專利名稱：固定化氨基?；饷覆鸱滞庀被嵘a(chǎn)左旋氨基酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生化制品的生產(chǎn)方法，即固定化氨基?；饷覆鸱滞庀被嵘a(chǎn)左旋氨基酸的方法，D,L-N-乙?；被岬闹迫　⒐潭ɑd體及固化方法、D-N-乙?；被嵬庀姆椒?。
氨基酸是指分子中既含有氨基又含有羧基的一類化合物的總稱。它是構(gòu)成生物體蛋白的基本物質(zhì)。隨著現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，氨基酸已廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、生化農(nóng)藥、食品調(diào)味劑及強(qiáng)化營(yíng)養(yǎng)劑、植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑、皮革、日用化妝品、保健等領(lǐng)域，應(yīng)用范圍日益擴(kuò)展。
自然界賦存的氨基酸一般為左旋體，存在于動(dòng)植物體中，是具有生物活性的一類。從以肽鏈形式結(jié)合的多種氨基酸構(gòu)成的生物蛋白中提取左旋氨基酸，一方面組分復(fù)雜，分離純化成單一結(jié)晶的氨基酸，工藝繁長(zhǎng)，收率極低；另一方面，環(huán)境污染十分嚴(yán)重，因而為現(xiàn)代社會(huì)逐步淘汰。
人工合成氨基酸，產(chǎn)量大，收率高，但除甘氨酸外，均為左旋體與右旋體的混合物。右旋體氨基酸往往對(duì)生物機(jī)能產(chǎn)生毒副作用或不具備生物活性，所以，對(duì)人工合成的氨基酸往往要進(jìn)行左、右旋體的拆分，以達(dá)到一定的光學(xué)純度。
左、右旋體氨基酸由于空間結(jié)構(gòu)的不同，使平面偏振光發(fā)生相同角度、不同方向的偏轉(zhuǎn)，表現(xiàn)出各異的生物性能，但由于分子結(jié)構(gòu)一樣，故而其物理性質(zhì)沒有明顯的差異，而化學(xué)性質(zhì)完全一樣，分離左、右旋體十分困難。
本發(fā)明的目的是提供一種固定化氨基?；饷父咝Р鸱滞庀被嵘a(chǎn)左旋氨基酸的方法。
本發(fā)明的原理是1、D,L-N-乙酰基氨基酸的制取 2、D,L-N-乙酰基氨基酸酶拆分 CO2-CO2-OH3N-C-H++H-C-N-C-CH3RR HL-氨基酸D-N-乙?；被?、D-N-乙?；被嵬庀?本發(fā)明推出的固定化氨基?；饷覆鸱滞庀被岬姆椒ú襟E如下(1)弱酸性陰離子交換樹脂經(jīng)平衡后，裝柱。將氨基?；饷?市售品)制成1000～1500μ/ml水溶酶，在42～45℃以0.01～0.05mL/min·g載體的流速勻速通過載體柱，進(jìn)行酶的固定化。當(dāng)固定化酶活力達(dá)到500～700μ/g載體時(shí)，固酶完畢。然后用0.15M醋酸鈉溶液洗滌。
(2)將D,L-N-乙?；被崤涑?～10％(w/w)水溶液，用Na2CO3或NH3·H2O調(diào)整溶液PH為6.5～10.0。
(3)將D,L-N-乙?；被岬孜锶芤涸?2～45℃保溫狀態(tài)下，以0.01～0.05mL/min·g載體的流速勻速通過酶柱，進(jìn)行拆分。
(4)拆分液在60～70℃真空減壓濃縮至原體積的1/2～1/4，冷卻至0～5℃，攪拌結(jié)晶，分離后經(jīng)乙醇或甲醇洗滌，干燥得左旋氨基酸。
(5)調(diào)整結(jié)晶母液PH1.0～5.0，攪拌升溫后用硫酸或鹽酸調(diào)整PH1.5～5.0，靜置冷卻結(jié)晶，分離干燥得D-N-乙?；被?。
(6)將D-N-乙?；被嵊?.5～3重量份水溶解，加入其理論用量1～3倍乙酸酐，升溫至60～70℃，攪拌3-5小時(shí)，然后冷卻至0～5℃，結(jié)晶≥5小時(shí)，離心脫水后，在40～100℃干燥，得D,L-N-乙?；被?。
本方法中涉及的D,L-N-乙酰基氨基酸是按如下步驟制取的。
取一重量份的D,L-氨基酸，投入搪瓷反應(yīng)釜中，加入1-5重量份水，在攪拌狀態(tài)下，滴加其理論用量1.5～2.0倍的醋酐，控制合成溫度為25～50℃，滴加完畢后，在25～50℃保溫?cái)嚢?～10小時(shí)，置于搪玻璃結(jié)晶釜中，冷卻至0～5℃，加入結(jié)晶促進(jìn)劑，攪拌結(jié)晶≥5小時(shí)，離心分離，得D,L-N-乙?；被帷?br> 本發(fā)明所涉及的固定化載體及固化方法如下(1)固定化酶載體采用弱酸性陰離子交換樹脂。
(2)將一重量份的樹脂浸泡于3重量份0.2N NaoH溶液中，靜置30小時(shí)，然后用去離子水漂洗至PH7～8，再浸泡于3重量份0.2N鹽酸溶液中，靜置30小時(shí)，然后用去離子水漂洗至PH5～6。
(3)將經(jīng)上述處理的樹脂裝柱，恒溫至43±1℃；將氨基?；饷负銣刂?3土1℃，以0.01～0.05mL/min·g載體的流速勻速從載體柱底部向上通過；用43土1℃的去離子水通過酶柱，此時(shí)固定酶活力達(dá)到500～700μ/g載體，在43±1℃恒溫備用。
本發(fā)明所涉及的D-N-乙?；被嵬庀前慈缦虏襟E進(jìn)行的(1)將D-N-乙酰基氨基酸在40～80℃條件下常壓干燥其水份≤3％。
(2)將一重量份經(jīng)干燥后的D-N-乙?；被嵬度胩虏ＡХ磻?yīng)釜中，加入1.5～3倍重量份的水溶解。
(3)加入其理論用量1～3倍乙酸酐，升溫至60～70℃，攪拌3～5小時(shí)。
(4)在攪拌狀態(tài)下，冷卻至0～5℃，結(jié)晶≥5小時(shí)。
(5)離心脫水，然后在40～100℃干燥，得D,L-N-乙?；被帷?br> 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是載體便宜，容量大，固定化酶活力高達(dá)500～700μ/g載體·h，半衰期長(zhǎng)達(dá)240天，固定化酶再生容易；運(yùn)用本發(fā)明可拆分一切α-氨基酸，如丙氨酸、精氨酸、天冬氨酸、胱氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、色氨酸、酪氨酸，纈氨酸等α-氨基酸。同時(shí)，運(yùn)用本發(fā)明生產(chǎn)左旋氨基酸可以簡(jiǎn)化反應(yīng)產(chǎn)物的提純步驟，而且收率也比可溶性自由酶高；生產(chǎn)過程中酶的成本大大下降；應(yīng)用本發(fā)明生產(chǎn)過程可以實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化控制節(jié)省勞力；利用固定化氨基?；饷高B續(xù)生產(chǎn)的總成本約是利用水溶性酶的分批拆分方法的80％。
實(shí)施例1D,L-乙?；z氨酸的合成將100kgD,L-乙?；z氨酸投入到搪玻璃反應(yīng)釜中，加入100kg水，攪拌、保溫至60℃，滴加130kg醋酐，保持合成液溫度為60±5℃，滴加完畢，在60℃保溫?cái)嚢?小時(shí)，再置于搪玻璃結(jié)晶釜中，冷卻至0～5℃，加入結(jié)晶促進(jìn)劑，靜置結(jié)晶8小時(shí)，離心分離，干燥，得D,L-乙?；z氨酸133kg，收率90％。
實(shí)施例2D,L-乙酰基蛋氨酸的合成將100kgD,L-蛋氨酸投入到搪玻璃反應(yīng)釜中，加入250kg水，攪拌，在60℃滴加95kg醋酐，滴加完畢，在65℃保溫?cái)嚢?小時(shí)。再置于搪玻璃結(jié)晶釜中，冷卻至0～5℃，加入結(jié)晶促進(jìn)劑，靜置結(jié)晶8小時(shí)，離心分離，干燥，得D,L-乙酰基蛋氨酸122kg，收率95％。
實(shí)施例3D,L-乙?；彼岬暮铣蓪?00kgD,L-精氨酸投入到搪玻璃反應(yīng)釜中，加入100kg水，攪拌至全溶，在60℃滴加85kg醋酐，滴加完畢，在65℃保溫?cái)嚢?0小時(shí)，再置于搪玻璃結(jié)晶釜中，冷卻至0～5℃，加入結(jié)晶促進(jìn)劑，靜置6～8小時(shí)，離心分離，干燥，得D,L-乙?；彼?15kg，收率93％。
實(shí)施例4固定化氨基酰化水解酶的制備取10kg弱酸性陰離子交換樹脂，置于50L容器中，加入0.2N NaoH溶液30L，浸泡30小時(shí)，然后用去離子水漂洗至PH7～8，加入30L0.2N鹽酸溶液，浸泡30小時(shí)，用去離子水漂洗至PH6.0。
將經(jīng)上述處理的樹脂裝入直徑140m/m，高800m/m的夾層玻璃柱中，恒溫至43±1℃。
將氨基?；饷钢瞥?000～1500μ/mL酶液，恒溫至43±1℃，以500mL/min的流速勻速從載體柱底部向上通過，然后用43±1℃50升0.2N醋酸鈉溶液和50升去離子水通過酶柱，此時(shí)，固定化酶活力達(dá)到580μ/g，載體在43±1℃恒溫備用。
實(shí)施例5固定化氨基?；饷覆鸱諨,L-N-乙?；z氨酸生產(chǎn)L-絲氨酸將130kgD,L-乙酰基絲氨酸溶解于1800L水中，用Na2CO3調(diào)整PH8.0，恒溫至43±1℃，將恒溫液以125L/h流速從固定化酶柱勻速通過，流出液置于真空濃縮蒸發(fā)器中，在-0.07MPa、65℃下濃縮至原體積的30％，將濃縮料投入搪玻璃結(jié)晶釜中，于0～5℃冷卻結(jié)晶8小時(shí)，離心分離，結(jié)晶體用50升乙醇浸洗，離心，在100±5℃下干燥4小時(shí)，得L-絲氨酸產(chǎn)品44kg，收率95％。
結(jié)晶母液用20％濃度鹽酸調(diào)PH1.5，在搪玻璃結(jié)晶釜中，0～5℃冷卻結(jié)晶15小時(shí)，離心分離，干燥得D-乙?；z氨酸61kg，收率94％。
將經(jīng)干燥的D-N-乙?；z氨酸60kg，投入搪玻璃反應(yīng)釜中，加入120kg水和100kg乙酸酐，升溫至60℃，攪拌5小時(shí)后，冷卻至0～5℃，結(jié)晶8小時(shí)，離心脫水，在70℃干燥4小時(shí)，得D,L-N-乙?；z氨酸55kg，收率91.7％，轉(zhuǎn)入固定化酶拆分。
實(shí)施例6固定化氨基?；饷覆鸱諨,L-N-乙?；鞍彼嵘a(chǎn)L-蛋氨酸將120kgD,L-乙?；鞍彼崛芙庥?200L水中，用NH4OH調(diào)整PH9.2，恒溫至43±1℃，將恒溫液以100L/h流速從固定化酶柱勻速通過，流出液置于真空濃縮蒸發(fā)器中，在-0.065MPa、60℃下濃縮至原體積的35％，將濃縮料投入搪玻璃結(jié)晶釜中，于0～5℃冷卻結(jié)晶8小時(shí)，離心分離，結(jié)晶體用70升甲醇浸洗，離心，在100±5℃干燥6小時(shí)，得L-蛋氨酸產(chǎn)品45kg，收率96％。
結(jié)晶母液用20％濃度鹽酸調(diào)PH1.8，在搪玻璃結(jié)晶釜中，0～5℃冷卻結(jié)晶15小時(shí)，離心分離，50℃±5℃干燥8小時(shí)得D-乙?；鞍彼?8kg，收率97％。
將經(jīng)干燥的D-乙?；鞍彼?8kg，投入到搪玻璃反應(yīng)釜中，加入130kg水及100kg乙酸酐，升溫至65℃，攪拌8小時(shí)，然后冷卻0～5℃，結(jié)晶12小時(shí)，離心脫水，在60℃干燥4小時(shí)，得D,L-N-乙酰基蛋氨酸54kg，收率92％，轉(zhuǎn)入固定化酶拆分。
實(shí)施例7固定化氨基?；饷覆鸱諨,L-N-乙酰基精氨酸生產(chǎn)L-精氨酸將110kgD,L-乙?；彼崛芙庥?000升水中，用NH4OH調(diào)整PH9.5，恒溫至43±1℃，將恒溫液以100L/h流速從固定化酶柱中勻速通過，流出液置于真空濃縮蒸發(fā)器中，在-0.07MPa、60℃下濃縮至原體積的25％，將濃縮料投入搪玻璃結(jié)晶釜中，于0～5℃冷卻結(jié)晶8小時(shí)，離心分離，結(jié)晶體用80升甲醇浸洗，離心，在95±5℃干燥5小時(shí)，得L-精氨酸產(chǎn)品42.5kg，收率96％。
結(jié)晶母液用20％濃度鹽酸調(diào)PH2.0，在搪玻璃結(jié)晶釜中，0～5℃冷卻結(jié)晶12小時(shí)，離心分離，60℃±5℃干燥10小時(shí)，得D-乙?；彼?2kg，收率94％。
將經(jīng)干燥的D-乙酰基精氨酸52kg投入到搪玻璃反應(yīng)釜中，加入100kg水及100kg乙酸酐，升溫至60℃，攪拌6小時(shí)，然后冷卻至0～5℃，結(jié)晶10小時(shí)，離心脫水，在60℃干燥6小時(shí)，得D,L-N-乙?；彼?8kg，收率92％，轉(zhuǎn)入固定化酶拆分。
權(quán)利要求
1.一種固定化氨基?；饷覆鸱滞庀被岬姆椒?，其特征是(1)弱酸性陰離子交換樹脂經(jīng)平衡后，裝柱，將氨基?；饷?市售品)制成1000～1500μ/ml水溶酶在42～45℃以0.01～0.05mL/min·g載體的流速勻速通過載體柱，進(jìn)行酶的固定化，當(dāng)固定化酶活力達(dá)到500～700μ/g載體時(shí)，固酶完畢。(2)將D,L-N-乙?；被崤涑?～10％(w/w)水溶液，用Na2CO3或NH3·H2O調(diào)整溶液PH為6.5～10.0。(3)將D,L-N-乙酰基氨基酸水溶液在42～45℃保溫狀態(tài)下，以0.01～0.05ml/min·g載體的流速勻速通過酶柱，進(jìn)行拆分。(4)拆分液在60～70℃真空減壓濃縮至原體積的1/2～1/4冷卻至0～5℃，攪拌結(jié)晶，分離后經(jīng)乙醇或甲醇洗滌，干燥得左旋氨基酸。(5)調(diào)整結(jié)晶母液PH1.0～5.0，攪拌，結(jié)晶，分離，干燥，得D-N-乙?；被?。(6)將D-N-乙?；被嶂频肈,L-N-乙?；被帷?br> 2.如權(quán)利要求1所速，制備固定化氨基酰化水解酶的方法，其特征是采用弱酸性陰離子交換樹脂作為固酶載體。
3.如權(quán)利要求1所述，制備固定化氨基?；饷傅姆椒?，其特征是使用氨基?；饷?，并配成活力為1000～1500μ/mL酶液，用Na2CO3或NH3·H2O調(diào)整PH6.5～10.0，在42～45℃，以0.01～0.05mL/min.g載體勻速流過酶柱。
4.如權(quán)利要求1所述，制備固定化氨基酰化水解酶的方法，其特征是當(dāng)酶被載體固定化后，用0.1～0.2M醋酸鈉溶液進(jìn)行洗滌。
5.如權(quán)利要求1所述，其特征是底物濃度為5～15％(w/w)，并用Na2CO3或NH4OH調(diào)整PH6.5～10.0。
6.如權(quán)利要求1所述，其特征是拆分溫度控制在42～45℃，底物按0.01～0.05mL/min·g載體勻速通過固定化氨基酰化水解酶柱。
7.如權(quán)利要求1所速，其特征是拆分液在真空狀態(tài)下，60～70℃進(jìn)行減壓濃縮，濃縮比控制在2～4∶1。
8.如權(quán)利要求1所述的D,L-N-乙?；被岬闹迫〔襟E，特征在于取一重量分D,L-氨基酸，置于搪玻璃反應(yīng)釜中，加入1～5份水，在攪拌狀態(tài)下，滴加其理論用量1.5～2.0倍的醋酐，控制合成溫度為25～50℃，滴加完畢后，在25～50℃保溫?cái)嚢?～10小時(shí)，置于搪玻璃結(jié)晶釜中，冷卻至0～5℃，加入結(jié)晶促進(jìn)劑，攪拌結(jié)晶≥5小時(shí)，離心分離，得D,L-N-乙?；被帷?br> 9.權(quán)利要求1所述的D-N-乙?；被岬幕厥辗椒?，特征在于(1)將離心分離出L-氨基酸的結(jié)晶母液投入搪玻璃反應(yīng)釜中，用10～20％濃度硫酸或25～30％濃度鹽酸調(diào)整PH1.5～5，升濕至45±5℃。(2)將上速溶液置于搪玻璃結(jié)晶釜中，冷卻靜置結(jié)晶，結(jié)晶溫度0～5℃，結(jié)晶時(shí)間≥5小時(shí)。(3)用離心機(jī)離心分離，40～100℃干燥，得D-N-乙?；被帷?br> 10.權(quán)利要求1所述的D-N-乙?；被嵬庀?，其特征是接如下步驟進(jìn)行的(1)將D-N-乙酰基氨基酸在40～100℃條件下常壓干燥其水份≤3％。(2)將一重量份D-N-乙?；被嵊?.5～3重量份水溶解，加入其理論用量1～3倍乙酸酐，升溫至60～70℃，攪拌3～5小時(shí)，然后冷卻至0～5℃，結(jié)晶≥5小時(shí)，離心脫水后，在40～100℃，干燥，得D,L-N-乙?；被帷?br> 全文摘要
一種固定化氨基?；饷覆鸱滞庀被嵘a(chǎn)左旋氨基酸的方法。該方法先將自由狀態(tài)的氨基?；饷附?jīng)弱酸性陰離子交換樹脂固定后,制成固定化酶柱,另將外消旋氨基酸用醋酐N－乙酰化后制成D,L－N－乙?；被?并配制成5～15%(w/w)水溶液,在42～45℃,以0.01～0.05mL/min·g載體的流速勻速通過固定化酶柱,進(jìn)行酶法拆分。拆分液經(jīng)真空濃縮,冷卻結(jié)晶,分離得左旋氨基酸和D－N－乙?；被?。D－N－乙酰基氨基酸經(jīng)冰乙酸外消旋后,制成D,L－N－乙?；被?按拆分參數(shù)通過固定化酶柱,進(jìn)行拆分。如此循環(huán),制得左旋氨基酸。
文檔編號(hào)C12P13/00GK1306092SQ0011323
公開日2001年8月1日 申請(qǐng)日期2000年1月18日 優(yōu)先權(quán)日2000年1月18日
發(fā)明者覃業(yè)亞 申請(qǐng)人:覃業(yè)亞