一種提高對(duì)葉百部組培苗生根率的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及植物組織培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，具體而言，設(shè)及一種提高對(duì)葉百部組培苗生 根率的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 對(duì)葉百部（StemonatuberosaLour.)主產(chǎn)于廣西、湖南、貴州等省，為《中華人民 共和國(guó)藥典》(2005、2010年版）所收載。具有歸肺經(jīng)，性微溫，味甘、苦，具有潤(rùn)肺下氣止咳、 殺蟲(chóng)滅風(fēng)等效果，用于新久咳嗽、肺瘦咳嗽和百日咳；外用于頭風(fēng)、體風(fēng)、曉蟲(chóng)病和陰癢等。 國(guó)內(nèi)已有140家制藥企業(yè)將其制成顆粒劑、片劑、膏劑、糖漿劑銷往全國(guó)內(nèi)服、外用，多個(gè)產(chǎn) 品已成為國(guó)內(nèi)外知名品牌，生產(chǎn)企業(yè)也成為當(dāng)?shù)氐慕?jīng)濟(jì)支柱之一。
[0003] 百部是中國(guó)傳統(tǒng)成方制劑的常用藥材，每年還大量出口到港、澳、臺(tái)、韓國(guó)、日本。 有二十多個(gè)企業(yè)進(jìn)行百部生物總堿的提取，制作洗發(fā)水、沐浴液等日用化工產(chǎn)品，制作殺 蟲(chóng)、滅菌生物農(nóng)藥。市場(chǎng)調(diào)查顯示，全國(guó)醫(yī)藥、農(nóng)藥、日化、出口等行業(yè)每年使用百部藥材達(dá) 3000噸，并呈逐年增加之勢(shì)。
[0004] 目前，對(duì)葉百部藥材完全依靠采挖野生資源，而對(duì)葉百部在野生狀態(tài)下結(jié)實(shí)性差， 自然繁殖能力弱，生長(zhǎng)緩慢，=年W上才能形成產(chǎn)量，需求明顯大于產(chǎn)出，造成其藥材經(jīng)常 缺貨斷檔。業(yè)內(nèi)人±研究用組織培養(yǎng)解決種苗繁育問(wèn)題，但在生根環(huán)節(jié)一直沒(méi)有取得突破。 因此，提高植物組織培養(yǎng)過(guò)程中對(duì)葉百部的生根率，開(kāi)展人工種植迫在眉睫。
[0005] 有鑒于此，特提出本發(fā)明。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明針對(duì)目前對(duì)葉百部人工栽培用苗緊缺的問(wèn)題，建立對(duì)葉百部組培快速繁殖 體系，尤其是解決對(duì)葉百部組培苗生根難、生根率低的問(wèn)題，為對(duì)葉百部的快速繁殖提供技 術(shù)保證，適合于規(guī)模化生產(chǎn)。
[0007] 為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，特采用W下技術(shù)方案：
[0008] 一種提高對(duì)葉百部組培苗生根率的方法，包括W下步驟：
[0009] (a)、選擇百部頂芽作為外植體，對(duì)所述外植體進(jìn)行無(wú)菌處理；
[0010] 化）、將無(wú)菌處理后的外植體切取莖尖，得到的莖尖轉(zhuǎn)入誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)28-35d， 得到無(wú)菌苗；
[0011](C)、將所述無(wú)菌苗切割為1. 0~1. 5cm的帶芽莖段，接種于增殖培養(yǎng)基，誘導(dǎo)叢生 芽，培養(yǎng)時(shí)間為18-25山得到無(wú)菌芽； 陽(yáng)01引 （d)、將所述無(wú)菌芽切成帶芽莖段，接種于生根培養(yǎng)基，所述生根培養(yǎng)基為：1/2濃 度的改良MS培養(yǎng)基中含有NAA1. 5~2. 5mg/l、IBA0. 5~3. 〇111邑/1、氯化膽堿0~1. 5g/ L薦糖30~40g/l、瓊脂5~7. 4g/L;
[0013] (e)、所述生根培養(yǎng)基中的帶芽莖段長(zhǎng)出新芽、新根，即得到生根苗，將所述生根苗 于常溫下遮陰處煉苗處理，然后移栽到草炭或黃屯、±基質(zhì)中；
[0014] 所述改良MS培養(yǎng)基是將MS培養(yǎng)基中的畑4NO3改為800 +lOmg/L、KH2P04改為 340 ±lOmg/l，無(wú)水化Clz改為330 ± 2mg/L，其余成分含量不變。
[0015] 本發(fā)明提供的一種提高對(duì)葉百部組培苗生根率的方法，W莖尖作為誘導(dǎo)材料，能 減少種苗帶病毒的幾率；在增殖階段誘導(dǎo)叢生芽，提高了增殖倍數(shù)；生根培養(yǎng)基中選擇性 添加NAA、IBA、氯化膽堿，提高對(duì)葉百部組培苗的生根率，生根率可達(dá)95 %;生根苗經(jīng)過(guò)煉苗 后移栽到草炭或黃屯、上基質(zhì)中移栽，提高成活率，成活率可達(dá)99 %，并且整個(gè)過(guò)程提高對(duì)葉 百部組培苗生根率穩(wěn)定性好，有效解決了對(duì)葉百部組培苗難于生根和生根率低的難題，降 低了生產(chǎn)成本，為實(shí)現(xiàn)規(guī)模化生產(chǎn)和種質(zhì)資源的保護(hù)提供了條件。
[0016] 本發(fā)明對(duì)MS培養(yǎng)基進(jìn)行了改良，MS培養(yǎng)基W及改良MS培養(yǎng)基具體成分含量如表 1所示。
[0017] 表1MS培養(yǎng)基W及改良MS培養(yǎng)基具體成分
[0020] 為了進(jìn)一步減少種苗帶病毒的幾率，優(yōu)選地，在步驟（a)中，選擇無(wú)病害、健壯的 百部頂芽作為外植體，W易于后續(xù)培養(yǎng)。
[0021] 優(yōu)選地，在步驟（a)中，所述無(wú)菌處理為：
[0022] 將所述外植體用無(wú)菌水沖洗后，放在超凈工作臺(tái)上，用70% -75%的酒精浸泡 30~40s，再用0. 1 %~0. 2%的升隸溶液處理6~14min，無(wú)菌水清洗4~6次。
[0023] 經(jīng)過(guò)該無(wú)菌處理后得到的外植體無(wú)菌，利于后續(xù)的培養(yǎng)。
[0024] 優(yōu)選地，在步驟化）中，所述莖尖的長(zhǎng)度為0. 15-0. 30mm。m亥長(zhǎng)度的莖尖進(jìn)行培 養(yǎng)，易于誘導(dǎo)叢生芽，誘導(dǎo)培養(yǎng)過(guò)程中，莖尖接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基表面。
[00巧]為了提高誘導(dǎo)的效果，優(yōu)選地，在步驟化）中，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基的成分為： 陽(yáng)〇%] 改良MS培養(yǎng)基中含有NAA0. 2~0. 5mg/l、BA0~1.Omg/l、薦糖30~40邑/1、瓊 脂 5 ~7. 4g/L。
[0027] 更優(yōu)選地，在步驟化）中，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基的成分為：
[0028] 改良MS培養(yǎng)基中含有NAA0. 4 ~0. 5mg/l、BA0. 9 ~1.Omg/l、薦糖 30 ~32g/L、 瓊脂5~5. 5g/L。
[0029] 為了達(dá)到更好的增殖效果，優(yōu)選地，在步驟（C)中，所述增殖培養(yǎng)基成分為：改良 MS培養(yǎng)基中含有 6-BA1. 0 ~2.Omg/l、KT0 ~1.Omg/l、NAA0 ~1. 2mg/l、薦糖 30 ~40g/ L瓊脂 5. 0 ~7. 4g/L。
[0030] 更優(yōu)選地，在步驟（C)中，所述增殖培養(yǎng)基成分為：改良MS培養(yǎng)基中含有6-BA 1. 8 ~2.Omg/l、KT0. 8 ~1.Omg/l、NAA0. 2 ~0. 3mg/l、薦糖 38 ~40g/l、瓊脂 5. 5 ~ 6.Og/Lo
[003U生根培養(yǎng)基中選擇性添加NM、IBA、氯化膽堿，W提高對(duì)葉百部組培苗的生根率。 優(yōu)選地，在步驟（d)中，所述生根培養(yǎng)基為：1/2濃度的改良MS培養(yǎng)基中含有NAA2. 3~ 2. 5mg/L、IBA1. 0 ~1. 2111邑/1、氯化膽堿 0. 9 ~1.Og/L、薦糖 38 ~40g/l、瓊脂 5. 0 ~5. 5g/ L。
[0032] 為了進(jìn)一步提高生根率，優(yōu)選地，在步驟（d)中，所述生根培養(yǎng)基前期在IOOlx弱 光下培養(yǎng)5~7山再進(jìn)行光照培養(yǎng)。
[0033] 為了給組培苗的生長(zhǎng)提供更適宜的生長(zhǎng)條件，優(yōu)選地，步驟化）~（d)中的培養(yǎng)基 的抑值均為5. 8~6.0,培養(yǎng)溫度為23°C~27°C，光照時(shí)間為10~14小時(shí)/天，光照強(qiáng)度 為1400-20001X。
[0034] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為：
[0035] (1)本發(fā)明提供的一種提高對(duì)葉百部組培苗生根率的方法，W莖尖作為誘導(dǎo)材料， 能減少種苗帶病毒的幾率；在增殖階段誘導(dǎo)叢生芽，提高了增殖倍數(shù)，增殖倍數(shù)在4. 5倍W 上。
[0036] (2)本發(fā)明提供的一種提高對(duì)葉百部組培苗生根率的方法，生根培養(yǎng)基中添加 NAA、IBA、氯化膽堿，生根培養(yǎng)前期在IOOlx弱光下培養(yǎng)，明顯提高對(duì)葉百部組培苗的生根 率，生根率為95% ;生根苗經(jīng)過(guò)煉苗后移栽到草炭基質(zhì)中移栽成活率為99%，穩(wěn)定性好。
[0037] (3)本發(fā)明有效解決了對(duì)葉百部組培苗難于生根和生根率低的難題，降低了生產(chǎn) 成本，為實(shí)現(xiàn)規(guī)?；a(chǎn)和種質(zhì)資源的保護(hù)提供了條件。
【具體實(shí)施方式】
[0038] 下面將結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的實(shí)施方案進(jìn)行詳細(xì)描述，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì) 理解，下列實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體 條件者，按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為 可W通過(guò)市售獲得的常規(guī)產(chǎn)品。 陽(yáng)〇例實(shí)施例1
[0040] 一種提高對(duì)葉百部組培苗生根率的方法，包括W下步驟：
[0041] (1)外植體的選擇和無(wú)菌預(yù)處理：選擇無(wú)病害、健壯的百部頂芽為外植體，用無(wú) 菌水沖洗，將材料放在超凈工作臺(tái)上，用75%的酒精浸泡30s，再用0. 1 %的升隸溶液處理 8min，無(wú)菌水清洗4次，備用。
[0042] (2)誘導(dǎo)培養(yǎng)：將處理好的外植體切取0. 2mm莖尖，接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基表面，誘導(dǎo) 培養(yǎng)基的成分為：改良MS培養(yǎng)基中含有NAAO. 5mg/l、BAl.Omg/l、薦糖30g/l、瓊脂5g/l，培 養(yǎng)8d后開(kāi)始萌芽，初始生長(zhǎng)較慢，經(jīng)過(guò)30d的誘導(dǎo)培養(yǎng)獲得健壯的無(wú)菌苗，誘導(dǎo)率為95%。
[0043] (3)將步驟（2)中無(wú)菌苗剪切為長(zhǎng)1.Ocm的帶芽莖段接種于增殖培養(yǎng)基，誘導(dǎo)叢 生芽，增殖培養(yǎng)基成分為：改良MS培養(yǎng)基中含有6-BA2.0mg/l、KT1.0mg/l、NAA0. 2mg/l、 薦糖40g/l、瓊脂5. 5g/L。培養(yǎng)周期20d，培養(yǎng)3d后開(kāi)始長(zhǎng)新芽，培養(yǎng)7d后開(kāi)始長(zhǎng)叢生芽。 培養(yǎng)到20d時(shí)，80%的苗能誘導(dǎo)長(zhǎng)叢生芽，增殖倍數(shù)為5倍。
[0044] (4)生根培養(yǎng)：將步驟（3)中的無(wú)菌叢生芽切成帶芽莖段接種于生根培養(yǎng)基：1/2 濃度的改良MS培養(yǎng)基中含有NAA2. 5mg/L、IBA1.〇111旨/1、氯化膽堿1. Og/L、薦糖40旨/1、瓊 脂5g/L。生根培養(yǎng)前期在IOOlx弱光下培養(yǎng)5山再進(jìn)行光照培養(yǎng)。培養(yǎng)周期為40山培養(yǎng) 7d后，可長(zhǎng)出新芽。培養(yǎng)12d后基部膨大，形成根源基。培養(yǎng)40d后可形成發(fā)達(dá)的根系，生 根率達(dá)95%。 W45] 妨移栽：將步驟（4)中根系長(zhǎng)到3cm的生根苗移出組培室，置于常溫下遮陰處煉 苗4山打開(kāi)培養(yǎng)瓶的蓋子2d，然后將組培苗取出，用清水將培養(yǎng)基沖洗干凈，移栽植到草炭 基質(zhì)中。移植后蓋上塑料薄膜保濕，并進(jìn)行遮陰處理，移栽后保持試驗(yàn)基質(zhì)保持濕潤(rùn)且不積 水為宜。移栽3d后可萌發(fā)新的根須，移栽15d后開(kāi)始長(zhǎng)新芽，移栽50d后成活率達(dá)99%。
[0046]步驟（1)~（4)中的培養(yǎng)基的抑值均為5. 8~6.0,培養(yǎng)溫度為24°C~27°C，光 照時(shí)間為10小時(shí)/d,光照強(qiáng)度為20001X。 W47] 實(shí)施例2
[0048] 一種提高對(duì)葉百部組培苗生根率的方法，包括W下步驟： W例 （1)外植體的選擇和無(wú)菌預(yù)處理：選擇無(wú)病害、健壯的百部頂芽為外植體，用無(wú) 菌水沖洗，將材料放在超凈工作臺(tái)上，用75%的酒精浸泡40s，再用0. 2%的升隸溶液處理 6min，無(wú)菌水清洗6次，備用。
[0050] (2)誘導(dǎo)培養(yǎng)：將處理好的外植體切取0. 2mm帶芽莖段，接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基表面， 誘導(dǎo)培養(yǎng)基的成分為：改良MS培養(yǎng)基中含有NAA 0. 5mg/l、BA 0. 5mg/l、薦糖30g/l、瓊脂 5g/l，培養(yǎng)IOd后開(kāi)始萌芽，初始生長(zhǎng)較慢，經(jīng)過(guò)30d的誘導(dǎo)培養(yǎng)獲得健壯的無(wú)菌苗，誘導(dǎo)率 為92%。
[0051] (3)將步驟（2)中無(wú)菌苗切割為長(zhǎng)1. 5cm的帶芽莖段接種