一種百合種球綜合性脫毒方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于在播種或種植前測試或處理種子的方法，具體涉及一種百合種球脫毒的方法。
【背景技術】
[0002]東方百合是百合雜種類中花朵最大而又最美麗的一大類，能散發(fā)出怡人的香味，故又稱之為香水百合，深受人們的喜愛，是世界上廣泛栽培的一大類百合雜種系。百合主要靠扦插繁殖和分球繁殖等方式繁殖，但長期的無性繁殖使病毒在體內積累，引發(fā)各種病毒病，嚴重影響種球和切花的產品品質，近年來，隨著我國百合引種數量和種植面積的迅速增力口，以及不規(guī)范的種球自繁，病毒病開始在我國各百合種植區(qū)發(fā)生流行，病毒病一般發(fā)病率在40?60%，二代種球帶毒率有的達到90%以上，嚴重地制約了我國百合產業(yè)的提質增效。
[0003]目前，國內外有關百合的脫毒處理主要是單獨采用熱處理脫毒、莖尖培養(yǎng)脫毒和愈傷組織脫毒及相互間的組合脫毒，這些方法單獨使用時效率低，脫毒效果差，其普遍采用較好的是莖尖培養(yǎng)脫毒法，其常規(guī)的步驟是；通過植物頂端分生組織切取0.2?0.3mm莖尖，誘導愈傷組織，然后從愈傷組織分化產生鱗莖芽，長成小植株得到脫毒苗。例如，專利號為200410079613.2的中國專利公開了一種“東方百合脫毒小籽球的瓶內生成方法”，是米用莖尖作為外植體，經滅菌，誘導培養(yǎng)后獲得東方百合脫毒鱗莖；該脫毒組織培養(yǎng)法存在的
問題是:切取很小的莖尖分生組織，在添加6-BA 1.0?2.0 mg / L和NAA 0.2?0.6mg / L的MS基本培養(yǎng)基上培養(yǎng)20?26d，莖尖會同時形成愈傷組織和不定芽，但從愈傷組織分化的不定芽易發(fā)生遺傳變異；且未對病毒進行進一步的檢測和監(jiān)控，難于了解脫毒情況。
[0004]也有如專利號為200910091972.6的中國專利公開了 “一種百合種球病毒的脫除方法”，是采用暗培養(yǎng)，對無性繁殖系的組培苗兩次剝取莖尖進行消毒并脫毒，莖尖的脫毒方式為莖尖熱處理結合化學藥劑脫毒，變溫處理種球球芯3?6周，溫度范圍為26?38°C，同時用病毒唑脫毒，濃度為6?7mg/ml，莖尖大小為0.4?1.2mm。該方法是對組培苗進行脫毒，組培苗需在無菌條件下獲取，獲取環(huán)境要求嚴格。

【發(fā)明內容】

[0005]本發(fā)明目的是提供一種綜合運用熱處理脫毒、莖尖培養(yǎng)脫毒和愈傷組織脫毒的百合種球綜合性脫毒方法，該方法能有效減少病毒交叉感染的機會，脫毒率高，成活率高，能有效縮短種球培養(yǎng)周期。
[0006]本發(fā)明通過以下技術方案實現:百合種球綜合性脫毒方法，包括以下步驟:
A、外植體生長點的剝取:選優(yōu)質種球，用濃度為20?40%的多菌靈600倍溶液浸泡30分鐘；將消過毒的泥炭用水拌濕，使其含水量為46?66%，備用；再將多菌靈浸泡后的種球種在拌濕的泥炭中，每箱下種20?26個種球，澆定根水，然后將泡過種球的多菌靈溶液灑在表面；按切花種植方法正常管理，保持泥炭46?66%的水分；在溫度為21?23°C，濕度為70?80%，光照強度1600?2000Lx，光照時間8?12h/d的條件下，經過6?7天后，芽長到6?6cm時進行熱處理脫毒。
[0007]B、熱處理脫毒:將溫度控制在36?38°C之間，濕度為70?86%，光照強度1600Lx，光照時間8?12h/d的環(huán)境條件下，經過7?16天培養(yǎng)，芽長高并綻開成蓮座狀。
[0008]C、外植體清洗消毒:①用清水沖洗后，剝去部分葉片，用中性肥皂水洗6分鐘，用紗布包好，清水沖洗12小時；②用濃度為0.1%的升汞浸泡8分鐘；③再用濃度為76%的酒精浸泡8?16秒；④吐溫80無菌水浸泡2?3分鐘；⑤再用無菌水洗6?7遍至無泡沫。
[0009]D、生長點采集誘導培養(yǎng):采集長度為0.3?0.6 mm的百合莖尖生長點接種到誘導培養(yǎng)基中培養(yǎng)，溫度21?23°C，光照強度1600?3000Lx，光照時間8?12h/d，培養(yǎng)40?60天后，生長點膨大成直徑2?3cm的葉叢。
[0010]其中，誘導培養(yǎng)基為:1/ 2MS+BA2.6 ?6mg/L+ ΝΑΑ0.26 mg/L+ 糖 40g/l+ 瓊脂 6.6g/L。
[0011]E、脫毒培養(yǎng):將誘導出的葉叢切成0.6cm小塊，接種于脫毒培養(yǎng)基中，脫毒培養(yǎng)基為:MS+ NAA0.2mg/L+ 0.4%糖+活性炭0.6%+病毒唑6 mg/L+瓊脂6.0 g/L，在溫度為21?23°C，光照時間為8?12h/d，光照強度為2000?3000Lx的環(huán)境條件下，經過40?60天培養(yǎng),形成帶球的瓶苗。
[0012]其中,病毒唑的添加方法如下:
a.用無菌蒸懼水配制好濃度為0.2mg/ml的病毒唑母液。
[0013].將無菌注射器的針頭換成直徑小于0.2納米的濾篩，用帶濾篩的無菌注射器吸取病毒唑母液。
[0014]c.將高溫滅菌后的培養(yǎng)基:MS+ NAA0.2mg/L+ 0.4%糖+活性炭0.6%+瓊脂
6.0g/L，冷至36?40°C時，吸取病毒唑母液，按6mg/L用量添加后搖勻，分裝入無菌瓶中，待冷卻凝固后用于藥物脫毒接種。
[0015]F、病毒檢測:將瓶苗采用RT-PCR檢測法檢測，經檢測確認無任何病蟲害現象，并不帶百合無癥病毒、黃瓜花葉病毒和百合斑駁病毒病毒，即為百合脫毒種苗。
[0016]優(yōu)選的，步驟A是用濃度為40%的多菌靈600倍溶液浸泡種球30分鐘。
[0017]步驟D是采集長度為0.3?0.4 _的百合莖尖生長點接種到誘導培養(yǎng)基中培養(yǎng)。
[0018]有益效果
①本發(fā)明采用綜合脫毒技術，即將熱處理、抗病毒藥劑和莖尖培養(yǎng)相結合的方法，有效解決了單獨使用一種方法存在的不足，縮短了培養(yǎng)周期，減少病毒交叉感染，植株成活率高，脫毒率明顯提高，百合脫毒率達到80%以上，脫毒率較只采用高溫處理提高了 26?70%。
[0019]②本發(fā)明的脫毒方法，采用了 36?38°C的高溫，在該高溫下病毒出現鈍化，其復制明顯減弱或不再繁殖，該期間生產的嫩梢?guī)Р《据^少，且該溫度能保證植株的成活率。
[0020]③本發(fā)明脫毒培養(yǎng)基內添加病毒唑的方法能使脫毒更徹底。
[0021]④熱處理后剝取0.3?0.6 mm的莖尖生長點進行培養(yǎng)，此操作簡單，易于操作，脫毒效果好。
具體實施例
[0022]實施例1:百合種球綜合性脫毒方法，包括以下步驟:
A、外植體生長點的剝取:選優(yōu)質種球，用濃度為20%的多菌靈600倍溶液浸泡30分鐘；將消過毒的泥炭用水拌濕，使其含水量為46%，備用；再將多菌靈浸泡后的種球種在拌濕的泥炭中，每箱下種20個種球，澆定根水，然后將泡過種球的多菌靈溶液灑在表面；按切花種植方法正常管理，保持泥炭46%的水分；在溫度為21°C，濕度為70%，光照強度1600LX，光照時間8h/d的條件下，經過6?7天后，芽長到6cm時進行熱處理脫毒。
[0023]B、熱處理脫毒:將溫度控制在36°C之間，濕度為70%，光照強度1600Lx，光照時間8h/d的環(huán)境條件下，經過7?16天培養(yǎng)，芽長高并綻開成蓮座狀。
[0024]C、外植體清洗消毒:①用清水沖洗后，剝去部分葉片，用中性肥皂水洗6分鐘，用紗布包好,清水沖洗12小時；②用濃度為0.1%的升汞浸泡8分鐘；③再用濃度為76%的酒精浸泡8秒；④吐溫80無菌水浸泡2分鐘；?再用無菌水洗6遍至無泡沫。
[0025]D、生長點采集誘導培養(yǎng):采集長度為0.3 mm的百合莖尖生長點接種到誘導培養(yǎng)基中培養(yǎng)，溫度21°C，光照強度1600Lx，光照時間8h/d，培養(yǎng)40?60天后，生長點膨大成直徑2cm的葉叢。
[0026]E、脫毒培養(yǎng):將誘導出的葉叢切成0.6cm小塊，接種于脫毒培養(yǎng)基中，在溫度為21°C,光照時間為8h/d，光照強度為2000LX的環(huán)境條件下，經過40?60天培養(yǎng)，形成帶球的瓶苗。
[0027]F、病毒檢測:將瓶苗采用RT-PCR檢測法檢測，經檢測確認無任何病蟲害現象，并不帶百合無癥病毒、黃瓜花葉病毒和百合斑駁病毒等病毒，即為百合脫毒種苗。
[0028]實施例2:百合種球綜合性脫毒方法，包括以下步驟:
A、外植體生長點的