通過(guò)影響eIF-2的磷酸化狀態(tài)調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)合成。據(jù)報(bào)道AGM-1470只抑制MetAP-2的氨肽酶活性，對(duì)MetAP-2的調(diào)節(jié)活性沒(méi)有影響(Griffith，E.C.等人，化學(xué)與生物學(xué)4:461-471(1997))。由于公知血管生成抑制劑如AGM-1470能夠選擇性殺傷癌細(xì)胞，所以預(yù)計(jì)MetAP-2的抑制劑具有抗血管生成性質(zhì)，是一種潛在的新型抗癌劑。MetAP-2是一種依賴鈷的酶，能水解某些蛋白質(zhì)的氨基端甲硫氨酸。其優(yōu)選的底物是Met-X-Y。X是含有不帶電的小側(cè)基的氨基酸，如Gly、Ala、Ser，而公知Leu、Met、Arg和Tyr將導(dǎo)致無(wú)活性的底物。Y可以是Ser、Met、Gly或其它氨基酸(Li，X.和Y.-H.，生物化學(xué)與生物物理學(xué)研究通訊(Biochem.Biophy.Res.Com.)227:152-159(1996))。因?yàn)榱_丹明比氨基酸大很多，所以甲硫氨酸直接連接于羅丹明的化合物很可能不是MetAP-2的底物。利用全細(xì)胞中氨肽酶的存在，甲硫氨酸與羅丹明之間(AA)m序列的插入將形成MetAP-2的一種良好底物。預(yù)計(jì)這類底物適用于全細(xì)胞測(cè)定，但在無(wú)細(xì)胞MetAP-2酶測(cè)定中則不適用。對(duì)于設(shè)計(jì)為MetAP-2底物的通式Ⅸ的化合物，優(yōu)選的R1是H，優(yōu)選的(AA)n是Met，優(yōu)選的(AA)m是Gly、Ala、Gly-Gly、Ala-Gly或Gly-Ala。在內(nèi)皮細(xì)胞中2型甲硫氨酸氨肽酶將切下甲硫氨酸，產(chǎn)生與(AA)m連接的羅丹明。然后存在于細(xì)胞內(nèi)的氨肽酶切除(AA)m，產(chǎn)生通式Ⅵ的熒光染料。通式Ⅸ的化合物可用于內(nèi)皮細(xì)胞中MetAP-2抑制劑的篩選，預(yù)計(jì)這將導(dǎo)致新型抗癌藥的鑒定。也能將通式Ⅸ的化合物設(shè)計(jì)為HIV蛋白酶的底物。HIV蛋白酶是一種天冬氨酸蛋白酶，它能加工由gag和pol基因轉(zhuǎn)錄的多肽，對(duì)于傳染性病毒的成熟是至關(guān)重要的。因此，HIV蛋白酶是HIV的化學(xué)治療性干預(yù)的重要目標(biāo)之一。最近，幾種HIV蛋白酶抑制劑顯示在HIV治療中具有極大的潛能，并獲準(zhǔn)上市。這些HIV蛋白酶抑制劑中的大多數(shù)是根據(jù)蛋白酶底物的結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)的。因此，這些化合物是肽或肽結(jié)構(gòu)模擬物(peptidomimetics)。對(duì)新型HIV蛋白酶抑制劑的尋找預(yù)期將得到對(duì)抗這種致死性疾病的更有效的藥物。HIV蛋白酶的優(yōu)選底物是在P1-P1'之間具有易分裂疏水-疏水肽鍵或芳族-脯氨酸肽鍵的肽(West，M.L．和Fairlie，D.P.，藥理學(xué)趨勢(shì)(Trand.Pharm.Sci.)16:67-74(1995))。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)病毒gag和gag-pol蛋白質(zhì)中的九個(gè)獨(dú)特位點(diǎn)能被蛋白酶切開(kāi)(Martin，J.A.等人，藥物化學(xué)進(jìn)展(Prog.Med.Chem.)32:239-287(1995)。這九個(gè)位點(diǎn)的P4-P3'序列是Ser-Gln-Asn-Tyr-Pro-Ile-ValSEQIDNO:28、Ala-Arg-Val-Leu-Ala-Glu-AlaSEQIDNO:29、Ala-Thr-Ile-Met-Met-Gln-ArgSEQIDNO:30、Arg-Gln-Ala-Asn-Phe-Leu-GlySEQIDNO:31、Pro-Gly-Asn-Phe-Leu-Gln-SerSEQIDNO:32、Ser-Phe-Ser-Phe-Pro-Gln-IleSEQIDNO:33、Thr-Leu-Asn-Phe-Pro-Ile-SerSEQIDNO:34、Ala-Glu-Thr-Phe-Tyr-Val-AspSEQIDNO:35和Arg-Lys-Val-Leu-Phe-Leu-AspSEQIDNO:36。根據(jù)這些天然底物已為HIV蛋白酶活性測(cè)定制備了HIV蛋白酶的多種發(fā)熒光、放射性或顯色底物。根據(jù)p24/p15酶切位點(diǎn)衍生的六肽底物制備了一種分子內(nèi)淬滅的發(fā)熒光底物-2-氨基苯甲酰-Thr-Ile-Nle-(4-NO2-Phe)-gln-Arg-NH2SEQIDNO:141，其中易分裂鍵是Nle-(4-NO2-Phe)(Toth，M.V.和Marshall，G.R.，國(guó)際肽與蛋白質(zhì)研究雜志(Int.J.Pept.ProteinRes.)36:544-550(1990))。Tamburini等人報(bào)道了利用HPLC用底物N-Dns-Ser-Gln-Asn-Tyr-Pro-Ile-ValSEQIDNO:28對(duì)HIV蛋白酶活性的熒光測(cè)定(Tamburini，P.P.等人，分析生物化學(xué)(Anal.Biochem.)186:363-368(1990))，其中Tyr-Pro是易分裂鍵。已經(jīng)發(fā)展了許多其它的HIV蛋白酶底物，其中從HIV蛋白酶底物切割位點(diǎn)的P側(cè)和P'側(cè)都引入了序列，包括發(fā)熒光的N-α-苯甲酰基-Arg-Gly-Phe-Pro-MeO-β-萘酰胺SEQIDNO:37，其含有能被HIV-1蛋白酶識(shí)別的Phe-Pro二肽鍵(Tyagi，S.C.和Carter，C.A.，分析生物化學(xué)200:143-148(1992))；放射性標(biāo)記的七肽底物，[酪氨酰-3,5-3H]Ac-Ser-Gln-Asn-Tyr-Pro-Val-Val-NH2SEQIDNO:38，它是基于在病毒多蛋白底物Pr55gag中發(fā)現(xiàn)的p17-p24切割位點(diǎn)Tyr-Pro(Hyland，L.J.等人，分析生物化學(xué)188:408-415(1990))；基于血管緊張肽Ⅰ的肽Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe-His-Leu-Leu-Glu-Glu-SerSEQIDNO:39，它產(chǎn)生血管緊張肽Ⅰ(AngⅠ)和Leu-Glu-Glu-SerSEQIDNO:40(Evans，D.B.等人，分析生物化學(xué)206:288-292(1992))；分子內(nèi)熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)底物4-(4-二甲基氨基苯偶氮基)苯甲酸(DABCYL)-Ser-Gln-Asn-Tyr-Pro-Ile-Val-Gln-5-[(2-氨乙基)氨基]萘-1SEQIDNO:41磺酸(EDANS)，其中Tyr-Pro是切割位點(diǎn)(Matayoshi，E.D.等人，科學(xué)247:954-958(1990))；和發(fā)色肽底物H-Ser-Gln-Asn-Leu-Phe(NO2)-Leu-Asp-Gly-NH2SEQIDNO:42和乙酰基-Arg-Lys-Ile-Leu-Phe(NO2)-Leu-Asp-Gly-NH2SEQIDNO:43，其中對(duì)硝基苯丙氨酰和亮氨酰殘基之間的酰胺鍵是易分裂鍵。另外，報(bào)道了發(fā)色底物L(fēng)ys-Ala-Arg-Val-Leu-Phe(NO2)-Glu-Ala-MetSEQIDNO:44，其中Leu-Phe(NO2)是切割位點(diǎn)(Richards，A.D.等人，生物化學(xué)雜志265:7733-7736(1990))。SAR研究發(fā)現(xiàn)，如在不同pH值時(shí)所測(cè)定的，用正亮氨酸、Met、Phe或Tyr取代P1中的Leu殘基對(duì)動(dòng)力學(xué)參數(shù)(Kcat和Kcat/Km)具有最小的影響，而發(fā)現(xiàn)在P1中含有Ile或Val的肽水解極其緩慢。利用全細(xì)胞中非特異性氨肽酶的存在，通式Ⅸ的HIV蛋白酶的發(fā)熒光或熒光底物能設(shè)計(jì)為從HIV底物P側(cè)與P'側(cè)都摻入氨基酸，以用于全細(xì)胞測(cè)定。預(yù)計(jì)在HIV蛋白酶切下P側(cè)肽序列后，P'側(cè)的肽序列將被細(xì)胞中存在的氨膚酶切除。對(duì)于設(shè)計(jì)為HIV蛋白酶底物的通式Ⅸ的化合物，優(yōu)選的R1是乙?；駽bz，優(yōu)選的(AA)n是Thr-Ile-Nle，優(yōu)選的(AA)m是Phe-Gln-Arg、Phe-Gln或Phe；或者優(yōu)選的(AA)n是Ser-Leu-Asn-PheSEQIDNO:54，或Leu-Asn-Phe，優(yōu)選的(AA)m是Pro-Ile-Val、Pro-Ile或Pro；或者優(yōu)選的(AA)n是Ser-Gln-Asn-TyrSEQIDNO:45，或Gln-Asn-Tyr，優(yōu)選的(AA)m是Pro-Ile-Val-GlnSEQIDNO:46、Pro-Ile-Val、Pro-Val-Val-NH2、Pro-Val-NH2、Pro-Ile或Pro；或者優(yōu)選的(AA)n是Arg-Gly-Phe，優(yōu)選的(AA)m是Pro；或者優(yōu)選的(AA)n是Lys-Ala-Arg-Val-LeuSEQIDNO:47、Ala-Arg-Val-LeuSEQIDNO:48或Arg-Val-Leu，優(yōu)選的(AA)m是Phe-Glu-Ala-MetSEQIDNO:49、Phe-Glu-Ala、Phe-Glu或Phe；或者優(yōu)選的(AA)n是Pro-Phe-His-LeuSEQIDNO:50或Phe-His-Leu，優(yōu)選的(AA)m是Leu-Glu-Glu-SerSEQIDNO:40、Leu-Glu-Glu、Leu-Glu或Leu；或者優(yōu)選的(AA)n是Ser-Gln-Asn-Leu-pheSEQIDNO:140、Gln-Asn-Leu-PheSEQIDNO:51、Asn-Leu-Phe、Arg-Lys-Ile-Leu-PheSEQIDNO:52、Lys-Ile-Leu-PheSEQIDNO:53或Ile-Leuphe，優(yōu)選的(AA)m是Leu-Asp-Gly-NH2、Leu-Asp-NH2或Leu-NH2。更優(yōu)選的(AA)n是Ser-Leu-Asn-PheSEQIDNO:54或Leu-Asn-Phe，更優(yōu)選的(AA)m是Pro-Ile-Val、Pro-Ile或Pro；或者更優(yōu)選的(AA)n是Arg-Gly-Phe，更優(yōu)選的(AA)m是Pro。通式Ⅸ的HIV蛋白酶的底物預(yù)計(jì)適用于全細(xì)胞測(cè)定，但不適用于無(wú)細(xì)胞酶測(cè)定。HIV感染的細(xì)胞中HIV蛋白酶對(duì)(AA)n-(AA)m酰胺鍵的切割產(chǎn)生與(AA)m連接的羅丹明。然后細(xì)胞內(nèi)存在的氨肽酶切下(AA)m，產(chǎn)生通式Ⅵ的熒光染料。通式Ⅸ的化合物可用于HIV感染的細(xì)胞中HIV蛋白酶抑制劑的篩選。這將加速新型HIV蛋白酶抑制劑的發(fā)現(xiàn)進(jìn)程，尤其是非肽或非肽結(jié)構(gòu)模擬物HIV蛋白酶抑制劑的發(fā)現(xiàn)進(jìn)程，這可能產(chǎn)生比目前使用的藥物更好的抗HIV劑。由于HIV蛋白酶在病毒復(fù)制末期加工病毒前體蛋白質(zhì)，所以也能用HIV蛋白酶的可透過(guò)細(xì)胞的發(fā)熒光或熒光底物，篩選抑制基因轉(zhuǎn)錄或翻譯、病毒進(jìn)入或HIV感染早期的其它關(guān)鍵蛋白質(zhì)的化合物。因此該方法能導(dǎo)致具有新型機(jī)制的HIV感染抑制劑的鑒定，它不能在無(wú)細(xì)胞酶測(cè)定中鑒定。另外，由于HIV感染細(xì)胞中的HIV蛋白酶能切割可透過(guò)細(xì)胞的通式Ⅸ的底物而在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生通式Ⅵ的熒光染料，因此通式Ⅴ的底物也能用于HIV感染的診斷。也能將通式Ⅸ的化合物設(shè)計(jì)為腺病毒蛋白酶的底物。腺病毒是幾種疾病的病因，包括能導(dǎo)致肺炎的散發(fā)性呼吸道疾病和流行性急性呼吸道疾病。腺病毒蛋白酶是一種半胱氨酸蛋白酶，它能切割幾種病毒蛋白質(zhì)，是病毒成熟和傳染性所必需的(Weber，J.M.，微生物學(xué)與免疫學(xué)當(dāng)前主題(Curr.Top.Microbiol.Immunol.)199/I:227-235(1995))。腺病毒蛋白酶的優(yōu)選的底物包括(M,L,I)XGX-G和(M,L,I)DXGG-X。底物的特異性主要取決于P2和P4氨基酸(Diouri，M.等人，生物化學(xué)雜志271:32511-32514(1996))。疏水性氨基酸如Met、Leu和Ile在P4中是優(yōu)選的。小氨基酸如Gly在P2中是優(yōu)選的。對(duì)于P1和P1'，疏水性小氨基酸也是優(yōu)選的，如Ala和Gly；而P3能適應(yīng)幾乎任何氨基酸。這些發(fā)現(xiàn)得到最近確定的人腺病毒蛋白酶晶體結(jié)構(gòu)的支持，其11個(gè)氨基酸輔因子和底物根據(jù)晶體結(jié)構(gòu)建模(Ding，J.等人，EMBOJ.15:1778-1783(1996))。利用全細(xì)胞中氨肽酶的存在，腺病毒蛋白酶的發(fā)熒光或熒光底物能設(shè)計(jì)為只從腺病毒蛋白酶底物的P側(cè)或從P側(cè)及P'側(cè)兩側(cè)摻入氨基酸，用于全細(xì)胞測(cè)定。對(duì)于設(shè)計(jì)為腺病毒蛋白酶底物的通式Ⅸ的化合物，優(yōu)選的R1是乙?；駽bz，優(yōu)選的(AA)n是Leu-Arg-Gly-GlySEQIDNO:55、Met-Arg-Gly-GlySEQIDNO:56、Ile-Arg-Gly-GlySEQIDNO:57、Leu-Val-Gly-GlySEQIDNO:58、Met-Val-Gly-GlySEQIDNO:59或Ile-Val-Gly-GlySEQIDNO:60，優(yōu)選的(AA)m是Gly、Ala或m=0。當(dāng)m為O時(shí)，腺病毒蛋白酶對(duì)(AA)n-羅丹明酰胺鍵的酶切將產(chǎn)生通式Ⅵ的熒光染料。當(dāng)m不是0時(shí)，細(xì)胞中腺病毒蛋白酶對(duì)(AA)n-(AA)m酰胺鍵的酶切產(chǎn)生與(AA)m連接的羅丹明。然后細(xì)胞內(nèi)存在的氨肽酶除去(AA)m，產(chǎn)生通式Ⅵ的熒光染料。通式Ⅸ的化合物可用于腺病毒感染的細(xì)胞中腺病毒蛋白酶抑制劑的篩選。也能將通式Ⅸ的化合物設(shè)計(jì)為1型單純皰疹病毒(HSV-1)蛋白酶的底物。人1型單純皰疹病毒可引起唇皰疹(感冒瘡)。HSV-1蛋白酶是一種絲氨酸蛋白酶，擔(dān)負(fù)其自身與ICP35的蛋白水解加工，用于病毒殼體的裝配(Gao，M.等人，病毒學(xué)雜志(J.Viroi.)68:3702-3712(1994))。已經(jīng)確定兩個(gè)蛋白水解位點(diǎn)為蛋白酶內(nèi)的Ala247和Ser248與Ala610和Ser611(Dilanni，C.L．等人，生物化學(xué)雜志268:25449-25454(1993))。最近，發(fā)現(xiàn)八氨基酸共有肽LCLASSFSEQIDNO:61能象20-mer成熟位點(diǎn)肽一樣被有效切割，而P4到P1序列被確定為HSV-1蛋白酶的最小底物識(shí)別區(qū)(O'Boyle，D.R．等人，病毒學(xué)(Virology)236:338-347(1997))。也已經(jīng)報(bào)道，HSV-1蛋白酶的特異性存在于切割位點(diǎn)的P4-P1'區(qū)內(nèi)(McCann，P.J．等人，病毒學(xué)雜志68:526-529(1994))。利用全細(xì)胞中氨肽酶的存在，HSV-1蛋白酶的發(fā)熒光或熒光底物能設(shè)計(jì)為只從HSV-1蛋白酶底物的P4-P1側(cè)或從P4-P1和P1'側(cè)兩側(cè)摻入氨基酸，用于全細(xì)胞測(cè)定。對(duì)于設(shè)計(jì)為HSV-1蛋白酶底物的通式Ⅸ的化合物，優(yōu)選的R1是乙?；駽bz，優(yōu)選的(AA)n是Leu-Val-Leu-AlaSEQIDNO:62，優(yōu)選的(AA)m是Ser、Ser-Ser或m=0。當(dāng)m為0時(shí)，HSV-1蛋白酶對(duì)(AA)n-羅丹明酰胺鍵的酶切將產(chǎn)生通式Ⅵ的熒光染料。當(dāng)m不是0時(shí)，細(xì)胞中HSV-1對(duì)(AA)n-(AA)m酰胺鍵的酶切產(chǎn)生與(AA)m連接的羅丹明。然后細(xì)胞內(nèi)存在的氨肽酶除去(AA)m，產(chǎn)生通式Ⅵ的熒光染料。通式Ⅸ的化合物可用于HSV-1感染的細(xì)胞中HSV-1蛋白酶抑制劑的篩選。也能將通式Ⅸ的化合物設(shè)計(jì)為人巨細(xì)胞病毒(HCMV)蛋白酶的底物。HCMV能在先天感染的嬰兒、無(wú)免疫應(yīng)答的個(gè)體和免疫抑制性癌癥或移植患者中引起危及生命的感染。人巨細(xì)胞病毒(HCMV)編碼一種能切割其自身及HCMV裝配蛋白質(zhì)的蛋白酶，并且是病毒復(fù)制所必需的，因此它是治療性干預(yù)的有效目標(biāo)。HCMV蛋白酶是一種絲氨酸蛋白酶，蛋白酶內(nèi)的兩個(gè)蛋白水解加工位點(diǎn)確定在Ala256-Ser257(釋放位點(diǎn))和Ala643-Ser644(成熟位點(diǎn))處。(Sztevens，J.T.等人，歐洲生物化學(xué)雜志(Eru.J.Biochem.)226:361-367(1994))。合成了一種發(fā)熒光底物，DABCYL-Arg-Gly-Val-Val-Asn-Ala-Ser-Ser-Arg-Leu-Ala-EDANSSEQIDNO:63，發(fā)現(xiàn)它能被CMV蛋白酶在Ala-Ser肽鍵處切開(kāi)(Holskin，B.P.等人，分析生物化學(xué)227:148-155(1995))。最近據(jù)報(bào)道，用優(yōu)化的Tbg-Tbg-Asn(NMe2)(Tbg，叔丁基甘氨酸)序列代替對(duì)應(yīng)于酶成熟位點(diǎn)P4-P2殘基的Val-Val-Asn序列明顯提高了底物對(duì)蛋白酶的親和力。AMC發(fā)熒光底物是用包含這些修飾氨基酸的P側(cè)肽序列制備的(Bonneau，P.R.等人，分析生物化學(xué)255:59-65(1998))。利用全細(xì)胞中氨肽酶的存在，HCMV蛋白酶的發(fā)熒光或熒光底物能設(shè)計(jì)為只從HCMV蛋白酶的P側(cè)或從P側(cè)及P'側(cè)兩側(cè)摻入氨基酸，以用于全細(xì)胞測(cè)定。對(duì)于設(shè)計(jì)為HCMV蛋白酶底物的通式Ⅸ的化合物，優(yōu)選的R1是乙?；駽bz，優(yōu)選的(AA)n是Val-Val-Asn-AlaSEQIDNO:64、Tbg-Tbg-Asn-AlaSEQIDNO:65，優(yōu)選的(AA)m是Ser、Ser-Ser或m=0。當(dāng)m為0時(shí)，HCMV蛋白酶對(duì)(AA)n-羅丹明酰胺鍵的酶切將產(chǎn)生通式Ⅵ的熒光染料。當(dāng)m不是0時(shí)，細(xì)胞中HCMV對(duì)(AA)n-(AA)m酰胺鍵的酶切產(chǎn)生與(AA)m連接的羅丹明。然后細(xì)胞內(nèi)存在的氨肽酶除去(AA)m，產(chǎn)生通式Ⅵ的熒光染料。通式Ⅸ的化合物可用于HCMV感染的細(xì)胞中HCMV蛋白酶抑制劑的篩選。也能將通式Ⅸ的化合物設(shè)計(jì)為丙型肝炎病毒(HCV)蛋白酶的底物。HCV是胃腸道外傳播及散發(fā)性非甲非乙型肝炎的主要病原體，它在世界范圍內(nèi)感染了估計(jì)5千萬(wàn)人。HCV蛋白酶NS3及其蛋白質(zhì)激活劑NS4A參與病毒多蛋白的加工，因此NS3/4A蛋白酶復(fù)合體是針對(duì)HCV的抗病毒治療的一種有吸引力的目標(biāo)。HCV蛋白酶是一種絲氨酸蛋白酶，已經(jīng)確定Cys-Ser為切割位點(diǎn)。底物序列之一是Asp-Asp-Ile-Val-Pro-Cys-Ser-Met-Ser-TyrSEQIDNO:66，并發(fā)現(xiàn)P1Cys和P3Val是關(guān)鍵的(Zhang，R.等人，病毒學(xué)雜志71:6208-6213(1997))。利用全細(xì)胞中氨肽酶的存在，HCV蛋白酶的發(fā)熒光或熒光底物能設(shè)計(jì)為從HCV蛋白酶底物的P側(cè)和P'側(cè)兩側(cè)摻入氨基酸，用于全細(xì)胞測(cè)定。對(duì)于設(shè)計(jì)為HCV蛋白酶底物的通式Ⅸ的化合物，優(yōu)選的R1是乙酰基或Cbz，優(yōu)選的(AA)n是Asp-Asp-Ile-Val-Pro-CysSEQIDNO:67、AsP-Ile-Val-Pro-CysSEQIDNO:68或He-Val-Pro-CysSEQIDNO:69，優(yōu)選的(AA)m是Ser-Met-Ser-TyrSEQIDNO:70、Ser-Met-Ser、Ser-Met、Ser或m=0。當(dāng)m為0時(shí)，HCV蛋白酶對(duì)(AA)n-羅丹明酰胺鍵的酶切將產(chǎn)生通式Ⅵ的熒光染料。當(dāng)m不是O時(shí)，細(xì)胞中HCV對(duì)(AA)n-(AA)m酰胺鍵的酶切產(chǎn)生與(AA)m連接的羅丹明。然后細(xì)胞內(nèi)存在的氨肽酶除去(AA)m，產(chǎn)生通式Ⅵ的熒光染料。通式IX的化合物可用于HCV感染的細(xì)胞中HCV蛋白酶抑制劑的篩選。本發(fā)明也涉及通式Ⅵ的新型化合物，它們是羅丹明的衍生物，通過(guò)向羅丹明兩個(gè)氨基之一上引入保護(hù)基團(tuán)R6而獲得。通式Ⅵ中的R2HN基提供附著點(diǎn)，用于與潛在酶底物如N端保護(hù)肽的羧基反應(yīng)，形成肽酰胺鍵。該反應(yīng)使通式Ⅵ的熒光分子轉(zhuǎn)化為通式Ⅶ-Ⅸ的非熒光分子，并產(chǎn)生一種作為蛋白酶或肽酶的底物的肽-報(bào)道分子。通式Ⅶ-Ⅸ中的肽-報(bào)道分子酰胺鍵在生物學(xué)條件下是易分裂鍵。蛋白酶或肽酶對(duì)肽-報(bào)道分子中易分裂肽-報(bào)道分子酰胺鍵的酶切產(chǎn)生通式Ⅵ或Ⅵ'的熒光化合物。更為重要的是，保護(hù)基團(tuán)中能引入疏水基。該疏水基用來(lái)提高底物的膜通透性，并導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)底物的積累，并且提高在被靶向蛋白酶或肽酶酶切后細(xì)胞內(nèi)熒光部分的保留。本發(fā)明的新型熒光染料具有通式Ⅵ或其生物學(xué)可接受的鹽，其中R2-R6如上對(duì)于通式Ⅶ所述。優(yōu)選的R2和R3為氫、甲基或乙基；優(yōu)選的R4和R5是氫或甲基。本發(fā)明的通式Ⅵ的化合物可以以互變異構(gòu)形式存在，尤其是通式Ⅵ'的開(kāi)環(huán)形式。本發(fā)明包括所有互變異構(gòu)形式包括Ⅵ和Ⅵ'。本發(fā)明的優(yōu)選的發(fā)熒光或熒光底物是具有通式Ⅱ的化合物，包括但不限于(Z-WEHD)2-羅丹明110，SEQIDNO:1(Z-YVAD)2-羅丹明110，SEQIDNO:2(Z-DETD)2-羅丹明110，SEQIDNO:4(Z-DEVD)2-羅丹明110，SEQIDNO:5(Z-DEHD)2-羅丹明110，SEQIDNO:6(Z-VEHD)2-羅丹明110，SEQIDNO:7(Z-LETD)2-羅丹明110，SEQIDNO:8(Z-LEHD)2-羅丹明110，SEQIDNO:3(Z-LEVD)2-羅丹明110，SEQIDNO:9(Z-IEPD)2-羅丹明110，SEQIDNO:23(Z-VEPD)2-羅丹明110，SEQIDNO:27(Z-SHVD)2-羅丹明110，SEQIDNO:10(Z-DELD)2-羅丹明110，SEQIDNO:11(Z-DGPD)2-羅丹明110，SEQIDNO:12(Z-DEPD)2-羅丹明110，SEQIDNO:13(Z-DGTD)2-羅丹明110，SEQIDNO:14(Z-DLND)2-羅丹明110，SEQIDNO:15(Z-DEED)2-羅丹明110，SEQIDNO:16(Z-DSLD)2-羅丹明110，SEQIDNO:17(Z-DVPD)2-羅丹明110，SEQIDNO:18(Z-DEAD)2-羅丹明110，SEQIDNO:19(Z-DSYD)2-羅丹明110，SEQIDNO:20(Z-ELPD)2-羅丹明110，SEQIDNO:21(Z-VEID)2-羅丹明110，SEQIDNO:26(Z-IETD)2-羅丹明110，SEQIDNO:24(Z-VD)2-羅丹明110，(Z-TD)2-羅丹明110，(Z-AD)2-羅丹明110，(Z-VAD)2-羅丹明110，(Boc-WEHD)2-羅丹明110，SEQIDNO:1(Boc-YVAD)2-羅丹明110，SEQIDNO:2(Boc-DETD)2-羅丹明110，SEQIDNO:4(Boc-DEVD)2-羅丹明110，SEQIDNO:5(Boc-DEHD)2-羅丹明110，SEQIDNO:6(Boc-VEHD)2-羅丹明110，SEQIDNO:7(Ac-YVAD)2-羅丹明110，SEQIDNO:2(Ac-LETD)2-羅丹明110，SEQIDNO:8(Ac-LEHD)2-羅丹明110，SEQIDNO:3(Ac-DEVD)2-羅丹明110，SEQIDNO:5(Ac-LEVD)2-羅丹明110，SEQIDNO:9(Ac-IEPD)2-羅丹明110，SEQIDNO:23(Ac-VEPD)2-羅丹明110，SEQIDNO:27(Ac-VD)2-羅丹明110，(Ac-TD)2-羅丹明110，(Ac-AD)2-羅丹明110，(Ac-VAD)2-羅丹明110，(Z-YVAD)2-羅丹明116，SEQIDNO:2(Z-LEHD)2-羅丹明116，SEQIDNO:3(Z-DETD)2-羅丹明116，SEQIDNO:4(Z-DEVD)2-羅丹明116，SEQIDNO:5(Z-YVAD)2-羅丹明19，SEQIDNO:2(Z-LEHD)2-羅丹明19，SEQIDNO:3(Z-DETD)2-羅丹明19，SEQIDNO:4(Z-DEVD)2-羅丹明19，SEQIDNO:5(Z-YVAD(OAM))2-羅丹明110，SEQIDNO:2(Z-LE(OAM)HD(OAM))2-羅丹明110，SEQIDNO:3(Z-D(OAM)E(OAM)TD(OAM))2-羅丹明110，SEQIDNO:4(Z-D(OAM)E(OAM)VD(OAM))2-羅丹明110，SEQIDNO:5(Z-D(OMe)E(OMe)VD(OAM))2-羅丹明110，SEQIDNO:5(Z-D(OME)E(OMe)VD)2-羅丹明11O，SEQIDNO:5本發(fā)明的優(yōu)選的發(fā)熒光或熒光底物是具有通式Ⅶ的化合物，包括但不限于:N-(Z-WEHD)-N'-乙酰基-羅丹明110，SEQIDNO:1N-(Z-YVAD)-N'-乙酰基-羅丹明110，SEQIDNO:2N-(Z-LEHD)-N'-乙酰基-羅丹明110，SEQIDNO:3N-(Z-LEVD)-N'-乙酰基-羅丹明110，SEQIDNO:9N-(Z-DETD)-N'-乙?；?羅丹明110，SEQIDNO:4N-(Z-DEVD)-N'-乙?；?羅丹明110，SEQIDNO:5N-(Z-DEHD)-N'-乙?；?羅丹明110，SEQIDNO:6N-(Z-VEHD)-N'-乙?；?羅丹明110，SEQIDNO:7N-(Z-LETD)-N'-乙?；?羅丹明110，SEQIDNO:8N-(Z-IEPD)-N'-乙?；?羅丹明110，SEQIDNO:23N-(Z-VEPD)-N'-乙?；?羅丹明110，SEQIDNO:27N-(Z-SHVD)-N'-乙?；?羅丹明110，SEQIDNO:10N-(Z-DELD)-N'-乙?；?羅丹明110，SEQIDNO:11N-(Z-DGPD)-N'-乙?；?羅丹明110，SEQIDNO:12N-(Z-DEPD)-N'-乙?；?羅丹明110，SEQIDNO:13N-(Z-DGTD)-N'-乙?；?羅丹明110，SEQIDNO:14N-(Z-DLND)-N'-乙酰基-羅丹明110，SEQIDNO:15N-(Z-DEED)-N'-乙酰基-羅丹明110，SEQIDNO:16N-(Z-DSLD)-N'-乙酰基-羅丹明110，SEQIDNO:17N-(Z-DVPD)-N'-乙?；?羅丹明110，SEQIDNO:18N-(Z-DEAD)-N'-乙?；?羅丹明110，SEQIDNO:19N-(Z-DSYD)-N'-乙?；?羅丹明110，SEQIDNO:20N-(Z-ELPD)-N'-乙酰基-羅丹明110，SEQIDNO:21N-(Z-VEID)-N'-乙?；?羅丹明110，SEQIDNO:26N-(Z-IETD)-N'-乙?；?羅丹明110，SEQIDNO:24N-(Z-VD)-N'-乙?；?羅丹明110，N-(Z-TD)-N'-乙?；?羅丹明110，N-(Z-AD)-N'-乙?；?羅丹明110，N-(Z-VAD)-N'-乙?；?羅丹明110，N-(Boc-WEHD)-N'-乙?；?羅丹明110，SEQIDNO:1N-(Boc-YVAD)-N'-乙酰基-羅丹明110，SEQIDNO:2N-(Ac-LETD)-N'-乙?；?羅丹明110，SEQIDNO:8N-(Ac-LEHD)-N'-乙?；?羅丹明110，SEQIDNO:3N-(Z-DEVD)-N'-甲氧羰基-羅丹明110，SEQIDNO:5N-(Z-YVAD)-N'-甲氧羰基-羅丹明110，SEQIDNO:2N-(Z-LEVD)-N'-甲氧羰基-羅丹明110，SEQIDNO:9N-(Z-LEHD)-N'-甲氧羰基-羅丹明110，SEQIDNO:3N-(Ac-WEHD)-N'-甲氧羰基-羅丹明110，SEQIDNO:1N-(Ac-YVAD)-N'-甲氧羰基-羅丹明110，SEQDNO:2N-(Ac-DEVD)-N'-甲氧羰基-羅丹明110，SEQIDNO:5N-(Ac-DEHD)-N'-甲氧羰基-羅丹明110，SEQIDNO:6N-(AC-DETD)-N'-甲氧羰基-羅丹明110，SEQIDNO:4N-(Ac-LEVD)-N'-甲氧羰基-羅丹明110，SEQIDNO:9N-(Ac-LEHD)-N'-甲氧羰基-羅丹明110，SEQIDNO:3N-(AC-LETD)-N'-甲氧羰基-羅丹明110，SEQIDNO:8N-(AC-VEHD)-N'-甲氧羰基-羅丹明110，SEQIDNO:7N-(AC-IEPD)-N'-甲氧羰基-羅丹明110，SEQIDNO:23N-(Z-WEHD)-N'-乙氧羰基-羅丹明110，SEQIDNO:1N-(Z-YVAD)-N'-乙氧羰基-羅丹明11O，SEQIDNO:2N-(Z-DEVD)-N'-乙氧羰基-羅丹明110，SEQIDNO:5N-(Z-LEVD)-N'-乙氧羰基-羅丹明11O，SEQIDNO:9N-(Ac-WEHD)-N'-乙氧羰基-羅丹明110，SEQIDNO:1N-(Ac-YVAD)-N'-乙氧羰基-羅丹明110，SEQIDNO:2N-(Ac-DEVD)-N'-乙氧羰基-羅丹明110，SEQIDNO:5N-(Ac-DEHD)-N'-乙氧羰基-羅丹明110，SEQIDNO:6N-(Ac-DETD)-N'-乙氧羰基-羅丹明110，SEQIDNO:4N-(Ac-LEVD)-N'-乙氧羰基-羅丹明110，SEQIDNO:9N-(Ac-LEHD)-N'-乙氧羰基-羅丹明110，SEQIDNO:3N-(Ac-LETD)-N'-乙氧羰基-羅丹明110，SEQIDNO:8N-(Ac-VEHD)-N'-乙氧羰基-羅丹明110，SEQIDNO:7N-(Ac-IEPD)-N'-乙氧羰基-羅丹明110，SEQIDNO:23N-(Z-WEHD)-N'-己氧羰基-羅丹明110，SEQIDNO:1N-(Z-YVAD)-N'-己氧羰基-羅丹明110，SEQIDNO:2N-(Z-DEVD)-N'-己氧羰基-羅丹明110，SEQIDNO:5N-(Z-LEVD)-N'-己氧羰基-羅丹明110，SEQIDNO:9N-(Ac-WEHD)-N'-己氧羰基-羅丹明11O，SEQIDNO:1N-(Ac-YVAD)-N'-己氧羰基-羅丹明110，SEQIDNO:2N-(Ac-DEVD)-N'-己氧羰基-羅丹明110，SEQIDNO:5N-(Ac-DEHD)-N'-己氧羰基-羅丹明110，SEQIDNO:6N-(Ac-DETD)-N'-己氧羰基-羅丹明110，SEQIDNO:4N-(Ac-LEVD)-N'-己氧羰基-羅丹明110，SEQIDNO:9N-(Ac-LEHD)-N'-己氧羰基-羅丹明110，SEQIDNO:3N-(Ac-LETD)-N'-己氧羰基-羅丹明110，SEQIDNO:8N-(Ac-VEHD)-N'-己氧羰基-羅丹明110，SEQIDNO:7N-(Ac-IEPD)-N'-己氧羰基-羅丹明110，SEQIDNO:23N-(Z-WEHD)-N'-辛氧羰基-羅丹明110，SEQIDNO:1N-(Z-YVAD)-N'-辛氧羰基-羅丹明110，SEQIDNO:2N-(Z-DEVD)-N'-辛氧羰基-羅丹明110，SEQIDNO:5N-(Z-LEVD)-N'-辛氧羰基-羅丹明110，SEQIDNO:9N-(Ac-WEHD)-N'-辛氧羰基-羅丹明110，SEQIDNO:1N-(Ac-YVAD)-N'-辛氧羰基-羅丹明110，SEQIDNO:2N-(Ac-DEVD)-N'-辛氧羰基-羅丹明110，SEQIDNO:5N-(Ac-DEHD)-N'-辛氧羰基-羅丹明110，SEQIDNO:6N-(Ac-DETD)-N'-辛氧羰基-羅丹明11O，SEQIDNO:4N-(Ac-LEVD)-N'-辛氧羰基-羅丹明110，SEQIDNO:9N-(Ac-LEHD)-N'-辛氧羰基-羅丹明110，SEQIDNO:3N-(Ac-LETD)-N'-辛氧羰基-羅丹明110，SEQIDNO:8N-(Ac-VEHD)-N'-辛氧羰基-羅丹明110，SEQIDNO:7N-(Ac-IEPD)-N'-辛氧羰基-羅丹明110，SEQIDNO:23N-(Z-WEHD)-N'-癸氧羰基-羅丹明11O，SEQIDNO:1N-(Z-YVAD)-N'-癸氧羰基-羅丹明110，SEQIDNO:2N-(Z-DEVD)-N'-癸氧羰基-羅丹明110，SEQIDNO:5N-(Z-LEVD)-N'-癸氧羰基-羅丹明110，SEQIDNO:9N-(Ac-WEHD)-N'-癸氧羰基-羅丹明11O，SEQIDNO:1N-(Ac-YAVD)-N'-癸氧羰基-羅丹明110，SEQIDNO:2N-(Ac-DEVD)-N'-癸氧羰基-羅丹明110，SEQIDNO:5N-(Ac-DEHD)-N'-癸氧羰基-羅丹明110，SEQIDNO:6N-(Ac-DETD)-N'-癸氧羰基-羅丹明110，SEQIDNO:4N-(Ac-LEVD)-N'-癸氧羰基-羅丹明110，SEQIDNO:9N-(Ac-LEHD)-N'-癸氧羰基-羅丹明11O，SEQIDNO:3N-(AC-LETD)-N'-癸氧羰基-羅丹明110，SEQIDNO:8N-(AC-VEHD)-N-癸氧羰基-羅丹明110，SEQIDNO:7N-(Ac-IEPD)-N'-癸氧羰基-羅丹明110，SEQIDNO:23N-(Z-WEHD)-N'-十二烷氧羰基-羅丹明11O，SEQIDNO:1N-(Z-YVAD)-N'-十二烷氧羰基-羅丹明110，SEQIDNO:2N-(Z-DEVD)-N'-十二烷氧羰基-羅丹明11O，SEQIDNO:5N-(Z-LEVD)-N'-十二烷氧羰基-羅丹明11O，SEQIDNO:9N-(Ac-WEHD)-N'-十二烷氧羰基-羅丹明11O，SEQIDNO:1N-(Ac-YVAD)-N'-十二烷氧羰基-羅丹明110，SEQIDNO:2N-(Ac-DEVD)-N'-十二烷氧羰基-羅丹明11O，SEQIDNO:5N-(Ac-DEHD)-N'-十二烷氧羰基-羅丹明110，SEQIDNO:6N-(Ac-DETD)-N'-十二烷氧羰基-羅丹明110，SEQIDNO:4N-(Ac-LEVD)-N'-十二烷氧羰基-羅丹明110，SEQIDNO:9N-(Ac-LEHD)-N'-十二烷氧羰基-羅丹明110，SEQIDNO:3N-(Ac-LETD)-N'-十二烷氧羰基-羅丹明110，SEQIDNO:8N-(Ac-VEHD)-N'-十二烷氧羰基-羅丹明110，SEQIDNO:7N-(Ac-IEPD)-N'-十二烷氧羰基-羅丹明110，SEQIDNO:23N-(Z-DEVD)-N'-(甲硫基)羰基-羅丹明110，SEQIDNO:5N-(Z-YVAD)N'-(甲硫基)羰基-羅丹明110，SEQIDNO:2N-(Z-LEVD)-N'-(甲硫基)羰基-羅丹明110，SEQIDNO:3N-(Z-LEHD)-N'-(甲硫基)羰基-羅丹明110，SEQIDNO:3N-(Ac-WEHD)-N'-(甲硫基)羰基-羅丹明110，SEQIDNO:1N-(Ac-YVAD)-N'-(甲硫基)羰基-羅丹明110，SEQIDNO:2N-(Ac-DEVD)-N'-(甲硫基)羰基-羅丹明110，SEQIDNO:5N-(Ac-DEHD)-N'-(甲硫基)羰基-羅丹明110，SEQIDNO:6N-(Ac-DETD)-N'-(甲硫基)羰基-羅丹明110，SEQIDNO:4N-(Ac-LEVD)-N'-(甲硫基)羰基-羅丹明110，SEQIDNO:9N-(Ac-LEHD)-N'-(甲硫基)羰基-羅丹明110，SEQIDNO:3N-(Ac-LETD)-N'-(甲硫基)羰基-羅丹明110，SEQIDNO:8N-(Ac-VEHD)-N'-(甲硫基)羰基-羅丹明110，SEQIDNO:7N-(Ac-IEPD)-N-(甲硫基)羰基-羅丹明110，SEQIDNO:23N-(Z-WEHD)-N'-(乙硫基)羰基-羅丹明110，SEQIDNO:1N-(Z-YVAD)-N'-(乙硫基)羰基-羅丹明110，SEQIDNO:2N-(Z-DEVD)-N'-(乙硫基)羰基-羅丹明110，SEQIDNO:5N-(Z-LEVD)-N'-(乙硫基)羰基-羅丹明110，SEQIDNO:9N-(Ac-WEHD)-N'-(乙硫基)羰基-羅丹明110，SEQIDNO:1N-(Ac-YVAD)-N'-(乙硫基)羰基-羅丹明110，SEQIDNO:2N-(Ac-DEVD)-N'-(乙硫基)羰基-羅丹明110，SEQIDNO:5N-(Ac-DEHD)-N'-(乙硫基)羰基-羅丹明110，SEQIDNO:6N-(Ac-DETD)-N'-(乙硫基)羰基-羅丹明110，SEQIDNO:4N-(Ac-LEVD)-N'-(乙硫基)羰基-羅丹明110，SEQIDNO:9N-(Ac-LEHD)-N'-(乙硫基)羰基-羅丹明110，SEQIDNO:3N-(Ac-LETD)-N'-(乙硫基)羰基-羅丹明110，SEQIDNO:8N-(Ac-VEHD)-N'-(乙硫基)羰基-羅丹明110，SEQIDNO:7N-(Ac-IEPD)-N'-(乙硫基)羰基-羅丹明110，SEQIDNO:23N-(Z-WEHD)-N'-(己硫基)羰基-羅丹明110，SEQIDNO:1N-(Z-YVAD)-N'-(己硫基)羰基-羅丹明110，SEQIDNO:2N-(Z-DEVD)-N'-(己硫基)羰基-羅丹明110，SEQIDNO:5N-(Z-LEVD)-N'-(己硫基)羰基-羅丹明110，SEQIDNO:9N-(Ac-WEHD)-N'-(己硫基)羰基-羅丹明110，SEQIDNO:1N-(Ac-YVAD)-N'-(己硫基)羰基-羅丹明110，SEQIDNO:2N-(Ac-DEVD)-N'-(己硫基)羰基-羅丹明110，SEQIDNO:5N-(Ac-DEHD)-N'-(己硫基)羰基-羅丹明110，SEQIDNO:6N-(Ac-DETD)-N'-(己硫基)羰基-羅丹明110，SEQIDNO:4N-(Ac-LEVD)-N'-(己硫基)羰基-羅丹明110，SEQIDNO:9N-(Ac-LEHD)-N'-(己硫基)羰基-羅丹明110，SEQIDNO:3N-(Ac-LETD)-N'-(己硫基)羰基-羅丹明110，SEQIDNO:8N-(Ac-VEHD)-N'-(己硫基)羰基-羅丹明11O，SEQIDNO:7N-(Ac-IEPD)-N'-(己硫基)羰基-羅丹明110，SEQIDNO:23N-(Z-WEHD)-N'-(辛硫基)羰基-羅丹明11O，SEQIDNO:1N-(Z-YVAD)-N'-(辛硫基)羰基-羅丹明110，SEQIDNO:2N-(Z-DEVD)-N'-(辛硫基)羰基-羅丹明110，SEQIDNO:5N-(Z-LEVD)-N'-(辛硫基)羰基-羅丹明110，SEQIDNO:9N-(Ac-WEHD)-N'-(辛硫基)羰基-羅丹明11O，SEQIDNO:1N-(Ac-YVAD)-N'-(辛硫基)羰基-羅丹明110，SEQIDNO:2N-(Ac-DEVD)-N'-(辛確基)羰基-羅丹明110，SEQIDNO:5N-(Ac-DEHD)-N'-(辛硫基)羰基-羅丹明110，SEQIDNO:6N-(Ac-DETD)-N'-(辛硫基)羰基-羅丹明110，SEQIDNO:4N-(Ac-LEVD)-N'-(辛硫基)羰基-羅丹明110，SEQIDNO:9N-(Ac-LEHD)-N'-(辛硫基)羰基-羅丹明110，SEQIDNO:3N-(Ac-LETD)-N'-(辛硫基)羰基-羅丹明11O，SEQIDNO:8N-(Ac-VEHD)-N'-(辛硫基)羰基-羅丹明110，SEQIDNO:7N-(Ac-IEPD)-N'-(辛硫基)羰基-羅丹明11O，SEQIDNO:23N-(Z-WEHD)-N'-(癸硫基)羰基-羅丹明10，SEQIDNO:1N-(Z-YVAD)-N'-(癸硫基)羰基-羅丹明110，SEQIDNO:2N-(Z-DEVD)-N'-(癸硫基)羰基-羅丹明110，SEQIDNO:5N-(Z-LEVD)-N'-(癸硫基)羰基-羅丹明11O，SEQIDNQ:9N-(Ac-WEHD)-N'-(癸硫基)羰基-羅丹明110，SEQIDNO:1N-(Ac-YVAD)-N'-(癸硫基)羰基-羅丹明110，SEQIDNO:2N-(Ac-DEVD)-N'-(癸硫基)羰基-羅丹明110，SEQIDNO:5N-(Ac-DEHD)-AT1-(癸硫基)羰基-羅丹明110，SEQIDNO:6N-(Ac-DETD)-N'-(癸硫基)羰基-羅丹明110，SEQIDNO:4N-(Ac-LEVD)-N'-(癸硫基)羰基-羅丹明110，SEQIDNO:9N-(Ac-LEHD)-N'-(癸硫基)羰基-羅丹明110，SEQIDNO:3N-(Ac-LETD)-N'-(癸硫基)羰基-羅丹明110，SEQIDNO:8N-(Ac-VEHD)-N'-(癸硫基)羰基-羅丹明110，SEQIDNO:7N-(Ac-IEPD)-N'-(癸硫基)羰基-羅丹明110，SEQIDNO:23N-(Z-WEHD)-N'-(十二烷硫基)羰基-羅丹明110，SEQIDNO:1N-(Z-YVAD)-N'-(十二烷硫基)羰基-羅丹明110，SEQIDNO:2N-(Z-DEVD)-N'-(十二烷硫基)羰基-羅丹明110，SEQIDNO:5N-(Z-LEVD)-N'-(十二烷硫基)羰基-羅丹明110，SEQIDNO:9N-(Ac-WEHD)-N'-(十二烷硫基)羰基-羅丹明110，SEQIDNO:1N-(Ac-YVAD)-N'-(十二烷硫基)羰基-羅丹明110，SEQIDNO:2N-(Ac-DEVD)-N'-(十二烷硫基)羰基-羅丹明110，SEQIDNO:5N-(Ac-DEHD)-N'-(十二烷硫基)羰基-羅丹明110，SEQIDNO:6N-(Ac-DETD)-N'-(十二烷硫基)羰基-羅丹明110，SEQIDNO:4N-(Ac-LEVD)-N'-(十二烷硫基)羰基-羅丹明110，SEQIDNO:9N-(Ac-LEHD)-N'-(十二烷硫基)羰基-羅丹明110，SEQIDNO:3N-(Ac-LETD)-N'-(十二烷硫基)羰基-羅丹明110，SEQIDNO:8N-(Ac-VEHD)-N'-(十二烷硫基)羰基-羅丹明110，SEQIDNO:7N-(Ac-IEPD)-N'-(十二烷硫基)羰基-羅丹明110，SEQIDNO:23N-(Z-WEHD)-N'-(二甲基氨基甲?；?-羅丹明110，SEQIDNO:1N-(Z-YVAD)-N'-(二甲基氨基甲?；?-羅丹明110，SEQIDNO:2N-(Z-DEVD)-N'-(二甲基氨基甲?；?-羅丹明110，SEQIDNO:5N-(Z-LEVD)-N'-(二甲基氨基甲?；?-羅丹明110，SEQIDNO:9N-(Ac-WEHD)-N'-(二甲基氨基甲?；?-羅丹明110，SEQIDNO:1N-(Ac-YVAD)-N'-(二甲基氨基甲?；?-羅丹明110，SEQIDNO:2N-(Ac-DEVD)-N'-(二甲基氨基甲?；?-羅丹明110，SEQIDNO:5N-(Ac-DEHD)-N'-(二甲基氨基甲?；?-羅丹明110，SEQIDNO:6N-(Ac-DETD)-N'-(二甲基氨基甲酰基)-羅丹明110，SEQIDNO:4N-(Ac-LECD)-N'-(二甲基氨基甲酰基)羰基-羅丹明110，SEQIDNO:9N-(Ac-LEHD)-N'-(二甲基氨基甲酰基)羰基-羅丹明110，SEQIDNO:6N-(Ac-LETD)-N'-(二甲基氨基甲?；?羰基-羅丹明110，SEQIDNO:8N-(Ac-VEHD)-N'-(二甲基氨基甲?；?羰基-羅丹明110，SEQIDNO:7N-(Ac-IEPD)-N'-(二甲基氨基甲?；?羰基-羅丹明110，SEQIDNO:23N-(Z-WEHD)-N'-(N-己基-N-甲基氨基甲酰)基-羅丹明110，SEQIDNO:1N-(Z-YVAD)-N'-(N-己基-N-甲基氨基甲?；?-羅丹明110，SEQIDNO:2N-(Z-DEVD)-N'-(N-己基-N-甲基氨基甲?；?-羅丹明110，SEQIDNO:5N-(Z-LEVD)-N'-(N-己基-N-甲基氨基甲?；?-羅丹明110，SEQIDNO:9N-(Ac-WEHD)-N'-(N-己基-N-甲基氨基甲酰基)-羅丹明110，SEQIDNO:1N-(Ac-YVAD)-N'-(N-己基-N-甲基氨基甲酰基)-羅丹明110，SEQIDNO:2N-(Ac-DEVD)-N'-(N-己基-N-甲基氨基甲?；?-羅丹明110，SEQIDNO:5N-(Ac-DEHD)-N'-(N-己基-N-甲基氨基甲酰基)-羅丹明110，SEQIDNO:6N-(Ac-DETD)-N'-(N-己基-N-甲基氨基甲酰基)-羅丹明110，SEQIDNO:4N-(Ac-LEVD)-N'-(N-己基-N-甲基氨基甲酰基)-羅丹明110，SEQIDNO:9N-(Ac-LEHD)-N'-(N-己基-N-甲基氨基甲酰基)-羅丹明110，SEQIDNO:3N-(Ac-LETD)-N'-(N-己基-N-甲基氨基甲?；?-羅丹明110，SEQIDNO:8N-(Ac-VEHD)-N'-(N-己基-N-甲基氨基甲酰基)-羅丹明110，SEQIDNO:7N-(Ac-IEPD)-N'-(N-己基-N-甲基氨基甲?；?-羅丹明110，SEQIDNO:23N-(Z-DECD)-N'-甲磺?；?羅丹明110，SEQIDNO:5N-(Z-YVAD)-N'-甲磺?；?羅丹明110，SEQIDNO:2N-(Z-DEVD)-N'-乙?；?羅丹明116，SEQIDNO:5N-(Z-YVAD)-N'-甲磺?；?羅丹明116，SEQIDNO:2N-(Z-DEVD)-N'-乙酰基-羅丹明19，SEQIDNO:5N-(Z-YVAD)-N'-甲磺?；?羅丹明19，SEQIDNO:2N-(Z-YVAD(OAM))-N'-乙?；?羅丹明110，SEQIDNO:2N-(Z-LE(OAM)HD(OAM))-N'-乙酰基-羅丹明110，SEQIDNO:3N(Z-D(OAM)E(OAM)TD(OAM))-N'-乙酰基-羅丹明110，SEQIDNO:4N(Z-D(OAM)E(OAM)VD(OAM)-N'-乙?；?羅丹明110，SEQIDNO:5N-(Z-D(OMe)E(OMe)VD(OAM))-N'-乙?；?羅丹明110，SEQIDNO:5N-(Z-D(OMe)E(OMe)VD)-N'-乙酰基-羅丹明110，SEQIDNO:5N-(Z-VD(OAM))-N'-乙?；?羅丹明110，和N-(Z-E(OAM)VD(OAM))-N'-乙酰基-羅丹明110。本發(fā)明的其它優(yōu)選的發(fā)熒光或熒光底物是具有通式Ⅷ的化合物，包括但不限于:N-(Z-WEHDG)-N'-乙?；?羅丹明110，SEQIDNO:71N-(Z-YVADG)-N'-乙酰基-羅丹明110，SEQIDNO:72N-(Z-LEHDG)-N'-乙酰基-羅丹明110，SEQIDNO:73N-(Z-LEVDG)-N'-乙?；?羅丹明110，SEQIDNO:74N-(Z-DETDG)-N'-乙?；?羅丹明110，SEQIDNO:75N-(Z-DEVDG)-N'-乙?；?羅丹明110，SEQIDNO:76N-(Ac-LETDG)-N'-乙?；?羅丹明110，SEQIDNO:77N-(Ac-LEHDG)-N'-乙?；?羅丹明110，SEQIDNO:73N-(Ac-WEHDG)-N'-甲氧羰基-羅丹明110，SEQIDNO:71N-(Ac-YVADG)-N'-甲氧羰基-羅丹明110，SEQIDNO:72N-(Ac-DEVDG)-N'-甲氧羰基-羅丹明110，SEQIDNO:76N-(Ac-DEHDG)-N'-甲氧羰基-羅丹明110，SEQIDNO:78N-(Z-WEHDGG)-N'-乙氧羰基-羅丹明110，SEQIDNO:79N-(Z-YVADG)-N'-乙氧羰基-羅丹明110，SEQIDNO:72N-(Z-DEVDG)-N'-乙氧羰基-羅丹明110，SEQIDNO:76N-(Z-LEVDG)-N'-乙氧羰基-羅丹明110，SEQIDNO:74N-(Ac-WEHDG)-N'-乙氧羰基-羅丹明110，SEQIDNO:71N-(Ac-YVADG)-N'-乙氧羰基-羅丹明110，SEQIDNO:72N-(Ac-DEVDG)-N'-乙氧羰基-羅丹明110，SEQIDNO:76N-(Ac-DEHDG)-N'-乙氧羰基-羅丹明110，SEQIDNO:78N-(Ac-WEHDG)-N'-己氧羰基-羅丹明110，SEQIDNO:71N-(Ac-YVADG)-N'-己氧羰基-羅丹明110，SEQIDNO:72N-(Ac-DEVDG)-N'-己氧羰基-羅丹明110，SEQIDNO:76N-(Ac-DEHDG)-N'-己氧羰基-羅丹明110，SEQIDNO:78N-(Ac-WEVDG)-N'-辛氧羰基-羅丹明110，SEQIDNO:71N-(Ac-YVADG)-N'-辛氧羰基-羅丹明110，SEQIDNO:72N-(AC-DEVDG)-N'-辛氧羰基-羅丹明110，SEQIDNO:76N-(AC-DEHDG)-N'-辛氧羰基-羅丹明110，SEQIDNO:78N-(Ac-WEHDG)-N'-癸氧羰基-羅丹明110，SEQIDNO:71N-(Ac-YVADG)-N'-癸氧羰基-羅丹明110，SEQIDNO:72N-(Ac-DEVDG)-N'-癸氧羰基-羅丹明110，SEQIDNO:76N-(Ac-DEHDG)-N'-癸氧羰基-羅丹明110，SEQIDNO:78N-(Ac-WEHDG)-N'-十二烷氧羰基-羅丹明110，SEQIDNO:71N-(Ac-YVADG)-N'-十二烷氧羰基-羅丹明110，SEQIDNO:72N-(Ac-DEVDG)-N'-十二烷氧羰基-羅丹明110，SEQIDNO:76N-(Ac-DEHDG)-N'-十二烷氧羰基-羅丹明110，SEQIDNO:78N-(Ac-WEHDG)-N'-(乙硫基)羰基-羅丹明110，SEQIDNO:71N-(Ac-YVADG)-N'-(乙硫基)羰基-羅丹明110，SEQIDNO:72N-(Ac-DEVDG)-N'-(乙硫基)羰基-羅丹明110，SEQIDNO:76N-(Ac-DEHDG)-N'-(乙硫基)羰基-羅丹明110，SEQIDNO:78N-(Ac-WEHDG)-N'-(己硫基)羰基-羅丹明110，SEQIDNO:71N-(Ac-YVADG)-N'-(己硫基)羰基-羅丹明110，SEQIDNO:72N-(Ac-DEVDG)-N'-(己硫基)羰基-羅丹明110，SEQIDNO:76N-(Ac-DEHDG)-N'-(己硫基)羰基-羅丹明110，SEQIDNO:78N-(Ac-WEHDG)-N'-(辛硫基)羰基-羅丹明110，SEQIDNO:71N-(Ac-YVADG)-N'-(辛硫基)羰基-羅丹明110，SEQIDNO:72N-(Ac-DEVDG)-N'-(辛硫基)羰基-羅丹明110，SEQIDNO:76N-(Ac-DEHDG)-N'-(辛硫基)羰基-羅丹明110，SEQIDNO:78N-(Ac-WEHDG)-N'-(癸硫基)羰基-羅丹明110，SEQIDNO:71N-(Ac-YVADGG)-N'-(癸硫基)羰基-羅丹明110，SEQIDNO:142N-(Ac-DEVDG)-N'-(癸硫基)羰基-羅丹明110，SEQIDNO:76N-(Ac-DEHDG)-N'-(癸硫基)羰基-羅丹明110，SEQIDNO:78N-(Ac-WEHDG)-N'-(十二烷硫基)羰基-羅丹明110，SEQIDNO:71N-(Ac-YVADG)-N'-(十二烷硫基)羰基-羅丹明110，SEQIDNO:72N-(Ac-DEVDG)-N'-(十二烷硫基)羰基-羅丹明110，SEQIDNO:76N-(Ac-DEHDG)-N'-(十二烷硫基)羰基-羅丹明110，SEQIDNO:78N-(Ac-WEHDG)-N'-(二甲基氨基甲?；?-羅丹明110，SEQIDNO:71N-(Ac-YVADG)-N'-(二甲基氨基甲酰基)-羅丹明110，SEQIDNO:72N-(Ac-DEVDG)-N'-(二甲基氨基甲?；?-羅丹明110，SEQIDNO:76N-(Ac-DEHDG)-N'-(二甲基氨基甲?；?-羅丹明110，SEQIDNO:78N-(Ac-WEHDG)-N'-(N-己基-N-甲基氨基甲?；?-羅丹明110，SEQIDNO:71N-(AC-YVADG)-N'-(N-己基-N-甲基氨基甲?；?-羅丹明110，SEQIDNO:72N-(AC-DEVDG)-N'-(N-己基-N-甲基氨基甲?；?-羅丹明110，SEQIDNO:76N-(AC-DEHDG)-N'-(N-己基-N-甲基氨基甲?；?-羅丹明110，SEQIDNO:78N-(Z-DEVDG)-N'-甲磺?；?羅丹明110，SEQIDNO:76N-(Z-YVADG)-N'-甲磺?；?羅丹明110，SEQIDNO:72N-(Z-DEVDG)-N'-乙?；?羅丹明116，SEQIDNO:76N-(Z-YVADG)-N'-甲磺?；?羅丹明116，SEQIDNO:72N-(Z-DEVDG)-N'-乙?；?羅丹明19，SEQIDNO:76N-(Z-TVADG)-N'-甲磺酰基-羅丹明19，SEQIDNO:72。本發(fā)明的其它優(yōu)選的發(fā)熒光或熒光底物是具有通式Ⅸ的化合物，包括但不限于N-(GP)-N'-辛氧羰基-羅丹明110，N-(GPG)-N'-辛氧羰基-羅丹明110，N-(GP)-N'-乙氧羰基-羅丹明110，N-(GPG)-N'-乙氧羰基-羅丹明110，N-(GPA)N'-乙氧羰基-羅丹明110，N-(GP)-N'-己氧羰基-羅丹明110，N-(GPG)-N'-己氧羰基-羅丹明110，N-(GP)-N'-(乙硫基)羰基-羅丹明110，N-(GPG)-N'-(乙硫基)羰基-羅丹明110，N-(MG)-N'-辛氧羰基-羅丹明110，N-(MA)-N'-辛氧羰基-羅丹明110，N-(MGG)-N'-辛氧羰基-羅丹明110，N-(MGA)-N-辛氧羰基-羅丹明110，N-(MAG)-N'-辛氧羰基-羅丹明110，N-G-N'-辛氧羰基-羅丹明110，N-(MG)-N'-乙氧羰基-羅丹明110，N-(MA)-N'-乙氧羰基-羅丹明110，N-G-N'-乙氧羰基-羅丹明110，N-(MG)-N'-己氧羰基-羅丹明110，N-(MA)-N'-己氧羰基-羅丹明110，N-G-N'-己氧羰基-羅丹明110，N-(MG)-N'-(乙硫基)羰基-羅丹明110，N-G-N'-(乙硫基)羰基-羅丹明110，N-(Boc-LM)-N'-辛氧羰基-羅丹明110，N-(Ac-LM)-N'-辛氧羰基-羅丹明110，N-(Boc-LM)-N'-乙氧羰基-羅丹明110，N-(Ac-LM)-N'-乙氧羰基-羅丹明110，N-(Boc-LM)-N'-己氧羰基-羅丹明110，N-(Ac-LM)-N'-己氧羰基-羅丹明110，N-(Boc-LM)-N'-(乙硫基)羰基-羅丹明110，N-(Ac-LM)-N'-(乙硫基)羰基-羅丹明110，N-(Ac-SLNFPIV)-N'-辛氧羰基-羅丹明110，SEQIDNO:80N-(Ac-SLNFPI)-N'-辛氧羰基-羅丹明110，SEQIDNO:81N-(Ac-SLNFP)-N'-辛氧羰基-羅丹明110，SEQIDNO:82N-(Ac-LNFPIV)-K'-辛氧羰基-羅丹明110，SEQIDNO:83N-(Ac-LNFPI)-N'-辛氧羰基-羅丹明110，SEQIDNO:84N-(Ac-LNFP)-N'-辛氧羰基-羅丹明110，SEQIDNO:85N-(Ac-RGFP)-N'-辛氧羰基-羅丹明110，SEQIDNO:37N-(Z-LNFPIV)-N-辛氧羰基-羅丹明110，SEQIDNO:83N-(Z-LNFPI)-N'-辛氧羰基-羅丹明110，SEQIDNO:84N-(Z-LNFP)-N'-辛氧羰基-羅丹明110，SEQIDNO:85N-(Z-RGFP)-N'-辛氧羰基-羅丹明110，SEQIDNO:37N-(Z-RQANFLG)-N'-辛氧羰基-羅丹明110，SEQIDNO:31N-(Z-RQANFL)-N'-辛氧羰基-羅丹明110，SEQIDNO:86N-(Z-RQANF)-N'-辛氧羰基-羅丹明110，SEQIDNO:87N-(Z-RKVLFLD)-N'-辛氧羰基-羅丹明110，SEQIDNO:36N-(Z-RKVLFL)-N'-辛氧羰基-羅丹明110，SEQIDNO:88N-(Z-RKVLF)-N'-辛氧羰基-羅丹明110，SEOIDNO:89N-(Z-ARVLFLG)-N'-辛氧羰基-羅丹明110，SEQIDNO:90N-(Z-ARVLFL)-N'-辛氧羰基-羅丹明110，SEQIDNO:91N-(Z-ARVLF)-N'-辛氧羰基-羅丹明110，SEQIDNO:92N-(Z-SQNYFLG)-N'-辛氧羰基-羅丹明110，SEQIDNO:93N-(Z-SQNYFL)-N'-辛氧羰基-羅丹明110，SEQIDNO:94N-(Z-SQNYF)-N'-辛氧羰基-羅丹明110，SEQIDNO:95N-(Ac-SLNFPIV)-N'-乙氧羰基-羅丹明110，SEQIDNO:80N-(Ac-SLNFPD-N'-乙氧羰基-羅丹明110，SEQIDNO:81N-(Ac-SLNFP)-N-乙氧羰基-羅丹明110，SEQIDNO:82N-(Ac-RGFP)-N'-乙氧羰基-羅丹明110，SEQIDNO:37N-(Ac-SLNFPIV)-N'-(乙硫基)羰基-羅丹明110，SEQIDNO:80N-(Ac-SLNFPD-N'-(乙硫基)羰基-羅丹明110，SEQIDNO:81N-(Ac-SLNFP)-N'-(乙硫基)羰基-羅丹明110，SEQIDNO:82N-(Ac-RGFP)-N'-(乙硫基)羰基-羅丹明110，SEQIDNO:37N-(Ac-MRGGG)-N'-辛氧羰基-羅丹明110，SEQIDNO:96N-(Ac-IRGGG)-N'-辛氧羰基-羅丹明110，SEQIDNO:97N-(Ac-LVGGG)-N'-辛氧羰基-羅丹明110，SEQIDNO:98N-(Ac-MVGGG)-N'-辛氧羰基-羅丹明110，SEQIDNO:99N-(Ac-IVGGG)-N'-辛氧羰基-羅丹明110，SEQIDNO:100N-(Ac-LRGGG)-N'-辛氧羰基-羅丹明110，SEQIDNO:101N-(Ac-LRGGA)-N'-辛氧羰基-羅丹明110，SEQIDNO:102N-(Ac-LRGG)-N'-辛氧羰基-羅丹明110，SEQIDNO:55N-(Z-LRGGG)-N'-辛氧羰基-羅丹明110，SEQIDNO:101N(Z-LRGGA)-N-辛氧羰基-羅丹明110，SEQIDNO:102N-(Z-LRGG)-N'-辛氧羰基-羅丹明110，SEQIDNO:55N-(Ac-LRGGG)-N'-乙氧羰基-羅丹明110，SEQIDNO:101N-(Ac-LRGGA)-N'-乙氧羰基-羅丹明110，SEQIDNO:102N-(Ac-LRGG)-N'-乙氧羰基-羅丹明110，SEQIDNO:55N-(Ac-LRGGG)-N'-(乙硫基)羰基-羅丹明110，SEQIDNO:101N-(Ac-LRGGA)-N'-(乙硫基)羰基-羅丹明110，SEQIDNO:102N-(Ac-LRGG)-N'-(乙硫基)羰基-羅丹明110，SEQIDNO:55N-(Ac-LVLASSS)-N'-辛氧羰基-羅丹明110，SEQIDNO:103N-(Ac-LVLASS)-N'-辛氧羰基-羅丹明110，SEQIDNO:104N-(Ac-LVLAS)-N'-辛氧羰基-羅丹明110，SEQIDNO:105N-(Ac-LVLA)-N'-辛氧羰基-羅丹明110，SEQIDNO:62N-(Z-LVLASSS)-N'-辛氧羰基-羅丹明110，SEQIDNO:103N-(Z-LVLASS)-N'-辛氧羰基-羅丹明110，SEQIDNO:104N-(Z-LVLAS)-N'-辛氧羰基-羅丹明110，SEQIDNO:105N-(Z-LVLA)-N'-辛氧羰基-羅丹明110，SEQIDNO:62N-(Ac-LVLASS)-N'-乙氧羰基-羅丹明110，SEQIDNO:104N-(Ac-LVLAS)-N'-乙氧羰基-羅丹明110，SEQIDNO:105N-(Ac-LVLA)-N'-乙氧羰基-羅丹明110，SEQIDNO:62N-(Ac-LVLASS)-N'(乙硫基)羰基-羅丹明110，SEQIDNO:104N-(Ac-LVLAS)-N'-(乙硫基)羰基-羅丹明110，SEQIDNO:105N-(Ac-LVLA)-N'-(乙硫基)羰基-羅丹明110，SEQIDNO:62N-(Ac-VVNASS)-N'-辛氧羰基-羅丹明110，SEQIDNO:106N-(Ac-VVNAS)-N'-辛氧羰基-羅丹明110，SEQIDNO:107N-(Ac-VVNA)-N'-辛氧羰基-羅丹明110，SEQIDNO:64N-(Ac-Tbg-Tbg-NASS)-N'-辛氧羰基-羅丹明110，SEQIDNO:108N-(Ac-Tbg-Tbg-NAS)-N'-辛氧羰基-羅丹明110，SEQIDNO:109N-(Ac-Tbg-Tbg-NA)-N'-辛氧羰基-羅丹明110，SEQIDNO:110N-(Z-Tbg-Thg-NASS)-N'-辛氧羰基-羅丹明110，SEQIDNO:108N-(Ac-Tbg-Tbg-NAS)-N'-辛氧羰基-羅丹明110，SEQIDNO:109N-(Ac-Tbg-Tbg-NA)-N'-辛氧羰基-羅丹明110，SEQIDNO:110N-(Ac-Tbg-Tbg-NASS)-N'-乙氧羰基-羅丹明110，SEQIDNO:108N-(Ac-Tbg-Tbg-NAS)-N'-乙氧羰基-羅丹明110，SEQIDNO:109N-(Ac-Tbg-Tbg-NA)-N'-乙氧羰基-羅丹明110，SEQIDNO:110N-(Ac-Tbg-Tbg-NASS)-N'-(乙硫基)羰基-羅丹明110，SEQIDNO:108N-(Ac-Tbg-Tbg-NAS)-N'-(乙硫基)羰基-羅丹明110，SEQIDNO:109N-(Ac-Thg-Thg-NA)-N'-(乙硫基)羰基-羅丹明110，SEQIDNO:110N-(Ac-DDIVPCSMST)-N'-辛氧羰基-羅丹明110，SEQIDNO:111N-(Ac-DIVPCSMST)-N'-辛氧羰基-羅丹明110，SEQIDNO:112N-(Ac-IVPCSMST)-N'-辛氧羰基-羅丹明110，SEQIDNO:113N-(Ac-IVPCSMS)-N'-辛氧羰基-羅丹明110，SEQIDNO:114N-(Ac-IVPCSM)-N'-辛氧羰基-羅丹明110，SEQIDNO:115N-(Ac-IVPCS)-N-辛氧羰基-羅丹明110，SEQIDNO:116N-(Ac-IVPC)-N'-辛氧羰基-羅丹明110，SEQIDNO:69N-(Z-IVPCSMST)-N'-辛氧羰基-羅丹明110，SEQIDNO:113N-(Z-IVPCSMS)-N'-辛氧羰基-羅丹明110，SEQIDNO:114N-(Z-IVPCSM)-N'-辛氧羰基-羅丹明110，SEQIDNO:115N-(Z-IVPCS)-N'-辛氧羰基-羅丹明110，SEQIDNO:116N-(Ac-IVPCSMS)-N'-乙氧羰基-羅丹明110，SEQIDNO:114N-(Ac-IVPCSM)-N'-乙氧羰基-羅丹明110，SEQIDNO:115N-(Ac-IVPCS)-N'-乙氧羰基-羅丹明110，SEQIDNO:116N-(Ac-IVPCSMS)-N'-(乙硫基)羰基-羅丹明110，SEQIDNO:114N-(Ac-IVPCSM)-N'-(乙硫基)羰基-羅丹明110，SEQIDNO:115N-(Ac-IVPCS)-N'-(乙硫基)羰基-羅丹明110，SEQIDNO:116。其中Z是芐氧羰基，BOC為叔丁氧羰基，Ac為乙?；琓bg為叔丁基甘氨酸，AM為乙酸基甲基。本發(fā)明的優(yōu)選的新型熒光染料是具有通式Ⅵ的化合物，包括但不限于N-甲?；?羅丹明110，N-乙?；?羅丹明110，N-己?；?羅丹明110，N-辛?；?羅丹明110，N-癸酰基-羅丹明110，N-十二烷?；?羅丹明110，N-甲氧羰基-羅丹明110，N-乙氧羰基-羅丹明110，N-丁氧羰基-羅丹明110，N-己氧羰基-羅丹明110，N-辛氧羰基-羅丹明110，N-癸氧羰基-羅丹明110，N-十二烷氧羰基-羅丹明110，N-芐氧羰基-羅丹明110，N-(2-丁氧基乙氧羰基)-羅丹明110，N-(2,5,8-三氧雜癸氧羰基)-羅丹明110，N-(甲硫基)羰基-羅丹明110，N-(乙硫基)羰基-羅丹明110，N-(丁硫基)羰基-羅丹明110，N-(己硫基)羰基-羅丹明110，N-(辛硫基)羰基-羅丹明110，N-(癸硫基)羰基-羅丹明110，N-(十二烷硫基)羰基-羅丹明110，N-甲磺酰基-羅丹明110，N-乙磺?；?羅丹明110，N-己磺?；?羅丹明110，N-辛磺?；?羅丹明110，N-癸磺?；?羅丹明110，N-十二烷基磺酰基-羅丹明110，N-三氟甲磺?；?羅丹明110，N-二甲基氨基甲?；?羅丹明110，N-二乙基氨基甲?；?羅丹明110，N-(N-甲基-N-己基氨基甲?；?-羅丹明110，N-(N-甲基-N-辛基氨基甲?；?-羅丹明110，N-(N-甲基-N-癸基氨基甲?；?-羅丹明110，N-乙?；?羅丹明116，N-甲氧羰基-羅丹明116，N-乙氧羰基-羅丹明116，N-辛氧羰基-羅丹明116，N-己氧羰基-羅丹明116，N-芐氧羰基-羅丹明116，N-甲磺?；?羅丹明116，N-三氟甲磺酰基-羅丹明116，N-辛磺酰基-羅丹明116，N-乙酰基-羅丹明19，N-乙氧羰基-羅丹明19，N-辛氧羰基-羅丹明19，N-甲氧羰基-羅丹明19，和N-甲磺?；?羅丹明19。典型的芳基是C6-10芳基，包括苯基、萘基、芴基等等，其中任何一種都可以用鹵素或烷基取代。典型的烷基是C1-10烷基，包括甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、庚基、辛基、壬基、癸基及其支鏈異構(gòu)體。典型的?；?烷?；?是C2-10烷?；?，如乙酰基、丙?；?、丁?；?、戊?；?、己酰基等等，及其支鏈異構(gòu)體。本發(fā)明化合物的典型的生物學(xué)可接受的鹽包括鈉鹽、鉀鹽、銨鹽、TRIS等等。本發(fā)明的某些化合物可以是互變異構(gòu)形式，尤其是通式Ⅰ中的y部分。本發(fā)明包括所有這些互變異構(gòu)體。本發(fā)明也包括立體異構(gòu)體、這些立體異構(gòu)體的外消旋混合物，以及個(gè)別的對(duì)映體，它們可以按照本領(lǐng)域普通技術(shù)人員眾所周知的方法分離。本發(fā)明的化合物可以用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法制備。具體地，通式Ⅰ-Ⅲ的化合物能如方案1-5中示例反應(yīng)所述進(jìn)行制備。方案1是最低優(yōu)選的方法，因?yàn)橛肏Br/HOAc去保護(hù)引起叔丁氧基和芐氧羰基(Z)的去除，這使下一步偶聯(lián)反應(yīng)復(fù)雜化。因此，需要叔丁氧基時(shí)，必須重新引入。當(dāng)用N-(9-芴基甲氧羰基)(fmoc)作為N端保護(hù)基團(tuán)時(shí)(方案2)，它能用嗎啉、哌啶或其它胺堿選擇性地去除，而不去除叔丁氧保護(hù)基，從而允許其它Z保護(hù)的氨基酸或肽的方便引入(參見(jiàn)方案2-4)。最后的Z-保護(hù)的化合物能用三氟乙酸(TFA)選擇性地去保護(hù)，以除去叔丁氧基而不去除Z基。方案1方案2方案3方案4方案5因此，本發(fā)明也涉及通式Ⅲ的化合物的制備方法，包括(a)使羅丹明110與N-fmoc-L-天冬氨酸β-叔丁酯一起縮合，產(chǎn)生(Fmoc-Asp(OBu-t))2-羅丹明110；(b)除去Fmoc基，得到(Asp(OBu-t))2-羅丹明110；(c)使(Asp(OBu-t))2-羅丹明110與Z-(AA)n縮合，產(chǎn)生(Z-(AA)n-Asp(OBu-t))2-羅丹明110；及(d)除去OBu-t保護(hù)基。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，-(AA)n為WEH、YVA、LEH、DET、DEV、DEH、VEH、LET、SHV、DEL、DGP、DEP、DGT、DLN、DEE、DSL、DVP、DEA、DSY、ELP、VED、IEP或IET。當(dāng)氨基酸被羧基取代時(shí)，它用OBu-t保護(hù)基保護(hù)，在最后一步除去該保護(hù)基?？梢允褂糜糜陔暮铣傻娜魏纬Ｒ?guī)縮合劑進(jìn)行縮合反應(yīng)。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，縮合劑是1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺(EDC)或2-乙氧基-1-乙氧基羰基-1,2-二氫喹啉(EEDQ)。該反應(yīng)的溶劑可以是吡啶或二甲基甲酰胺(DMF)。該反應(yīng)一般在室溫下進(jìn)行?？s合劑與羅丹明的比例大約為10∶1，受保護(hù)的氨基酸或肽與羅丹明或(Asp(OBu-t)2-羅丹明110的比例也是大約10∶1。Fmoc基的去除一般是通過(guò)用嗎啉、哌啶或其它胺堿的極性非質(zhì)子溶劑如DMF溶液處理。通常，加入過(guò)量的嗎啉，并在室溫下進(jìn)行反應(yīng)。α,α-二甲基-3,5-二甲氧基芐氧羰基(Ddz)是能用來(lái)代替fmoc的另一種N端保護(hù)基。因此，能用N-Ddz-L-天冬氨酸β-叔丁酯代替N-fmoc-L-天冬氨酸β-叔丁酯。在叔丁氧基存在下，1％的TFA二氯甲烷溶液能選擇性地裂解Ddz。OBu-t基可以用三氟乙酸的非質(zhì)子溶劑如二氯甲烷溶液在室溫下去除。具有通式Ⅵ的化合物能如方案6中示例反應(yīng)所述制備。方案6具有通式Ⅶ-Ⅸ的化合物能如方案7-10中示例反應(yīng)所述制備。方案7方案8方案9方案10因此，本發(fā)明也涉及通式Ⅶ的化合物的制備方法，包括(a)使羅丹明與乙酸酐反應(yīng)，產(chǎn)生N-乙?；?羅丹明；(b)使N-乙酰基-羅丹明與N-fmoc-L-天冬氨酸β-叔丁酯一起縮合，產(chǎn)生N-(Fmoc-Asp(OBu-t))-N'-乙?；?羅丹明；(c)除去Fmoc基，得到N-(Asp(OBu-t))-N'-乙?；?羅丹明；(d)使N-(Asp(OBu-t))-N'-乙?；?羅丹明與Z-(AA)n縮合，產(chǎn)生N-(Z-(AA)n-Asp(OBu-t))-N'-乙?；?羅丹明；及(e)除去OBu-t保護(hù)基，得到N-(Z-(AA)n-Asp)-N'-乙?；?羅丹明；或者備擇地(a)使羅丹明與乙酸酐反應(yīng)，產(chǎn)生N-乙酰基-羅丹明；(b)使N-乙酰基-羅丹明與Z-(AA)n-Asp(OBu-t)縮合，產(chǎn)生N-(Z-(AA)n-Asp(OBu-t))-N'-乙酰基-羅丹明；及(c)除去OBu-t保護(hù)基，得到N-(Z-(AA)n-Asp)-N'-乙?；?羅丹明。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，-(AA)n為WEH、YVA、LEH、DET、DEV、DEH、VEH、LET、SHV、DEL、DGP、DEP、DGT、DLN、DEE、DSL、DVP、DEA、DSY、ELP、VED、IEP或IET。通式Ⅶ的化合物也能用?；?烷酰基)氯代替乙酸酐而制備，如乙酰氯、己酰氯、辛酰氯和癸酰氯。能用來(lái)代替乙酸酐的其它試劑包括但不限于氨基甲酰氯，如二甲基氨基甲酰氯、二乙基氨基甲酰氯和N-甲基-N-己基氨基甲酰氯；氯甲酸酯，如氯甲酸甲基酯、氯甲酸乙基酯、氯甲酸辛基酯、氯甲酸2-丁氧乙基酯和氯甲酸2,5,8-三氧雜癸基酯；氯硫甲酸酯，如氯硫甲酸甲基酯、氯硫甲酸乙基酯、氯硫甲酸辛基酯；烷基、鹵烷基和芳烷基磺酰鹵，如甲磺酰氯、辛磺酰氯、三氟甲磺酰氯和甲苯磺酰氯。該反應(yīng)在堿如(Et)3N、(i-Pr)2-NEt或吡啶的存在下進(jìn)行。優(yōu)選的溶劑是DMF。該反應(yīng)一般在室溫下進(jìn)行。酸酐或酰氯與羅丹明的比例約為1∶1?？梢允褂糜糜陔暮铣傻娜魏纬Ｒ?guī)縮合劑進(jìn)行縮合反應(yīng)。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，縮合劑是EDC或EEDQ，反應(yīng)溶劑為吡啶或二甲基甲酰胺(DMF)。該反應(yīng)一般在室溫下進(jìn)行?？s合劑與N-乙?；?羅丹明的比例約為3∶1，受保護(hù)氨基酸或肽與N-乙?；?羅丹明或N-(Asp(OBu-t))-N'-乙?；?羅丹明的比例約為3∶1。在一步反應(yīng)中使N-乙?；?羅丹明與一種肽如Z-(AA))n-Asp(OBu-t)縮合產(chǎn)生N-(Z-(AA)n-Asp(OBu-t))-N'-乙酰基-羅丹明是一種優(yōu)選的方法。因此，通式Ⅵ的化合物提供了熒光染料，它們能與任何肽或其它結(jié)構(gòu)縮合，用于制備作為蛋白酶或肽酶底物的發(fā)熒光或熒光化合物。原則上，也能如下制備通式Ⅷ的化合物，首先使肽與羅丹明縮合產(chǎn)生N-肽-羅丹明，然后使N-肽-羅丹明與乙酸酐或其它?；瘎┓磻?yīng)，產(chǎn)生例如N-乙?；?N'-肽-羅丹明。然而，a)肽通常比酰氯或酐貴得多，b)肽與羅丹明的縮合反應(yīng)不是一種高效的反應(yīng)。由于這些原因，優(yōu)選的是使肽與N-乙?；?羅丹明連接，而不是使酰基與N-肽-羅丹明連接。一方面，本發(fā)明涉及一種方法，用于確定試驗(yàn)底物對(duì)試驗(yàn)細(xì)胞中參與細(xì)胞凋亡級(jí)聯(lián)的酶是否有影響，包括(a)在一定條件下使試驗(yàn)細(xì)胞與試驗(yàn)物質(zhì)及根據(jù)本發(fā)明的報(bào)道化合物相接觸，從而使試驗(yàn)物質(zhì)或者與細(xì)胞的外膜受體相互作用，或者被該細(xì)胞吸收，而報(bào)道化合物被該細(xì)胞吸收，和(b)記錄試驗(yàn)細(xì)胞的熒光，其中與只接觸報(bào)道化合物而未接觸試驗(yàn)物質(zhì)的對(duì)照細(xì)胞相比，試驗(yàn)細(xì)胞內(nèi)熒光在數(shù)值或波長(zhǎng)上的變化表明該試驗(yàn)物質(zhì)對(duì)該酶有影響。能將該方法獲得的結(jié)果與應(yīng)用已知可影響參與細(xì)胞中細(xì)胞凋亡級(jí)聯(lián)的酶的試驗(yàn)化合物所獲得的結(jié)果相比較，產(chǎn)生試驗(yàn)物質(zhì)相對(duì)效能的量度。能使用的化合物包括參與凋亡級(jí)聯(lián)的酶的公知激活劑和抑制劑。通過(guò)直接或間接機(jī)制參與凋亡級(jí)聯(lián)的酶的激活劑包括但不限于已知的化療劑，如依托泊甙(YoonHJ，ChoiIY，KangMR，KimSS，MullerMT，SpitznerJR，ChungIK(1998)，生物化學(xué)與生物物理學(xué)學(xué)報(bào)(BiochimBiophysActa)1395:110-120)和阿霉素(GamenS，AnelA，LasierraP，AlavaMA，Martinez-LorenzoMJ，PineiroA，NavalJ(1997)，F(xiàn)EBSLett417:360-364)，它們是拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ抑制劑；順鉑(MaldonadoV，Melendez-ZajglaJ，OrtegaA(1997)，突變研究(MutatRes)381:67-75)；苯丁酸氮芥(HickmanJA.(1992)，癌癥轉(zhuǎn)移綜述(CancermetastasisRev)11:121-139)，它是一種烷化劑；和氟尿嘧啶，一種RNA/DNA抗代謝物(HickmanJA.(1992)，癌癥轉(zhuǎn)移綜述11:121-139)。當(dāng)在全細(xì)胞中篩選凋亡抑制劑時(shí)也能用這些凋亡激活劑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。通過(guò)直接或間接機(jī)制參與凋亡級(jí)聯(lián)的酶的滅活劑包括但不限于內(nèi)源蛋白質(zhì)，包括Bcl-2(JoensuuH，PylkkanenL，ToikkanenS(1994)，美國(guó)病理學(xué)雜志(Am.J.Pathol.)5:1191-1198)、病毒產(chǎn)生因子p53(MillerLK(1997)，細(xì)胞生理學(xué)雜志(J.CellPhysiol.)173:178-182)和合成的胱天肽酶抑制劑Z-VAD-FMK(AnS，KnoxKA(1996)，F(xiàn)EBSLett.386:115-122)。本發(fā)明尤其涉及具有通式Ⅰ-Ⅲ、Ⅴ、Ⅶ和Ⅷ的報(bào)道化合物在全細(xì)胞測(cè)定中的應(yīng)用，該測(cè)定法使用已被誘導(dǎo)經(jīng)歷凋亡的全細(xì)胞或組織標(biāo)本，來(lái)篩選直接或間接抑制參與細(xì)胞凋亡(程序性細(xì)胞死亡)的酶的化合物。應(yīng)用具有通式Ⅰ-Ⅲ、Ⅴ、Ⅶ和Ⅷ的化合物的這些篩選試驗(yàn)預(yù)計(jì)將導(dǎo)致新藥物或已知藥物的新用途的發(fā)現(xiàn)，這些藥物能在發(fā)生細(xì)胞、組織或完整器官損失的多種臨床條件下減緩或阻斷細(xì)胞死亡。具有通式Ⅰ-Ⅲ、Ⅴ、Ⅶ和Ⅷ的報(bào)道化合物和本發(fā)明的篩選試驗(yàn)?zāi)苡脕?lái)鑒定在多種局部缺血和興奮中毒條件下減少或防止神經(jīng)系統(tǒng)(腦、脊髓和周圍神經(jīng)系統(tǒng))中細(xì)胞死亡的藥物，包括但不限于中風(fēng)引起的病灶性局部缺血和心搏停止引起的完全性缺血。也能用該篩選試驗(yàn)鑒定能減少或防止神經(jīng)系統(tǒng)中細(xì)胞死亡的化合物，該細(xì)胞死亡是由于創(chuàng)傷性損傷(如頭損傷或脊髓損傷)、病毒感染或輻射誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞死亡(例如，癌癥放射治療的副作用)或環(huán)境毒性(例如，某些鹵代烴類引起的)。也能用該篩選試驗(yàn)鑒定可用于減少或防止多種神經(jīng)變性疾病中細(xì)胞死亡的細(xì)胞死亡抑制劑，這些疾病包括但不限于阿爾茨海默病、huntington舞蹈病、帕金森氏癥、多發(fā)性硬化癥、肌萎縮側(cè)索硬化和脊髓延髓萎縮。能用本發(fā)明的篩選試驗(yàn)鑒定在可能引起心肌死亡的任何疾病中防止細(xì)胞死亡的化合物。這包括心肌梗死、充血性心力衰竭和心肌癥。該篩選試驗(yàn)的一種特殊用途是鑒定能減少或防止某些心臟病毒感染中發(fā)生的心肌細(xì)胞死亡的化合物。能用本發(fā)明的篩選試驗(yàn)鑒定可防止視網(wǎng)膜神經(jīng)元細(xì)胞死亡的化合物，這種細(xì)胞死亡發(fā)生于與眼壓增高有關(guān)的疾病(如青光眼)中或與老化過(guò)程有關(guān)的視網(wǎng)膜疾病(如年齡相關(guān)的黃斑變性)中。也能用該試驗(yàn)鑒定可治療遺傳性退行性視網(wǎng)膜疾病如色素性視網(wǎng)膜炎的化合物。也能用本發(fā)明的篩選試驗(yàn)鑒定如下的細(xì)胞死亡抑制劑，它們能用來(lái)減少或防止免疫系統(tǒng)中細(xì)胞的成熟前死亡，尤其可用于鑒定在治療免疫缺陷疾病如獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS)、重度聯(lián)合免疫缺陷綜合征(SCIDS)及相關(guān)疾病中有用的抑制劑。也能用該篩選試驗(yàn)鑒定能用來(lái)治療輻射誘導(dǎo)的免疫抑制的細(xì)胞死亡抑制劑。也能用本發(fā)明的篩選試驗(yàn)鑒定在器官移植過(guò)程中有用的藥物。人器官及組織的移植是一種對(duì)器官衰竭的常用療法。然而，在移植過(guò)程中，供體器官或組織具有細(xì)胞死亡的危險(xiǎn)，因?yàn)樗谥踩胨拗髦叭狈φ５难汗?yīng)。這種局部缺血狀態(tài)能用細(xì)胞死亡抑制劑來(lái)治療，方法是將其輸入供體器官或組織中，或直接向器官/組織貯存介質(zhì)中加入細(xì)胞死亡抑制劑。這類細(xì)胞死亡抑制劑能用本發(fā)明所述的篩選試驗(yàn)鑒定。移植后，也可用細(xì)胞死亡抑制劑減少或防止供體器官/組織中的細(xì)胞死亡，以保護(hù)其免于通過(guò)觸發(fā)細(xì)胞凋亡而殺傷其目標(biāo)的宿主免疫細(xì)胞的作用。本發(fā)明所述的篩選試驗(yàn)?zāi)苡脕?lái)鑒定可用于保護(hù)移植器官免受排斥的細(xì)胞死亡抑制劑。也能用細(xì)胞死亡抑制劑的細(xì)胞保護(hù)作用防止體外受精過(guò)程使用的人或動(dòng)物精子和卵子的死亡。這些抑制劑能在收獲過(guò)程中使用，并且也能包含于貯存介質(zhì)中。利用本發(fā)明所述的篩選試驗(yàn)?zāi)荑b定在受精方法中有用的細(xì)胞死亡抑制劑。哺乳動(dòng)物細(xì)胞系和酵母細(xì)胞通常用來(lái)產(chǎn)生大量重組蛋白質(zhì)(如抗體、酶或激素)，供工業(yè)或醫(yī)藥應(yīng)用。這些細(xì)胞系中某些的壽命由于生長(zhǎng)條件、所表達(dá)重組分子的性質(zhì)(某些是毒性的)及其它未知因素而受限制。生長(zhǎng)培養(yǎng)基中含有細(xì)胞死亡抑制劑能延長(zhǎng)工業(yè)細(xì)胞系的壽命?？捎糜谘娱L(zhǎng)細(xì)胞系壽命的細(xì)胞死亡抑制劑能用本發(fā)明所述的篩選測(cè)定法來(lái)鑒定。負(fù)責(zé)毛發(fā)生長(zhǎng)及損失的因素大部分未知。然而有一些證據(jù)表明，毛囊退化(稱為退化期毛發(fā))可能至少部分地是由于細(xì)胞凋亡。因此，細(xì)胞死亡抑制劑能用來(lái)治療由于多種病癥而發(fā)生的毛發(fā)損失，包括但不限于男性型禿發(fā)、輻射誘導(dǎo)或化學(xué)治療誘導(dǎo)的毛發(fā)損失，和情緒應(yīng)激引起的毛發(fā)損失。也有證據(jù)表明細(xì)胞凋亡可能在毛色的損失中起作用。因此，細(xì)胞死亡抑制劑也能用于治療毛發(fā)過(guò)早變灰的病癥?？捎糜谥委熁蝾A(yù)防毛發(fā)損失或毛發(fā)變灰的細(xì)胞死亡抑制劑能用本發(fā)明所述的篩選測(cè)定法來(lái)鑒定。暴露于高水平的射線、熱或化學(xué)藥品后能發(fā)生皮膚上皮細(xì)胞的死亡。細(xì)胞死亡抑制劑能用來(lái)減少或防止此類皮膚損傷。在一種具體應(yīng)用中，能以軟膏的形式施用細(xì)胞死亡抑制劑，來(lái)治療對(duì)日光的急性過(guò)度暴露，并防止皮膚的起泡和脫皮?？捎糜谥委熁蚍乐蛊つw細(xì)胞死亡的細(xì)胞死亡抑制劑能用本發(fā)明所述的篩選測(cè)定法來(lái)鑒定。本發(fā)明的另一重要方面在于具有通式Ⅰ-Ⅲ、Ⅴ、Ⅶ和Ⅷ的報(bào)道化合物在全細(xì)胞測(cè)定中的應(yīng)用，該方法使用活的或死的全細(xì)胞或組織標(biāo)本，用于篩選直接或間接刺激參與細(xì)胞凋亡的酶的化合物。因此，這些應(yīng)用具有通式Ⅰ-Ⅲ、Ⅴ、Ⅶ和Ⅷ的化合物的篩選試驗(yàn)預(yù)計(jì)將導(dǎo)致新藥的發(fā)現(xiàn)，或發(fā)現(xiàn)在如癌癥、腫瘤及細(xì)胞增生等疾病中用作抗癌劑的已知藥物的新用途?？衫煤Y選試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)的化合物和此處所述的試劑可用于治療癌癥、腫瘤或組織增生，包括但不限于腦、周圍神經(jīng)系統(tǒng)、眼、耳、鼻、口、扁桃體、牙齒、食道、肺、心臟、血液、血管、骨髓、淋巴結(jié)、胸腺、脾、免疫系統(tǒng)、肝、胃、腸道、胰、內(nèi)分泌腺及組織、腎、膀胱、生殖器及生殖腺、關(guān)節(jié)、骨和皮膚的癌癥或腫瘤。本發(fā)明的另一重要方面在于具有通式Ⅰ-Ⅲ、Ⅴ、Ⅶ和Ⅷ的報(bào)道化合物在全細(xì)胞測(cè)定中的應(yīng)用，該方法使用酵母及其它真菌和細(xì)菌為抗真菌或抗細(xì)菌藥物篩查化合物文庫(kù)，這些藥物通過(guò)直接或間接地誘導(dǎo)胱天肽酶級(jí)聯(lián)或在這些細(xì)胞中參與細(xì)胞凋亡的其它酶而起作用。本發(fā)明的另一重要方面在于使用具有通式Ⅰ-Ⅲ、Ⅳ、Ⅶ和Ⅷ的報(bào)道化合物監(jiān)測(cè)對(duì)患者施用的治療劑或治療的治療效果，該治療旨在減少、預(yù)防或治療凋亡性細(xì)胞死亡是其原因或結(jié)果的疾病。本發(fā)明的另一重要方面在于用具有通式Ⅸ的報(bào)道化合物在HIV感染細(xì)胞中篩選HIV蛋白酶抑制劑，包括(a)在一定條件下使試驗(yàn)細(xì)胞與試驗(yàn)物質(zhì)和根據(jù)本發(fā)明的報(bào)道化合物相接觸，從而使該試驗(yàn)物質(zhì)或者與外膜受體相互作用，或者被該細(xì)胞吸收，而報(bào)道化合物被該細(xì)胞吸收，和(b)記錄試驗(yàn)細(xì)胞的熒光，其中與只接觸報(bào)道化合物、未接觸試驗(yàn)物質(zhì)的對(duì)照細(xì)胞相比，試驗(yàn)細(xì)胞內(nèi)熒光在數(shù)值或波長(zhǎng)上的變化表明該試驗(yàn)物質(zhì)對(duì)HIV蛋白酶具有抑制作用。本發(fā)明的再另一重要方面在于用具有通式Ⅸ的報(bào)道化合物診斷HIV感染，包括(a)在一定條件下使取自懷疑有HIV感染的個(gè)體的試驗(yàn)細(xì)胞與根據(jù)本發(fā)明的報(bào)道化合物相接觸，從而使報(bào)道化合物被該細(xì)胞吸收，和(b)記錄試驗(yàn)細(xì)胞的熒光，其中與接觸報(bào)道化合物的對(duì)照細(xì)胞相比，試驗(yàn)細(xì)胞內(nèi)熒光在數(shù)值或波長(zhǎng)上的變化表明試驗(yàn)細(xì)胞已被HIV病毒感染，并且該個(gè)體已感染了HIV。應(yīng)用與在HIV感染細(xì)胞中篩選HIV蛋白酶抑制劑相同的方法，能用本發(fā)明具有通式Ⅸ的報(bào)道化合物在腺病毒感染的細(xì)胞中篩選腺病毒蛋白酶抑制劑。本發(fā)明具有通式Ⅸ的報(bào)道化合物也能用來(lái)在1型單純皰疹病毒(HSV-1)感染的細(xì)胞中篩選HSV-1蛋白酶抑制劑。也能用該報(bào)道化合物在人巨細(xì)胞病毒(HCMV)感染的細(xì)胞中篩選HCMV蛋白酶抑制劑；在丙型肝炎病毒(HCV)感染的細(xì)胞中篩選HCV蛋白酶抑制劑；在T細(xì)胞中篩選DPP-IV抑制劑；以及在內(nèi)皮細(xì)胞中篩選2型甲硫氨酸氨肽酶(MetAP-2)抑制劑。另外，應(yīng)用與HIV感染的診斷相同的方法，也能用本發(fā)明具有通式Ⅸ的報(bào)道化合物診斷腺病毒、1型單純皰疹病毒、人巨細(xì)胞病毒和丙型肝炎病毒。本發(fā)明范圍內(nèi)的組合物包括所有這樣的組合物，其中以能有效實(shí)現(xiàn)預(yù)期目標(biāo)的量包含本發(fā)明的發(fā)熒光或熒光化合物。雖然其量可能隨測(cè)定法不同而不同，但對(duì)每種成分有效量最佳范圍的確定在本領(lǐng)域的技術(shù)之中。一般地，發(fā)熒光或熒光底物化合物可應(yīng)用于來(lái)源于哺乳動(dòng)物如人或其它動(dòng)物的細(xì)胞或細(xì)胞系，方法是使細(xì)胞或含有細(xì)胞的組織與大約0.01納摩爾到大約1摩爾濃度的發(fā)熒光或熒光底物一起溫育，或與其等量的鹽或前報(bào)道分子的生理學(xué)相容緩沖液溫育。這些緩沖液包括細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基，它是一種用于白血病衍生的癌細(xì)胞的實(shí)例，為含或不含10％胎牛血清的RPMI-1640。其它公知的細(xì)胞溫育緩沖液可能包括用磷酸鹽或HEPES緩沖的等滲溶液。本領(lǐng)域的一名普通技術(shù)人員能僅用常規(guī)實(shí)驗(yàn)確定其它合適的緩沖液。細(xì)胞可能來(lái)源于任何器官或器官系統(tǒng)，希望能利用篩選試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)能用于治療凋亡介導(dǎo)疾病的藥物，這些疾病包括例如神經(jīng)元細(xì)胞死亡、心臟疾病、肝臟疾病、視網(wǎng)膜疾病、腎、關(guān)節(jié)及骨疾病、免疫系統(tǒng)疾病、癌癥、腫瘤爭(zhēng)組織增生，等等。合適的增溶劑可用于向組織、細(xì)胞或細(xì)胞系遞呈本發(fā)明的發(fā)熒光或熒光化合物。合適的增溶劑包括水溶形式的活性化合物水溶液，例如，水溶性鹽和堿性溶液。另外，可以向細(xì)胞或組織遞呈為適當(dāng)油狀懸液的化合物懸液。合適的親脂性溶劑或載體包括脂肪油如芝麻油，或合成的脂肪酸酯如油酸乙酯或甘油三酯或聚乙二醇-400(這些化合物在PEG-400中可溶)或二甲亞砜(DMSO)或其它合適的增溶劑。任選地，該懸液或溶液也可含有穩(wěn)定劑。任選地，脂質(zhì)體或去污劑中報(bào)道分子的電穿孔或呈遞可用來(lái)提高發(fā)熒光或熒光報(bào)道分子的細(xì)胞通透性。一般地，細(xì)胞與本發(fā)明的報(bào)道分子和試驗(yàn)物質(zhì)接觸大約30分鐘到大約5小時(shí)，最優(yōu)選地大約1小時(shí)。本發(fā)明也涉及本發(fā)明的化合物的前報(bào)道分子衍生物。這些前報(bào)道分子衍生物包括可由內(nèi)源酶原位酶切產(chǎn)生通式Ⅰ-Ⅲ、Ⅴ和Ⅶ-Ⅸ的化合物的化合物。這些前報(bào)道分子衍生物包括含羧基氨基酸殘基如Asp和Glu的低級(jí)烷基酯。特別優(yōu)選的前報(bào)道分子衍生物包括含Asp和Glu的化合物的甲酯和乙酸基甲(AM)酯。下列實(shí)施例證明了本發(fā)明在測(cè)定胱天肽酶活性及參與細(xì)胞及組織中凋亡的其它酶的活性方面的有效性。這些實(shí)施例也證明了本發(fā)明在能用來(lái)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞凋亡增強(qiáng)劑或抑制劑的藥物篩選試驗(yàn)中的有效性。這些實(shí)施例用來(lái)說(shuō)明而不是限制本發(fā)明的方法及組合物。在體外測(cè)定、藥物篩選方法或診斷方法中常常遇到對(duì)多種條件及參數(shù)的其它適當(dāng)修改和改進(jìn)，這對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見(jiàn)的，都落在本發(fā)明的精神與范圍之內(nèi)。實(shí)施例1[Fmoc-Asp(OBu-t]2-羅丹明1100℃下，向溶解于二甲基甲酰胺與吡啶無(wú)水1∶1混合物(30mL)的Fmoc-L-天冬氨酸β-叔丁酯(4.9g，11.91mmol)溶液中加入EDC(2.28g，11.91mmol)。將該溶液攪拌45分鐘，然后加入羅丹明110HCl(0.44g，1.19mmol)在相同溶劑(2mL)中的溶液。在室溫下攪拌反應(yīng)混合物60小時(shí)，并在真空中濃縮為大約10mL。然后用100mL水稀釋殘余物，并用乙酸乙酯(3×50mL)抽提。用1NHCl(2×50mL)和水(2×50mL)洗滌有機(jī)相。該溶液在Na2SO4上干燥并濃縮，產(chǎn)生粗制品，通過(guò)柱層析(CH2Cl2/EtOAc10∶1)純化，得到0.89g(67％)為無(wú)色固體的標(biāo)題化合物，熔點(diǎn)為156-158℃。1HNMR(CDCl3):δ8.75(bs，2H),8.02(d,J=9.3Hz,2H),7.80-6.70(m,26H),6.12(bs,2H),4.64(bs,2H),4.46(d,J=6.8Hz,4H),4.22(t,J=6.8Hz,2H),2.82(m,4H),1.45(s,18H).實(shí)施例2[Asp(OBu-t)]2-羅丹明1102HCl將預(yù)冷的DMF/嗎啉溶液(3mL，1∶1)逐滴加入攪拌的[Fmoc-Asp(OBu-t)]2-羅丹明110(150mg，0.13mmol)二甲基甲酰胺溶液(3mL)中。攪拌該溶液20分鐘，倒入冰水中(100mL)，并用乙酸乙酯(2×100mL)抽提。用水(3×100mL)洗滌有機(jī)相，在Na2SO4上干燥。向該溶液中加入1NHCl的醚溶液(0.39mL)，濃縮后得到一種紅色固體。收集該紅色固體，溶解于甲醇(1mL)中，用乙醚(50mL)沉淀，得到為紅色固體的標(biāo)題化合物(65mg，77％)，熔點(diǎn)為200℃(分解)。實(shí)施例3[Z-Ala-Asp(OBu-t)]2-羅丹明1100℃下芐氧羰基-L-丙氨酸(376mg，1.69mmol)、EDC(258mg，1.35mmol)和[Asp(OBu-t)]2-羅丹明1102HCl(50mg，0.072mmol)的1∶1無(wú)水DMF/吡啶溶液(10mL)獲得63mg(86％)固體標(biāo)題化合物，熔點(diǎn)為124-126℃。1HNMR(CDCl3):δ8.85(d,2H),7.90(m,2H),7.60(m,4H),7.32(m,10H),7.10(m,2H),6.68(m,2H),5.20(s,2H),5.10(d，4H),4.90(s,2H),4.18(m,2H),2.82(m,4H),1.42(m,24H).實(shí)施例4(Z-Ala-Asp)2-羅丹明110向冷卻(0℃)的[Z-Ala-Asp(OBu-t)]2-羅丹明110(41mg，0.038mmol)二氯甲烷溶液(5mL)中加入50％三氟乙酸的二氯甲烷溶液(16mL)。溶液變?yōu)槌壬?，在室溫下攪?小時(shí)。除去溶劑，用快速柱層析(EtOAc/CF3CO2H=20∶0.5)純化粗制品，得到34mg(91％)標(biāo)題化合物。1HNMR(CD3OD):δ8.02(d,J=8.1Hz,1H),7.85(s,2H),7.73(t,J=7.5Hz,2H),7.34-6.60(m,15H).5.08(d,4H).4.05(m,2H),2.95(m,4H),1．38(d,J=6.4Hz,6H).實(shí)施例5[Z-Asp(OBu-t)]2-羅丹明1100℃下芐氧羰基-L-天冬氨酸β-叔丁酯(4.41g,13.63mmol)、EDC(2.61g，13.63mmol)和羅丹明110HCl(0.50g,1.36mmol)的1∶1無(wú)水DMF/吡啶溶液(40mL)獲得1.09g(82％)為無(wú)色固體的標(biāo)題化合物，熔點(diǎn)為127-129℃。1HNMR(CDCl3):δ8.75(bs,2H),8.06(d,J=6.3Hz,2H),7.68-7.56(m,4H),7.40-6.60(m,15H),6.12(bs,2H),5.16(s,4H),4.62(bs,2H),2.97(dd,J1=17.1Hz,J2=33Hz,2H),2.69(dd,J1=17．3Hz,J=6.9Hz,2H),1.44(s,18H).實(shí)施例6(Asp)2-羅丹明1102HBr將預(yù)冷的30％HBr醋酸溶液(5mL)逐滴加入[Z-Asp(OBu-t)]2-羅丹明110(200mg，0.21mmol)的醋酸攪拌溶液(2mL)中。在室溫下攪拌該溶液1小時(shí)，然后在真空中濃縮。向殘余物中加入100mL無(wú)水乙醚，產(chǎn)生紅色沉淀，離心后分離該沉淀，得到118mg(78％)的固體，熔點(diǎn)為130℃。1HNMR(DMSO-d6):δ10.81(s,2H),8.35(bs,6H),8.05-6.79(m,10H),4.25(bs,2H),2.96(m,4H).實(shí)施例7(Z-Val-Asp)2-羅丹明1100℃下芐氧羰基-L-纈氨酸(628mg，25mmol)、EDC(383mg，2mmol)和(Asp)2-羅丹明1102HBr(72mg，0.1mmol)的1∶1無(wú)水DMF/吡啶溶液(12mL)獲得38mg(37％)標(biāo)題化合物，熔點(diǎn)為169-171℃。1HNMR(DMSO):δ8.70(d,2H),8.04(d,J=7.5Hz,1H),7.80(m,2H),7.48-7.20(m,11H),7.05(m,2H),5.02(bs,4H),4.70(m,2H),3.85(t,2H),3.20(m,2H),2.60(m,2H),2.05(bs,2H),0.85(t,12H).實(shí)施例8[Z-Val-Ala-Asp(OBu-t)]2-羅丹明1100℃下芐氧羰基-L-纈氨酸-L-丙氨酸(200mg，0.62mmol)、EDC(110mg，0.57mmol)和[Asp(OBu-t)]2-羅丹明1102HCl(31mg，0.043mmol)的1∶1無(wú)水DMF/吡啶溶液獲得45mg(85％)標(biāo)題化合物，熔點(diǎn)為85-87℃。1HNMR(CDCl3):δ9.10(bs,1H),8.90(bs,1H),8.80(d,1H),7.80-6.60(m,19H),5.42(bs,2H),5.10(bs,4H),4.90(s,2H),4.00(d,2H),2.90(m,4H),2.12(m,2H),1.35(s,18H),1.30(d,J=6.4Hz,6H),0.92(m,12H).實(shí)施例9(Z-Val-Ala-Asp)2-羅丹明1100℃下[Z-Val-Ala-Asp(OBu-t)]2-羅丹明110(28mg,0.022mmol)和50％三氟乙酸的二氯甲烷溶液(30mL)獲得23mg(88％)標(biāo)題化合物。1HNMR(CD3OD):δ8.00(s,1H),7.92(bs,1H),7.86(bs,1H),7.70(m,2H),7.40-7.21(m,13H),6.70(s,1H),6.68(s,1H),5.08(d,4H),4.22(m,2H),3.90(m,2H),2.92(m,4H),2.06(m,2H),1.34(d,J=6.4Hz,6H),0.95(m,12H).實(shí)施例10[Z-Tyr-Val-Ala-Asp(OBu-t)]2-羅丹明110SEQIDNO:20℃下芐氧羰基-L-Tyr-L-Val-L-Ala(339mg，0.70mmol)、EDC(122mg，0.64mmol)和[Asp(OBu-t)]2-羅丹明1102HCl(39mg，0.058mmol)的1∶1無(wú)水DMF/吡啶溶液獲得61mg(65％)標(biāo)題化合物，熔點(diǎn)為155-157℃。1HNMR(CD3OD):δ8.02-6.60(m,28H),5.02(bs,4H),4.92(t,2H),4,80(t,2H),4.38(m,2H),4.22(n,2H),3.05-2.62(m,8H),2.02(m,2H),1.42(s,18H),1.32(d,J=6.6Hz,6H),0.92(m,12H).實(shí)施例11(Z-Tyr-Val-Ala-Aspt)2-羅丹明110SEQIDNO:20℃下[Z-Tyr-Val-Ala-Asp(OBu-t)]2-羅丹明110SEQIDNO:2(47mg，0.029mmol)和50％三氟乙酸的二氯甲烷溶液(30mL)獲得36mg(82％)標(biāo)題化合物，熔點(diǎn)為115℃。1HNMR(CD3OD):δ8.02(bs,2H),7.82(bs,2H),7.70(m,2H),7.40-6.60(m,22H),5.02(bs,4H),4.80(m,2H),4.38(m,2H),4.22(m,2H),4.10(m,2H),3.10-2.60(m,6H),2.06(m,2H),1.36(d,J=7.2Hz,6H),0.91(d,J=7.5Hz,12H).實(shí)施例12N-乙酰基-羅丹明1100℃下羅丹明110(500mg，1.36mmol)的DMF溶液(20mL)中加入N,N-二異丙基乙胺(176mg，1.36mmol)，然后向上述溶液中逐滴加入乙酸酐(167mg，1.64mmol)。在室溫下攪拌反應(yīng)溶液24小時(shí)，然后用100mL水稀釋，并用乙酸乙酯(3×50mL)抽提。用水(2×100mL)洗滌有機(jī)相，在Na2SO4上干燥并濃縮得到粗制品，通過(guò)柱層析(己烷/EtOAc1∶1)純化得到210mg(41％)為無(wú)色固體的標(biāo)題化合物，熔點(diǎn)為179℃(分解)。Rf=0.36(EtOAc/CH2Cl2=1∶1).1HNMR(CDCl3):δ8.00(d,J=6.7Hz,1H),7.78-7.52(m,4H),7.14(d,J=6.7Hz,1H),6.93(d,J=6.7Hz,1H),6.64(d,J=7.9Hz.1H),6.54-6.28(m,3H),3.86(bs,2H)，2.15(s,3H).實(shí)施例13N-[Fmoc-Asp(OBu-t)]-N'-乙?；?羅丹明1100℃下Fmoc-L-天冬氨酸叔丁酯(739mg，1.79mmol)、EDC(302mg，1.57mmol)和N-乙?；?羅丹明110(160mg，0.43mmol)的1∶1無(wú)水DMF/吡啶溶液(8mL)獲得276mg(84％)為無(wú)色固體的標(biāo)題化合物。Rf=0.75(EtOAc/CH2Cl2=1∶1).1HNMR(CDCl3):δ8.72(bs,1H),8.02(d,J=6.3Hz,1H),7.80-6.68(m,17H),6.12(bs,1H),4.63(bs,1H),4.47(d,J=5.5Hz,2H),4.22(t,J=7.2Hz,1H),2.96(m,1H),2.68(m,1H),2.20(s,3H),1.46(s,9H).實(shí)施例14N-[Asp(OBu-t)]-N'-乙?；?羅丹明110由預(yù)冷的DMF/嗎啉溶液(3mL，1∶1)和N-[Fmoc-Asp(OBu-t)]-N'-乙?；?羅丹明110(100mg，0.13mmol)獲得固體標(biāo)題化合物(67mg，95％)，熔點(diǎn)為131-133℃。1HNMR(CDCl3):δ9.73(s,1H),8.01(d,J=7.2Hz,1H),7.72(s,1H),7.70-6.65(m,9H),3.80(m,1H),2.88(d,J=16.5Hz,1H),2.70(m,1H),2.17(s,3H),1.90(bs,2H),1.44(s,9H).實(shí)施例15N-[Z-Ala-Asp(OBu-t)]-N'-乙?；?羅丹明1100℃下芐氧羰基-L-丙氨酸(43mg，0.19mmol)、EDC(37mg，0.19mmol)和N-Asp(OBu-t)-N'-乙酰基-羅丹明110(30mg，0.055mmol)的1∶1無(wú)水DMF/吡啶溶液獲得38mg(92％)固體標(biāo)題化合物，熔點(diǎn)為138-140℃。Rf=0.42(EtOAc/己烷4∶1)。1HNMR(CDCl3):δ8.82(bs,1H),8.01(d,J=6.6Hz.1H),7.70-6.67(m,14H),5.20(m,1H),5.16(bs,2H),4.90(m,1H),4.20(m,1H),3.12(m,1H),2.61(m,1H),2.19(s,3H),1.56(bs,3H),1.43(s,9H).實(shí)施例16N-(Z-Ala-Asp)-N'-乙?；?羅丹明-1100℃下N-[Z-Ala-Asp(OBu-t)]-N'-乙?；?羅丹明110(38mg，0.052mmol)和50％三氟乙酸的二氯甲烷溶液(3mL)獲得34mg(96％)標(biāo)題化合物。Rf=0.6(10mLEtOAc加5滴CF3CO2H)。1HNMR(CD3OD):δ8.02(d,J=7.5Hz,1H),7.80-6.69(m,14H),5.10(bs,2H),2.92(m,2H),2.14(s,3H),1.37(d,J=7.5Hz,3H).實(shí)施例17N-[Z-Val-Asp(OBu-t)]-N'-乙?；?羅丹明1100℃下芐氧羰基-L-纈氨酸(49mg，0.19mmol)、EDC(37mg，0.19mmol)和N-Asp(OBu-t)-N'-乙?；?羅丹明110(30mg，0.055mmol)的1∶1無(wú)水DMF/吡啶溶液(4mL)獲得40mg(94％)固體標(biāo)題化合物，熔點(diǎn)為155-157℃。Rf=05(EtOAc/己烷4∶1)。1HNMR(CDCl3):δ8.87(s,1H),8.01(d,J=7.5Hz,1H),7.64-6.66(m,14H),5.32(bs,1H),5.11(d,J=3.3Hz,2H),4.92(m,1H),4.02(m,1H),3.06(d,J=15.6Hz,1H),2.62(m,J=15.8Hz,1H),2.20(s,3H),1.43(s,9H),1.26(bs,1H),0.96(m,6H).實(shí)施例18N-(Z-Val-Asp)-N'-乙?；?羅丹明1100℃下N-[Z-Val-Asp(OBu-t)]-N'-乙?；?羅丹明110(40mg，0.051mmol)和50％三氟乙酸的二氯甲烷溶液(3mL)獲得37mg(99％)標(biāo)題化合物。Rf=0.6(10mLEtOAc加5滴CF3CO2H)。1HNMR(CD3OD):δ8.01(d,J=7.5Hz,1H),7.78-6.60(m,14H),5.08(d,J=6.5Hz,2H),4.83(m,1H),3.89(d,J=5.7Hz,1H),3.02(m,1H),2.85(m,1H),2.14(s,3H),1.25(m,1H),0.97(bs,6H).實(shí)施例19N-[Z-Val-Ala-Asp(OBu-t)]-N'-乙?；?羅丹明1100℃下芐氧羰基-L-纈氨酸-L-丙氨酸(63mg，0.019mmol)、EDC(37mg，0．19mmol)和N-Asp(OBu-t)-N'-乙?；?羅丹明110(30mg，0.052mmol)的1∶1無(wú)水DMF/吡啶溶液獲得40mg(97％)標(biāo)題化合物，熔點(diǎn)為101-103℃。Rf=0.35(EtOAc/己烷6∶1)。1HNMR(CDCl3):δ7.99(d,J=8.4Hz),7.80-6.62(m,14H),5.42(m,1H),5.11(bs,2H),4.90(m,1H),4.40(bs,1H),4.08(m,1H),3.68(bs,2H),3.50(m,1H),2.90(m,2H),2.16(bs,3H),1.41(s,9H),1.26(d,J=6.3Hz,3H),1.25(m,1H),0.93(m,6H).實(shí)施例20N-(Z-Val-Ala-Asp)-N'-乙?；?羅丹明1100℃下由N-[Z-Val-Ala-Asp(OBu-t)]-N'-乙?；?羅丹明110(36mg，0.043mmol)和50％三氟乙酸的二氯甲烷溶液(4mL)獲得35mg(100％)標(biāo)題化合物。Rf=0.4(10mLEtOAc加4滴CF3CO2H)。1HNMR(CD3OD):δ8.02(d,J=5.7Hz,1H),7.95-7.12(m,12H),6.71(s,1H),6.68(s,1H),5.09(bs,2H),4.82(m,1H),4.25(m,1H),3.88(m,1H),3.64(bs,1H),2.94(m,2H),2.14(s,3H),1.30(d,J=6.0Hz,3H),0.95(d,J=6.9Hz,6H).實(shí)施例21N-[Z-Tyr-Val-Ala-Asp(OBu-t)]-N'-乙?；?羅丹明110SEQIDNO:20℃下芐氧羰基-L-酪氨酸-L-纈氨酸-L-丙氨酸(119mg，0.25mmol)、EDC(47mg，0.25mmol)和N-Asp(OBu-t)-N'-乙?；?羅丹明110(30mg，0.055mmol)的1∶1無(wú)水DMF/吡啶溶液獲得50mg(95％)標(biāo)題化合物。Rf=0.5(EtOAc).1HNMR(CD3OD):δ8.02(d,J=7.8Hz,1H),7.82-6.58(m,18H),4.90(m,2H),4.35(m,1H),4.24(m,1H),4.08(m,1H),2.93(m,1H),2.73(m,1H),2.13(s,3H),1.43(s,9H),1.37(d,J=7.2Hz,3H),1.29(bs,1H),0.91(m,6H).實(shí)施例22N-(Z-Tyr-Val-Ala-Asp)-N'-乙?；?羅丹明110SEQIDNO:20℃下N-[Z-Tyr-Val-Ala-Asp(OBu-t)]-N'-乙酰基-羅丹明110SEQIDNO:2(49mg，0.049mmol)和50％三氟乙酸的二氯甲烷溶液(4mL)獲得42mg(89％)標(biāo)題化合物。Rf=0.62(10mLEtOAc加5滴CF3CO2H)。1HNMR(CD3OD):δ8.00(d,J=7.2Hz,1H),7.84-6.56(m,18H),4.99(bs,2H),4.80(m,1H),4.32(m,1H),4.23(m,1H),4.10(m,1H),2.97(m,2H),2.13(s,3H),1.37(d,J=6.9Hz,3H),1.23(m,1H),0.90(m,6F).實(shí)施例23N-[Z-Asp(OBu-t)-Glu(OBu-t)-Val-Asp(OBu-t)]-N'-乙酰基-羅丹明110SEQIDNO:50℃下芐氧羰基-L-Asp(OBu-t)-L-Glu(OBu-t)-L-Val-L-Asp(OBu-t)(262mg,0.34mmol)、EDC(65mg，0.34mmol)和N-乙?；?羅丹明110(30mg，0.08mmol)的1∶1無(wú)水DMF/吡啶溶液(4mL)獲得73mg(81％)標(biāo)題化合物，熔點(diǎn)為127-129℃。Rf=0.69(EtOAc/CH2Cl2=1∶1).1HNMR(CDCl3):δ9.05(s,1H),8.79(d,J=10.8Hz,1H),8.38(bs,1H),8.01-6.65(m,15H),6.10(m,1H),5.14(m,2H),4.92(bs,1H),4.52(m,1H),4.42(m,1H),4.18(m,1H),3.92(m,1H),3.10-2.64(m,4H),2.48(m,2H),2.17(bs,3H),1.40(m,27H),0.99(bs,6H).實(shí)施例24N-(Z-Asp-Glu-Val-Asp)-N'-乙酰基-羅丹明110SEQIDNO:50℃下N-[Z-Asp(OBu-t)-Glu(OBu-t)-Val-Asp(OBu-t)]-N'-乙?；?羅丹明110SEQIDNO:5(49mg，0.043mmol)和50％三氟乙酸的二氯甲烷溶液(5mL)獲得38mg(92％)標(biāo)題化合物。Rf=0.52(10mLEtOAc加5滴CF3CO2H)。1HNMR(CD3OD):δ8.04-6.63(m,15H),5.05(m,2H),4.50(m,1H),4.40(m,1H),4.05(m,1H),3.93(d,J=7.9Hz,1H),3.10-2.61(m,4H),2.37(m,2H),2.13(s,3H),0.97(m,6H).實(shí)施例25N-乙氧羰基-羅丹明110-50℃下向溶解于二甲基甲酰胺的羅丹明110(3.00g,8.18mmol)溶液(140mL)中加入N,N-二異丙基乙胺(1.27g，1.2mmol)，然后向上述溶液中逐滴加入氯甲酸乙酯(1.07mg，9.81mmol)。使反應(yīng)溶液緩慢升溫至室溫，持續(xù)攪拌5小時(shí)。然后用200mL冰水稀釋，并用乙酸乙酯(3×50mL)抽提。用鹽水(3×100mL)洗滌有機(jī)相，在Na2SO4上干燥并濃縮產(chǎn)生粗制品，通過(guò)柱層析(己烷/EtOAc3∶1)純化得到1.31g(40％)為無(wú)色固體的標(biāo)題化合物。Rf=0.4(EtOAc/己烷=2∶1)。1HNMR(CDCl3):δ8.00(d,J=6.9Hz,1H),7.65-7.50(m,4H),7.15(d,J=7.2Hz,1H),6.88-6.32(m,8H),4.24(q,J=7.2Hz,2H),3.92(bs,2H),1.33(t,J=7.2Hz,3H).實(shí)施例26N-[Cbz-Va1-Asp(OBu-t)]-N'-乙氧羰基-羅丹明110由Cbz-Val-Asp(OBu-t)(197mg,0.47mmol)、EDC(89.53mg，0.47mmol)和N-乙氧羰基-羅丹明110(47mg，0.12mmol)(如實(shí)施例1所述)獲得47mg(50％)固體標(biāo)題化合物。1HNMR(CDCl3):δ9.04(bs,1H),8.00(d,J=6.9Hz,1H),7.82-6.62(m,15H),5.30(bs,1H),5.20-5.11(m,2H),4.98(m,1H),4.23(q,J=6.9Hz,2H),3.74(t,1H),3.15(d,J=16.5Hz,1H),2.59(m,1H),2.10(m,1H),1.45(s,9H),1.32(t,J=6.9Hz,3H),1.01(m,6H).實(shí)施例27N-(Cbz-Val-Asp)-N'-乙氧羰基-羅丹明110由N-[Z-Val-Asp(OBu-t)]-N'-乙氧羰基-羅丹明110(20mg，0.025mmol)和50％三氟乙酸的二氯甲烷溶液(2mL)獲得15mg(80％)標(biāo)題化合物。1HNMR(CD3OD):δ8.02(d,J=6.6Hz,1H),7.86-6.59(m,14H),5.10(m,2H),4.97(m,1H),4.20(q,J=6.9Hz,2H),3.77(d,J=8.1Hz,1H),3.04(m,1H)，2.76(m,1H),2.00(m,1H),1.32(t.J=7.2Hz,3H),1.02(m,6H).實(shí)施例28N-[Cbz-Asp(OBu-t)-Glu(OBu-t)-Val-Asp(OBu-t)]-N'-乙氧羰基-羅丹明110SEQIDNO:5由Cbz-Asp(OBu-t)-Glu(OBu-t)-Val-Asp(OBu-t)SEQIDNO:5(374mg，0.48mmol)、EDC(92mg，0.48mmol)和N-乙氧羰基-羅丹明110(48.28mg，0.12mmol)(如實(shí)施例1所述)獲得81mg(58％)固體標(biāo)題化合物。1HNMR(CDCl3):δ9.02(bs,1H),8.80(d,1H),8.00-6.78(m,15H),6.18-6.02(m,1H),5.13(bs,2H),4.94(bs,1H),4.60(bs,1H),4.44(bs,1H),4.22(m,2H),3.89(m,1H),3.15-2.00(m,8H),1.46-1.31(m,27H),1.26(m,1H),1.05-0.98(m,9H).實(shí)施例29N-(Cbz-Asp-Glu-Val-Asp)-N'-乙氧羰基-羅丹明110SEQIDNO:5由N-[Z-Asp(OBu-t)-Glu(OBu-t)-Val-Asp(OBu-t)]-N'-乙氧羰基-羅丹明110SEQIDNO:5(100mg，0.086mmol)和50％三氟乙酸的二氯甲烷溶液(3mL)(如實(shí)施例4所述)獲得85mg(99％)標(biāo)題化合物。Rf=0.5(10mLEtOAc加5滴CF3CO2H)。1HNMR(CD3OD):δ8.02-6.63(m,15H),5.08-5.04(d,2H),4.48-3.92(m,6H),3.10-1.95(m,8H),1.31(t,J=7.2Hz,3H),1.05-0.96(m,9H).實(shí)施例30N-[Ac-Asp(OBu-t)-Glu(OBu-t)-Val-Asp(0Bu-t)]-N'-乙氧羰基-羅丹明110SEQIDNO:5由Ac-Asp(OBu-t)-Glu(OBu-t)-Val-Asp(OBu-t)SEQIDNO:5(307.6mg，0.45mmol)、EDC(86mg，0.45mmol)和N-乙氧羰基-羅丹明110(60mg，0.15mmol)(如實(shí)施例1所述)獲得128mg(80％)固體標(biāo)題化合物。Rf=0.35(EtOAc/CH2Cl2=1∶1).1HNMR(CDCl3):δ9.00(d,J=7.5Hz),8.80-8.54(m,2H),8.05-6.90(m,9H),6.72(s,1H),6.69(s,1H),4.93-4.02(m,6H),3.09-2.30(m,6H),2.10(s,3H),2.05(m,2H),1.48-1.30(m,29H),1.06-0.96(m,6H).實(shí)施例31N-(Ac-Asp-Glu-Val-Asp)-N'-乙氧羰基-羅丹明110SEQIDNO:5由N-[Ac-Asp(OBu-t)-Glu(OBu-t)-Val-Asp(OBu-t)]-N'-乙氧羰基-羅丹明110SEQIDNO:5(90mg，0.084mmol)和50％三氟乙酸的二氯甲烷溶液(2mL)獲得65mg(86％)標(biāo)題化合物。1HNMR(CD3OD):δ8.12-7.26(m,9H),7.2l(d,J=7.2Hz,1H),7.08-7.05(m,1H),6.79-6.64(m,2H),4.67(m,1H),4.40(m,1H),4.20(q,J=6.9Hz,2H),4.07-3.52(m,2H),3.07-2.68(m,4H),2.38(m,2H),2.13(m,2H),1.98-1.94(t,3H),1.32(t,J=6.9Hz,3H),1.04-0.95(m,6H).實(shí)施例32N-辛氧羰基-羅丹明110由羅丹明110(500mg，1．36mmol)、N,N-二異丙基乙胺(351.6mg，2.76mmol)和氯甲酸辛酯(316mg，1.64mmol)(如實(shí)施例25所述)獲得182mg(28％)為無(wú)色固體的標(biāo)題化合物。Rf=0.7(EtOAc/己烷=1∶1)。1HNMR(CDCl3):δ7.99(d,J=7.2Hz,1H),7.65-7.56(m,2H),7.52(bs,1H),7.15(d,J=7.5Hz,1H),6.88-6.32(m,6H),4.17(t,J=6.6Hz,2H),3.9(2H),1.68(m,2H),1.42-1.26(m,8H),0.89(t,J=6.3Hz,3H).實(shí)施例33N-[Ac-Asp(OBu-t)-Glu(OBu-t)-Val-Asp(OBu-t)]-N'-辛氧羰基-羅丹明110SEQIDNO:5由Ac-Asp(OBu-t)-Glu(OBu-t)-Val-Asp(OBu-t)SEQIDNO:5(123.7mg，0.18mmol)、EDC(34.5mg，0.18mmol)和N-辛氧羰基-羅丹明110(29mg,0.06mmol)(如實(shí)施例1所述)獲得43mg(62％)固體標(biāo)題化合物。1HNMR(CDCl3):δ9.0l-8.53(m,3H),8.07-7.99(m,1H),7.77-6.78(m,9H),6.72(s,1H),6.69(s,1H),4.93(m,1H),4.76-4.64(m,1H),4.39(m,1H),4.16(m,2H),4.06(m,1H),3.08-2.02(m,9H),2.10(s,3H),1.47-1.29(m,39H),1.05-0.96(m,6H),0.88(t,J=5.7Hz,3H).實(shí)施例34N-(Ac-Asp-Glu-Val-Asp)-N'-辛氧羰基-羅丹明110SEQIDNO:5由N-[Z-Asp(OBu-t)-Glu(OBu-t)-Val-Asp(OBu-t)]-N'-辛氧羰基R-110SEQIDNO:5和50％三氟乙酸的二氯甲烷溶液(2mL)獲得16.5mg(100％)標(biāo)題化合物。Rf=0.46(10mLEtOAc與5滴CF3CO2H)。1HNMR(CD3OD):δ8.02-7.04(m,8H),6.79-6.64(m,2H),4.67(m,1H),4.40(m,1H),4.15(t,J=6.6Hz.2H),4.15-3.94(m,2H),3.10-2.10(m,6H),2.01-1.94(m,3H),1.69(m,2H),1.29(bs,10H),1.05-0.86(m,9H).實(shí)施例35N-甲氧羰基-羅丹明110由羅丹明110(600mg，1.64mmol)、N,N-二異丙基乙胺(254mg，1.96mmol)和氯甲酸甲酯(201mg，2.13mmol)(如實(shí)施例25所述)獲得28mg(4.4％)為無(wú)色固體的標(biāo)題化合物。Rf=0.77(EtOAc/己烷=3∶1)。1HNMR(CDCl3):δ8.10-6.53(m,9H),6.35(d,J=7.2Hz,1H),3.90(bs,2H),3.80(s,3H).實(shí)施例36N-甲磺?；?羅丹明110由羅丹明110(500mg，1.36mmol)、N,N-二異丙基乙胺(211mg，1.64mmol)和甲磺酰氯(187mg,1.64mmol)(如實(shí)施例25所述)獲得42.1mg(9.4％)標(biāo)題化合物。1HNMR(CDCl3):δ8.02(d,J=7.5Hz,1H),7.71-7.62(m,3H),7.24-6.36(m,7H),3.95(bs,2H),3.18(s,3H).實(shí)施例37N-乙?；?羅丹明116由羅丹明116(458.8mg，1.0mmol)、N,N-二異丙基乙胺(129.3mg，1.0mmol)和乙酸酐(122mg，1.2mmol)(如實(shí)施例25所述)獲得141mg(9.4％)為無(wú)色固體的標(biāo)題化合物。Rf=0.64(EtOAc/CH2Cl2=2∶1).1HNMR(CDCl3):δ8.01(d,J=7.5Hz,1H),7.69-7.62(m,3H),7.24-6.36(m,7H),3.95(bs,2H),3.28(s,3H),2.87(s,3H),1.95(bs,3H).實(shí)施例38N-二甲基氨基甲酰基-羅丹明110由羅丹明110(1.0g，2.73mmol)、N,N-二異丙基乙胺(0.42g，3.27mmol)和二甲基氨基甲酰氯(0.35g，3.27mmol)(如實(shí)施例25所述)獲得10mg(1％)固體標(biāo)題化合物。Rf=0.3(EtOAc).1HNMR(CD3OD):δ8.00(d,J=7.2Hz,1H),7.80-7.64(m,3H),7.55(d,J=2.1Hz,1H),7.21-6.40(m,6H),3.03(s,6H).實(shí)施例39N-己氧羰基-羅丹明-110由羅丹明-110、二異丙基乙胺(0.24g，2.52mmol)和氯甲酸己酯(0.27mL，1.64mmol)(如實(shí)施例25所述)獲得為橙色固體的標(biāo)題化合物(80mg，13％)。1HNMR(CDCl3):δ7.99(d,J=6.6,1H),7.67-7.56(m,2H),7.51(s,1H),7.14(d,J=7.5,1H),6.87(dd,J=1.8,8.7,1H),6.79(s,1H),6.66(d,J=8.7,1H),6.54-6.50(m,2H),6.33(dd,J=2.1,8.7,1H),4.17(t,J=6.6,2H),3.92(s,2H),1.68(m,2H),1.34(brs,6H),0.91(t,J=6.0,3H).實(shí)施例40N-癸氧羰基-羅丹明-110如實(shí)施例25所述制備標(biāo)題化合物。1HNMR(CDCl3):δ7.98(d,J=7.2,1H),7.67-7.56(m,2H),7.51(s,1H),7.14(d,J=7.5,1H),6.89-6.87(m,2H),6.66(d,J=8.4,1H),6.5.3-6.49(m,2H),6.32(d,J=8.4,1H),4.17(t,J=6.6,2H),3.93(s,2H),1.67(m,2H),1.27(brs,14H),0.89(t,J=6.9,3H).實(shí)施例41N-十二烷氧羰基-羅丹明-110如實(shí)施例25所述制備標(biāo)題化合物,1HNMR(CDCl3):δ8.00(d,J=6.9,1H),7.68-7.57(m,2H),7.51(s,1H),7.16(d,J=6.9,1H),6.86(d,J=8.4,1H),6.89-6.53(m,4H),6.35(d,J=7.1,1H),4.17(t,J=6.3,2H),3.89(s,2H),1.67(m,2H),1.27(brs,18H),0.89(t,J=5.7,3H).實(shí)施例42N-[Ac-Asp(OBu-t)-Glu(OBu-t)-Val-Asp(OBu-t)]-N'-己氧羰基-羅丹明-110SEQIDNO:5由Ac-Asp(OBu-t)-Glu(OBu-t)-Val-Asp(OBu-t)-OHSEQIDNO:5(263mg，0.383mmol)、EDC(74mg，0.39mmol)和N-己氧羰基-羅丹明-110(44mg，0.096mmol)(根據(jù)實(shí)施例1)獲得為白色固體的標(biāo)題化合物(30mg，28％)。1HNMR(CDCl3):δ8.99(d,J=6.9,1H),8.78(d,J=11.7,1H),8.52(s,1H),8.06-6.69(m,13H),4.97-4.01(m,6H),3.08-2.04(m,12H),1.70-1.34(m,39H),1.04-0.89(m,9H).實(shí)施例43N-[Ac-Asp(OBu-t)-Glu(OBu-t)-Val-Asp(OBu-t)]-N'-癸氧羰基-羅丹明-110SEQIDNO:5如實(shí)施例l所述制備標(biāo)題化合物。1HNMR(CDCl3):δ9.01-8.76(m,3H),8.51(s,1H),8.02-6.69(m,13H),4.97-4.01(m,6H),3.08-2.04(m,12H),1.70-1.34(m,47H),1.04-0.88(m,9H).實(shí)施例44N-[Ac-Asp(OBu-t)-Glu(OBu-t)-Val-Asp(OBu-t)]-N'-十二烷氧羰基-羅丹明-110SEQIDNO:5如實(shí)施例1所述制備標(biāo)題化合物。1HNMR(CDCl3):δ9.01-8.76(m,3H),8.51(s,1H),8.02-6.69(m,13H),4.97-4.01(m,6H),3.08-2.04(m,12H),1.70-1.34(m,51H),1.04-0.88(m,9H).實(shí)施例45N-(Ac-Asp-Glu-Val-Asp)-N'-己氧羰基-羅丹明-110SEQIDNO:5由N-[Ac-Asp(OBu-t)-Glu(OBu-t)-Val-Asp(OBu-t]-N'-己氧羰基-羅丹明-110SEQIDNO:5(30mg，0.027mmol)和三氟乙酸(2mL)獲得為黃色固體的標(biāo)題化合物(22mg，85％)。1HNMR(CD3OD):δ8.13-7.32(m,8H),7.26(d,J=6.6,1H),7.12(d,J=8.7,1H),6.83-6.69(m,2H),4.72(m,1H),4.44-3.99(m,5H),3.11-2.77(m,3H),2.43(m,2H),2.17(m,2H),2.03-1.98(m,5H),1.73(m,2H),1.49-1.34(m,8H),1.04-0.97(m,9H).實(shí)施例46N-(Ac-Asp-Glu-Val-Asp)-N'-癸氧羰基-羅丹明-110SEQIDNO:5如實(shí)施例45所述制備標(biāo)題化合物。1HNMR(CD3OD):δ8.13-7.32(m,8H),7.26(d,J=7.8,1H),7.12(d.J=8.1,1H),6.83-6.69(m,2H),4.72(m,1H),4.44-3.99(m,5H),3.11-2.77(m,3H),2.45(m,2H),2.22-2.10(m,2H),2.05-1.98(m,5H),1.73(m,2H),1.49-1.26(m,14H),1.06-0.92(m,9H).實(shí)施例47N-(Ac-Asp-Glu-Val-Asp)-N'-十二烷氧羰基-羅丹明-110SEQIDNO:5如實(shí)施例45所述制備標(biāo)題化合物。1HNMR(CD3OD):δ8.07-7.08(m,10H),6.81-6.68(m,2H),4.73(m,1H),4.44-3.35(m,5H),3.26-2.02(m,12H),1.73(m,2H),1.49-1.29(m,18H),1.06-0.92(m,9H).實(shí)施例48N-(乙硫基)羰基-羅丹明110向-61℃溶解于二甲基甲酰胺的羅丹明110(500mg，1.36mmol)溶液(12mL)中加入N,N-二異丙基乙胺(264mg，2.04mmol)，然后向上述溶液中逐滴加入氯甲酸乙酯(204mg，1.64mmol)。使反應(yīng)溶液緩慢升溫至室溫，持續(xù)攪拌1小時(shí)。然后用100mL冰水稀釋，并用乙酸乙酯(3×30mL)抽提。用鹽水(2×50mL)洗滌有機(jī)相，將其在Na2SO4上干燥并濃縮得到粗制品，經(jīng)層析(己烷/EtOAc2∶1)純化得到238mg(42％)固體標(biāo)題化合物。Rf=0.6(EtOAc/己烷=1∶1)。1HNMR(CDCl3):δ8.01(d,J=6.9Hz,1H),7.68-7.57(m,3H),7.21(bs,1H),7.14(d,J=7.2Hz,1H),6.88(dd,J1=8.4Hz,J2=2.1Hz,1H),6.68(d,1H),6.56-6.50(m,2H),6.34(dd,J1=8.4Hz,J2=2.1Hz,1H),3.91(s,2H),3.00(q,J=7.5Hz,2H),1.36(t,J=7.5Hz,3H).實(shí)施例49N-[Ac-Asp(OBu-t)-Glu(OBu-t)-Val-Asp(OBu-t)]-N'-(乙硫基)羰基-羅丹明110SEQIDNO:5如實(shí)施例1所述制備標(biāo)題化合物。Rf=0.56(EtOAc/CH2Cl2=2∶1)；1HNMR(CDCl3):δ9.04-8.46(m,3H),8.01-6.68(m,11H),4.93-3.86(m,4H),3.15-1.85(m,8H),2.14(d,3H),1.48-1.33(m,29H),1.06-0.98(m,6H).實(shí)施例50N-(Ac-Asp-Glu-Val-Asp)-N'-(乙硫基)羰基-羅丹明110SEQIDNO:5如實(shí)施例45所述制備標(biāo)題化合物。1HNMR(CD3OD):δ8.12-7.09(m,11H),6.79-6.66(m,2H),4.67-3.93(m,4H),3.08-2.68(m,6H),2.38(m,2H),2.12(m,2H),1.99-1.94(t,3H),1.32(t,J=7.5Hz,3H),1.04-0.94(m,6H).實(shí)施例51氯甲酸2,5,8-三氧雜癸酯將三乙二醇一甲醚(2g，12.2mmol)的乙醚溶液(15mL)逐滴加入攪拌的冰冷的20％光氣甲苯溶液(11.36mL，21.92mmol)中20分鐘。使反應(yīng)混合物升溫至室溫，繼續(xù)攪拌15小時(shí)。溶劑的蒸發(fā)產(chǎn)生2.63g(95％)標(biāo)題化合物。1HNMR(CDCl3):δ4.44(m,2H),3.37(m,2H),3.68-3.63(m,6H),3.55(n,2H),3.38(s,3H).實(shí)施例52N-(2,5,8-三氧雜癸氧羰基)-羅丹明110由羅丹明110(500mg，1.36mmol)、N,N-二異丙基乙胺(317mg，2.45mmol)和氯甲酸2,5,8-三氧雜癸酯(371mg，1.64mmol)獲得261mg(37％)固體標(biāo)題化合物。Rf=0.52(EtOAc/己烷=4∶1)。1HNMR(CDCl3):δ8.00(d,J=6.6Hz,1H),7.66-7.58(m,3H),7.49(s,1H),7.26(bs,1H),6.88(d,J=9.0Hz,1H),6.65(d,J=8.4Hz,1H),6.54-6.31(m,3H),4.33(t,J=4.2Hz,2H),3.93(bs,2H),3.74(t,J=3.3Hz,2H),3.70-3.64(m,6H),3.55(m,2H),3.37(bs,3H).實(shí)施例53N-[Ac-Leu-Glu(OBu-t)-Val-Asp(OBu-t]-N'-乙氧羰基-羅丹明110SEQIDNO:9由Ac-Leu-Glu(OBu-t)-Val-Asp(OBu-t)(189mg，0.3mmol)SEQIDNO:9、EDC(57.5mg，0.3mmol)和N-乙氧羰基-羅丹明110(40mg，0.1mmol)(根據(jù)實(shí)施例1)獲得48mg(47％)固體標(biāo)題化合物。Rf=0.35(EtOAc/CH2Cl2=1∶1);1HNMR(CD3OD):δ8.02-7.04(m,8H),6.79-6.93(m,2H),4.35(m,2H),4.20(q,J=6.9Hz,2H),4.11(m,1H),3.94(d,J=6.3Hz),3.00-2.65(m,2H),2.30(bs,2H),2.00(m,2H),1.98-1.95(d,3H),1.62-1.28(m,25H),1.04-0.82(m,12H).實(shí)施例54N-(ac-Leu-Glu-Val-Asp)-N'-乙氧羰基-羅丹明110SEQIDNO:9如實(shí)施例45所述制備標(biāo)題化合物。1HNMR(CD3OD):δ8.40-7.05(m,9H),6.79-6.63(m,2H),4.37(m,1H),4.31(m,1H),4.20(q,J=6.9Hz,2H),4.11(m,1H),3.94(m,1H),3.07-2.68(m,2H),2.38(m,2H),2.08(m,2H),1.99-1.95(t,3H),1.68-1.48(m,3H),1.31(t,J=6.9Hz,3H),1.04-0.80(m,12H).實(shí)施例55N-[Cbz-Gly-Pro]-N'-乙氧羰基-羅丹明110由Cbz-Gly-Pro(91.8mg，0.3mmol)、EDC(57.5mg，0.3mmol)和N-乙氧羰基-羅丹明110(40.2mg，0.1mmol)(根據(jù)實(shí)施例1)獲得68mg(98％)固體標(biāo)題化合物。Rf=0.6(EtOAC/CH2Cl2=4∶1).1HNMR(CDCl3):δ9.45(s,1H),8.00(d,J=7.2Hz,1H),7.61-6.91(m,8H),6.68-6.63(m,2H),5.69(bs,1H),5.11(s,2H),4.72(d,1H),4.22(q,J=6.9Hz,2H),4.03(bs,2H),3.58(1H),3.43(m,1H),2.49-1.90(m,4H),2.42(bs,1H),2.18-1.95(m,3H),1.31(t,J=6.9Hz,3H).實(shí)施例56N-(Gly-Pro)-N'-乙氧羰基-羅丹明110HBr1HNMR(CD3OD):δ8.11(d,J=7.8Hz,1H),8.00(bs,1H),7.84-7.72(m,3H),7.32-7.15(m,3H),6.95-6.87(m,2H),4.64(m,1H),4.23(q,J=6.9Hz,2H).3.96(s,2H),3.68(m,2H),2.35-2.05(m,4H),1.33(t,J=6.9Hz,3H).實(shí)施例571-氯硫代甲酸己酯將1-己硫醇(3.72g，31.5mmol)的乙醚溶液(15mL)逐滴加入攪拌的冰預(yù)冷的20％光氣甲苯溶液(25mL，47mmol)中20分鐘。使反應(yīng)混合物升溫至室溫，持續(xù)攪拌15小時(shí)。溶劑的蒸發(fā)產(chǎn)生6.1g(98％)標(biāo)題化合物。1HNMR(CDCl3):δ2.96(t,J=7.2Hz,2H),1.64-1.24(m,8H),0.91(t,J=63Hz,3H).實(shí)施例58N-(己硫基)羰基-羅丹明110根據(jù)實(shí)施例25所述制備標(biāo)題化合物。Rf=0.8(EtOAc/己烷=1∶1)。1HNMR(CDCl3):δ8.00(d,J=7.2Hz,1H),7.65-7.58(m,3H),7.24(bs,1H),7.14(d,1H),6.87(dd,1H),6.68-6.32(m,4H),3.92(bs,2H),2.99(t,J=6.9Hz,2H),1.68(m,2H),1.42(m,2H),1.34-1.26(m,4H),0.90(t,J=7.2Hz,3H).實(shí)施例592-氯甲酸丁氧基乙酯由2-丁氧基乙醇(3.72g，31.5mmol)和20％光氣的甲苯溶液(25mL，47mmol)獲得4.51g(79％)標(biāo)題化合物。1HNMR(CDCl3):δ4.46(t,2H),3.70(m,2H),3.51(t,J=6.6Hz,2H),1.56(m,2H),1.40(m,2H),0.94(t,J=6.9Hz,3H).實(shí)施例60N-(2-丁氧基乙氧羰基)-羅丹明110根據(jù)實(shí)施例25制備標(biāo)題化合物。Rf=0.58(EtOAc/己烷=1∶1)。1HNMR(CDCl3):δ8.00(d,J=7.5Hz,1H),7.67-7.49(m,3H),7.15(d,J=7.8Hz,1H),6.89-6.32(m,6H),4.34(m,2H),3.91(bs,2H),3.68(m,2H),3.50(t,J=6.6Hz),1.59(m,2H),1.39(m,2H),0.93(t,J=7.2Hz,3H).實(shí)施例61N-[Cbz-Asp(OEt)-Glu(OEt)-Val-Asp(OEt)]-N'-乙氧羰基-羅丹明110SEQIDNO:5由Cbz-Asp(OEt)-Glu(OEt)-Val-Asp(OEt)SEQIDNO:5(181mg，0.3mmol)、EDC(57.5mg，0.3mmol)和N-乙氧羰基-羅丹明110(40mg，0.1mmol)(根據(jù)實(shí)施例1)獲得71mg(72％)固體標(biāo)題化合物。Rf=0.3(EtOAc/CH2Cl2=4∶1),1HNMR(CDCl3):δ9.00(bs,1H),8.76(d,1H),8.43(bs,1H),8.14-6.90(m,10H),6.80-6.62(m,2H),5.1-3.8(m,6H),3.2-2.0(m,11H),1.35-1.22(m,12H),1.12-0.84(m,7H).實(shí)施例62N-[Ac-Leu-Glu(OBu-t)-Val-Asp(OBu-t)]-N'-辛氧羰基-羅丹明110SEQIDNO:9根據(jù)實(shí)施例1制備標(biāo)題化合物。Rf=0.65(EtOAc/CH2Cl2=1∶1),1HNMR(CD3OD):δ8.02-7.04(m,8H),6.79-6.93(m,2H),6.20(bs,1H),4.95(bs,1H),4.52-4.20(m,5H),3.15-2.00(m,9H),1.68(m,2H),1.48(s,9H),1.45(s,9H),1.41-1.29(m,12H),1.18-0.88(m,15H).實(shí)施例63N-(Z-Gly)-N'-乙氧羰基-羅丹明110由Z-甘氨酸(284mg，1.356mmol)、EDC(260mg，1.356mmol)和N-乙氧羰基-羅丹明110(58mg，0.135mmol)(根據(jù)實(shí)施例1)獲得固體標(biāo)題化合物(70mg，83％)。1HNMR(CDCl3):δ8.95(bs,1H),7.98(s,2H),7.53(m,8H),7.30(s,5H),7.05(m,2H),6.63(dd,2H,J=8.4,11.4Hz),5.09(s,2H),4.19(q,2H,J=7.5Hz),1.27(t,3H,J=7.5Hz).實(shí)施例64N-Gly-N'-乙氧羰基-羅丹明110HBr根據(jù)實(shí)施例6制備標(biāo)題化合物。1HNMR(CDCl3):δ9.41(bs,1H),9.20(s,1H),8.04(m,1H),7.62(m,3H),7.33(m,2H),7.12(m,2H),6.97(m,2H),6.74(m,2H),4.25(q,2H,J=6.9),1.33(t,3H,J=6.9Hz).實(shí)施例65N-(Z-Gly-Pro-Gly)-N'-乙氧羰基-羅丹明110由Z-甘氨酸-脯氨酸(315mg，1.03mmol)、EDC(197mg，1.03mmol)和N-Gly-N'-乙氧羰基-羅丹明110(50mg，0.103mmol)(根據(jù)實(shí)施例1)獲得為淺黃色固體的標(biāo)題化合物(70mg，96％)。1HNMR(CDCl3):δ8.97(bs,1H),7.94(d,1H,J=7.8Hz),7.77(d,1H,J=15Hz),7.52(m,4H),7.32(s，5H),7.22(m,2H),7.15(m,2H),6.64(m,1H),5.92(bs,2H),5.78(bs,1H),5.57(bs,1H),5.09(s,2H),4.95(m,2H),4.74(m,2H),4.16(m,2H),3.62(m,1H),3.46(m,1H),1.98(m,4H),1.26(m,3H).實(shí)施例66N-(Gly-Pro-Gly)-N'-乙氧羰基-羅丹明110HBr1HNMR(CD3OD):δ8.02(d,1H,J=7.8Hz),7.71(m,3H),7.28(m,2H),7.19(m,1H),7.01(m,1H),6.71(m,2H),4.48(m,1H),4.19(q,2H,J=7.2Hz),4.05(m,2H),3.94(m,2H),3.61(m,2H),2.12(m,4H),1.30(t,3H,J=7.2Hz).實(shí)施例67N-己基-N-甲基氨基甲酰氯向0℃的0.35ml(i-Pr)2NEt在10ml二乙醚中的溶液中加入光氣(1.06ml，1.93M甲苯溶液)和N-己基甲胺(0.31ml，2.05mm)。使反應(yīng)混合物升溫至25℃，進(jìn)一步在25℃下攪拌14小時(shí)。過(guò)濾混合物，在真空下除去溶劑。產(chǎn)物用于下一步反應(yīng)，不需進(jìn)一步純化。1HNMR(CDCl3):δ3.42(m,2H),3.07(s,3H),1.59(m,2H),1.31(m,6H),0.90(m,3H).實(shí)施例68N-(N-己基-N-甲基氨基甲?；?-羅丹明110向-61℃的羅丹明110(0.5g，1.36mmol)DMF溶液(15ml)中加入N,N-二異丙基乙胺(0.25ml)和N-己基-N-甲基氨甲酰氯的DMF溶液(2.05mmol)。在-61℃下攪拌反應(yīng)混合物1小時(shí),然后使之升溫至室溫。在室溫下進(jìn)一步攪拌該反應(yīng)混合物14小時(shí),然后在水飽和NH4Cl溶液與乙酸乙酯(2×50ml)之間分配。用鹽水(100ml)洗滌有機(jī)相，并在Na2SO4上干燥。除去溶劑,通過(guò)快速層析(己烷:EtOAc，1∶1)純化粗制品。獲得固體標(biāo)題化合物(115mg，18％)。1HNMR(CDCl3):δ7.97(d,1H,J=7.2Hz),7.59(m,3H),7.12(d,1H,J=7.5Hz),6.85(dd,1H,J=8.4,2.1Hz),6.60(dd,2H,J=5.1,3.3Hz),6.48(dd,2H,J=8.4,2.1Hz),6.31(dd,1H,J=8.4,2.4Hz),3.93(bs,2H),3.33(t,2H,J=6.9Hz),2.79(s,3H),1.56(m,2H),1.30(m,6H),0.88(t,3H,J=6.6Hz).實(shí)施例69N-(辛硫基)羰基-羅丹明110根據(jù)實(shí)施例25制備標(biāo)題化合物。1HNMR(CDCl3):δ7.99(d,1H,J=7.5Hz),7.59(m,3H),7.11(dd,1H,J=6.9,0.9Hz),6.89(dd,1H,J=8.4,2.1Hz),6.64(d,1H,J=8.4Hz),6.48(dd,2H,J=8.4,2.1Hz),6.31(dd,1H,J=8.4,2.4Hz),3.97(bs,2H),2.95(m,2H),1.67(m,2H),1.29(m,10H),0.88(t,3H,J=6.6Hz).實(shí)施例70N-(Z-Gly)-N'-辛氧羰基-羅丹明-110根據(jù)實(shí)施例1制備標(biāo)題化合物。1HNMR(CDCl3):δ8.22(s,1H),7.11(d,J=7.5,1H),7.046.97(m,2H),6.85(s,1H),6.70(dd,J=7.5,7.5,2H),5.57(s,1H),5.16(s,1HF),5.16(s,2H),4.18(t,J=6.6,2H),4.01(d,J=5.7,1H),1.68(q,J=6.6,2H),1.29(brs,10H),0.89(t,J=6.9,3H).實(shí)施例71N-Gly-N'-辛氧羰基-羅丹明-110HBr根據(jù)實(shí)施例6制備標(biāo)題化合物。1HNMR(CD3OD):δ8.10(d,J=6.9,1H),7.93(d,J=2.4,1H),7.86-7.75(m,3H),7.28-7.24(m,2H),7.11(dd,J=2.4,9.0,1H),6.85(d,J=9.0,1H),6.78(d,J=9.0,1H),4.20(t,J=6.6,2H),3.94(s,2H),1.74(m,2H),1.50-1.30(brm10H),0.94(t,J=6.6,3H).實(shí)施例72與羅丹明110相比N-乙?；?羅丹明110的熒光及穩(wěn)定性用熒光測(cè)定法測(cè)定作為合成底物之熒光部分的羅丹明110和N-乙?；?羅丹明110的活性。用熒光分光光度計(jì)或熒光微量滴定板讀出器在485的激發(fā)波長(zhǎng)和530的發(fā)射波長(zhǎng)下讀取熒光信號(hào)。應(yīng)用該測(cè)定法，對(duì)兩種熒光部分測(cè)定其相對(duì)熒光值。用下列緩沖條件測(cè)定熒光:100mMHEPESpH7.5，含10％蔗糖、1％CHAPS、5mM谷胱甘肽和1-200nM試驗(yàn)化合物。穩(wěn)定性的測(cè)定一般在37℃下進(jìn)行2天。熒光信號(hào)的比例在時(shí)間零點(diǎn)時(shí)為10.2(羅丹明110/N-乙?；_丹明110)，37℃溫育兩天后為10.1。結(jié)果顯示，類似于羅丹明110，N-乙酰基-羅丹明110是穩(wěn)定且有效的熒光指示劑。實(shí)施例73修飾的羅丹明染料的熒光用常規(guī)光譜測(cè)定法和熒光光譜測(cè)定法估測(cè)修飾的羅丹明染料。為進(jìn)行此兩種類型的分析，將染料溶解于甲醇或50mMTris中，染料終濃度為10nM-100μM。使用BeckmanDU-7000分光光度計(jì)測(cè)定每種染料200nm-700nm波長(zhǎng)的吸收光譜。這些染料都具有470-480nm左右的吸收峰。選擇該波長(zhǎng)為熒光激發(fā)波長(zhǎng)，并用HitachiF-2000熒光分光光度計(jì)測(cè)定完全熒光發(fā)射光譜。對(duì)于每種染料，發(fā)射峰在520nm左右，在試驗(yàn)條件下(見(jiàn)表1)測(cè)定熒光輸出。表3.修飾的羅丹明染料的熒光實(shí)施例74HL-60細(xì)胞對(duì)修飾的羅丹明染料的吸收和儲(chǔ)留將HL-60細(xì)胞置于5mlIscove培養(yǎng)基(不含血清或酚紅)中，其中含有10μM或50μMN-辛氧羰基-羅丹明110、N-癸氧羰基-羅丹明110、N-十二烷氧羰基-羅丹明110、N-己氧羰基-羅丹明110、N-(乙硫基)羰基-羅丹明110或羅丹明110。使細(xì)胞在CO2培養(yǎng)箱中37℃下溫育不同時(shí)間，離心回收，用50mL冰冷的培養(yǎng)基洗滌。再離心細(xì)胞，將最終沉淀重懸浮于50μL新鮮培養(yǎng)基中。將每種細(xì)胞懸液的等份置于顯微鏡載玻片上，用配有表面熒光照明的Nikon倒置顯微鏡觀察。如圖1A-1F所示，N-辛氧羰基-羅丹明110(圖1A)、N-癸氧羰基-羅丹明110(圖1B)和N-十二烷氧羰基-羅丹明110(圖1C)強(qiáng)烈染色HL-60細(xì)胞，幾乎沒(méi)有染料向培養(yǎng)基滲漏。N-己氧羰基-羅丹明110(圖1D)不甚強(qiáng)烈地染色HL-60細(xì)胞，但仍較好地保留。N-(乙硫基)羰基-羅丹明110(圖1E)引起適中的、但仍易于檢測(cè)的染色，盡管有輕微的滲漏。羅丹明110(圖1F)快速染色細(xì)胞，但染料快速滲漏至細(xì)胞之外，導(dǎo)致低強(qiáng)度的細(xì)胞染色和含有細(xì)胞的培養(yǎng)基中的高度熒光。因此，修飾的羅丹明染料優(yōu)于羅丹明110，因?yàn)樗鼈円子诒籋L-60細(xì)胞吸收，并且可在細(xì)胞內(nèi)保留至少30分鐘。實(shí)施例75底物的酶活性用熒光酶測(cè)定法測(cè)定作為重組CPP32蛋白質(zhì)和ICE蛋白質(zhì)的合成底物的N-(Z-VD)-N'-乙?；?羅丹明110、N-(Z-VAD)-N'-乙?；?羅丹明110、N-(Z-DEVD)-N'-乙?；?羅丹明110SEQIDNO:5、N-(Z-YVAD)-N-乙?；?羅丹明110SEQIDNO:2、(Z-VAD)2-羅丹明110和(Z-YVAD)2-羅丹明110SEQIDNO:2的活性。重組CPP32蛋白質(zhì)和ICE蛋白質(zhì)的制備是利用桿狀病毒作為載體，在昆蟲(chóng)宿主細(xì)胞(sf9細(xì)胞)中表達(dá)編碼這些酶的DNA克隆。參見(jiàn)，Webb，N.R．等人，“利用重組桿狀病毒的蛋白質(zhì)表達(dá)”，技術(shù)(Technique)2:173-188(1990)。酶對(duì)合成底物的酶切產(chǎn)生一種可在熒光分光光度計(jì)或熒光微量滴定板讀出器中讀取的熒光信號(hào)。應(yīng)用該測(cè)定法，用CPP32或ICE測(cè)定每種底物的Km和Vmax值。應(yīng)用下列緩沖條件測(cè)定依賴CPP32和ICE的底物裂解100mMHEPESpH7.5，含10％蔗糖、1％CHAPS、5mM谷胱甘肽和1-100μM試驗(yàn)底物。利用特異性CPP32和ICE抑制劑測(cè)定非特異性酶裂解，這兩種抑制劑分別包含具有序列Asp-Glu-Val-Asp或Tyr-Val-Ala-Asp的寡聚體，以及與C末端結(jié)合的醛基。酶活性的測(cè)定一般在37℃下進(jìn)行60分鐘。表4列出了作為CPP32和ICE底物的N-(Z-VD)-N'-乙?；?羅丹明110、N-(Z-VAD)-N'-乙?；?羅丹明110、N-(Z-DEVD)-N'-乙?；?羅丹明110SEQIDNO:5、N-(Z-YVAD)-N'-乙?；?羅丹明110SEQIDNO:2、(Z-VAD)2-羅丹明110和(Z-YVAD)2-羅丹明110SEQIDNO:2的Km和Vmax值。表4.CPP32和ICE對(duì)底物的裂解<tablesid="table3"num="003"><table>酶CPP32ICEN-(Z-VD)-N'-Ac-羅丹明110N-(Z-VAD)-N'-Ac-羅丹明110N-(Z-DEVD)-N'-Ac-羅丹明110SEQIDNO:5N-(Z-YVAD)-N'-Ac-羅丹明110SEQIDNO:2(Z-VAD)2-羅丹明110(Z-YVAD)2-羅丹明110SEQIDNO:2Km(μM)60NA154NANANAVmax(nmol/分鐘)11160Km(μM)NA701232216Vmax(nmol/分鐘)4996914</table></tables>NA=37℃、3小時(shí)溫育、1-100μM底物時(shí)，未觀察到活性。表4的結(jié)果顯示，N-(Z-DEVD)-N'-Ac-羅丹明110SEQIDNO:5是ICE和CPP32兩者的有效底物。也顯示，N-(Z-VD)-N'-乙?；?羅丹明110是CPP32而不是ICE的有效底物，N(Z-VAD)-N'-乙?；?羅丹明110、N-(Z-YVAD)-N'-乙?；?羅丹明110SEQIDNO:2、(Z-VAD)2-羅丹明110和(Z-YVAD)2-羅丹明110SEQIDNO:2是ICE而不是CPP32的有效底物。實(shí)施例76重組人胱天肽酶-3和凋亡HL-60細(xì)胞裂解物對(duì)胱天肽酶-3底物的裂解用重組胱天肽酶-3并用由凋亡的HL-60細(xì)胞制備的裂解物測(cè)定胱天肽酶的底物。該試驗(yàn)于37℃下在96孔板中進(jìn)行，100μL溫育液中含有30μL胱天肽酶-3制劑或細(xì)胞裂解物、10μM或50μM底物和胱天肽酶測(cè)定緩沖液(40mM1,4-哌嗪雙(乙磺酸)(PIPES，Aldrich化學(xué)公司)pH7.2；100mMNaCl；10％蔗糖；0.1％CHAPS；1mMEDTA；10mMDTT)。在溫育期結(jié)束時(shí)，在Bio-TekFL500熒光微量培養(yǎng)板讀出器上分別用485和530nm的激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)測(cè)定熒光。做兩種不同的對(duì)照1)酶空白，由含底物的樣品組成，但不含酶或細(xì)胞裂解物；2)抑制劑對(duì)照，由含有胱天肽酶抑制劑Ac-DEVD-CHO(f.c.，10μM)的樣品組成。表5是用這些底物獲得的結(jié)果的概括。表5.胱天肽酶-3和裂解物對(duì)底物的裂解如圖2A所述，二肽底物N-Z-VD-N'-乙氧羰基-R110的裂解需要極高濃度的重組胱天肽酶-3(酶量比三肽和四肽底物所需高50倍)。盡管應(yīng)用大量的酶，但信號(hào)仍較低。相反，三肽底物N-Z-EVD-N'-乙氧羰基-R110(圖2A)和所有四肽底物(圖2B-2L)可被胱天肽酶-3和凋亡裂解物有效地裂解。實(shí)施例77胱天肽酶-3底物N-Ac-DEVD-N'-辛氧羰基R110對(duì)凋亡HL-60細(xì)胞的染色應(yīng)用凋亡的HL-60和Jurkat細(xì)胞檢驗(yàn)了N-Ac-DEVD-N'-辛氧羰基-R110SEQIDNO:5檢測(cè)完整細(xì)胞中胱天肽酶激活的能力。這些全細(xì)胞測(cè)定法分兩個(gè)階段進(jìn)行1)細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)；2)與底物一起溫育。對(duì)于HL-60細(xì)胞，通過(guò)用10μg/ml長(zhǎng)春花堿處理4小時(shí)來(lái)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。對(duì)照樣品用DMSO處理。對(duì)于Jurkat細(xì)胞，通過(guò)用500ng/ml拮抗性抗Fas抗體處理2小時(shí)來(lái)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。對(duì)照樣品用PBS處理。細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)后，使細(xì)胞與50μMN-Ac-DEVD-N'-辛氧羰基-R110SEQIDNO:5在胱天肽酶測(cè)定緩沖液(40mMPIPES，pH7.4；100mMNaCl；10％蔗糖；1mMEDTA；10mMDTT)中溫育。然后將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至顯微鏡載玻片上，用Nikon倒置顯微鏡上的表面熒光照明觀察。如圖3A所示，長(zhǎng)春花堿處理的HL-60細(xì)胞被N-Ac-DEVD-N'-辛氧羰基-R110SEQIDNO:5強(qiáng)烈染色。DMSO處理的細(xì)胞也顯示一定的染色(圖3B)，但其信號(hào)強(qiáng)度明顯低于長(zhǎng)春花堿處理的細(xì)胞。在測(cè)定階段用50μMN-Ac-DEVD-CHOSEQIDNO:5處理的HL-60細(xì)胞(圖3C)幾乎不顯示熒光信號(hào)，表明在長(zhǎng)春花堿處理的細(xì)胞中觀察到的染色幾乎完全是由于胱天肽酶介導(dǎo)的裂解。經(jīng)抗Fas誘導(dǎo)經(jīng)歷細(xì)胞凋亡的Jurkat細(xì)胞(圖3D)也顯示出被N-Ac-DEVD-N'-辛氧羰基-R110SEQIDNO:5強(qiáng)烈染色，而對(duì)照細(xì)胞僅顯示輕微染色(圖3F)。這些實(shí)驗(yàn)表明，N-Ac-DEVD-N'-辛氧羰基-R110SEQIDNO:5能用來(lái)測(cè)定完整細(xì)胞中的細(xì)胞凋亡，由N-Ac-DEVD-N'-辛氧羰基-R110SEQIDNO:5獲得的信號(hào)是胱天肽酶依賴的。實(shí)施例78凋亡Jurkat全細(xì)胞對(duì)胱天肽酶-3底物N-Ac-DEVD-N'-辛氧羰基R110SEQIDNO:5的裂解為了定量全細(xì)胞對(duì)N-Ac-DEVD-N'-辛氧羰基-R110SEQIDNO:5的裂解，進(jìn)行一種測(cè)定，其中用分光熒光平板讀出器測(cè)定凋亡的Jurkat細(xì)胞使該底物產(chǎn)生的熒光信號(hào)。Jurkat細(xì)胞在含500ng/ml抗Fas抗體的96孔板中溫育不同時(shí)間，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。對(duì)照細(xì)胞與PBS溫育。在處理期結(jié)束時(shí)，收獲細(xì)胞，在1.5ml管中離心，重懸浮于25μl含1％FBS的培養(yǎng)基中。加入25μl含有50μMN-Ac-DEVD-N'-辛氧羰基R110SEQIDNO:5的胱天肽酶緩沖液，溫育細(xì)胞1小時(shí)。在溫育期結(jié)束時(shí)，將每一時(shí)點(diǎn)的三個(gè)5μl等份加于96孔板中，以485/530nm的激發(fā)/發(fā)射波長(zhǎng)測(cè)定熒光。圖4顯示用PBS處理的細(xì)胞產(chǎn)生較低的熒光信號(hào)，其不隨所用的處理時(shí)間而增強(qiáng)。然而，用抗Fas處理的細(xì)胞在細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)約1小時(shí)后產(chǎn)生可檢測(cè)的熒光信號(hào)，且該信號(hào)持續(xù)增強(qiáng)可達(dá)2小時(shí)的時(shí)點(diǎn)，信號(hào)與背景的比例約為7。該實(shí)驗(yàn)表明，N-Ac-DEVD-N'-辛氧羰基R110SEQIDNO:5在凋亡全細(xì)胞中產(chǎn)生較強(qiáng)的信號(hào)，因此能用來(lái)在基于細(xì)胞的測(cè)定法中定量測(cè)定胱天肽酶介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。實(shí)施例79重組人胱天肽酶-3、6、7和8對(duì)胱天肽酶-8底物N-Ac-LEVD-N'-乙氧羰基R110SEQIDNO:9的裂解用重組人胱天肽酶-3、6、7和8測(cè)定N-Ac-LEVD-N'-乙氧羰基R110SEQIDNO:9。該試驗(yàn)于37℃下在96孔板中進(jìn)行，100μL溫育液中含有重組人胱天肽酶、10μMN-Ac-LEVD-N'-乙氧羰基R110SEQIDNO:9和胱天肽酶測(cè)定緩沖液(40mMPIPES，pH7.2；100mMNaCl；10％蔗糖；0.1％CHAPS；1mMEDTA；10mMDTT)。在溫育期結(jié)束時(shí)，在Bio-TekFL500熒光微量培養(yǎng)板讀出器上分別用485和530nm的激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)測(cè)定熒光。為了校正未裂解底物的內(nèi)源熒光，也做對(duì)照，該對(duì)照由含有10μMN-Ac-LEVD-N'-乙氧羰基R110SEQIDNO:9、不含酶的樣品組成(“酶空白”)。其它對(duì)照包括含有胱天肽酶抑制劑Ac-DEVD-CHOSEQIDNO:5的樣品。如圖5所示，胱天肽酶-6和胱天肽酶-8裂解N-Ac-LEVD-N'-乙氧羰基R110SEQIDNO:9，產(chǎn)生易于測(cè)定的熒光信號(hào)(對(duì)于胱天肽酶-6，信號(hào)與背景的比例約為13，對(duì)于胱天肽酶-8約為26)。胱天肽酶-3不甚高效地地裂解N-Ac-LEVD-N'-乙氧羰基R110SEQIDNO:9，產(chǎn)生比酶空白值約高5倍的信號(hào)。胱天肽酶-7實(shí)際上不產(chǎn)生信號(hào)。這些實(shí)驗(yàn)表明，N-Ac-LEVD-N'-乙氧羰基R110SEQIDNO:9能被胱天肽酶-8亞家族的成員裂解，并且能用來(lái)報(bào)道這類胱天肽酶的活性。實(shí)施例80HL-60細(xì)胞裂解物對(duì)氨肽酶底物N-G-N'-辛氧羰基R110的裂解氨肽酶存在于許多細(xì)胞中，能由N末端開(kāi)始，從肽上順序去除未保護(hù)的氨基酸殘基。具有保護(hù)的氨基末端的肽不被切割。通過(guò)在胱天肽酶緩沖液中勻漿化HL-60細(xì)胞制備HL-60裂解液，并用微量滴定板測(cè)定檢驗(yàn)這些裂解物裂解N-Z-G-N'-辛氧羰基R110和N-G-N'-辛氧羰基R110的能力。圖6顯示HL-60細(xì)胞裂解物輕易地裂解N-G-N'-辛氧羰基R110，而信號(hào)大小取決于底物的濃度。相反，HL-60細(xì)胞裂解液不從N-Z-G-N'-辛氧羰基R110中產(chǎn)生信號(hào)。實(shí)施例81熒光測(cè)定法在篩選刺激胱天肽酶級(jí)聯(lián)的藥物中的應(yīng)用在無(wú)Fas配體時(shí)刺激胱天肽酶級(jí)聯(lián)的藥物可用作例如抗癌的化療劑。實(shí)施例78所述的測(cè)定法可用來(lái)篩選刺激胱天肽酶級(jí)聯(lián)的藥物，方法是在與實(shí)施例78相似的條件下進(jìn)行測(cè)定，所不同的是用具有已知或未知抗癌或抗腫瘤活性的已知或未知化合物代替Fas配體試劑。實(shí)施例82熒光測(cè)定法在篩選抑制或加強(qiáng)Fas配體或其它凋亡誘導(dǎo)劑刺激的胱天肽酶級(jí)聯(lián)的藥物方面的應(yīng)用抑制胱天肽酶級(jí)聯(lián)的藥物可用于治療由于胱天肽酶級(jí)聯(lián)的激活不充分引起的或與之相關(guān)的退行性疾病及其它疾病。加強(qiáng)另一種胱天肽酶刺激劑作用的藥物，如Fas配體或抗癌藥或抗癌劑，可適于治療由于胱天肽酶級(jí)聯(lián)的不適當(dāng)功能引起的或與之相關(guān)的癌癥或腫瘤。本發(fā)明所述的試驗(yàn)和試劑可用來(lái)篩選抑制或加強(qiáng)細(xì)胞中胱天肽酶級(jí)聯(lián)的藥物，方法是在可抑制或加強(qiáng)第一種細(xì)胞凋亡或胱天肽酶級(jí)聯(lián)誘導(dǎo)劑的作用或與之協(xié)同作用的試驗(yàn)物質(zhì)存在下，使用Fas配體或能刺激胱天肽酶級(jí)聯(lián)或其它凋亡途徑的其它任何因子，如實(shí)施例78所述進(jìn)行測(cè)定。實(shí)施例83熒光測(cè)定在測(cè)定患者癌細(xì)胞標(biāo)本對(duì)抗癌藥的化學(xué)敏感性中的應(yīng)用眾所周知，不同患者的相同癌癥對(duì)于抗癌藥治療顯示很大的變化性。因此，在開(kāi)始治療之前預(yù)測(cè)患者的癌癥是否能用一種特定抗癌藥治療是非常困難的。本發(fā)明所述的熒光測(cè)定允許對(duì)取自個(gè)體癌癥或腫瘤患者的癌細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞或組織標(biāo)本進(jìn)行化學(xué)敏感性或抗藥性試驗(yàn)。為了進(jìn)行化學(xué)敏感性試驗(yàn)，可如實(shí)施例78所述對(duì)取自患者的癌細(xì)胞或組織標(biāo)本進(jìn)行熒光測(cè)定。應(yīng)用該方法，能檢測(cè)具有已知或未知化學(xué)治療能力的不同藥物刺激胱天肽酶級(jí)聯(lián)的能力。該試驗(yàn)的結(jié)果提供了能用來(lái)為患者設(shè)計(jì)最佳化療藥治療方案的信息。實(shí)施例84HL-60細(xì)胞對(duì)氨肽酶底物N-G-N'-辛氧羰基-R110的吸收和裂解將HL-60細(xì)胞置于5mlIscove培養(yǎng)基(不含血清或酚紅)中，其中含有10μMN-G-N'-辛氧羰基-R110或10μMN-Z-G-N-辛氧羰基-R110。將三百萬(wàn)個(gè)HL-60細(xì)胞在CO2培養(yǎng)箱中37℃下溫育3小時(shí)，離心回收，用50μL冰冷的培養(yǎng)基洗滌。再離心細(xì)胞，將最終沉淀重懸浮于50μL新鮮培養(yǎng)基中。將每種細(xì)胞懸液的等份置于96孔微量滴定板中，用485nm的激發(fā)波長(zhǎng)、525nm的發(fā)射波長(zhǎng)在Wallac1420微量培養(yǎng)板讀出器上讀取。也將每種細(xì)胞懸液的等份置于顯微鏡載玻片上，用配備有表面熒光照明的Nikon倒置顯微鏡觀察。如表6所示，只有與10μMN-G-N'-辛氧羰基-R110溫育的細(xì)胞顯示有信號(hào)。與10μMN-Z-G-N'-辛氧羰基-R110溫育的細(xì)胞無(wú)信號(hào)。同樣，只有與N-G-N'-辛氧羰基-R110溫育的細(xì)胞在顯微鏡下顯示熒光，而未觀察到與N-Z-G-N'-辛氧羰基-R110溫育的細(xì)胞有熒光信號(hào)(圖7A-B)。表6.HL-60細(xì)胞對(duì)N-G-N'-辛氧羰基-R110的裂解<tablesid="table5"num="005"><table>底物計(jì)數(shù)/μg蛋白質(zhì)N-Z-G-N'-辛氧羰基-R1100N-G-N'-辛氧羰基-R11012.98</table></tables>現(xiàn)已完全敘述了本發(fā)明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，在不影響本發(fā)明范圍或其任何實(shí)施方案的情況下，在寬范圍或相同范圍的條件、公式及其它參數(shù)內(nèi)能實(shí)行本發(fā)明。此處引用的所有專利、專利申請(qǐng)和出版物在此都完全引用作為參考。序列表&amp;#60110&amp;#62Cytoyia,Inc.&amp;#60120&amp;#62新型熒光報(bào)道分子及其應(yīng)用，包括對(duì)胱天肽酶的測(cè)定&amp;#60130&amp;#621735.029PC02&amp;#60140&amp;#62&amp;#60141&amp;#62&amp;#60150&amp;#62US60/061.582&amp;#60151&amp;#621997-10-10&amp;#60150&amp;#62US09/033,661&amp;#60151&amp;#621998-03-03&amp;#60160&amp;#62142&amp;#60170&amp;#62PatenInVer.2.0&amp;#60210&amp;#621&amp;#60211&amp;#624&amp;#60212&amp;#62PRT&amp;#60213&amp;#62人工序列&amp;#60220&amp;#62&amp;#60223&amp;#62人工序列的描述合成肽&amp;#60400&amp;#621TrpGluHisAsp1&amp;#60210&amp;#622&amp;#60211&amp;#624&amp;#60212&amp;#62PRT&amp;#60213&amp;#62人工序列&amp;#60220&amp;#62&amp;#60223&amp;#62人工序列的描述合成肽&amp;#60400&amp;#622TvrValAlaAsp1&amp;#60210&amp;#623&amp;#60211&amp;#624&amp;#60212&amp;#62PRT&amp;#60213&amp;#62人工序列&amp;#60220&amp;#62&amp;#60223&amp;#62人工序列的描述合成肽&amp;#60400&amp;#623LeuGluHisAsp1&amp;#60210&amp;#624&amp;#60211&amp;#624&amp;#60212&amp;#62PRT&amp;#60213&amp;#62人工序列&amp;#60220&amp;#62&amp;#60223&amp;#62人工序列的描述合成肽&amp;#60400&amp;#624AspGluThrAsp1&amp;#60210&amp;#625&amp;#60211&amp;#624&amp;#60212&amp;#62PRT&amp;#60213&amp;#62人工序列&amp;#60220&amp;#62&amp;#60223&amp;#62人工序列的描述合成肽&amp;#60400&amp;#625AspGluValAsp1&amp;#60210&amp;#626&amp;#60211&amp;#624&amp;#60212&amp;#62PRT&amp;#60213&amp;#62人工序列&amp;#60220&amp;#62&amp;#60223&amp;#62人工序列的描述合成肽&amp;#60400&amp;#626AspGluHisAsp1&amp;#60210&amp;#627&amp;#60211&amp;#624&amp;#60212&amp;#62PRT&amp;#60213&amp;#62人工序列&amp;#60220&amp;#62&amp;#60223&amp;#62人工序列的描述合成肽&amp;#60400&amp;#627ValGluHisAsp1&amp;#60210&amp;#628&amp;#60211&amp;#624&amp;#60212&amp;#62PRT&amp;#60213&amp;#62人工序列&amp;#60220&amp;#62&amp;#60223&amp;#62人工序列的描述合成肽&amp;#60400&amp;#628LeuG1uThrAsp1&amp;#60210&amp;#629&amp;#60211&amp;#624&amp;#60212&amp;#62PRT&amp;#60213&amp;#62人工序列&amp;#60220&amp;#62&amp;#60223&amp;#62人工序列的描述合成肽&amp;#60400&amp;#629LeuGluValAsp1&amp;#60210&amp;#6210&amp;#60211&amp;#624&amp;#60212&amp;#62PRT&amp;#60213&amp;#62人工序列&amp;#60220&amp;#62&amp;#60223&amp;#62人工序列的描述合成肽&amp;#60400&amp;#6210SerHisValAsp1&amp;#60210&amp;#6211&amp;#60211&amp;#624&amp;#60212&amp;#62PRT&amp;#60213&amp;#62人工序列&amp;#60220&amp;#62&amp;#60223&amp;#62人工序列的描述合成肽&amp;#60400&amp;#6211AspGluLeuAsp1&amp;#60210&amp;#6212&amp;#60211&amp;#624&amp;#60212&amp;#62PRT&amp;#60213&amp;#62人工序列&amp;#60220&amp;#62&amp;#60223&amp;#62人工序列的描述合成肽&amp;#60220&amp;#62&amp;#60400&amp;#6212AspGlyProAsp1&amp;#60210&amp;#6213&amp;#60211&amp;#624&amp;#60212&amp;#62PRT&amp;#60213&amp;#62人工序列&amp;#60220&amp;#62&amp;#60223&amp;#62人工序列的描述合成肽&amp;#60400&amp;#6213AspGluProAsp1&amp;#60210&amp;#6214&amp;#60211&amp;#624&amp;#60212&amp;#62PRT&amp;#60213&amp;#62人工序列&amp;#60220&amp;#62&amp;#60223&amp;#62人工序列的描述合成肽&amp;#60400&amp;#6214AspGlyThrAsp1&amp;#60210&amp;#6215&amp;#60211&amp;#624&amp;#60212&amp;#62PRT&amp;#60213&amp;#62人工序列&amp;#60220&amp;#62&amp;#60223&amp;#62人工序列的描述合成肽&amp;#60400&amp;#6215AspLeuAsnAsp1&amp;#60210&amp;#6216&amp;#60211&amp;#624&amp;#60212&amp;#62PRT&amp;#60213&amp;#62人工序列&amp;#60220&amp;#62&amp;#60223&amp;#62人工序列的描述合成肽&amp;#60400&amp;#6216AspGluGluAsp1&amp;#60210&amp;#6217&amp;#60211&amp;#624&amp;#60212&amp;#62PRT&amp;#60213&amp;#62人工序列&amp;#60220&amp;#62&amp;#60223&amp;#62人工序列的描述合成肽&amp;#60400&amp;#6217AspSerLeuAsp1&amp;#60210&amp;#6218&amp;#60211&amp;#624&amp;#60212&amp;#62PRT&amp;#60213&amp;#62人工序列&amp;#60220&amp;#62&amp;#60223&amp;#62人工序列的描述合成肽&amp;#60400&amp;#6218AspValProAsp1&amp;#60210&amp;#6219&amp;#60211&amp;#624&amp;#60212&amp;#62PRT&amp;#60213&amp;#62人工序列&amp;#60220&amp;#62&amp;#60223&amp;#62人工序列的描述合成肽&amp;#60400&amp;#6219AspGluAlaAsp1&amp;#60210&amp;#6220&amp;#60211&amp;#624&amp;#60212&amp;#62PRT&amp;#60213&amp;#62人工序列&amp;#60220&amp;#62&amp;#60223&amp;#62人工序列的描述合成肽&amp;#60400&amp;#6220AspSerTyrAsp1&amp;#60210&amp;#6221&amp;#60211&amp;#624&amp;#60212&amp;#62PRT&amp;#60213&amp;#62人工序列&amp;#60220&amp;#62&amp;#60223&amp;#62人工序列的描述合成肽&amp;#60400&amp;#6221GluLeuProAsp1&amp;#60210&amp;#6222&amp;#60211&amp;#624&amp;#60212&amp;#62PRT&amp;#60213&amp;#62人工序列&amp;#60220&amp;#62&amp;#60223&amp;#62人工序列的描述合成肽&amp;#60400&amp;#6222ValGluAspAsp1&amp;#60210&amp;#6223&amp;#60211&amp;#624&amp;#60212&amp;#62PRT&amp;#60213&amp;#62人工序列&amp;#60220&amp;#62&amp;#6022&amp;#62人工序列的描述合成肽&amp;#60400&amp;#6223IIeGluProAsp1&amp;#60210&amp;#6224&amp;#60211&amp;#624&amp;#60212&amp;#62PRT&amp;#60213&amp;#62人工序列&amp;#60220&amp;#62&amp;#60223&amp;#62人工序列的描述合成肽&amp;#60400&amp;#6224IleGluThrAsp1&amp;#60210&amp;#6225&amp;#60211&amp;#624&amp;#60212&amp;#62PRT&amp;#60213&amp;#62人工序列&amp;#60220&amp;#62&amp;#60221&amp;#62不確定&amp;#60222&amp;#62(1)&amp;#60223&amp;#62氨基酸可為色氨酸或亮氨酸&amp;#60220&amp;#62&amp;#60223&amp;#62人工序列的描述合成肽&amp;#60400&amp;#6225XaaGluHisAsp1&amp;#60210&amp;#6226&amp;#60211&amp;#624&amp;#60212&amp;#62PRT&amp;#60213&amp;#62人工序列&amp;#60220&amp;#62&amp;#60222&amp;#62人工序列的描述合成肽&amp;#60400&amp;#6226ValGluIleAsp1&amp;#60210&amp;#6227&amp;#60211&amp;#624&amp;#60212&amp;#62PRT&amp;#60213&amp;#62人工序列&amp;#60220&amp;#62&amp;#60223&amp;#62人工序列的描述合成肽&amp;#60400&amp;#6227ValGluProAsp1&amp;#60210&amp;#6228&amp;#60211&amp;#627&amp;#60212&amp;#62PRT&amp;#60213&amp;#62人工序列&amp;#60220&amp;#62&amp;#60223&amp;#62人工序列的描述合成肽&amp;#60400&amp;#6228SerGlnAsnTyrProIleVal15&amp;#60210&amp;#6229&amp;#60211&amp;#627&amp;#60212&amp;#62PRT&amp;#60213&amp;#62人工序列&amp;#60220&amp;#62&amp;#60223&amp;#62人工序列的描述合成肽&amp;#60400&amp;#6229laArgValLeuAlaGluAla15&amp;#60210&amp;#6230&amp;#60211&amp;#627&amp;#60212&amp;#62PRT&amp;#60213&amp;#62人工序列&amp;#60220&amp;#62&amp;#60223&amp;#62人工序列的描述合成肽&amp;#60400&amp;#6230AlaThrIleMetMetGlnArg15&amp;#60210&amp;#6231&amp;#60211&amp;#627&amp;#60212&amp;#62PRT&amp;#60213&amp;#62人工序列&amp;#60220&amp;#62&amp;#60223&amp;#62人工序列的描述合成肽&amp;#60400&amp;#6231ArgGlnAlaAsnPheLeuGly15&amp;#60210&amp;#6232&amp;#60211&amp;#627&amp;#60212&amp;#62PRT&amp;#60213&amp;#62人工序列&amp;#60220&amp;#62&amp;#60223&amp;#62人工序列的描述合成肽&amp;#60400&amp;#6232ProGlyAsnPheLeuGlnSer15&amp;#60210&amp;#6233&amp;#60211&amp;#627&amp;#60212&amp;#62PRT&amp;#60213&amp;#62人工序列&amp;#60220&amp;#62&amp;#60223&amp;#62人工序列的描述合成肽&amp;#60400&amp;#6233SerPheSerPheProGlnIle15&amp;#60210&amp;#6234&amp;#60211&amp;#627&amp;#60212&amp;#62PRT&amp;#60213&amp;#62人工序列&amp;#60220&amp;#62&amp;#60223&amp;#62人工序列的描述合成肽&amp;#60400&amp;#6234ThrLeuAsnPheProIleSer15&amp;#60210&amp;#6235&amp;#60211&amp;#627&amp;#60212&amp;#62PRT&amp;#60213&amp;#62人工序列&amp;#60220&amp;#62&amp;#60223&amp;#62人工序列的描述合成肽&amp;#60400&amp;#6235AlaGluThrPheTyrValAsp15&amp;#60210&amp;#6236&amp;#60211&amp;#627&amp;#60212&amp;#62PRT&amp;#60213&amp;#62人工序列&amp;#60220&amp;#62&amp;#60223&amp;#62人工序列的描述合成肽&amp;#60400&amp;#6236ArgLysValLeuPheLeuAsp15&amp;#60210&amp;#6237&amp;#60211&amp;#624&amp;#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#60220&amp;#62&amp;#60223&amp;#62人工序列的描述合成肽&amp;#60400&amp;#62121ProGlyAsnPheLeuGln15&amp;#60210&amp;#62122&amp;#60211&amp;#626&amp;#60212&amp;#62PRT&amp;#60213&amp;#62人工序列&amp;#60220&amp;#62&amp;#60223&amp;#62人工序列的描述合成肽&amp;#60400&amp;#62122SerPheSerPheProGln15&amp;#60210&amp;#62123&amp;#60211&amp;#626&amp;#60212&amp;#62PRT&amp;#60213&amp;#62人工序列&amp;#60220&amp;#62&amp;#60223&amp;#62人工序列的描述合成肽&amp;#60400&amp;#62123ThrLeuAsnPheProIle15&amp;#60210&amp;#62124&amp;#60211&amp;#626&amp;#60212&amp;#62PRT&amp;#60213&amp;#62人工序列&amp;#60220&amp;#62&amp;#60223&amp;#62人工序列的描述合成肽&amp;#60400&amp;#62124AlaGluThrPheTyrVal15&amp;#60210&amp;#62125&amp;#60211&amp;#626&amp;#60212&amp;#62PRT&amp;#60213&amp;#62人工序列&amp;#60220&amp;#62&amp;#60223&amp;#62人工序列的描述合成肽&amp;#60400&amp;#62125ArgLysValLeuPheLeu15&amp;#60210&amp;#62126&amp;#60211&amp;#625&amp;#60212&amp;#62PRT&amp;#60213&amp;#62人工序列&amp;#60220&amp;#62&amp;#60223&amp;#62人工序列的描述合成肽&amp;#60400&amp;#62126SerGlnAsnTyrPro15&amp;#60210&amp;#62127&amp;#60211&amp;#625&amp;#60212&amp;#62PRT&amp;#60213&amp;#62人工序列&amp;#60220&amp;#62&amp;#60223&amp;#62人工序列的描述合成肽&amp;#60400&amp;#62127AlaArgValLeuAla15&amp;#60210&amp;#62128&amp;#60211&amp;#625&amp;#60212&amp;#62PRT&amp;#60213&amp;#62人工序列&amp;#60220&amp;#62&amp;#60223&amp;#62人工序列的描述合成肽&amp;#60400&amp;#62128AlaThrIleMetMet15&amp;#60210&amp;#62129&amp;#60211&amp;#625&amp;#60212&amp;#62PRT&amp;#60213&amp;#62人工序列&amp;#60220&amp;#62&amp;#60223&amp;#62人工序列的描述合成肽&amp;#60400&amp;#62129ArgGlnAlaAsnPhe15&amp;#60210&amp;#62130&amp;#60211&amp;#625&amp;#60212&amp;#62PRT&amp;#60213&amp;#62人工序列&amp;#60220&amp;#62&amp;#60223&amp;#62人工序列的描述合成肽&amp;#60400&amp;#62130ProGlyAsnPheLeu15&amp;#60210&amp;#62131&amp;#60211&amp;#625&amp;#60212&amp;#62PRT&amp;#60213&amp;#62人工序列&amp;#60220&amp;#62&amp;#60223&amp;#62人工序列的描述合成肽&amp;#60400&amp;#62131SerPheSerPhePro15&amp;#60210&amp;#62132&amp;#60211&amp;#625&amp;#60212&amp;#62PRT&amp;#60213&amp;#62人工序列&amp;#60220&amp;#62&amp;#60223&amp;#62人工序列的描述合成肽&amp;#60400&amp;#62132ThrLeuAsnPhePro15&amp;#60210&amp;#62133&amp;#60211&amp;#625&amp;#60212&amp;#62PRT&amp;#60213&amp;#62人工序列&amp;#60220&amp;#62&amp;#60223&amp;#62人工序列的描述合成肽&amp;#60400&amp;#62133AlaGluThrPheTyr15&amp;#60210&amp;#62134&amp;#60211&amp;#625&amp;#60212&amp;#62PRT&amp;#60213&amp;#62人工序列&amp;#60220&amp;#62&amp;#60223&amp;#62人工序列的描述合成肽&amp;#60400&amp;#62134ArgLysValLeuPhe15&amp;#60210&amp;#62135&amp;#60211&amp;#625&amp;#60212&amp;#62PRT&amp;#60213&amp;#62人工序列&amp;#60220&amp;#62&amp;#60223&amp;#62人工序列的描述合成肽&amp;#60400&amp;#62135MetArgGlyGlyAla15&amp;#60210&amp;#62136&amp;#60211&amp;#625&amp;#60212&amp;#62PRT&amp;#60213&amp;#62人工序列&amp;#60220&amp;#62&amp;#60223&amp;#62人工序列的描述合成肽&amp;#60400&amp;#62136IleArgGlyGlyAla15&amp;#60210&amp;#62137&amp;#60211&amp;#625&amp;#60212&amp;#62PRT&amp;#60213&amp;#62人工序列&amp;#60220&amp;#62&amp;#60223&amp;#62人工序列的描述合成肽&amp;#60400&amp;#62137LeuValGlyGlyAla15&amp;#60210&amp;#62138&amp;#60211&amp;#625&amp;#60212&amp;#62PRT&amp;#60213&amp;#62人工序列&amp;#60220&amp;#62&amp;#60223&amp;#62人工序列的描述合成肽&amp;#60400&amp;#62138MetValGlyGlyAla15&amp;#60210&amp;#62139&amp;#60211&amp;#625&amp;#60212&amp;#62PRT&amp;#60213&amp;#62人工序列&amp;#60220&amp;#62&amp;#60223&amp;#62人工序列的描述合成肽&amp;#60400&amp;#62139IleValGlyGlyAla15&amp;#6021O&amp;#62140&amp;#60211&amp;#625&amp;#60212&amp;#62PRT&amp;#60213&amp;#62人工序列&amp;#60220&amp;#62&amp;#60223&amp;#62人工序列的描述合成肽&amp;#60400&amp;#62140SerGlnAsnLeuPhe15&amp;#60210&amp;#62141&amp;#60211&amp;#626&amp;#60212&amp;#62PRT&amp;#60213&amp;#62人工序列&amp;#60220&amp;#62&amp;#60223&amp;#62人工序列的描述合成肽&amp;#60400&amp;#62141ThrIleAsnPheGlnArg15&amp;#60210&amp;#62142&amp;#60211&amp;#626&amp;#60212&amp;#62PRT&amp;#60213&amp;#62人工序列&amp;#60220&amp;#62&amp;#60223&amp;#62人工序列的描述合成肽&amp;#60400&amp;#62142TyrValAlaAspGlyGly1權(quán)利要求1．一種具有通式Ⅱ的報(bào)道化合物R1-(AA)n-Asp-y-Asp-(AA)n-R1(Ⅱ)或其生物學(xué)可接受的鹽或其前報(bào)道分子，其中R1是N端保護(hù)基團(tuán)；每個(gè)AA獨(dú)立地為α-氨基酸或β-氨基酸殘基，或α-氨基酸或β-氨基酸的衍生物；每個(gè)n獨(dú)立地為0-5；并且y是發(fā)熒光或熒光部分。2．權(quán)利要求1的化合物，其中R1-(AA)n-Asp是N端保護(hù)的四肽，它是胱天肽酶的底物。3．權(quán)利要求2的化合物，其中所述四肽為WEHDSEQIDNO:1、YVADSEQIDNO:2、LEHDSEQIDNO:3、DETDSEQIDNO:4、DEVDSEQIDNO:5、DEHDSEQIDNO:6、VEHDSEQIDNO:7、LETDSEQIDNO:8、LEHDSEQIDNO:3、SHVDSEQIDNO:10、DELDSEQIDNO:11、DGPDSEQIDNO:12、DEPDSEQIDNO:13、DGTDSEQIDNO:14、DLNDSEQIDNO:15、DEEDSEQIDNO:16、DSLDSEQIDNO:17、DVPDSEQIDNO:18、DEADSEQIDNO:19、DSYDSEQIDNO:20、ELPDSEQIDNO:21、VEIDSEQIDNO:26或IETDSEQIDNO:24。4．權(quán)利要求1的化合物，其中R1-(AA)n-Asp是N端保護(hù)的四肽，它是粒酶B的底物。5．權(quán)利要求4的化合物，其中R1-(AA)n-Asp為IEPD或VEPD。6．權(quán)利要求1的化合物，其中R1-(AA)n-Asp是由C端Asp和一種肽鏈的1、2或3個(gè)氨基酸組成的N端保護(hù)的肽，該肽鏈選自WEHDSEQIDNO:1、YVADSEQIDNO:2、LEHDSEQIDNO:3、DETDSEQIDNO:4、DEVDSEQIDNO:5、DEHDSEQIDNO:6、VEHDSEOIDNO:7、LETDSEQIDNO:8、LEHDSEQIDNO:3、SHVDSEQIDNO:10、DELDSEQIDNO:11、DGPDSEQIDNO:12、DEPDSEQIDNO:13、DGTDSEQIDNO:14、DLNDSEQIDNO:15、DEEDSEQIDNO:16、DSLDSEQIDNO:17、DVPDSEQIDNO:18、DEADSEQIDNO:19、DSYDSEQIDNO:20、ELPDSEQIDNO:21、VEIDSEQIDNO:26、IETDSEQIDNO:24、IEPDSEQIDNO:23和VEPDSEQIDNO:27。7．權(quán)利要求1的化合物，其中y是羅丹明110；前報(bào)道分子是含Asp或Glu的化合物的低級(jí)烷基酯或乙酸基甲基(AM)酯。8．權(quán)利要求1的化合物，其具有通式Ⅲ9．權(quán)利要求8的化合物，其中R1為叔丁氧羰基、乙?；?、己?；?、辛?；蚱S氧羰基。10．權(quán)利要求8的化合物，其中-(AA)n為WEH.YVA.LEH、DET、DEV、DEH、VEH、LET、SHV、DEL、DGP、DEP、DGT、DLN、DEE、DSL、DVP、DEA、DSY、ELP、VED、IEP或IET。11．權(quán)利要求1的化合物，其選自(Z-YVAD)2-羅丹明110，SEQIDNO:2；(Z-DEVD)2-羅丹明110，SEQIDNO:5；(Z-VAD)2-羅丹明110；(Z-YVAD(OAM))2-羅丹明110，SEQIDNO:2；(Z-LE(OAM)HD(OAM))2-羅丹明110，SEQIDNO:3；(Z-D(OAM)E(OAM)TD(OAM))2-羅丹明110，SEQIDNO:4；(Z-D(OAM)E(OAM)VD(OAM))2-羅丹明110，SEQIDNO:5；(Z-D(OMe)E(OMe)VD(OAM))2-羅丹明110，SEQIDNO:5；和(Z-D(OMe)E(OMe)VD)2-羅丹明110，SEQIDNO5。12．權(quán)利要求8的化合物的制備方法，包括(a)使羅丹明110與N-fmoc-L-天冬氨酸β-叔丁酯一起縮合，產(chǎn)生(Fmoc-Asp(OBu-t))2-羅丹明110；(b)除去Fmoc基，得到(Asp(OBu-t))2-羅丹明110；(c)使(Asp(OBu-t))2-羅丹明與Z-(AA)n縮合，產(chǎn)生(Z-(AA)n-Asp(OBu-t))2-羅丹明110；及(d)除去OBu-t保護(hù)基。13．權(quán)利要求12的方法，其中-(AA)n為WEH、YVA、LEH、DET、DEV、DEH、VEH、LET、SHV、DEL、DGP、DEP、DGT、DLN、DEE、DSL、DVP、DEA、DSY、ELP、VED、IEP或IET。14．具有通式Ⅴ的報(bào)道化合物R1-(AA)n-Asp-y-R6(Ⅴ)或其生物學(xué)可接受的鹽或其前報(bào)道分子，其中R1是N端保護(hù)基團(tuán)；R6是一種保護(hù)基團(tuán)，不是氨基酸或氨基酸的衍生物；每個(gè)AA獨(dú)立地為α-氨基酸或β-氨基酸殘基，或α-氨基酸或β-氨基酸的衍生物；n為0-5；并且y是發(fā)熒光或熒光部分。15．權(quán)利要求14的化合物，其中R1-(AA)n-Asp是N端保護(hù)的四肽，它是胱天肽酶的底物。16．權(quán)利要求15的化合物，其中所述四肽為WEHDSEQIDNO:1、YVADSEQIDNO:2、LEHDSEQIDNO:3、DETDSEQIDNO:4、DEVDSEQIDNO:5、DEHDSEQIDNO:6、VEHDSEQIDNO:7、LETDSEQIDNO:8、LEHDSEQIDNO:3、SHVDSEQIDNO:10、DELDSEQIDNO:11、DGPDSEQIDNO:12、DEPDSEQIDNO:13、DGTDSEQIDNO:14、DLNDSEQIDNO:15、DEEDSEQIDNO:16、DSLDSEQIDNO:17、DVPDSEQIDNO:18、DEADSEQIDNO:19、DSYDSEQIDNO:20、ELPDSEQIDNO:21、VEIDSEQIDNO:26或IETDSEQIDNO:24。17．權(quán)利要求14的化合物，其中R1-(AA)n-Asp是N端保護(hù)的四肽，它是粒酶B的底物。18．權(quán)利要求17的化合物，其中R1-(AA)n-Asp為N端保護(hù)的IEPD或VEPD。19．權(quán)利要求14的化合物，其中R1-(AA)n-Asp是由C端Asp和一種肽鏈的1、2或3個(gè)氨基酸組成的N端保護(hù)的肽，該肽鏈選自WEHDSEQIDNO:1、YVADSEQIDNO:2、LEHDSEQIDNO:3、DETDSEQIDNO:4、DEVDSEQIDNO:5、DEHDSEQIDNO:6、VEHDSEQIDNO:7、LETDSEQIDNO:8、LEHDSEQIDNO:3、SHVDSEQIDNO:10、DELDSEQIDNO:11、DGPDSEQIDNO:12、DEPDSEQIDNO:13、DGTDSEQIDNO:14、DLNDSEQIDNO:15、DEEDSEQIDNO:16、DSLDSEQIDNO:17、DVPDSEQIDNO:18、DEADSEQIDNO:19、DSYDSEQIDNO:20、ELPDSEQIDNO:21、VEIDSEQIDNO:26、IETDSEQIDNO:24、IEPDSEQIDNO:23和VEPDSEQIDNO:27。20．權(quán)利要求14的化合物，其中y是羅丹明110。21．權(quán)利要求14的化合物，其中R6為CH3OCO-、Cbz、Cl3CCH2OCO-、PhCH2CH2OCO-或CH3(CH2)POCO-，其中p為1-11。22．權(quán)利要求14的化合物，其中R6為Me2NCO-、Et2NCO-或N-Me-N-CH3(CH2)vNCO-，其中v為0-9。23．權(quán)利要求14的化合物，其中R6為Ts-、PhSO2-、MeSO2-、PhCH2SO2-、CF3SO2-或CH3(CH2)uSO2-，其中u為0-11。24．權(quán)利要求14的化合物，其中R6為CH3SCO-或CH3(CH2)tSCO-，其中t為0-11。25．權(quán)利要求14的化合物，其中R6為HCO-、CH3CO-、PhCH2CO-、PhCO-或CH3(CH2)wCO-，其中W為0-11。26．權(quán)利要求14的化合物，其中R6為CH3(OCH2CH2)qOCO-或CH3(CH2)r(OCH2CH2)sOCO-，其中q為1-4，r為0-5，s為1-4。27．權(quán)利要求14的化合物，其具有通式Ⅶ或其生物學(xué)可接受的鹽或其前報(bào)道分子，其中R2和R3獨(dú)立地為氫、甲基或乙基；并且R4和R5獨(dú)立地為氫或甲基。28．權(quán)利要求27的化合物，其中R1為叔丁氧羰基、乙?；?、己?；⑿刘；蚱S氧羰基；R2、R3、R4和R5為氫。29．權(quán)利要求27的化合物，其中-(AA)n為WEH、YVA、LEH、DET、DEV、DEH、VEH、LET、LEV、SHV、DEL、DGP、DEP、DGT、DLN、DEE、DSL、DVP、DEA、DSY、ELP、VED、IEP或IET。30．權(quán)利要求14的化合物，其選自N-(Z-YVAD)-N'-乙?；?羅丹明110，SEQIDNO:2；N-(Z-DEVD)-N'-乙酰基-羅丹明110，SEQIDNO:5；N-(Z-VD)-N'-乙酰基-羅丹明110；N-(Z-AD)-N'-乙?；?羅丹明110；N-(Z-VAD)-N'-乙?；?羅丹明110；N-(Z-DEVD)-N'-乙氧羰基-羅丹明110，SEQIDNO:5；N-(Ac-DEVD)-N'-乙氧羰基-羅丹明110，SEQIDNO:5；N-(Ac-DEVD)-N'-己氧羰基-羅丹明110，SEQIDNO:5；N-(Ac-DEVD)-N'-辛氧羰基-羅丹明11O，SEQIDNO:5；N-(Ac-DEVD)-N'-癸氧羰基-羅丹明11O，SEQIDNO:5；N-(Ac-DEVD)-N'-十二烷基氧羰基-羅丹明110，SEQIDNO:5；和N-(Ac-DEVD)-N'-(乙硫基)羰基-羅丹明110，SEQIDNO:5。31．一種權(quán)利要求27的化合物的制備方法，包括(a)使羅丹明與乙酸酐反應(yīng)，產(chǎn)生N-乙?；?羅丹明；(b)使N-乙?；?羅丹明與N-fmoc-L-天冬氨酸β-叔丁酯一起縮合，產(chǎn)生N-(Fmoc-Asp(OBu-t)-N'-乙酰基-羅丹明；(c)除去Fmoc基，得到N-(Asp(OBu-t))-N'-乙?；?羅丹明；(d)使N-(Asp(OBu-t))-N'-乙?；?羅丹明與Z-(AA)n縮合，產(chǎn)生N-(Z-(AA)n-Asp(OBu-t))-N'-乙?；?羅丹明；及(e)除去OBu-t保護(hù)基，得到N-(Z-(AA)n-Asp)-N'-乙?；?羅丹明。32．一種權(quán)利要求27的化合物的制備方法，包括(a)使羅丹明與乙酸酐反應(yīng)，產(chǎn)生N-乙?；?羅丹明；(b)使N-乙?；?羅丹明與Z-(AA)n-Asp(OBu-t))縮合，產(chǎn)生N-(Z-(AA)n-Asp(OBu-t))-N'-乙?；?羅丹明；及(c)除去OBu-t保護(hù)基，得到N-(Z-(AA)n-Asp)-N'-乙?；?羅丹明。33．權(quán)利要求31或32的方法，其中-(AA)n為WEH、YVA、LEH、DET、DEV、DEH、VEH、LET、LEV、SHV、DEL、DGP、DEP、DGT、DLN、DEE、DSL、DVP、DEA、DSY、ELP、VED、IEP或IET。34．權(quán)利要求1的化合物，其具有通式Ⅸ或其生物學(xué)可接受的鹽或其前報(bào)道分子，其中R1是氫或N端保護(hù)基團(tuán)；R6是一種保護(hù)基團(tuán)，不是氨基酸或氨基酸的衍生物；每個(gè)AA獨(dú)立地為α-氨基酸或β-氨基酸殘基，或α-氨基酸或β-氨基酸的衍生物；n為0-5的整數(shù)；m為0-3的整數(shù)；R2和R3獨(dú)立地為氫、甲基或乙基；并且R4和R5獨(dú)立地為氫或甲基。35．權(quán)利要求34的化合物，其中R2、R3、R4和R5為氫。36．權(quán)利要求34的化合物，其中R1為H；n=1；(AA)n為M；m為1-2的整數(shù)；(AA)m選自GG、GA、AG、G和A。37．權(quán)利要求34的化合物，其中該化合物選自N-(GP)-N'-乙氧羰基-羅丹明11O；N-(GPG)-N'-乙氧羰基-羅丹明110；和N-G-N'-辛氧羰基-羅丹明110。38．權(quán)利要求34的化合物，其中R7為N端保護(hù)基團(tuán)，選自叔丁氧羰基、乙?；?、己?；?、辛酰基、十二烷?；推S氧羰基。39．權(quán)利要求34的化合物，其中(AA)n-(AA)m選自SQNY-PIVSEQIDNO:28、ARVL-AEASEQIDNO:29、ATIM-MQRSEQIDNO:30、RQAN-FLGSEQIDNO:31、PGNF-LQSSEQIDNO:32、SFSF-PQISEQIDNO:33、TLNF-PISSEQIDNO:34、AETF-YVDSEQIDNO:35或RKVL-FLDSEQIDNO:36；SQNY-PISEQIDNO:117、ARVL-AESEQIDNO:118、ATIM-MQSEQIDNO:119、RQAN-FLSEQIDNO:120、PGNF-LQSEQIDNO:121、SFSF-PQSEQIDNO:122、TLNF-PISEQIDNO:123、AETF-YVSEQIDNO:124或RKVL-FLSEQIDNO:125；SQNY-PSEQIDNO:126、ARVL-ASEQIDNO:127、ATIM-MSEQIDNO:128、RQAN-FSEQIDNO:129、PGNF-LSEQIDNO:130、SFSF-PSEQIDNO:131、TLNF-PSEQIDNO:132、AETF-YSEQIDNO:133和RKVL-FSEQIDNO:134。40．權(quán)利要求34的化合物，其中(AA)n-(AA)m選自LRGGGSEQIDNO:101、LRGGASEQIDNO:102、MRGGGSEQIDNO:96、MRGGASEQIDNO:135、IRGGGSEQIDNO:97、IRGGASEQIDNO:136、LVGGGSEQIDNO:98、LVGGASEQIDNO:137、MVGGGSEQIDNO:99、MVGGASEQIDNO:138、IVGGGSEQIDNO:100、IVGGASEQIDNO:139、LRGGSEQIDNO:55、MRGGSEQIDNO:56、IRGGSEQIDNO:57、LVGGSEQIDNO:58、MVGGSEQIDNO:59和IVGGSEQIDNO:60。41．一種具有通過(guò)Ⅵ的化合物或其生物學(xué)可接受的鹽，其中R2和R3獨(dú)立地為氫、甲基或乙基；R4或R5獨(dú)立地為氫或甲基；R6為一種保護(hù)基團(tuán)，不是氨基酸或氨基酸衍生物。42．權(quán)利要求41的化合物，其中R2、R3、R4和R5為氫。43．權(quán)利要求41的化合物，其中R2和R3是甲基；R4和R5為氫。44．權(quán)利要求41的化合物，其中R2和R3是乙基；R4和R5為甲基。45．權(quán)利要求41的化合物，其選自N-甲氧羰基-羅丹明110、N-乙氧羰基-羅丹明110、N-己氧羰基-羅丹明110、N-辛氧羰基-羅丹明110、N-癸氧羰基-羅丹明110和N-十二烷氧羰基-羅丹明110。46．權(quán)利要求41的化合物，其選自N-二甲基氨基甲?；?羅丹明110、N-(N-甲基-N-己基氨基甲酰基)-羅丹明110、N-甲磺酰基-羅丹明110、N-(乙硫基)羰基-羅丹明110、N-(己硫基)羰基-羅丹明110、N-(辛硫基)羰基-羅丹明110、N-乙酰基-羅丹明110、N-乙酰基-羅丹明116、N-(2，5，8-三氧雜癸氧羰基)-羅丹明110和N-(2-丁氧基乙氧羰基)-羅丹明110。47．一種方法，用于檢測(cè)一種或多種細(xì)胞中參與細(xì)胞凋亡級(jí)聯(lián)的酶，包括(a)在一定條件下使所述一種或多種細(xì)胞與根據(jù)權(quán)利要求1或14的報(bào)道化合物相接觸，從而使該報(bào)道化合物被該一種或多種細(xì)胞吸收，和(b)記錄該一種或多種細(xì)胞的熒光，其中與未如此接觸的對(duì)照細(xì)胞相比，該一種或多種細(xì)胞內(nèi)熒光的變化表明該酶的存在。48．權(quán)利要求47的方法，其中該酶是一種胞內(nèi)胱天肽酶。49．一種方法，用于測(cè)定一種或多種細(xì)胞中參與細(xì)胞凋亡級(jí)聯(lián)的酶的活性，包括(a)在一定條件下使所述一種或多種細(xì)胞與根據(jù)權(quán)利要求1或14的報(bào)道化合物相接觸，從而使該報(bào)道化合物被該一種或多種細(xì)胞吸收，和(b)記錄該一種或多種細(xì)胞的熒光，其中與未如此接觸的對(duì)照細(xì)胞相比，該一種或多種細(xì)胞內(nèi)熒光的相對(duì)變化是酶活性的量度。50．權(quán)利要求49的方法，其中該酶是一種胞內(nèi)胱天肽酶。51．一種方法，用于確定試驗(yàn)物質(zhì)對(duì)一種或多種試驗(yàn)細(xì)胞中參與細(xì)胞凋亡級(jí)聯(lián)的酶是否有影響，包括(a)在一定條件下使所述一種或多種試驗(yàn)細(xì)胞與試驗(yàn)物質(zhì)和根據(jù)權(quán)利要求1或14的報(bào)道化合物相接觸，從而使該試驗(yàn)物質(zhì)或者與外部受體相互作用，或者被該一種或多種細(xì)胞吸收，而該報(bào)道化合物被該一種或多種細(xì)胞吸收，和(b)記錄該一種或多種試驗(yàn)細(xì)胞的熒光，與只接觸該報(bào)道化合物的對(duì)照細(xì)胞相比較，其中與該對(duì)照細(xì)胞相比，一種或多種細(xì)胞內(nèi)熒光的變化表明該試驗(yàn)物質(zhì)對(duì)該酶有影響。52．權(quán)利要求51的方法，其中該酶是一種胞內(nèi)胱天肽酶。53．根據(jù)權(quán)利要求51的方法，其中在使所述試驗(yàn)細(xì)胞與報(bào)道化合物接觸之前，使一種或多種試驗(yàn)細(xì)胞與試驗(yàn)物質(zhì)接觸。54．根據(jù)權(quán)利要求51的方法，其中在接觸報(bào)道化合物之后，使一種或多種試驗(yàn)細(xì)胞與所述試驗(yàn)物質(zhì)接觸。55．根據(jù)權(quán)利要求51的方法，其中使一種或多種試驗(yàn)細(xì)胞與所述試驗(yàn)物質(zhì)和所述報(bào)道化合物基本上同時(shí)接觸。56．根據(jù)權(quán)利要求51的方法，其中該方法用來(lái)確定該試驗(yàn)物質(zhì)是否能刺激該酶的活性。57．根據(jù)權(quán)利要求51的方法，其中該方法用來(lái)確定該試驗(yàn)物質(zhì)是否抑制該酶的活性。58．根據(jù)權(quán)利要求51的方法，其中該接觸步驟進(jìn)一步包括在第一種試驗(yàn)物質(zhì)存在下使一種或多種試驗(yàn)細(xì)胞與至少一種第二種試驗(yàn)物質(zhì)相接觸。59．根據(jù)權(quán)利要求51的方法，其中該一種或多種試驗(yàn)細(xì)胞來(lái)源于一種單細(xì)胞生物。60．根據(jù)權(quán)利要求51的方法，其中該一種或多種試驗(yàn)細(xì)胞來(lái)源于一種多細(xì)胞生物。61．根據(jù)權(quán)利要求60的方法，其中該多細(xì)胞生物選自哺乳動(dòng)物、無(wú)脊椎動(dòng)物、昆蟲(chóng)和植物。62．根據(jù)權(quán)利要求51的方法，其中一種或多種試驗(yàn)細(xì)胞及對(duì)照細(xì)胞來(lái)源于所述多細(xì)胞生物的毛發(fā)、腦、周圍神經(jīng)系統(tǒng)、眼、耳、鼻、口、扁桃體、牙齒、食道、肺、乳房、心臟、血液、血管、骨髓、淋巴結(jié)、胸腺、脾、免疫系統(tǒng)、肝、胃、腸道、胰、內(nèi)分泌腺及組織、腎、膀胱、生殖器或生殖腺、關(guān)節(jié)、骨和皮膚。63．根據(jù)權(quán)利要求51的方法，其中一種或多種試驗(yàn)細(xì)胞是癌細(xì)胞。64．根據(jù)權(quán)利要求63的方法，其中所述一種或多種癌細(xì)胞來(lái)源于所述多細(xì)胞生物的腦、周圍神經(jīng)系統(tǒng)、眼、耳、鼻、口、扁桃體、牙齒、食道、肺、乳房、心臟、血液、血管、骨髓、淋巴結(jié)、胸腺、脾、免疫系統(tǒng)、肝、胃、腸道、胰、內(nèi)分泌腺或組織、腎、膀胱、生殖器或生殖腺、關(guān)節(jié)、骨和皮膚。65．根據(jù)權(quán)利要求63的方法，其中所述一種或多種試驗(yàn)癌細(xì)胞來(lái)源于需要用化療藥治療的人類，而所述試驗(yàn)物質(zhì)為一種化療劑。66．根據(jù)權(quán)利要求51的方法，其中試驗(yàn)物質(zhì)是一種化療劑。67．根據(jù)權(quán)利要求51的方法，其中試驗(yàn)物質(zhì)是化療劑的混合物。68．一種方法，用于確定患有癌癥的動(dòng)物對(duì)一種或多種化療劑治療的敏感性，包括(a)在一定條件下使取自該動(dòng)物的癌細(xì)胞與所述一種或多種化療劑及根據(jù)權(quán)利要求1或14的報(bào)道化合物相接觸，從而使一種或多種藥劑或者與外部受體相互作用，或者被該癌細(xì)胞吸收，和(b)記錄所述癌細(xì)胞的熒光，與只接觸該報(bào)道化合物的對(duì)照細(xì)胞相比較，其中與該對(duì)照細(xì)胞相比癌細(xì)胞的熒光的變化表明該癌細(xì)胞對(duì)一種或多種化療劑是化學(xué)敏感的，并且該動(dòng)物對(duì)該治療敏感。69．權(quán)利要求68的方法，其中所述動(dòng)物為人類。70．一種監(jiān)測(cè)應(yīng)用一種或多種化療劑對(duì)動(dòng)物治療的方法，包括(a)對(duì)該動(dòng)物施用一種或多種化療劑，(b)在一定條件下將施用后取自該動(dòng)物的細(xì)胞與根據(jù)權(quán)利要求1或14的報(bào)道化合物相接觸，從而使所述報(bào)道化合物被該細(xì)胞吸收，和(c)記錄與所述報(bào)道化合物接觸的該細(xì)胞的熒光，與施用前取自該動(dòng)物的對(duì)照細(xì)胞相比較，其中與該對(duì)照細(xì)胞相比，取自該動(dòng)物的細(xì)胞的熒光變化表明該動(dòng)物對(duì)該化療劑敏感。71．根據(jù)權(quán)利要求70的方法，其中所述動(dòng)物患有與凋亡性細(xì)胞死亡有關(guān)的疾病。72．一種方法，用于確定試驗(yàn)物質(zhì)是否抑制或阻止一種或多種試驗(yàn)細(xì)胞中的細(xì)胞死亡，包括(a)在一定條件下使該一種或多種試驗(yàn)細(xì)胞與該試驗(yàn)物質(zhì)及根據(jù)權(quán)利要求1或14的報(bào)道化合物相接觸，從而使報(bào)道化合物被一種或多種細(xì)胞吸收，和(b)記錄一種或多種試驗(yàn)細(xì)胞的熒光，與只接觸報(bào)道化合物的對(duì)照細(xì)胞相比較，其中與該對(duì)照細(xì)胞相比，一種或多種試驗(yàn)細(xì)胞內(nèi)熒光的減弱表明該試驗(yàn)物質(zhì)抑制或阻止細(xì)胞死亡。73．權(quán)利要求72的方法，其中所述一種或多種試驗(yàn)細(xì)胞是神經(jīng)細(xì)胞。74．權(quán)利要求72的方法，其中所述一種或多種試驗(yàn)細(xì)胞選自心肌細(xì)胞、免疫細(xì)胞、待移植器官的細(xì)胞、精子、卵細(xì)胞、產(chǎn)生重組蛋白質(zhì)的細(xì)胞系、毛發(fā)細(xì)胞、皮膚細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞。75．一種方法，用于確定一種試驗(yàn)物質(zhì)是否能引起或增強(qiáng)一種或多種試驗(yàn)細(xì)胞中的細(xì)胞死亡，包括(a)在一定條件下使一種或多種試驗(yàn)細(xì)胞與試驗(yàn)物質(zhì)及根據(jù)權(quán)利要求1或14的報(bào)道化合物相接觸，從而使該報(bào)道化合物被一種或多種細(xì)胞吸收，和(b)記錄一種或多種試驗(yàn)細(xì)胞的熒光，與只接觸報(bào)道化合物的對(duì)照細(xì)胞比較，其中與該對(duì)照細(xì)胞相比，一種或多種試驗(yàn)細(xì)胞內(nèi)熒光的增強(qiáng)表明該試驗(yàn)物質(zhì)引起或增強(qiáng)細(xì)胞死亡。76．權(quán)利要求75的方法，其中所述一種或多種試驗(yàn)細(xì)胞是癌細(xì)胞、酵母、真菌或細(xì)菌。77．一種檢測(cè)一種或多種細(xì)胞中病毒蛋白酶的方法，包括(a)在一定條件下使該細(xì)胞與權(quán)利要求34的報(bào)道化合物接觸，從而使報(bào)道化合物被該細(xì)胞吸收，和(b)記錄該細(xì)胞的熒光，其中與未如此接觸的對(duì)照細(xì)胞相比，該細(xì)胞內(nèi)熒光的變化表明病毒蛋白酶的存在。78．一種測(cè)定一種或多種病毒感染的細(xì)胞中病毒蛋白酶活性的方法，包括(a)在一定條件下使一種或多種病毒感染細(xì)胞與權(quán)利要求34的報(bào)道化合物相接觸，從而使該報(bào)道化合物被一種或多種病毒感染的細(xì)胞吸收，和(b)記錄該一種或多種細(xì)胞的熒光，其中與未如此接觸的對(duì)照細(xì)胞相比，一種或多種病毒感染的細(xì)胞內(nèi)熒光的變化是病毒蛋白酶活性的量度。79．一種方法，用于確定試驗(yàn)物質(zhì)對(duì)一種或多種病毒感染的細(xì)胞中的病毒蛋白酶活性是否有影響，包括(a)在一定條件下使病毒感染細(xì)胞與試驗(yàn)物質(zhì)及權(quán)利要求34的報(bào)道化合物相接觸，從而使該報(bào)道化合物被該感染的試驗(yàn)細(xì)胞吸收，和(b)記錄該感染的試驗(yàn)細(xì)胞的熒光，與只接觸該報(bào)道化合物的感染的對(duì)照細(xì)胞相比較，其中與該感染的對(duì)照細(xì)胞相比，感染的試驗(yàn)細(xì)胞內(nèi)熒光的變化表明該試驗(yàn)物質(zhì)對(duì)病毒蛋白酶有影響。80．權(quán)利要求77-79中任一項(xiàng)的方法，其中該細(xì)胞是HIV感染的細(xì)胞，病毒蛋白酶是HIV蛋白酶。81．權(quán)利要求77-79中任一項(xiàng)的方法，其中該細(xì)胞是腺病毒感染的細(xì)胞，病毒蛋白酶是腺病毒蛋白酶。82．權(quán)利要求77-79中任一項(xiàng)的方法，其中該細(xì)胞是HSV感染的細(xì)胞，病毒蛋白酶是HSV蛋白酶。83．權(quán)利要求77-79中任一項(xiàng)的方法，其中該細(xì)胞是HCMV感染的細(xì)胞，病毒蛋白酶是HCMV蛋白酶。84．權(quán)利要求77-79中任一項(xiàng)的方法，其中該細(xì)胞是HCV感染的細(xì)胞，病毒蛋白酶是HCV蛋白酶。85．一種測(cè)定細(xì)胞中蛋白酶或肽酶活性的方法，包括(a)在一定條件下使試驗(yàn)細(xì)胞與權(quán)利要求34的報(bào)道化合物接觸，從而使該報(bào)道化合物被該試驗(yàn)細(xì)胞吸收，或者該報(bào)道化合物與該細(xì)胞的外膜蛋白酶或肽酶相互作用，和(b)記錄該細(xì)胞的熒光，其中與未如此接觸的對(duì)照細(xì)胞相比，該試驗(yàn)細(xì)胞內(nèi)熒光的變化是該蛋白酶或肽酶活性的量度。86．一種方法，用于確定試驗(yàn)物質(zhì)對(duì)試驗(yàn)細(xì)胞中的蛋白酶或膚酶活性是否有影響，包括(a)在一定條件下使該試驗(yàn)細(xì)胞與試驗(yàn)物質(zhì)及權(quán)利要求34的報(bào)道化合物相接觸，從而使該報(bào)道化合物被該試驗(yàn)細(xì)胞吸收，或者該報(bào)道化合物與該細(xì)胞的外膜蛋白酶或肽酶相互作用，和(b)記錄該試驗(yàn)細(xì)胞的熒光，與只接觸該報(bào)道化合物的對(duì)照細(xì)胞相比較，其中與該對(duì)照細(xì)胞相比，試驗(yàn)細(xì)胞內(nèi)熒光的變化表明該試驗(yàn)物質(zhì)對(duì)該蛋白酶或肽酶有影響。87．權(quán)利要求85-86中任一項(xiàng)的方法，其中該細(xì)胞是內(nèi)皮細(xì)胞，肽酶是2型甲硫氨酸氨肽酶。88．權(quán)利要求85-86中任一項(xiàng)的方法，其中該細(xì)胞是T細(xì)胞，肽酶是二肽基肽酶Ⅳ。89．權(quán)利要求85-86中任一項(xiàng)的方法，其中該細(xì)胞是神經(jīng)元細(xì)胞，而蛋白酶是鈣激活蛋白酶。90．權(quán)利要求85-86中任一項(xiàng)的方法，其中該肽酶是氨肽酶。全文摘要本發(fā)明涉及新型熒光染料、新型發(fā)熒光及熒光報(bào)道分子和新的測(cè)定法,這些測(cè)定法能用來(lái)檢測(cè)來(lái)源于任何活生物或器官的全細(xì)胞、細(xì)胞系和組織標(biāo)本中胱天肽酶的活性及參與細(xì)胞凋亡的其它酶的活性。這些報(bào)道分子及測(cè)定法能用于藥物篩選方法,用來(lái)鑒定在全細(xì)胞或組織中作為胱天肽酶級(jí)聯(lián)抑制劑或誘導(dǎo)劑的化合物。此處所述的試劑和測(cè)定也能用于確定人癌細(xì)胞對(duì)化療藥治療的化學(xué)敏感性。本發(fā)明也涉及新型發(fā)熒光或熒光報(bào)道分子及新的酶測(cè)定法,它們能用來(lái)檢測(cè)2型甲硫氨酸氨肽酶、二肽基肽酶IV、鈣激活蛋白酶、氨肽酶、HIV蛋白酶、腺病毒蛋白酶、HSV－1蛋白酶、HCMV蛋白酶和HCV蛋白酶的活性。文檔編號(hào)G01N15/14GK1281346SQ98810021公開(kāi)日2001年1月24日申請(qǐng)日期1998年10月9日優(yōu)先權(quán)日1997年10月10日發(fā)明者E·威伯,蔡遂雄,J·F·W·克阿納,J·A·德里威,張漢忠申請(qǐng)人:西托維亞公司