專利名稱：在單端孢菌毒素缺陷的絲狀真菌突變細(xì)胞中生產(chǎn)異源多肽的方法
背景技術(shù)：
發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及在單端孢菌毒素缺陷的絲狀真菌突變細(xì)胞中產(chǎn)生異源多肽的方法。本發(fā)明還涉及所述絲狀真菌細(xì)胞的突變細(xì)胞和獲得這些突變細(xì)胞的方法。本發(fā)明還涉及分離的trichodiene合成酶和分離的編碼trichodiene合成酶的核酸序列。本發(fā)明還涉及包含所述核酸序列的核酸構(gòu)建體、載體和宿主細(xì)胞以及制備trichodiene合成酶的方法。此外本發(fā)明涉及包含無(wú)標(biāo)記修飾的基因的突變細(xì)胞和獲得和使用這種突變細(xì)胞的方法。
相關(guān)工藝描述單端孢菌毒素是以首次分離到該物質(zhì)的真菌粉紅單端孢(Trichothecium roseum)命名的倍半萜環(huán)氧化物。單端孢菌毒素T-2毒素、蛇形菌素，以及脫氧瓜萎鐮菌醇最常見(jiàn)于感染了鐮孢的農(nóng)產(chǎn)品。對(duì)這些化合物的興趣主要基于這一發(fā)現(xiàn)，即食品和飼料污染了單端孢菌毒素對(duì)人和動(dòng)物可能是有害的。
單端孢菌毒素是由trichodiene(產(chǎn)生自酶-trichodiene合成酶催化的反式，反式-法尼焦磷酸環(huán)化)經(jīng)一系列氧合、異構(gòu)化、環(huán)化和酯化反應(yīng)產(chǎn)生的(Desjardins，Hohn和McCormick，1993，微生物綜述57595-604)。
已從擬分枝孢鐮孢(Hohn和Beremand，1989，基因79131-138)、虱狀赤霉(Hohn和Desjardins，1992，分子植物-微生物相互作用5249-256)、玉蜀黍赤霉(Proctor等，1995，分子植物-微生物相互作用4593-601)、露濕漆斑菌(Myrothecium roridin)(Trapp等，1995，細(xì)胞生物化學(xué)雜志增刊19B154)和早熟禾鐮孢(Fekete等，1997，真菌病理學(xué)13891-97)中克隆了Trichodiene合成酶基因(tri5或tox5)。
已經(jīng)制備了虱狀赤霉(Hohn和Desjardins，1992，同前)和玉蜀黍赤霉(Proctor等，1995，同前)的Tri5-突變體，該突變體不產(chǎn)生單端孢菌毒素。
已經(jīng)克隆了單端孢菌毒素生物合成途徑中的其他基因，包括來(lái)自擬分枝孢鐮孢的編碼15-O-乙酰基轉(zhuǎn)移酶的tri3基因(McCormick等，1996，應(yīng)用和環(huán)境微生物學(xué)62353-359)、來(lái)自擬分枝孢鐮孢的編碼細(xì)胞色素P450單加氧酶的tri4基因(Hohn等，1995，分子和普通遺傳學(xué)24895-102)、來(lái)自擬分枝孢鐮孢的編碼一個(gè)參與調(diào)控單端孢菌毒素生物合成的鋅指蛋白的tri6基因(Proctor等，1995，應(yīng)用和環(huán)境微生物學(xué)611923-1930)、來(lái)自擬分枝孢鐮孢的編碼C-15羥基化需要的細(xì)胞色素P450單加氧酶的tri11基因(Alexander等，1997，應(yīng)用和環(huán)境微生物學(xué)64221-225)、來(lái)自擬分枝孢鐮孢的編碼參與形成單端孢菌毒素的一個(gè)表觀轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(apparent transport protein)的tri12基因(Alexander等，1997，谷類研究通訊25347-348)，以及來(lái)自禾本科鐮孢的編碼3-O-乙酰基轉(zhuǎn)移酶的tri101基因(Kimura等，1998，生物化學(xué)雜志2721654-1661)。
本發(fā)明的目的是提供在突變細(xì)胞中制備多肽的方法。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及制備異源多淺的方法，包括(a)在有利于異源多肽產(chǎn)生的條件下培養(yǎng)親本絲狀真菌細(xì)胞的突變細(xì)胞，其中(i)所述突變細(xì)胞包含編碼異源多肽的第一核酸序列以及含有至少一個(gè)參與產(chǎn)生單端孢菌毒素的基因發(fā)生修飾的第二核酸序列和(ii)培養(yǎng)在相同條件下，所述突變細(xì)胞產(chǎn)生的單端孢菌毒素比親本絲狀真菌細(xì)胞少；以及(b)從培養(yǎng)基中分離異源多肽。本發(fā)明還涉及絲狀真菌細(xì)胞的突變細(xì)胞以及獲得所述突變細(xì)胞的方法。
本發(fā)明還涉及分離的trichodiene合成酶和分離的編碼trichodiene合成酶的核酸序列。此外本發(fā)明涉及包含所述核酸序列的核酸構(gòu)建體、載體以及宿主細(xì)胞和制備trichodiene合成酶的方法。
本發(fā)明還涉及獲得突變細(xì)胞的方法，包括(a)向具有編碼第一多肽的第一核酸序列的親本細(xì)胞導(dǎo)入第一核酸構(gòu)建體，該構(gòu)建體包含作為選擇標(biāo)記的硝酸還原酶基因和第一核酸序列的修飾，其中第一構(gòu)建體整合到親本細(xì)胞的基因組，以修飾過(guò)的第一核酸序列取代內(nèi)源的第一核酸序列，使得在相同條件下培養(yǎng)時(shí)，第一多肽的產(chǎn)量較之親本細(xì)胞減少；和(b)選擇來(lái)自步驟(a)的有硝酸還原酶基因并且第一多肽產(chǎn)量減少的突變細(xì)胞。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，獲得突變細(xì)胞的方法可以進(jìn)一步包括(c)在培養(yǎng)條件下選擇來(lái)自步驟(b)的缺失硝酸還原酶基因的突變細(xì)胞。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，獲得突變細(xì)胞的方法可以進(jìn)一步包括(c)向來(lái)自步驟(b)的突變細(xì)胞導(dǎo)入包含第二核酸序列的第二核酸構(gòu)建體，所述第二核酸序列含有被修飾的第一核酸序列的5’和3’區(qū)，但缺少硝酸還原酶基因。其中該第二構(gòu)建體整合到親本細(xì)胞的基因組，以所述第二核酸序列取代被修飾的第一核酸序列；以及(d)在培養(yǎng)條件下挑選來(lái)自步驟(c)的缺失硝酸還原酶基因的突變細(xì)胞。
本發(fā)明還涉及來(lái)自這些方法的突變細(xì)胞以及用這些突變細(xì)胞制備多肽的方法。
附圖簡(jiǎn)述

圖1顯示鐮孢中的單端孢菌毒素生物合成途徑。
圖2A-2E顯示Fusarium venenatum ATCC20334的trichodiene合成酶的基因組核酸序列和推測(cè)的氨基酸序列(分別為SEQ ID NO1和2)。
圖3顯示pDM181的限制酶切圖譜。
圖4顯示pJRoy36的限制酶切圖譜。
圖5顯示pJRoy40的限制酶切圖譜。
圖6顯示pBANe20的限制酶切圖譜。
圖7顯示pLC30的限制酶切圖譜。
圖8顯示pJRoy41的限制酶切圖譜。
圖9顯示缺失tri5基因并去除amdS選擇標(biāo)記的方案。
圖10顯示pJRoy44的限制酶切圖譜。
圖11顯示pJRoy47的限制酶切圖譜。
圖12顯示pLC31b的限制酶切圖譜。
發(fā)明詳述單端孢菌毒素缺陷型突變細(xì)胞本發(fā)明涉及制備異源多肽的方法，包括(a)在有利于異源多肽產(chǎn)生的條件下培養(yǎng)親本絲狀真菌細(xì)胞的突變細(xì)胞，其中(i)所述突變細(xì)胞與親本細(xì)胞相比不同在于，參與單端孢菌毒素產(chǎn)生的1或多個(gè)基因經(jīng)過(guò)例如打斷或缺失等修飾，和(ii)培養(yǎng)在相同條件下，所述突變細(xì)胞產(chǎn)生的單端孢菌毒素比親本細(xì)胞少；以及(b)從突變細(xì)胞的培養(yǎng)基中分離異源多肽。
術(shù)語(yǔ)“單端孢菌毒素”此處定義為一族經(jīng)一系列氧合、異構(gòu)化、環(huán)化和酯化反應(yīng)產(chǎn)生的倍半萜環(huán)氧化物，從而由trichodiene形成更復(fù)雜的單端孢菌毒素。單端孢菌毒素包括，但不限于，2-hydroxytrichodiene、12，13-epoxy-9，10-trichoene-2-ol、isotrichodiol、isotrichotriol、trichotriol、異木霉菌醇、異木霉素、15-decalonectrin、3，15-didecalonectrin、脫氧瓜萎鐮菌醇、3-乙酰脫氧瓜萎鐮菌醇、calonectrin、3，15-diacetoxyscirpenol、3，4，15-triacetoxyscirpenol、4，15-diacetoxyscirpenol、3-acetylneosolaniol、乙?；鵗-2毒素和T-2毒素；以及它們的衍生物。單端孢菌毒素生物合成途徑見(jiàn)圖1(Desjardins，Hohn和McCormick，1993，同前)。
術(shù)語(yǔ)“產(chǎn)生單端孢菌毒素”此處定義為包括參與產(chǎn)生單端孢菌毒素的任何步驟，包括但不限于生物合成、生物合成的調(diào)節(jié)、運(yùn)輸和分泌。
在本發(fā)明的方法中，所述絲狀真菌細(xì)胞可以是野生型細(xì)胞或其突變體。此外，所述絲狀真菌細(xì)胞可以是不產(chǎn)生可檢測(cè)量單端孢菌毒素，但含有編碼單端孢菌毒素基因的細(xì)胞。優(yōu)選地，所述絲狀真菌細(xì)胞是支頂孢屬(Acremonium)，曲霉屬，短梗霉屬，隱球酵母屬，線黑粉菌屬(Filibasidium)，鐮孢屬，赤霉屬，腐質(zhì)霉屬，Magnaporthe，毛霉屬，毀絲霉屬，漆斑菌屬，Neocallimastix，鏈孢霉屬，擬青霉屬，青霉屬，Piromyces，皺褶菌屬，踝節(jié)菌屬(Talaromyces)，熱子囊菌屬(Thermoascus)，梭孢殼屬(Thielavia)，Tolypocladium或者木霉屬細(xì)胞。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述絲狀真菌細(xì)胞是棘孢曲霉、泡盛曲霉、臭曲霉、日本曲霉、構(gòu)巢曲霉、黑曲霉或者米曲霉細(xì)胞。
在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述絲狀真菌細(xì)胞是桿孢狀鐮孢、Fusarium crookwellense(與Fusarium cerealis同物異名)、大刀鐮孢、禾本科鐮孢、禾赤鐮孢、異孢鐮孢、合歡木鐮孢、尖鐮孢、多枝鐮孢、粉紅鐮孢、接骨木鐮孢、膚色鐮孢、腐皮鐮孢、擬分枝孢鐮孢、硫色鐮孢(Fusarium sulphureum)、Fusarium torulosum。Fusariumtrichothecioides或Fusarium venenatum細(xì)胞。
在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述絲狀真菌細(xì)胞是虱狀赤霉、玉蜀黍赤霉、Humicola insolens、Humicola lanuginosa、米赫毛霉(Mucormiehei)、嗜熱毀絲霉(Myceliophthora thermophila)、露濕漆斑菌、粗糙鏈孢霉或產(chǎn)紫青霉細(xì)胞。
在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述絲狀真菌細(xì)胞是Trichodermaharzianum，康寧木霉、Trichoderma longibrachiatum、Trichodermareesei或綠色木霉細(xì)胞。
在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述Fusarium venenatum細(xì)胞是Fusarium venenatum A3/5，該菌原來(lái)以禾本科鐮孢ATCC 20334保藏，最近由Yoder和Christianson(1998，真菌遺傳學(xué)與生物學(xué)2362-80)以及O’Donnell等(1998，真菌遺傳學(xué)與生物學(xué)2357-67)重新分類為Fusarium venenatum；以及Fusarium vanenatum的分類學(xué)上的等同物，無(wú)論它們現(xiàn)在稱為什么種名。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述Fusarium vanenatum細(xì)胞是WO9726330中公開(kāi)的FusariumvenenatumA3/5或Fusarium venenatumATCC 20334的形態(tài)學(xué)突變體。
在本發(fā)明所述方法中，絲狀真菌細(xì)胞中參與產(chǎn)生單端孢菌毒素的任何基因都可以修飾，包括但不限于，tri3、tri4、tri5、tri6、tri11、tri12和/或tri101。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述基因是tri5。在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述基因是具有SEQ ID NO1之核酸序列的Fusarium venenatum tri5基因。
可以通過(guò)利用本領(lǐng)域的已知方法減少或消除此處描述的1或多個(gè)基因的表達(dá)來(lái)構(gòu)建單端孢菌毒素缺陷的絲狀真菌突變細(xì)胞，例如插入、打斷、取代或缺失。待修飾或失活的基因是，例如，編碼區(qū)或活性關(guān)鍵部分，或者所述基因可以含有表達(dá)編碼區(qū)所需要的調(diào)控區(qū)。這類調(diào)控或控制序列的一個(gè)例子可以是啟動(dòng)子序列或其功能部分，即足以影響所述核酸序列表達(dá)的部分。其他可能作修飾的調(diào)控序列包括，但不限于，前導(dǎo)序列、多聚腺苷酸化序列、前肽序列、信號(hào)序列、轉(zhuǎn)錄終止子和轉(zhuǎn)錄激活子。
可以通過(guò)將親本細(xì)胞進(jìn)行誘變并篩選其中該基因的表達(dá)被減少或消除的突變細(xì)胞，從而將所述基因修飾或失活。例如，可以通過(guò)使用合適的物理或化學(xué)誘變劑，使用合適的寡核苷酸或者對(duì)DNA序列進(jìn)行PCR導(dǎo)致的突變來(lái)進(jìn)行特異或隨機(jī)的誘變。此外，可以聯(lián)合使用這些誘變方法來(lái)進(jìn)行誘變。
適用于該目的的物理或化學(xué)誘變劑的例子包括紫外線(UV)輻射、羥胺、N-甲基-N’-硝基-N-亞硝基胍(MNNG)、O-甲基羥胺、亞硝酸、甲烷磺酸乙酯(EMS)、亞硫酸氫鈉、甲酸和核苷酸類似物。
使用這些試劑時(shí)，一般通過(guò)于合適的條件下，在有所選誘變劑的情況下溫育待突變的親本細(xì)胞，并篩選顯示出所述基因表達(dá)減少或沒(méi)有表達(dá)的突變細(xì)胞來(lái)進(jìn)行誘變。
還可以通過(guò)在所述基因或者其轉(zhuǎn)錄或翻譯必需的調(diào)控元件中導(dǎo)入、取代或去除1或多個(gè)核苷酸來(lái)進(jìn)行所述基因的修飾或失活。例如，可以插入或去除核苷酸從而導(dǎo)入終止密碼子、去除起始密碼子或者改變開(kāi)放讀碼框?？梢愿鶕?jù)本領(lǐng)域已知的方法，通過(guò)定點(diǎn)誘變或PCR導(dǎo)致的誘變來(lái)實(shí)現(xiàn)這類修飾或失活。雖然從理論上說(shuō)，可以在體內(nèi)，即直接在表達(dá)待修飾基因的細(xì)胞上進(jìn)行修飾，但優(yōu)選修飾如以下闡述在體外進(jìn)行。
使所選絲狀真菌細(xì)胞的單端孢菌毒素產(chǎn)量減少或使其失活的方便的方法的例子基于基因取代、缺失或打斷技術(shù)。例如，在基因打斷方法中，于體外將目的內(nèi)源基因或基因片段所對(duì)應(yīng)的核酸序列誘變以便產(chǎn)生缺陷的核酸序列，然后將后者轉(zhuǎn)化到親本細(xì)胞中產(chǎn)生缺陷基因。通過(guò)同源重組，所述缺陷核酸序列取代內(nèi)源基因或基因片段?？扇〉氖撬鋈毕莼蚧蚧蚱芜€編碼可用于挑選轉(zhuǎn)化子的標(biāo)記物，所述轉(zhuǎn)化子中的核酸序列已被修飾或破壞。選擇標(biāo)記基因可用于實(shí)現(xiàn)基因打斷。缺陷的核酸序列可以單純地以選擇標(biāo)記基因打斷所述內(nèi)源序列?？蛇x擇地，除了用選擇標(biāo)記基因打斷外，缺陷核酸序列還可以含有內(nèi)源序列，或其一部分的插入或缺失。此外，缺陷核酸序列可以含有內(nèi)源序列或其一部分的插入或缺失，選擇標(biāo)記基因不參與修飾，而是作為鑒定含有缺陷基因的轉(zhuǎn)化子的選擇標(biāo)記。
可選擇地，可以通過(guò)已確立的反義技術(shù)，利用與所述基因的核酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列來(lái)作基因修飾或失活。更具體地說(shuō)，可以通過(guò)導(dǎo)入與所述基因的核酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列，該核苷酸序列可以在細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄并能與細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的mRNA雜交從而減少或消除絲狀真菌細(xì)胞中基因的表達(dá)。在互補(bǔ)反義核苷酸序列能與mRNA雜交的條件下，翻譯出的蛋白質(zhì)的量就會(huì)減少或消失。
可以從其他產(chǎn)生單端孢菌毒素的微生物來(lái)源獲得參與絲狀真菌細(xì)胞中單端孢菌毒素生產(chǎn)的基因的核酸序列的同源或互補(bǔ)核酸序列。具有與Fusarium venenatum的SEQ ID NO1核酸序列互補(bǔ)或同源的核酸序列的Tri5基因的優(yōu)選來(lái)源包括，但不限于，擬分枝孢鐮孢(Hohn和Beremand，1989，同前)、虱狀赤霉(Hohn和Desjardins，1992，同前)、玉蜀黍赤霉(Proctor等，1995，同前)、露濕漆斑菌(Trapp等，1995，同前)和早熟禾鐮孢(Fekete等，1997，同前)。
單端孢菌毒素生物合成途徑中可能與絲狀真菌細(xì)胞相應(yīng)基因的核酸序列互補(bǔ)或同源的其他基因的優(yōu)選來(lái)源包括，但不限于，來(lái)自擬分枝孢鐮孢的tri3基因(McCormick等，1996，同前)、來(lái)自擬分枝孢鐮孢的tri4基因(Hohn等，1995，同前)、來(lái)自擬分枝孢鐮孢的tri6基因(Proctor等，1997，同前)、來(lái)自擬分枝孢鐮孢的tri11基因(Alexander等，1997，同前)、來(lái)自擬分枝孢鐮孢的tri12基因(Alexander等，1997，同前)以及來(lái)自禾本科鐮孢的tri101基因(Kimura等，1998，同前)。此外，所述核酸序列可以是絲狀真菌細(xì)胞天然存在的。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，突變絲狀真菌細(xì)胞中參與產(chǎn)生單端孢菌毒素的基因的修飾未用選擇標(biāo)記標(biāo)志。
可以通過(guò)在反選擇培養(yǎng)基上培養(yǎng)突變子來(lái)挑選去掉了選擇標(biāo)記基因的。選擇標(biāo)記基因含有側(cè)接于其5’和3’末端的重復(fù)序列時(shí)，當(dāng)對(duì)突變細(xì)胞進(jìn)行反選擇，重復(fù)序列將通過(guò)同源重組促進(jìn)選擇標(biāo)記的環(huán)出。還可以通過(guò)向突變細(xì)胞中導(dǎo)入這樣的核酸片段，該片段含有缺陷基因的5’和3’區(qū)，但缺少選擇標(biāo)記基因，然后在反選擇培養(yǎng)基上挑選，從而通過(guò)同源重組來(lái)去除選擇標(biāo)記基因。通過(guò)同源重組，含有選擇標(biāo)記基因的缺陷基因被缺少選擇標(biāo)記基因的核酸片段取代。還可以使用本領(lǐng)域其他已知方法。
應(yīng)當(dāng)明白，本發(fā)明所述獲得突變絲狀真菌細(xì)胞的方法不限于特定順序?？梢栽跇?gòu)建所述產(chǎn)生異源多肽的細(xì)胞的任何步驟向親本細(xì)胞中引入對(duì)參與產(chǎn)生單端孢菌毒素的基因的修飾。優(yōu)選地，在導(dǎo)入編碼異源多肽的基因之前，所述絲狀真菌突變子已是單端孢菌毒素缺陷的。
可以采用本領(lǐng)域已知的方法(參見(jiàn)，例如，Rood等，1988，農(nóng)業(yè)和食品化學(xué)雜志3674-79；Romer，1986，官方分析化學(xué)家協(xié)會(huì)雜志69699-703；McCormick等，1990，應(yīng)用與環(huán)境微生物學(xué)56702-706)來(lái)確定本發(fā)明所述突變絲狀真菌細(xì)胞產(chǎn)生的單端孢菌毒素的水平。優(yōu)選在相同條件下培養(yǎng)時(shí)，所述突變絲狀真菌細(xì)胞較之相應(yīng)親本絲狀真菌細(xì)胞產(chǎn)生的單端孢菌毒素少至少大約25％、更優(yōu)選少至少大約50％，更優(yōu)選少至少大約75％，最優(yōu)選少至少大約95％，最最優(yōu)選的是沒(méi)有單端孢菌毒素?？梢栽谟欣谀康亩嚯漠a(chǎn)生或有利于單端孢菌毒素產(chǎn)生的條件下，就單端孢菌毒素的產(chǎn)量來(lái)比較親本和突變細(xì)胞。
采用本領(lǐng)域已知方法，在適合目的異源多肽產(chǎn)生的營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)中培養(yǎng)所述突變絲狀真菌細(xì)胞。例如，可以在有合適的培養(yǎng)基的實(shí)驗(yàn)室或工業(yè)發(fā)酵罐中，于異源多肽能進(jìn)行表達(dá)和/或分離的條件下通過(guò)搖瓶培養(yǎng)、或小量或大規(guī)模發(fā)酵(包括連續(xù)、分批、補(bǔ)料分批或固態(tài)發(fā)酵)來(lái)培養(yǎng)所述細(xì)胞?？梢栽诤刑己偷匆约盁o(wú)機(jī)鹽的適當(dāng)營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)中，采用本領(lǐng)域已知操作進(jìn)行培養(yǎng)。合適的培養(yǎng)基可購(gòu)自供應(yīng)商或者可以按照公開(kāi)的配方(例如，美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心的目錄)來(lái)制備。如果異源多肽分泌出來(lái)，可以直接從培養(yǎng)基中回收。
檢測(cè)異源多肽可以利用本領(lǐng)域已知的該多肽的特異方法。這些檢測(cè)方法可能包括利用特異抗體、酶產(chǎn)物的形成、酶底物的消失、SDS-PAGE或者其他本領(lǐng)域的已知方法。例如，可以用酶檢測(cè)來(lái)確定異源多肽的活性。許多酶的測(cè)活步驟是本領(lǐng)域已知的。
可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的方法來(lái)分離所得異源多肽。例如可以通過(guò)常規(guī)操作，包括，但不限于，離心、過(guò)濾、提取、噴霧干燥、蒸發(fā)或沉淀來(lái)從營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)中分離所述多肽。分離的多肽可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的許多操作，包括，但不限于層析(例如，離子交換、親合、疏水、層析聚焦以及體積排阻層析)、電泳操作(例如制備性等電聚焦)、差示溶解(例如硫酸銨沉淀)或者提取(參見(jiàn)，例如《蛋白質(zhì)純化》J-C，Janson和Lars Ryden編，VCH Publishers，New York，1989)來(lái)進(jìn)一步純化。
所述多肽可以是突變絲狀真菌細(xì)胞的任何異源多肽。此處術(shù)語(yǔ)“多肽”并非指示編碼產(chǎn)物的具體長(zhǎng)度，因此涵蓋肽、寡肽和蛋白質(zhì)。術(shù)語(yǔ)“異源多肽”此處定義為絲狀真菌細(xì)胞的非天然多肽。突變絲狀真菌細(xì)胞可以含有1或多拷貝的編碼所述異源多肽的核酸序列。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述異源多肽是激素、激素變體、酶、受體或其部分、抗體或其部分或者是報(bào)道蛋白。在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述異源多肽是氧化還原酶、轉(zhuǎn)移酶、水解酶、裂解酶、異構(gòu)酶或連接酶。在一個(gè)甚至更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述異源多肽是氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、過(guò)氧化氫酶、纖維素酶、幾丁質(zhì)酶、角質(zhì)酶(cutinase)、環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶、脫氧核糖核酸酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、轉(zhuǎn)化酶、漆酶、脂酶、甘露糖苷酶、齒斑葡聚糖酶(mutanase)、氧化酶、果膠水解酶、過(guò)氧化物酶、磷脂酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶(transglutaminase)或木聚糖酶。
在本發(fā)明的方法中，所述異源多肽也可以是多肽的工程化變體。
編碼能在絲狀真菌細(xì)胞中表達(dá)的異源多肽的核酸序列可以得自任何原核細(xì)胞、真核細(xì)胞或其他來(lái)源。就本發(fā)明而言，術(shù)語(yǔ)“得自”與給定來(lái)源聯(lián)系在一起用于此處表示多肽由該來(lái)源或插入了來(lái)自該來(lái)源的基因的細(xì)胞產(chǎn)生。
在本發(fā)明的方法中，突變絲狀真菌細(xì)胞也可以用于重組生產(chǎn)細(xì)胞的天然多肽。通過(guò)例如，使編碼該多肽的基因處于不同啟動(dòng)子的調(diào)控下以便增強(qiáng)該多肽的表達(dá)、利用信號(hào)序列促進(jìn)目的天然多肽運(yùn)送到細(xì)胞外以及增加編碼多肽(其正常情況下由細(xì)胞產(chǎn)生)的基因拷貝數(shù)從而重組地生產(chǎn)所述天然多肽。本發(fā)明術(shù)語(yǔ)“異源多肽”的范圍還涵蓋重組產(chǎn)生絲狀真菌細(xì)胞天然的內(nèi)源多肽，其中這種表達(dá)涉及利用對(duì)細(xì)胞并非天然的基因元件，或者利用已被改變成以宿主細(xì)胞中原來(lái)不存在的方式行使功能的天然元件。
用于分離或克隆編碼異源多肽的核酸序列的技術(shù)是本領(lǐng)域已知的，包括從基因組DNA中分離、由cDNA制備或者聯(lián)合使用它們。例如利用公知的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)可以實(shí)現(xiàn)來(lái)自基因組DNA的核酸序列的克隆。參見(jiàn)，例如，Innis等，1990，PCR方案方法和應(yīng)用手冊(cè)，Academic Press，New York。也可以使用其他核酸擴(kuò)增操作，比如連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(LCR)、連接激活轉(zhuǎn)錄(LAT)和基于核酸序列的擴(kuò)增(NASBA)。所述克隆過(guò)程可能包括切割和分離所需含有編碼多肽的核酸序列的核酸片段，將該片段插入載體分子，以及使重組載體摻入到突變真菌細(xì)胞，從而在此復(fù)制多拷貝或多克隆的核酸序列。所述核酸序列可以是基因組、cDNA、RNA、半合成、合成來(lái)源的或者是它們的任何組合形式。
在本發(fā)明的方法中，異源多肽還可以包括融合或雜合的多肽，其中在所述多肽或其片段的氨基端或羧基端融合了另一個(gè)多肽。通過(guò)將編碼一個(gè)多肽的核酸序列(或其一部分)與編碼另一個(gè)多肽的核酸序列(或其一部分)融合在一起可以產(chǎn)生融合多肽。制備融合多肽的技術(shù)是本領(lǐng)域已知的，包括將編碼多肽的編碼序列連接起來(lái)以便使它們讀框一致，并且融合多肽的表達(dá)受到相同啟動(dòng)子和終止子的調(diào)控。雜合多肽可以包含組合在一起的至少兩種不同多肽的部分或完整多肽序列，其中的一種或多種多肽對(duì)突變絲狀真菌細(xì)胞是異源的。
可以多種途徑操作編碼目的異源多肽的分離的核酸序列從而使其表達(dá)所述多肽。表達(dá)應(yīng)理解為包括生產(chǎn)多肽涉及到的任何步驟，包括，但不限于，轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后修飾、翻譯、翻譯后修飾和分泌。根據(jù)表達(dá)載體不同，在將核酸序列插入載體前進(jìn)行操作可能是可取或必需的。利用克隆方法修飾核酸序列的技術(shù)是本領(lǐng)域公知的。
此處“核酸構(gòu)建體”定義為這樣一個(gè)核酸分子，它是單鏈或雙鏈的，分離自天然基因或者已被修飾從而含有幾個(gè)核酸區(qū)段，這些區(qū)段的組合和排列方式不存在于自然界。核酸構(gòu)建體含有表達(dá)編碼序列所需的全部調(diào)控序列時(shí)，術(shù)語(yǔ)核酸構(gòu)建體與術(shù)語(yǔ)表達(dá)盒是同義詞。術(shù)語(yǔ)“編碼序列”此處定義為轉(zhuǎn)錄為mRNA并翻譯為多肽的序列?；蚪M編碼序列的界線通常由正好位于mRNA 5’末端的開(kāi)放讀碼框上游的ATG起始密碼子和正好位于mRNA 3’末端的開(kāi)放讀碼框下游的轉(zhuǎn)錄終止子序列確定。編碼序列可以包括，但不限于，基因組、cDNA、RNA、半合成的、合成的、重組的或者它們的任何組合方式。
術(shù)語(yǔ)“調(diào)控序列”此處定義為包括表達(dá)異源多肽所必需或有益的全部組分。每個(gè)調(diào)控序列對(duì)于編碼多肽的核酸序列可以是天然或外來(lái)的。這類調(diào)控序列包括，但不限于，前導(dǎo)序列、多聚腺苷酸化序列、前肽序列、啟動(dòng)子、信號(hào)序列以及轉(zhuǎn)錄終止子。所述調(diào)控序列最低限度包括一個(gè)啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄及翻譯終止信號(hào)。可以和調(diào)控序列一起提供接頭以用于導(dǎo)入能協(xié)助調(diào)控序列和編碼異源多肽的核酸序列的編碼區(qū)進(jìn)行連接的特異限制酶位點(diǎn)。術(shù)語(yǔ)“可操縱地連接”此處定義為這樣一種構(gòu)型，其中調(diào)控序列相對(duì)DNA序列的編碼序列適當(dāng)?shù)刂糜谀芤龑?dǎo)產(chǎn)生所述異源多肽的位置。
所述調(diào)控序列可以是合適的啟動(dòng)子序列，即絲狀真菌細(xì)胞表達(dá)核酸序列時(shí)識(shí)別的核酸序列。啟動(dòng)子序列含有介導(dǎo)異源多肽的表達(dá)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列。該啟動(dòng)子可以是任何在絲狀真菌細(xì)胞中顯示轉(zhuǎn)錄活性的核酸序列，包括突變的、截短的和雜合啟動(dòng)子，可以得自編碼對(duì)細(xì)胞是同源的或異源的胞外或胞內(nèi)多肽的基因。
適合在本發(fā)明所述方法中引導(dǎo)核酸構(gòu)建體進(jìn)行轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子的例子是得自下列基因的啟動(dòng)子，這些基因編碼米曲霉TAKA淀粉酶、Rhizomucor miehei天冬氨酸蛋白酶、黑曲霉中性α淀粉酶、黑曲霉酸穩(wěn)定α淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶(glaA)、Rhizomucormiehei脂酶、米曲霉堿性蛋白酶、米曲霉磷酸丙糖異構(gòu)酶、構(gòu)巢曲霉乙酰胺酶、米曲霉乙酰胺酶、尖鐮孢類胰蛋白酶蛋白酶(美國(guó)專利4288627)及其突變的、截短的和雜合啟動(dòng)子。特別優(yōu)選的啟動(dòng)子是葡糖淀粉酶，TAKA淀粉酶和NA2-tpi啟動(dòng)子(來(lái)自黑曲霉中性α淀粉酶和米曲霉磷酸丙糖異構(gòu)酶編碼基因的啟動(dòng)子的雜合體)。
調(diào)控序列還可以是合適的轉(zhuǎn)錄終止子序列，即由絲狀真菌細(xì)胞識(shí)別從而終止轉(zhuǎn)錄的一個(gè)序列。所述終止子序列可操縱地連接在編碼異源多肽的核酸序列的3’端。任何在絲狀真菌細(xì)胞中有功能的終止子均可用于本發(fā)明。
優(yōu)選的終止子得自編碼米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、構(gòu)巢曲霉鄰氨基苯甲酸合成酶、黑曲霉α葡糖苷酶和尖鐮孢類胰蛋白酶蛋白酶的基因。
所述調(diào)控序列還可以是合適的前導(dǎo)序列，即mRNA的一個(gè)非翻譯區(qū)，它對(duì)絲狀真菌細(xì)胞的翻譯非常重要。前導(dǎo)序列可操縱地連接在編碼異源多肽的核酸序列的5’端。任何在絲狀真菌細(xì)胞中有此功能的前導(dǎo)序列均可用于本發(fā)明。
優(yōu)選的前導(dǎo)序列得自編碼米曲霉TAKA淀粉酶和構(gòu)巢曲霉磷酸丙糖異構(gòu)酶的基因。
所述調(diào)控序列還可以是多聚腺苷酸化序列，即可操縱地連接在核酸序列的3’末端，并在轉(zhuǎn)錄時(shí)被絲狀真菌細(xì)胞識(shí)別，作為一個(gè)信號(hào)向被轉(zhuǎn)錄的mRNA添加多聚腺苷酸殘基的序列。任何在絲狀真菌細(xì)胞中有此功能的多聚腺苷酸化序列均可用于本發(fā)明。
優(yōu)選的多聚腺苷酸化序列得自編碼米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、構(gòu)巢曲霉鄰氨基苯甲酸合成酶和黑曲霉α葡糖苷酶的基因。
所述調(diào)控序列還可以是信號(hào)肽編碼區(qū)，它編碼連接在異源多肽氨基端的一個(gè)氨基酸序列，并引導(dǎo)編碼多肽進(jìn)入細(xì)胞的分泌途徑。核酸序列中編碼序列的5’末端可以自身含有信號(hào)肽編碼區(qū)，后者天然地與編碼所分泌多肽的編碼區(qū)片段在翻譯閱讀框中連接在一起。可選擇地，編碼序列的5’末端可以含有該編碼序列的外源信號(hào)肽編碼區(qū)。編碼序列正常情況下不含信號(hào)肽編碼區(qū)時(shí)，可能需要外來(lái)的信號(hào)肽編碼區(qū)?？蛇x擇地，可以直接用外來(lái)信號(hào)肽編碼區(qū)代替天然的信號(hào)肽編碼區(qū)以便增強(qiáng)多肽的分泌。但是，任何能引導(dǎo)所表達(dá)異源多肽進(jìn)入絲狀真菌細(xì)胞的分泌途徑的信號(hào)肽編碼區(qū)都可用于本發(fā)明。
對(duì)絲狀真菌宿主細(xì)胞有效的信號(hào)肽編碼區(qū)是這樣一些信號(hào)肽編碼區(qū)，它們得自編碼米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、Rhizomucor miehei天冬氨酸蛋白酶、Humicola insolens纖維素酶和Humicola lanuginosa脂酶的基因。
所述調(diào)控序列還可以是前肽編碼區(qū)，它編碼位于多肽氨基端的一段氨基酸序列。所得的多肽稱為前酶或多肽原(在某些情況中稱為酶原)。多肽原通常是沒(méi)有活性的，由多肽原通過(guò)催化或自身催化切割掉前肽可以將其轉(zhuǎn)化為成熟、有活性的多肽。所述前肽編碼區(qū)可以得自Rhizomucor miehei天冬氨酸蛋白酶基因或者嗜熱毀絲霉漆酶基因(WO9533836)。
信號(hào)肽和前肽區(qū)均位于多肽的氨基端時(shí)，前肽區(qū)與多肽的氨基端相鄰，信號(hào)肽區(qū)域與前肽區(qū)的氨基端相鄰。
所述核酸構(gòu)建體還可以包含1或多個(gè)核酸序列，這些序列編碼1或多個(gè)有利于指導(dǎo)異源多肽進(jìn)行表達(dá)的因子，例如轉(zhuǎn)錄激活子(例如反式作用因子)、伴侶蛋白和加工蛋白酶。任何在絲狀真菌細(xì)胞中有功能的因子均可用于本發(fā)明。所述編碼1或多個(gè)因子的核酸不必與編碼異源多肽的核酸序列串聯(lián)。
添加這樣一些調(diào)控序列可能也是可取的，這些序列能相對(duì)絲狀真菌細(xì)胞的生長(zhǎng)而調(diào)節(jié)異源多肽的表達(dá)。調(diào)控體系的例子是那些在化學(xué)或物理刺激(包括存在調(diào)控化合物)下導(dǎo)致基因表達(dá)開(kāi)放或關(guān)閉的體系。TAKAα-淀粉酶啟動(dòng)子、黑曲霉葡糖淀粉酶啟動(dòng)子以及米曲霉葡糖淀粉酶啟動(dòng)子均可作為調(diào)控序列。調(diào)控序列的其他例子是能使基因擴(kuò)增的序列，例如可用重金屬擴(kuò)增的金屬硫蛋白基因。在這些情況中，編碼異源多肽的核酸序列應(yīng)與調(diào)控序列可操縱地連接在一起。
利用一個(gè)含有最少量的改變內(nèi)源核酸序列表達(dá)所需成分的核酸構(gòu)建體也可以改變細(xì)胞的內(nèi)源核酸序列的表達(dá)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述核酸構(gòu)建體優(yōu)選含有(a)導(dǎo)靶序列，(b)調(diào)控序列，(c)外顯子和(d)剪接供體位點(diǎn)。該核酸構(gòu)建體一導(dǎo)入細(xì)胞，就通過(guò)同源重組插入細(xì)胞基因組的內(nèi)源核酸序列位點(diǎn)。導(dǎo)靶序列引導(dǎo)元件(a)-(d)整合到內(nèi)源核酸序列中，從而使元件(b)-(d)可操縱地與內(nèi)源核酸序列連接。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述核酸構(gòu)建體含有(a)導(dǎo)靶序列，(b)調(diào)控序列，(c)外顯子，(d)剪接供體位點(diǎn)，(e)內(nèi)含子以及(f)剪接受體位點(diǎn)，其中導(dǎo)靶序列引導(dǎo)元件(a)-(f)的整合從而使元件(b)-(f)可操縱地與內(nèi)源核酸序列連接。但構(gòu)建體還可以含有其他成分比如選擇標(biāo)記。
在這兩個(gè)實(shí)施方案中，這些成分的導(dǎo)入均產(chǎn)生一個(gè)新的轉(zhuǎn)錄單元，其中內(nèi)源核酸序列的表達(dá)被改變。實(shí)質(zhì)上，這個(gè)新的轉(zhuǎn)錄單元是導(dǎo)靶構(gòu)建體所導(dǎo)入的序列與內(nèi)源核酸序列的融合產(chǎn)物。在一個(gè)內(nèi)源核酸序列被改變的實(shí)施方案中，核酸序列是被激活。在該實(shí)施方案中，利用同源重組，通過(guò)插入一個(gè)調(diào)控序列來(lái)將正常情況下與親本細(xì)胞的內(nèi)源核酸序列相連的調(diào)控區(qū)取代、打斷或失活，該調(diào)控序列使得核酸序列以高于相應(yīng)親本細(xì)胞的水平進(jìn)行表達(dá)。利用本領(lǐng)域已知的方法(參見(jiàn)，例如美國(guó)專利5641670)，通過(guò)使構(gòu)建體中含有一個(gè)可擴(kuò)增的選擇標(biāo)記基因能進(jìn)一步擴(kuò)增被激活的核酸序列。在另一個(gè)內(nèi)源核酸序列被改變的實(shí)施方案中，基因的表達(dá)降低。
所述導(dǎo)靶序列可以在內(nèi)源核酸序列內(nèi)、緊接著核酸序列、在上游基因之內(nèi)或者在內(nèi)源核酸序列的上游或有一定距離。可以使用1或多個(gè)導(dǎo)靶序列。例如，環(huán)形質(zhì)?；蚱銬NA片段優(yōu)選采用單個(gè)導(dǎo)靶序列，而線性質(zhì)粒或其DNA片段優(yōu)選采用兩個(gè)導(dǎo)靶序列。
構(gòu)建體中的調(diào)控序列可以包含1或多個(gè)啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、支架附著區(qū)或者基質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)、負(fù)調(diào)控元件、轉(zhuǎn)錄結(jié)合位點(diǎn)或者這些序列的組合形式。
所述構(gòu)建體另外含有內(nèi)源核酸序列的1或多個(gè)外顯子。外顯子定義為這樣一個(gè)DNA序列，它可被拷貝成RNA并存在于成熟的mRNA分子中，因此外顯子序列與內(nèi)源核酸序列的編碼區(qū)讀框一致。任選外顯子含有編碼1或多個(gè)氨基酸和/或部分編碼氨基酸的DNA?？蛇x擇地，外顯子含有對(duì)應(yīng)于5’非編碼區(qū)的DNA。在外源外顯子編碼1或多個(gè)氨基酸和/或氨基酸的一部分的情況下，將所述核酸構(gòu)建體設(shè)計(jì)成當(dāng)轉(zhuǎn)錄和剪接時(shí)，讀碼框與內(nèi)源核酸序列的編碼區(qū)讀框一致，從而來(lái)自第二個(gè)外顯子的mRNA部分的正確讀碼框不被改變。
構(gòu)建體的剪接供體位點(diǎn)引導(dǎo)一個(gè)外顯子與另一個(gè)外顯子的剪接。通常，第一外顯子位于第二外顯子的5’，與第一外顯子在3’方向重疊和側(cè)接的剪接供體位點(diǎn)識(shí)別側(cè)接在第二外顯子5’側(cè)的剪接受體位點(diǎn)。剪接受體位點(diǎn)和剪接供體位點(diǎn)一樣，是引導(dǎo)一個(gè)外顯子與另一個(gè)外顯子進(jìn)行剪接的序列。剪接系統(tǒng)利用剪接受體位點(diǎn)，與剪接供體位點(diǎn)聯(lián)合作用來(lái)去除內(nèi)含子。
可以將以上描述的各種核酸和調(diào)控序列連接在一起產(chǎn)生一個(gè)重組表達(dá)載體，該載體可以包括1或多個(gè)方便的限制位點(diǎn)以便在該位點(diǎn)插入或取代編碼異源多肽的核酸序列?？蛇x擇地，可以通過(guò)將編碼異源多肽的核酸序列或包含該序列的核酸構(gòu)建體插入到合適的表達(dá)載體中使所述序列得以表達(dá)。在制備表達(dá)載體時(shí)，將編碼序列置于載體中，從而使編碼序列可操縱地連接合適的調(diào)控序列以便進(jìn)行表達(dá)，還有可能分泌。
所述重組表達(dá)載體可以是任何可以方便地對(duì)它進(jìn)行重組DNA操作，并能表達(dá)編碼異源多肽的核酸序列的載體(例如質(zhì)?；虿《?。通常載體的選擇取決于載體與該載體要導(dǎo)入的絲狀真菌細(xì)胞的相容性。載體可以是線性或封閉環(huán)形質(zhì)粒。載體可以是自主復(fù)制的載體，即以染色體外個(gè)體存在的載體，其復(fù)制獨(dú)立于染色體的復(fù)制，例如，質(zhì)粒、染色體外元件、微小染色體或人工染色體。該載體可以含有確保進(jìn)行自我復(fù)制的任何手段?？蛇x擇地，載體可以是一個(gè)在導(dǎo)入絲狀真菌細(xì)胞時(shí)能整合到基因組中并與它所整合的染色體一起復(fù)制的載體。載體系統(tǒng)可以是單個(gè)載體或質(zhì)?；蛘邇蓚€(gè)或多個(gè)載體或質(zhì)粒，它們共同含有要導(dǎo)入絲狀真菌細(xì)胞基因組的DNA，或者是轉(zhuǎn)座子。
優(yōu)選所述載體含有1或多個(gè)能使得容易挑出被轉(zhuǎn)化的絲狀真菌細(xì)胞的選擇標(biāo)記。選擇標(biāo)記是這樣一個(gè)基因，其產(chǎn)物能提供殺生物劑或病毒抗性、重金屬抗性，使?fàn)I養(yǎng)缺陷型成為原養(yǎng)型等。用于絲狀真菌宿主細(xì)胞的選擇標(biāo)記可以選自amdS(乙酰胺酶)、argB(鳥(niǎo)氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶)、bar(膦絲菌素轉(zhuǎn)乙酰酶)、hph(潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶)、niaD(硝酸還原酶)、pyrG(乳清苷-5’-磷酸脫羧酶)、sC(硫酸腺苷轉(zhuǎn)移酶)和trpC(鄰氨基苯甲酸合成酶)，以及來(lái)自其他物種的等同物，但不局限于此。優(yōu)選用于絲狀真菌細(xì)胞的是構(gòu)巢曲霉或米曲霉的amdS和pyrG基因以及吸水鏈霉菌的bar基因。
優(yōu)選所述載體含有能使載體穩(wěn)定地整合到絲狀真菌細(xì)胞基因組或者能使載體在細(xì)胞中獨(dú)立于該細(xì)胞的基因組而自主復(fù)制的元件。
“導(dǎo)入”意味著將包含核酸序列的載體引入絲狀真菌細(xì)胞從而該載體維持染色體的整合子或自我復(fù)制的染色體外載體的形態(tài)。通常認(rèn)為整合比較占優(yōu)勢(shì)，因?yàn)檫@樣核酸序列更可能穩(wěn)定地維持在細(xì)胞中。載體的整合是通過(guò)同源重組、非同源重組或轉(zhuǎn)座實(shí)現(xiàn)的。
向絲狀真菌細(xì)胞中導(dǎo)入表達(dá)載體可能包括這樣的過(guò)程以已知方式進(jìn)行原生質(zhì)體形成、原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化以及細(xì)胞壁再生。在EP238023和Yelton等，1984，美國(guó)科學(xué)院學(xué)報(bào)811470-1474中描述了轉(zhuǎn)化曲霉宿主細(xì)胞的合適程序。Malardier等，1989，基因78147-156以及WO96/00787中描述了轉(zhuǎn)化鐮孢菌種的適用方法。
為了整合到絲狀真菌細(xì)胞基因組中，載體可以依賴于編碼異源多肽的核酸序列或者能使載體通過(guò)同源或非同源重組穩(wěn)定整合到基因組中的其他載體元件?？蛇x擇地，載體可以含有引導(dǎo)通過(guò)同源重組整合至絲狀真菌細(xì)胞基因組的其他核酸序列。所述其他核酸序列使載體能在染色體的精確位點(diǎn)整合到基因組中。為了提高在精確位點(diǎn)整合的可能性，整合元件應(yīng)優(yōu)選含有足夠數(shù)量的核酸序列，比如100到1500堿基對(duì)，優(yōu)選400到1500堿基對(duì)，最優(yōu)選800到1500堿基對(duì)，這些核酸序列與相應(yīng)的靶序列高度同源以便增加同源重組的幾率。整合元件可以是與絲狀真菌細(xì)胞基因組中的靶序列同源的任何序列。此外，整合元件可以是非編碼或編碼核酸序列。另一方面，載體可以通過(guò)非同源重組整合到細(xì)胞基因組中。
為了進(jìn)行自主復(fù)制，載體還包含復(fù)制起點(diǎn)以保證載體在所述絲狀真菌細(xì)胞中自主地復(fù)制。
用于將文中描述的元件連接起來(lái)構(gòu)建重組表達(dá)載體的步驟是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的(參見(jiàn)，例如J.Sambrook，E.F.Fritsch和T.Maniatus，1989，分子克隆，實(shí)驗(yàn)指南，第2版，Cold Spring Harbor，New York)。
在本發(fā)明的另一個(gè)方面，所述突變絲狀真菌細(xì)胞另外含有1或多個(gè)核酸序列的修飾，這些核酸序列編碼對(duì)目的異源多肽的生產(chǎn)、提純和/或應(yīng)用可能有害的蛋白質(zhì)。修飾將使1或多個(gè)第三核酸序列的表達(dá)減少或消除，這樣得到的突變細(xì)胞培養(yǎng)在相同條件下比第三核酸序列未修飾的突變細(xì)胞產(chǎn)生更多異源多肽。
所述第三核酸序列可以編碼任何蛋白質(zhì)或酶。例如，酶可以是氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、過(guò)氧化氫酶、纖維素酶、幾丁質(zhì)酶、角質(zhì)酶、環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶、脫氧核糖核酸酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、轉(zhuǎn)化酶、漆酶、脂酶、甘露糖苷酶、齒斑葡聚糖酶、氧化酶、果膠水解酶、過(guò)氧化物酶、磷脂酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶或木聚糖酶。優(yōu)選第三核酸序列編碼蛋白水解酶，例如氨肽酶、羧肽酶或蛋白酶。
本方法還涉及獲得單端孢菌毒素缺陷型絲狀真菌突變細(xì)胞的方法，包括(a)向親本絲狀真菌細(xì)胞中導(dǎo)入核酸序列，該序列包含至少一個(gè)參與單端孢菌毒素產(chǎn)生的基因的修飾；和(b)鑒定來(lái)自步驟(a)的包含被修飾之核酸序列的突變體，其中突變細(xì)胞培養(yǎng)在相同條件下比親本絲狀真菌細(xì)胞產(chǎn)生的單端孢菌毒素少。
本發(fā)明還涉及用于生產(chǎn)異源多肽的絲狀真菌細(xì)胞的單端孢菌毒素缺陷型突變體，其包含編碼異源多肽的第一核酸序列和含有至少一個(gè)參與單端孢菌毒素產(chǎn)生之基因的修飾的第二核酸序列，其中突變細(xì)胞培養(yǎng)在相同條件下時(shí)產(chǎn)生的單端孢菌毒素比親本絲狀真菌細(xì)胞少。Trichodiene合成酶及其編碼核酸本發(fā)明還涉及分離的trichodiene合成酶。
在第一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及分離的trichodiene合成酶，其具有與SEQ ID NO2相同性至少大約97％(下文稱為“同源多肽”)的氨基酸序列。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，同源多肽具有與SEQ ID NO2有5個(gè)、優(yōu)選4個(gè)、更優(yōu)選3個(gè)、更加優(yōu)選的是2個(gè)，最優(yōu)選1個(gè)氨基酸不同的氨基酸序列。用在本發(fā)明中，通過(guò)Clustal方法(Higgins，1989，CABIOS5151-153)，使用LASERGENETMMEGALIGNTM軟件(DNASTAR，Inc.，Madison，WI)來(lái)確定兩個(gè)氨基酸序列之間的相同程度，所述軟件有一個(gè)相同性表及以下多重比對(duì)參數(shù)缺口罰分10，缺口長(zhǎng)度罰分10。成對(duì)比對(duì)參數(shù)是Ktuple＝1，缺口罰分＝3，窗口(window)＝5，對(duì)角線(diagonal)＝5。
優(yōu)選地，本發(fā)明的trichodiene合成酶包含SEQ ID NO2之氨基酸序列或其等位基因變體，或其具有trichodiene合成酶活性的片段。在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的trichodiene合成酶包含氨基酸序列SEQ ID NO2。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的trichodiene合成酶由氨基酸序列SEQ ID NO2或其等位基因變體，或其具有trichodiene合成酶活性的片段組成。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的多肽由氨基酸序列SEQ ID NO2組成。
SEQ ID NO2的片段是在該氨基酸序列的氨基和/或羧基端缺失了1或多個(gè)氨基酸的多肽。優(yōu)選地，所述片段含有至少290個(gè)氨基酸殘基，更優(yōu)選含有至少320個(gè)氨基酸殘基，最優(yōu)選至少350個(gè)氨基酸殘基。
等位基因變體表示占據(jù)相同染色體座位的基因的兩個(gè)或多個(gè)替換形式中的一種。通過(guò)突變可以自然產(chǎn)生等位基因變異，并可能造成種群內(nèi)的多態(tài)性?；蛲蛔兛梢允浅聊?所編碼多肽沒(méi)有變化)或可以編碼氨基酸序列被改變的多肽。多肽的等位基因變體是基因的等位基因變體所編碼的多肽。
在第二個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及分離的trichodiene合成酶，其由在極低的嚴(yán)謹(jǐn)條件下、優(yōu)選在低度嚴(yán)謹(jǐn)條件下，更優(yōu)選在中等嚴(yán)謹(jǐn)條件下，更優(yōu)選的是在高度嚴(yán)謹(jǐn)條件下，最優(yōu)選在極高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與下述核酸探針雜交的核酸序列編碼，該探針在相同條件下可與(i)SEQ ID NO.1的2521到3686位核苷酸，(ii)包含在SEQ ID NO.1的2521到3686位核苷酸中的cDNA序列，(iii)(i)或(ii)的亞序列，或者(iv)(i)、(ii)或(iii)的互補(bǔ)鏈雜交(J.Sambrook，E.F.Fritsch，和T.Maniatus，1989，分子克隆，實(shí)驗(yàn)指南，第二版，Cold Spring Harbor，New York)。SEQ ID NO.1的亞序列可以是至少100個(gè)核苷酸或優(yōu)選至少200個(gè)核苷酸。此外，所述亞序列可以編碼具有trichodiene合成酶活性的多肽片段。多肽還可以是具有trichodiene合成酶活性的多肽的等位基因變體或片段。
可以用SEQ ID NO1的核酸序列或其亞序列，以及SEQ ID NO2的氨基酸序列或其片段，按照本領(lǐng)域已知方法來(lái)設(shè)計(jì)核酸探針以便從不同屬或種的菌株中鑒定和克隆編碼trichodiene合成酶的DNA。具體來(lái)說(shuō)，可以用這類探針在常規(guī)Southern印跡后與目的屬或種的基因組或cDNA雜交，以便鑒定和分離相應(yīng)基因。所述探針可以比完整序列短得多，但應(yīng)當(dāng)至少長(zhǎng)15個(gè)，優(yōu)選至少25個(gè)，更優(yōu)選至少35個(gè)核苷酸。也可以用較長(zhǎng)的探針。DNA和RNA探針都可以使用。通常將探針標(biāo)記以檢測(cè)相應(yīng)基因(例如，用32P、3H、35S、生物素、抗生物素蛋白、熒光素或洋地黃毒苷)。本發(fā)明也涵蓋這些探針。
因此，可以從制備自其他生物的基因組DNA或cDNA文庫(kù)篩選可與文中描述的探針雜交并編碼trichodiene合成酶的DNA?？梢酝ㄟ^(guò)瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠電泳，或者其他分離技術(shù)來(lái)分離來(lái)自其他生物的基因組或其他DNA。可以將來(lái)自文庫(kù)的DNA或分離的DNA轉(zhuǎn)移并固定在硝酸纖維素或其他合適的載體材料上。為了鑒定與SEQ ID NO1或其亞序列同源的克隆或DNA，在Southern印跡中使用載體材料。本發(fā)明中，雜交指核酸序列與標(biāo)記核酸探針在極低到極高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可雜交，該探針對(duì)應(yīng)SEQ ID NO1所示的核酸序列，其互補(bǔ)鏈或亞序列。用X-光膠片檢測(cè)與所述核酸探針在這些條件下發(fā)生雜交的分子。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，核酸探針是編碼SEQ ID NO2之多肽的核酸序列或其亞序列。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，核酸探針是SEQ IDNO1中2521到3686位核苷酸。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，核酸探針是包含在質(zhì)粒pTri5中的核酸序列，該質(zhì)粒包含于大腸桿菌NRRLB-30029中，所述核酸序列編碼trichodiene合成酶。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，核酸探針是大腸桿菌NRRL B-30029包含的質(zhì)粒pTri5中所含有的成熟多肽編碼區(qū)。
對(duì)于至少長(zhǎng)100個(gè)核苷酸的長(zhǎng)探針，極低到極高嚴(yán)謹(jǐn)條件定義為依照常規(guī)Southern印跡步驟后，于42℃在5X SSPE、0.3％SDS、200μg/ml剪切變性的鮭精DNA以及對(duì)極低和低嚴(yán)謹(jǐn)度是25％甲酰胺，對(duì)中等和中高嚴(yán)謹(jǐn)度是35％甲酰胺，或者對(duì)高和極高嚴(yán)謹(jǐn)度是50％甲酰胺中進(jìn)行預(yù)雜交和雜交。
對(duì)于至少長(zhǎng)100個(gè)核苷酸的長(zhǎng)探針，最后將載體材料洗3次，每次用2X SSC、0.2％SDS，優(yōu)選于至少45℃(極低度嚴(yán)謹(jǐn))、更優(yōu)選于至少50℃(低度嚴(yán)謹(jǐn))、更優(yōu)選于至少55℃(中等嚴(yán)謹(jǐn))、更優(yōu)選于至少60℃(中高度嚴(yán)謹(jǐn))，甚至還要優(yōu)選的是至少65℃(高度嚴(yán)謹(jǐn))，最優(yōu)選于至少70℃(極高度嚴(yán)謹(jǐn))洗15分鐘。
對(duì)于大約15到70個(gè)核苷酸長(zhǎng)的短探針，嚴(yán)謹(jǐn)條件定義為依照常規(guī)Southern印跡步驟后，于低于按Bolton和McCarthy的公式(1962，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院學(xué)報(bào)，481390)計(jì)算的Tm大約5到10℃的溫度下，在0.9M NaCl、0.09M Tris-HCl(pH7.6)、6mM EDTA、0.5％NP-40、1XDenhardt’s溶液、1mM焦磷酸鈉、磷酸二氫鈉、0.1mM ATP和0.2mg/ml酵母RNA中預(yù)雜交、雜交和雜交后洗滌。
對(duì)于大約15到70個(gè)核苷酸長(zhǎng)的短探針，在比計(jì)算的Tm低大約5到10℃的溫度下，載體材料在加有0.1％SDS的6X SCC中洗15分鐘一次，用6X SSC洗兩個(gè)15分鐘。
在第三個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及具有SEQ ID NO2氨基酸序列的trichodiene合成酶的變體，所述變體中包含1或多個(gè)氨基酸的取代、缺失和/或插入。
所述變體多肽的氨基酸序列與SEQ ID NO2或其成熟多肽的氨基酸序列不同之處在于插入或缺失1或多個(gè)氨基酸殘基和/或以不同氨基酸殘基取代1或多個(gè)氨基酸殘基。優(yōu)選地，氨基酸變化較小，即不會(huì)顯著影響蛋白質(zhì)的折疊和/或活性的保守性氨基酸取代；小的缺失，通常為1到大約30個(gè)氨基酸的缺失；小的氨基或羧基端延伸，比如，氨基端甲硫氨酸殘基；多達(dá)大約20-25個(gè)殘基的小接頭肽；或者通過(guò)改變凈電荷或其它功能來(lái)協(xié)助純化的小延伸，比如多聚組氨酸片段，抗原表位或結(jié)合域。
保守性取代的例子是堿性氨基酸(精氨酸、賴氨酸和組氨酸)、酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)、極性氨基酸(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水氨基酸(亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸)、芳香族氨基酸(苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸)和小氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸和甲硫氨酸)各組內(nèi)的取代。一般不改變其比活性的氨基酸取代是本領(lǐng)域已知的，并且H.Neurath和R.L.Hill，1979在《蛋白質(zhì)》(AcademicPress，New York)中描述過(guò)。最常見(jiàn)的替換是Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu和Asp/Gly以及相反替換。
本發(fā)明的多肽具有SEQ ID NO2之成熟多肽的至少20％、優(yōu)選至少40％、更優(yōu)選至少60％、更優(yōu)選至少80％、更優(yōu)選至少90％，最優(yōu)選至少100％的trichodiene合成酶活性。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的trichodiene合成酶得自Fusarium venenatum菌株，更優(yōu)選得自Fusarium venenatumATCC20334或其突變菌株，例如具有SEQ ID NO2之氨基酸序列的多肽。
“分離的”trichodiene合成酶文中定義為這樣一種多肽，其基本上不含其他多肽，例如，通過(guò)SDS-PAGE確定，至少大約20％純、優(yōu)選至少大約40％純、更優(yōu)選至少大約60％純、更優(yōu)選至少大約80％純，最優(yōu)選大約90％純，甚至更加最優(yōu)選的是大約95％純。
本發(fā)明還涉及編碼本發(fā)明所述trichodiene合成酶的分離的核酸序列。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，該核酸序列如SEQ ID NO1所示。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，該核酸序列是包含于大腸桿菌NRRL B-30029內(nèi)的質(zhì)粒pTri5中含有的序列。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，該核酸序列是SEQ ID NO1的成熟多肽編碼區(qū)。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，該核酸序列是包含于大腸桿菌NRRL B-30029內(nèi)的質(zhì)粒pTri5中含有的成熟多肽編碼區(qū)。本發(fā)明還涵蓋編碼具有氨基酸序列SEQ ID NO2的多肽的核酸序列，該核酸序列與SEQ ID NO1的區(qū)別在于遺傳密碼的簡(jiǎn)并性。本發(fā)明還涉及編碼SEQ ID NO2的具有trichodiene合成酶活性的片段的SEQ ID NO1亞序列。
SEQ ID NO1的亞序列是SEQ ID NO1包含的核酸序列，但在5’和/或3’末端缺失了1或多個(gè)核苷酸。優(yōu)選地，亞序列含有至少870個(gè)核苷酸，更優(yōu)選至少960個(gè)核苷酸，最優(yōu)選至少1050個(gè)核苷酸。
本發(fā)明還涉及在SEQ ID NO1的成熟多肽編碼序列中包含至少1個(gè)突變的突變核酸序列，其中所述突變核酸序列編碼由SEQ ID NO2的1到380位氨基酸構(gòu)成的多肽。
文中描述了用于分離或克隆編碼多肽的核酸序列的技術(shù)。所述核酸序列可以克隆自鐮孢屬菌株，或者另一種或相關(guān)生物，并且例如可以是所述核酸序列的多肽編碼區(qū)的等位基因或物種變體。
術(shù)語(yǔ)“分離的核酸序列”用在文中指這樣一個(gè)核酸序列，它基本上不含其他核酸序列，例如通過(guò)瓊脂糖電泳確定為至少大約20％純，優(yōu)選至少大約40％純，更優(yōu)選至少大約60％純，更優(yōu)選至少大約80％純，最優(yōu)選至少大約90％。例如，通過(guò)基因工程中用來(lái)將核酸序列從它的天然位置重新放置到它可以被增殖的不同位點(diǎn)的常規(guī)克隆技術(shù)，就可以獲得分離的核酸序列?？寺∵^(guò)程可能包括包含編碼多肽的核酸序列的所需核酸片段的切割和分離、將片段插入載體分子，以及將重組載體摻入到宿主細(xì)胞中，由此將復(fù)制出多個(gè)拷貝或克隆的核酸序列。所述核酸序列可以是基因組、cDNA、RNA、半合成、合成來(lái)源或者它們的任何組合形式。
本發(fā)明還涉及與SEQ ID NO1中2521到3686位核苷酸同源性至少大約97％，并編碼trichodiene合成酶的核酸序列。本發(fā)明中，兩個(gè)核酸序列之間的同源性是通過(guò)Wilbur-Lipman方法(Wilbur和Lipman，1983，美國(guó)科學(xué)院學(xué)報(bào)80726-730)，使用LASERGENETMMEGALIGNTM軟件(DNASTAR，Inc.Madison，WI)確定的，該軟件中使用相同表和以下多重比對(duì)參數(shù)缺口罰分10，缺口長(zhǎng)度罰分10。成對(duì)比對(duì)參數(shù)為Ktuple＝3，缺口罰分＝3，窗口＝20。
對(duì)編碼本發(fā)明所述trichodiene合成酶的核酸序列進(jìn)行修飾可能是合成與trichodiene合成酶基本上類似的多肽所必需的。術(shù)語(yǔ)與trichodiene合成酶“基本上類似”指該多肽的非天然形式。這些多肽可能與分離自天然來(lái)源的trichodiene合成酶在某些工程化方法上不同，例如，比活性、熱穩(wěn)定性、最適pH等不同的變體?？梢栽赟EQID NO1之多肽編碼部分所示的核酸序列(例如其亞序列)的基礎(chǔ)上，和/或通過(guò)引入核苷酸取代，該取代不會(huì)使核酸序列編碼的多肽具有另一個(gè)氨基酸序列，但符合用來(lái)產(chǎn)生酶的宿主微生物的密碼子使用習(xí)慣，或者通過(guò)引入能產(chǎn)生不同氨基酸序列的核苷酸取代，從而構(gòu)建所述變體序列。對(duì)核苷酸取代的全面描述，參見(jiàn)，例如Ford等，1991，蛋白質(zhì)表達(dá)和純化295-107。
可以在分子的功能關(guān)鍵區(qū)以外進(jìn)行這類取代，仍得到有活性的多肽，這對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見(jiàn)的。對(duì)于本發(fā)明所述分離核酸序列編碼的多肽的活性起關(guān)鍵作用，因此優(yōu)選不對(duì)它們進(jìn)行取代的氨基酸殘基，可以根據(jù)本領(lǐng)域已知步驟，比如定點(diǎn)誘變或丙氨酸掃描誘變來(lái)鑒定(參見(jiàn)，例如，Cunningham和Wells，1989，科學(xué)2441081-1085)。在后一種技術(shù)中，在分子中每個(gè)帶正電的殘基處引入突變，測(cè)試所得突變分子的trichodiene合成酶活性，以便鑒定對(duì)分子活性至關(guān)重要的氨基酸殘基。通過(guò)分析比如通過(guò)核磁共振、結(jié)晶學(xué)或光親合標(biāo)記技術(shù)等確定的三維結(jié)構(gòu)，也可以確定底物-酶相互作用的位點(diǎn)(參見(jiàn)，例如，de Vos等，1992，科學(xué)255306-312；Smith等，1992，分子生物學(xué)雜志224899-904；Wlodaver等，1992，F(xiàn)EBS快報(bào)30959-64)。
本發(fā)明還涉及編碼本發(fā)明所述trichodiene合成酶的分離的核酸序列，該序列與下述核酸探針在極低嚴(yán)謹(jǐn)條件下，優(yōu)選在低嚴(yán)謹(jǐn)條件下，更優(yōu)選中等嚴(yán)謹(jǐn)條件下，更優(yōu)選中高嚴(yán)謹(jǐn)條件下，更優(yōu)選高度嚴(yán)謹(jǐn)條件下，最優(yōu)選極高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可雜交，所述探針在相同條件下與SEQ ID NO1之核酸序列或其互補(bǔ)鏈可雜交；或文中定義的其等位基因變體或亞序列(Sambrook等，1989，同前)。
本發(fā)明還涉及這樣產(chǎn)生的分離的核酸序列(a)將DNA在極低、低、中等、中高、高或極高嚴(yán)謹(jǐn)條件下與(i)SEQ ID NO1的2521到3686位核苷酸，(ii)包含在SEQ ID NO1的2521到3686位核苷酸中的cDNA序列，(iii)(i)或(ii)的亞序列，或者(iv)(i)、(ii)或(iii)的互補(bǔ)鏈雜交；以及(b)分離該核酸序列。所述亞序列優(yōu)選是至少100個(gè)核苷酸的序列，比如編碼具有trichodiene合成酶活性的多肽片段的序列。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述編碼trichodiene合成酶的分離的核酸序列得自Fusarium venenatum，在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，該核酸序列得自Fusarium venenatum ATCC 20334，例如SEQ ID NO1所示核酸序列。在另一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，該核酸序列是包含于大腸桿菌NRRL B-30029內(nèi)的質(zhì)粒pTri5中含有的序列。本申請(qǐng)還涵蓋與SEQ ID NO1因遺傳密碼簡(jiǎn)并性而不同的核酸序列。
可以從Fusarium venenatum的分類學(xué)上的等同微生物(按照Yoder和Christianson(1998，同前)以及O’Donnell等(1998，同前)的定義，不論它們現(xiàn)在稱為何菌種)獲得所述核酸序列。
本發(fā)明另外涉及制備突變核酸序列的方法，包括向SEQ ID NO1的成熟多肽編碼序列或其亞序列中導(dǎo)入至少一個(gè)突變，其中該突變核酸序列編碼由SEQ ID NO2的1到380位氨基酸組成的多肽或者其具有trichodiene合成酶活性的片段。
可以采用本領(lǐng)域已知方法，通過(guò)定點(diǎn)誘變來(lái)向所述核酸序列中導(dǎo)入突變以便將一個(gè)核苷酸置換為另一核苷酸。尤其有用的步驟利用一個(gè)帶有目的插入片段的超螺旋雙鏈DNA載體和兩個(gè)含有所需突變的合成引物。所述寡核苷酸引物分別與載體的相對(duì)鏈互補(bǔ)，它們借助PfuDNA聚合酶在溫度循環(huán)過(guò)程中延伸。引物摻入后將產(chǎn)生含有交錯(cuò)切口的突變質(zhì)粒。在溫度循環(huán)之后，用DpnI處理產(chǎn)物，該酶特異識(shí)別甲基化和半甲基化DNA，由此消化親本DNA模板并能選擇含有突變的合成DNA。也可以使用本領(lǐng)域已知的其他步驟。
本發(fā)明還涉及用于表達(dá)所述序列的含有SEQ ID NO1之核酸序列、其亞序列或同源物的核酸構(gòu)建體、重組表達(dá)載體和宿主細(xì)胞。可以按照文中的描述構(gòu)建所述構(gòu)建體和載體。宿主細(xì)胞可以是任何適用于表達(dá)該核酸序列的細(xì)胞。術(shù)語(yǔ)“宿主細(xì)胞”涵蓋親本細(xì)胞的任何后代，它與親本細(xì)胞的不同源于復(fù)制過(guò)程中發(fā)生的突變。選擇宿主細(xì)胞很大程度上取決于編碼多肽的基因和它的來(lái)源。
宿主細(xì)胞可以是真核細(xì)胞，比如哺乳動(dòng)物、昆蟲(chóng)、植物或真菌細(xì)胞。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞是一種真菌細(xì)胞。文中所用“真菌”包括子囊菌門(mén)(Ascomycota)、擔(dān)子菌門(mén)(Basidiomycota)、壺菌門(mén)(Chytridiomycota)和接合菌門(mén)(Zygomycota)(如Hawksworth等在Ainsworth and Bisby’s Dictionary of The Fungi，第8版，1995，CAB International，University Press，Cambridge，UK中的定義)以及卵菌門(mén)(Oomycota)(Hawksworth等，1995，同前，171頁(yè))和所有的有絲分裂孢子真菌(Hawksworth等，1995，同前)。
在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，該真菌宿主細(xì)胞是一種酵母細(xì)胞。文中使用的“酵母”包括產(chǎn)子囊酵母(內(nèi)孢霉目)、產(chǎn)擔(dān)子酵母和屬于半知菌類的酵母(芽孢綱)。因?yàn)榻湍傅姆诸愒趯?lái)可能改變，就本發(fā)明的目的而言，應(yīng)按照《酵母的生物學(xué)和活性》(Skinner，F(xiàn).A.，Passmore，S.M.和Davenport，R.R.，編，Soc.App.Bacteriol.論文集9，1980)中的描述來(lái)定義酵母。
在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，酵母宿主細(xì)胞是假絲酵母屬、漢遜酵母屬、克魯維酵母屬、畢赤酵母屬、酵母屬、裂殖酵母屬或者Yarrowia屬的細(xì)胞。
在一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，酵母宿主細(xì)胞是卡爾酵母、釀酒酵母、糖化酵母、Saccharomyces douglasii、克魯弗酵母、諾地酵母或卵形酵母(Saccharomyces oviformis)細(xì)胞。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，酵母宿主細(xì)胞是乳酸克魯維酵母細(xì)胞。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，酵母宿主細(xì)胞是Yarrowia lipolytica細(xì)胞。
在另一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，真菌宿主細(xì)胞是一種絲狀真菌細(xì)胞?！敖z狀真菌”包括真菌門(mén)(Eumycota)和卵菌門(mén)亞支的所有絲狀形態(tài)(如Hawksworth等定義，1995，同前)。絲狀真菌的特點(diǎn)通常在于其菌絲壁由殼多糖、纖維素、葡聚糖、脫乙酰殼多糖、甘露聚糖和其他復(fù)雜多糖組成。它們通過(guò)菌絲的延長(zhǎng)進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)，碳代謝是專性需氧的。相反，酵母比如釀酒酵母的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)是通過(guò)單細(xì)胞菌體的出芽進(jìn)行的，碳代謝是發(fā)酵性的。
在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，絲狀真菌宿主細(xì)胞是以下屬內(nèi)的種，但不限于這些屬內(nèi)的種的細(xì)胞支頂孢屬、曲霉屬、鐮孢屬、腐質(zhì)霉屬、毛霉屬、毀絲霉屬、脈孢菌屬、青霉屬、梭孢殼屬、Tolypocladium或者木霉屬。
在一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，絲狀真菌宿主細(xì)胞是泡盛曲霉、臭曲霉、日本曲霉、構(gòu)巢曲霉、黑曲霉或米曲霉細(xì)胞。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，絲狀真菌宿主細(xì)胞是桿孢狀鐮孢、F.cerealis、F.crookwellense、大刀鐮孢、禾本科鐮孢、禾赤鐮孢、異孢鐮孢、合歡木鐮孢、尖鐮孢、多枝鐮孢、粉紅鐮孢、接骨木鐮孢、膚色鐮孢、擬分枝孢鐮孢、硫色鐮孢、F.torulosum、F.trichothecioides或F.venenatum細(xì)胞。在一個(gè)更加最優(yōu)選的實(shí)施方案中，絲狀真菌親本細(xì)胞是F.venenatum(Nirenberg新種)細(xì)胞。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，絲狀真菌宿主細(xì)胞是Humicola insolens、H.lanuginosa、米赫毛霉、嗜熱毀絲霉、粗糙脈孢菌、產(chǎn)紫青霉、Thielaviaterrestris、Trichoderma harzianum、康寧氏木霉、Trichodermalongibrachiatum、Trichoderma reesei或綠色木霉細(xì)胞。
可以利用文中描述的步驟來(lái)轉(zhuǎn)化所述絲狀真菌細(xì)胞。轉(zhuǎn)化酵母可以使用Becker和Guarente(在Abelson，J.N.Simon，M.I.編的酵母遺傳學(xué)和分子生物學(xué)指南，酶學(xué)方法194卷，182-187，AcademicPress，Inc.，New York)、Ito等(1983，細(xì)菌學(xué)雜志153163)以及Hinnen等(1978，美國(guó)科學(xué)院學(xué)報(bào)751920)描述的步驟。
本發(fā)明還涉及制備本發(fā)明所述trichodiene合成酶的方法，包括(a)培養(yǎng)一個(gè)菌株來(lái)制備包含trichodiene合成酶的上清液，所述菌株的野生型能產(chǎn)生所述多肽；和(b)回收trichodiene合成酶。優(yōu)選地，該菌株屬于鐮孢屬，更優(yōu)選是Fusarium venenatum。
本發(fā)明還涉及制備本發(fā)明所述trichodiene合成酶的方法，包括(a)在有利于產(chǎn)生trichodiene合成酶的條件下培養(yǎng)宿主細(xì)胞；和(b)回收trichodiene合成酶。
此外本發(fā)明涉及制備trichodiene合成酶的方法，包括(a)在適合產(chǎn)生由內(nèi)源核酸序列編碼的trichodiene合成酶的條件下培養(yǎng)一種同源重組細(xì)胞，該細(xì)胞中摻入了一個(gè)新的轉(zhuǎn)錄單元，包含調(diào)控序列、外顯子和/或可操縱地連接著本發(fā)明所述核酸序列(它對(duì)于細(xì)胞是內(nèi)源的)的第二外顯子的剪接供體位點(diǎn)；以及(b)回收trichodiene合成酶。該方法基于利用基因活化技術(shù)，例如美國(guó)專利5641670中描述的。
在本發(fā)明的制備方法中，利用文中描述的本領(lǐng)域的已知方法在適合產(chǎn)生trichodiene合成酶的營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)中培養(yǎng)所述細(xì)胞?？梢圆捎帽绢I(lǐng)域已知的該酶的特異方法來(lái)檢測(cè)trichodiene合成酶(參見(jiàn)，例如，Hohn和Beremand，1989，應(yīng)用和環(huán)境微生物學(xué)551500-1503)。通過(guò)文中描述的本領(lǐng)域已知方法可以將得到的trichodiene合成酶回收并純化。
無(wú)硝酸還原酶選擇標(biāo)記的突變細(xì)胞本發(fā)明還公開(kāi)了利用硝酸還原酶基因作為修飾靶基因或DNA元件的選擇標(biāo)記從而減少或消除細(xì)胞內(nèi)一種基因產(chǎn)物的產(chǎn)生。然后可以從細(xì)胞中缺失掉硝酸還原酶基因以便產(chǎn)生不含選擇標(biāo)記的細(xì)胞。
因此本發(fā)明還涉及獲得突變細(xì)胞的方法，包括(a)向具有編碼一種基因產(chǎn)物的核酸序列的親本細(xì)胞中導(dǎo)入一個(gè)核酸構(gòu)建體，該構(gòu)建體含有作為選擇標(biāo)記的硝酸還原酶基因和對(duì)該核酸序列的修飾，其中所述構(gòu)建體整合至親本細(xì)胞的基因組中取代核酸序列，造成培養(yǎng)在相同條件下時(shí)，其基因產(chǎn)物較之親本細(xì)胞減少；和(b)從步驟(a)挑選含有硝酸還原酶基因并且所述基因產(chǎn)物減少的突變細(xì)胞。
硝酸還原酶催化硝酸鹽向亞硝酸鹽的轉(zhuǎn)化，這使得細(xì)胞能以硝酸鹽為唯一氮源生長(zhǎng)。對(duì)于缺少或僅有有限的能力利用硝酸鹽作為唯一氮源的細(xì)胞，從理論上來(lái)說(shuō)，只要細(xì)胞能攝取硝酸鹽，就可以利用硝酸還原酶基因作為選擇標(biāo)記。優(yōu)選硝酸還原酶基因在所選細(xì)胞內(nèi)是顯性的。編碼硝酸還原酶的DNA可以是基因組、cDNA、RNA、半合成、合成來(lái)源的，或者是它們的任何組合形式，能產(chǎn)生有功能的酶。
可以利用文中描述的或本領(lǐng)域已知的任何重組方法來(lái)從任何來(lái)源中獲得硝酸還原酶。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，硝酸還原酶得自真菌來(lái)源，更優(yōu)選得自酵母或絲狀真菌菌株。在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，硝酸還原酶得自粗糙脈孢菌(nit3，參見(jiàn)，F(xiàn)u和Marzluf，1987，美國(guó)科學(xué)院學(xué)報(bào)848243-8247)。在另一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，硝酸還原酶得自曲霉屬菌株(niaD)，比如構(gòu)巢曲霉、黑曲霉、米曲霉和寄生曲霉。在另一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，硝酸還原酶得自鐮孢屬菌株(nia)，比如尖鐮孢。
利用文中描述的或者本領(lǐng)域已知的基因插入、打斷、取代或缺失方法可以對(duì)靶核酸序列進(jìn)行修飾?；蛐揎椏梢允前泻怂嵝蛄谢蚱湟徊糠种械?或多個(gè)核苷酸改變，例如插入、缺失和/或取代，所述部分是比如，但不限于編碼區(qū)、信號(hào)序列、啟動(dòng)子、終止子、內(nèi)含子或調(diào)控DNA序列。因此構(gòu)建一個(gè)包含靶核酸序列或其部分被修飾形式的核酸構(gòu)建體以便用于消除或減少該核酸序列的表達(dá)。然后將該構(gòu)建體轉(zhuǎn)化到親本細(xì)胞中產(chǎn)生缺陷的核酸序列，在此通過(guò)同源重組，缺陷序列取代了靶序列或其一部分。為了導(dǎo)入細(xì)胞，所述構(gòu)建體可以包含在一個(gè)載體上。硝酸還原酶基因作為選擇標(biāo)記用于鑒定含有缺陷核酸序列的轉(zhuǎn)化子。
該缺陷核酸序列可以是簡(jiǎn)單地用硝酸還原酶打斷靶序列?？蛇x擇地，除了硝酸還原酶基因造成的基因打斷，缺陷核酸序列還可以含有靶序列或其一部分的插入、取代和/或缺失。此外，缺陷核酸序列可以含有靶序列或其一部分的插入、取代和/或缺失，而硝酸還原酶基因不參與修飾，但后者與缺陷序列毗連。
所述核酸構(gòu)建體在硝酸還原酶基因的5’和3’端可以進(jìn)一步含有1或多個(gè)重復(fù)序列以便協(xié)助最終缺失掉硝酸還原酶基因。重復(fù)序列可以是任何適用于促進(jìn)染色體內(nèi)同源重組的核酸序列。通過(guò)提高基因進(jìn)行染色體內(nèi)同源重組的能力可以顯著地增加標(biāo)記基因缺失的頻率。
硝酸還原酶的一個(gè)有用特性是它能將氯酸鹽轉(zhuǎn)化為對(duì)細(xì)胞有毒的亞氯酸鹽。正是這個(gè)特性形成了本發(fā)明另一個(gè)方面，即制備不含硝酸還原酶選擇標(biāo)記的轉(zhuǎn)化子的基礎(chǔ)。轉(zhuǎn)化氯酸鹽的特性使得能反選擇轉(zhuǎn)化細(xì)胞。使挑選出的含有硝酸還原酶基因的轉(zhuǎn)化子生長(zhǎng)在以氯酸鹽為唯一氮源的培養(yǎng)基上，鑒定存活的轉(zhuǎn)化子，它們已丟失硝酸還原酶基因。某些存活轉(zhuǎn)化子可能自身在硝酸還原酶基因中有突變。因此，應(yīng)當(dāng)通過(guò)例如Southern雜交證實(shí)硝酸還原酶基因的缺失。
因此，獲得突變細(xì)胞的方法可以進(jìn)一步包括(c)在培養(yǎng)條件下從步驟(b)中挑選已缺失硝酸還原酶基因的突變細(xì)胞?？蛇x擇地，獲得突變細(xì)胞的方法還可以包括(c)向來(lái)自步驟(b)的突變細(xì)胞中導(dǎo)入第二核酸構(gòu)建體，該構(gòu)建體包含含有被修飾核酸序列的5’和3’區(qū)，但缺少硝酸還原酶基因的第二核酸序列，其中所述第二構(gòu)建體摻入到親本細(xì)胞的基因組中，以第二核酸序列取代被修飾的核酸序列，以及(d)在培養(yǎng)條件下從步驟(c)中挑選已缺失硝酸還原酶基因的突變細(xì)胞。
在這兩種情況下，培養(yǎng)條件包括反選擇硝酸還原酶的含有氯酸鹽的反選擇培養(yǎng)基。
缺失作為選擇標(biāo)記的硝酸還原酶基因的一個(gè)優(yōu)選構(gòu)建體從5’到3’應(yīng)含有以下元件待缺失基因的5’端序列，其直接與待缺失基因的3’端序列融合在一起，下游隨之是有功能的硝酸還原酶基因，再下游又是待缺失基因的3’端序列。在這種情況中，選擇待缺失基因3’端的兩個(gè)序列以使它們形成側(cè)接選擇標(biāo)記基因的重復(fù)區(qū)。該核酸構(gòu)建體的轉(zhuǎn)化以及隨后待缺失基因的5’和3’序列交換點(diǎn)取代該核酸構(gòu)建體待缺失基因的染色體拷貝，導(dǎo)致所述基因的缺失。隨后側(cè)接選擇標(biāo)記基因的重復(fù)序列之間的染色體內(nèi)重組以及對(duì)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行的反選擇最終產(chǎn)生不含選擇標(biāo)記的菌株。5’和3’重復(fù)序列不必都存在于構(gòu)建體中，因?yàn)榭梢岳脝蝹€(gè)重復(fù)序列通過(guò)單交換整合來(lái)缺失基因。可以這樣一種方式構(gòu)建構(gòu)建體，其在缺失硝酸還原酶基因后，沒(méi)有外來(lái)的硝酸還原酶基因DNA還保持在轉(zhuǎn)化細(xì)胞的染色體中。
所述構(gòu)建體可以包含在載體中。可以按照文中的描述制備構(gòu)建體和載體。
本發(fā)明的方法可以用來(lái)減少或消除1或多種靶基因產(chǎn)物的產(chǎn)生，這些靶基因產(chǎn)物是生產(chǎn)目的蛋白質(zhì)(或化合物)時(shí)不需要的，特別是靶基因產(chǎn)物對(duì)所述蛋白質(zhì)或化合物的產(chǎn)生、回收和/或應(yīng)用有害時(shí)更可如此。這些方法還可以用來(lái)減少或消除抗生素和其他生物活性化合物的生物合成。
所述細(xì)胞可以是單細(xì)胞微生物，例如，原核細(xì)胞，或者非單細(xì)胞微生物，例如真核細(xì)胞，比如哺乳動(dòng)物、昆蟲(chóng)、植物或真菌細(xì)胞。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞是真菌細(xì)胞，比如酵母或絲狀真菌細(xì)胞。該酵母或真菌細(xì)胞可以是文中描述的任何細(xì)胞。
有用的單細(xì)胞細(xì)胞是細(xì)菌細(xì)胞，比如革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，包括，但不限于，芽孢桿菌細(xì)胞，例如嗜堿性芽孢桿菌、液化淀粉芽孢桿菌、短芽孢桿菌、環(huán)形芽孢桿菌、Bacillus clausii、凝結(jié)芽孢桿菌、燦爛芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌和蘇云金芽孢桿菌；或者鏈霉菌細(xì)胞，例如淺青紫鏈霉菌或鼠灰鏈霉菌，或者是革蘭氏陰性細(xì)菌比如大腸桿菌和假單胞菌屬的種。
可以利用感受態(tài)細(xì)胞(參見(jiàn)，例如Young和Spizizin，1961，細(xì)菌學(xué)雜志81823-829，或Dubnau和Davidoff-Abelson，1971，分子生物學(xué)雜志56209-221)通過(guò)原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化(參見(jiàn)，例如Chang和Cohen，1979，分子普通遺傳學(xué)168111-115)、電穿孔(參見(jiàn)，例如Shigekawa和Dower，1988，生物技術(shù)6742-751)或接合(參見(jiàn)，例如Koehler和Thorne，1987，細(xì)菌學(xué)雜志1695771-5278)將構(gòu)建體導(dǎo)入細(xì)菌細(xì)胞。
本發(fā)明還涉及通過(guò)這些方法產(chǎn)生的突變細(xì)胞。本發(fā)明的突變細(xì)胞可以用于制備該突變細(xì)胞的天然或外來(lái)多肽。所述多肽可以是任何多肽，比如文中描述過(guò)的。利用文中描述的方法可以在本發(fā)明所述突變細(xì)胞中表達(dá)多肽。
本發(fā)明還涉及制備多肽的方法，包括(a)在有利于產(chǎn)生多肽的條件下培養(yǎng)含有編碼所述多肽的核酸序列的突變細(xì)胞；以及(b)從突變細(xì)胞的培養(yǎng)基中分離多肽。文中描述了培養(yǎng)突變體和分離多肽的方法。
通過(guò)以下實(shí)施例進(jìn)一步描述本發(fā)明，但不應(yīng)將實(shí)施例理解為對(duì)發(fā)明范圍的限制。
實(shí)施例材料用作緩沖液和底物的化學(xué)藥品是至少試劑純的商品。
菌株鐮孢屬菌株A3/5，現(xiàn)在重新分類為Fusarium venenatum(Yoder和Christianson，1998，真菌遺傳學(xué)與生物學(xué)2362-80；O’Donnell等，1998，真菌遺傳學(xué)與生物學(xué)2357~67)，其得自Dr.AnthonyTrinci(Universisty of Manchester，Manchester，England) 或者美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(Manassas，VA)的鐮孢屬菌株ATCC 20334。Fusarium venenatum 菌株#93(BBA 64537)得自BiologischeBundensanstalt fur Land-und Fortswirtschaft，Berlin，德國(guó)。Fusarium venenatum A3/5的形態(tài)學(xué)突變體，命名為CC1-1、CC1-2、CC1-3、CC1-5、CC1-8、CC2-3、MC3-2、MC3-5、MC3-6和MC3-9(Wiebe等，1992，真菌學(xué)研究96555-562；Wiebe等，1991，真菌學(xué)研究951284~1288；Wiebe等，1991，真菌學(xué)研究96555-562)是高度分枝的菌落變體。以下菌株均來(lái)源于Fusarium venenatum A3/5的形態(tài)學(xué)突變體CC1-3Fusarium venenatum MLY3(CC1-3的一個(gè)衍生物，它與CC1-3的互補(bǔ)特性相同)；Fusarium venenatum JRoy36-19B(CC1-3，木聚糖酶+，bar+)；Fusarium venenatum LyMC4(CC1-3，tri5缺失，amdS+bar+.木聚糖酶+)；Fusariwn venenatum LyMC4.B(CC1-3，tri5缺失，amdS+，bar+，木聚糖酶+，LyMC4的單孢子分離物)；Fusariumvenenatum LYMC4.C(CC1-3，tri5缺失，amdS+，bar+，木聚糖酶+，LyMC4的單孢子分離物)；Fusariwn venenatum LyMC19(CC1-3，tri5缺失，andS+，bar+，木聚糖酶+)；Fusarium venenaturn LyMC19.2(CC1-3，tri5缺失，amdS+，bar+，木聚糖酶+，LyMC19的單孢子分離物)；Fusariwn venenatum LyMC19.5(CC1-3，tri5缺失，amdS+，bar+，木聚糖酶+，LyMC19的單孢子分離物)；Fusarium venenatumLyMC1(MLY3，tri5缺失)；Fusarium venenatum LyMC1A(MLY3，tri5缺失，amdS，單孢子分離物)；Fusarium venenaturn LyMC1B(MLY3.tri5缺失，amdS，單孢子分離物)；以及Fusarium venenatum LyMC1C(MLY3，tri5缺失，amdS，單孢子分離物)。
培養(yǎng)基和溶液AMG微量金屬溶液每升含有14.3g ZnSO4·7H2O、2.5g CuSO4·5H2O、0.5g NiCl2、13.8g FeSO4、8.5g MnSO4和3.0g檸檬酸。
生物素儲(chǔ)液為在100ml 50％乙醇中含有5mg生物素。
COVE微量金屬溶液每升含有0.04g NaB4O7·10H2O、0.4gCuSO4·5H2O、1.2g FeSO4·7H2O、0.7g MnSO4·H2O、0.8g Na2MoO2·2H2O以及10g ZnSO4·7H2O。
50X COVE鹽溶液每升含有26g KCl、26g MgSO4·7H2O、76g KH2PO4以及50ml COVE微量金屬溶液。
COVE培養(yǎng)基每升含有342.3g蔗糖、20ml 50X COVE鹽溶液、1mM乙酰胺、1.5mM CsCl2和25g Noble瓊脂。
50X Vogels培養(yǎng)基每升含有150g檸檬酸鈉、250g KH2PO4、10gMgSO4·7H2O、10g CaCl2·2H2O、2.5ml生物素儲(chǔ)液以及5.0ml AMG微量金屬溶液。
COVE頂層瓊脂糖每升含有20ml 50X COVE鹽、0.8M蔗糖、15mM氯化銫、10mM乙酰胺和10g低熔點(diǎn)瓊脂糖，pH調(diào)至6.0。
NY50培養(yǎng)基每升含有62.5g Nutriose 725、2g MgSO4·7H2O、10gKH2PO4、2g K2SO4、2g檸檬酸、10g酵母提取物、2g尿素、0.5gCaCl2·2H2O和0.5ml AMG微量金屬溶液，pH6.0。
NYU35培養(yǎng)基每升含有35g麥芽糖糊精、1g MgSO4·7H2O、2g KH2PO4、2g檸檬酸、4g酵母提取物、1g尿素和0.25ml AMG微量金屬溶液，pH6.0。
RA生孢培養(yǎng)基每升含有50g琥珀酸、12.1g NaNO3、1g葡萄糖、20ml50X Vogels和0.5ml 10mg/ml NaMoO4儲(chǔ)液，pH6.0。
YEG培養(yǎng)基每升含有5g酵母提取物和20g葡萄糖。
YEP培養(yǎng)基每升含有10g酵母提取物和20g蛋白胨。
YEPG培養(yǎng)基每升含有10g酵母提取物、20g蛋白胨和20g葡萄糖。
基本培養(yǎng)基每升含有6g NaNO3、0.52g KCl、1.52gKH2PO4、1ml COVE微量金屬溶液、1g葡萄糖、500mg MgSO4～7H2O、342.3g蔗糖以及20g Noble瓊脂(pH6.5)。
STC含有0.8M山梨醇、25mM Tris(pH8)、25mM CaCl2。
SPTC含有40％PEG4000、0.8M山梨醇、25mM Tris pH8、25mM CaCl2。
M400Da培養(yǎng)基每升含有50g麥芽糖糊精、2g MgSO4～7H2O、2g KH2PO4、4g檸檬酸、8g酵母提取物、2g尿素以及1ml COVE微量金屬溶液。
生孢III培養(yǎng)基每升含有20ml 50X Vogels、4g葡萄糖、0.8gNaNO3和1ml 10mg/ml NaMoO4儲(chǔ)液。
含有BASTATM的Vogels培養(yǎng)基(第一階段種子接種)每升含有20ml50X Vogels、5％葡萄糖、16.5一元堿磷酸銨以及5mg BASTATM/ml，pH6.5。
用于挑選niaD突變體的氯酸鉀培養(yǎng)基每升含有20ml 50X COVE鹽溶液、61.28g氯酸鉀、0.3g尿素、25g noble瓊脂和2％高溫滅菌后加入的葡萄糖。
氟乙酰胺培養(yǎng)基每升含有12g醋酸鈉、2g氯化鈉、0.5g MgSO4、3gKH2PO4、0.3g尿素、2g氟乙酰胺、1ml Vogels鹽和15g Noble瓊脂，pH6.1。
TAE緩沖液每升含有4.84gTris堿、1.14ml冰醋酸以及2ml 0.5MEDTA，pH8.0。
實(shí)施例1提取Fusarium venenatum ATCC 20334基因組DNA將Fusarium venenaturn ATCC 20334在25ml YEG培養(yǎng)基中于28℃、150rpm生長(zhǎng)24小時(shí)。然后經(jīng)Miracloth(Calbiochem，La Jolla，CA)過(guò)濾收集菌絲，并用25ml 10mM Tris-1mM EDTA(TE)緩沖液洗一次。從菌絲上吸去多余的緩沖液，隨后將菌絲冷凍在液氮中。在電咖啡磨中將冷凍的菌絲磨成細(xì)粉，粉末加入一次性塑料離心管中的20mlTE緩沖液和5ml 20％w/v十二烷基硫酸鈉(SDS)中。將混合體系輕輕地顛倒幾次以確?；靹?，用等體積的苯酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1v/v/v)抽提兩次。加入醋酸鈉(3M溶液)至終濃度0.3M，用2.5體積的冰冷乙醇沉淀核酸。將試管在15,000xg離心30分鐘，沉淀風(fēng)干30分鐘，然后重懸于0.5ml TE緩沖液中。加入無(wú)DNase的核糖核酸酶至濃度為100mg/ml，混合物于37℃保溫30分鐘。然后加入蛋白酶K(200mg/ml)，將混合物于37℃再保溫1小時(shí)。最后，用酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1v/v/v)將混合物抽提兩次，然后按照常規(guī)操作用醋酸鈉和乙醇沉淀DNA。將DNA沉淀真空下干燥，重懸于TE緩沖液，儲(chǔ)存在4℃。
實(shí)施例2制備Fusarium venenatum ATCC 20334 trichodiene合成酶探針在擬分枝孢鐮孢、早熟禾鐮孢和虱狀赤霉的trichodiene合成酶的保守氨基酸序列基礎(chǔ)上，用Applied Biosystems Model 394 DNA/RNA合成儀，按照制造商的說(shuō)明，合成下列寡核苷酸引物，以便PCR擴(kuò)增來(lái)自Fusarium venenatum ATCC 20334基因組DNA的trichodiene合成酶基因片段。
引物15’-GGCTGCTCATCACTTTGCTC-3’引物25’-TGCATGAAGCACTCAATCGT-3’用大約0.8μg如實(shí)施例1所描述制備的Fusarium venenatum基因組DNA作為模板來(lái)制備擴(kuò)增反應(yīng)體系(50μl)。每個(gè)反應(yīng)體系中含有以下成分0.8μg基因組DNA、40pmol引物1、40pmol引物2、dATP、dCTP、dGTP和dTTP各200μM、1×Taq DNA聚合酶緩沖液(Perkin-Elmer Corp.，Branchburg，NJ)和2.5單位Taq DNA聚合酶(Perkin-Elmer Corp.，Branchburg，NJ)。反應(yīng)體系在一臺(tái)設(shè)定30個(gè)循環(huán)的Perkin-ElmerModel 480熱循環(huán)儀中保溫，每循環(huán)為95℃3分鐘，58℃2分鐘，72℃2分鐘。在1.5％瓊脂糖凝膠(Eastman Kodak，Rochester，NY)上分離反應(yīng)產(chǎn)物，從凝膠上切下812bp的產(chǎn)物條帶并用Qiaex II(Qiagen，Chatsworth，CA)按照制造商的說(shuō)明進(jìn)行純化。隨后將純化過(guò)的PCR產(chǎn)物克隆至pCRII載體(Invitrogen.San Diego，CA)中，利用lac正向和反向引物(New England BioLabs，Beverly，MA)確定DNA序列。
將所擴(kuò)增的基因片段與擬分枝孢鐮孢、早熟禾鐮孢和虱狀赤霉trichodiene合成酶基因序列進(jìn)行序列比較，在此基礎(chǔ)上的DNA序列分析表明擴(kuò)增的基因片段編碼相應(yīng)Fusarium venenatum trichodiene合成酶基因的一部分。按照制造商的說(shuō)明，利用DIG試劑盒(BoehringerMannheim Corp.，Indianapolis，IN)將trichodiene合成酶基因片段(812kb)經(jīng)PCR標(biāo)記上洋地黃毒苷以便探測(cè)Fusarium venenarum基因組DNA文庫(kù)。
實(shí)施例3DNA文庫(kù)及tri5克隆的鑒定利用噬菌體克隆載體λZipLox(Life Technologies，Gaithersburg，MD)，以大腸桿菌Y1090ZL細(xì)胞(Life Technologies，Gaithersburg，MD)作為鋪板和純化重組噬菌體的宿主，大腸桿菌DH10Bzip(Life Technologies，Gaithersburg，MD)作為切割單個(gè)pZLl-tri5克隆的宿主來(lái)構(gòu)建基因組DNA文庫(kù)。用Tsp509I將總細(xì)胞DNA部分消化，并在1％瓊脂糖凝膠上按大小分離。將遷移到3-8kb范圍內(nèi)的DNA片段切下，并用Qiaex(Qiagen Inc.，Chatsworth CA)從凝膠上洗脫下來(lái)。洗脫下來(lái)的DNA片段與經(jīng)EcoRI切割并去磷酸化的λZipLox載體臂(Life Technologies，Gaithersburg，MD)進(jìn)行連接，用商品化包裝提取物(Stratagene.La Jolla，CA)將連接體系包裝。包裝好的DNA文庫(kù)鋪板并在大腸桿菌Y1090ZL細(xì)胞(Life Technologies，Gaithersburg，MD)中擴(kuò)增。擴(kuò)增好的基因組文庫(kù)含有1.4×107pfu/ml。采用常規(guī)操作(參見(jiàn)，Sambrook等，1989，同前)，用實(shí)施例2中描述的非放射性洋地黃毒苷通過(guò)噬斑雜交對(duì)來(lái)自文庫(kù)的大約30,000個(gè)噬斑進(jìn)行篩選。
挑出與探針強(qiáng)雜交的3個(gè)陽(yáng)性克隆，其中的兩個(gè)在大腸桿菌Y1090ZL細(xì)胞中純化兩次。隨后從λZipLox載體中切下兩個(gè)tris5克隆pSMO129和pSMO130，作為pZL1-tri5克隆(D’Alessio等，1992，F(xiàn)ocus1476)。
實(shí)施例4Fusarium venenatum tri5基因的DNA序列分析在Applied Biosystems 373A型自動(dòng)DNA測(cè)序儀(AppliedBiosystems，Inc.，F(xiàn)oster City，CA)對(duì)tri5克隆pSMO129和pSMO130進(jìn)行DNA測(cè)序。除了lac-正向和lac-反向引物，還按照制造商的說(shuō)明在Applied Biosystems 394型DNA/RNA合成儀上合成特異性寡核苷酸測(cè)序引物。
對(duì)命名為pSMO129和pSMO130的克隆進(jìn)行的DNA測(cè)序表明，兩個(gè)克隆都不含有基因的完整序列，但含有重疊序列，從其中得到了完整基因的DNA序列。由兩個(gè)序列組合得到的DNA序列揭示出一個(gè)開(kāi)放讀碼框，如圖2所示(SEQ ID NO.1)。
由兩個(gè)重疊克隆pSO130和pSO129構(gòu)建含有完整基因片段的一個(gè)克隆。用限制酶SacI消化pSO129和pSO130，然后在1％瓊脂糖凝膠上走膠。用QIAquick凝膠提取試劑盒(Qiagen，Chatsworth，CA)從膠上分離合適的片段，并采用常規(guī)方法于14℃過(guò)夜連接從而產(chǎn)生pTri5。然后通過(guò)常規(guī)方法將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌菌株DH5α中。用QiagenMaxiPrep kit(Qiagen，Chiatsworth CA)從推測(cè)的全長(zhǎng)克隆中分離質(zhì)粒DNA，并用Applied Biosystems 373A型自動(dòng)測(cè)序儀將DNA測(cè)序，測(cè)序結(jié)果證實(shí)該序列與SEQ ID NO1相同。該克隆命名為大腸桿菌DH5αpTri5。
基于推測(cè)氨基酸序列(SEQ ID NO.2)與相應(yīng)早熟禾鐮孢trichodiene合成酶基因產(chǎn)物(SEQ ID NO.3)的比對(duì)，確定了Fusariumvenenatum ATCC 20334 trichodiene合成醇基因的內(nèi)含子和外顯子位置。根據(jù)這一比較，F(xiàn)usarium venenatum ATCC 20334 trichodiene合成酶基因含有2個(gè)外顯子(1-469bp和529-1203bp)，中間被1個(gè)小內(nèi)含子(470-528 bp)打斷。該內(nèi)含子的大小和組成與其他真菌基因的內(nèi)含子(Gurr等，1987，在Kinghorn，J.R.編的《真核微生物的基因結(jié)構(gòu)》中93-139頁(yè)，IRL Press，Oxford)一致，因?yàn)樗泄灿屑艚庸w和受體序列以及靠近每個(gè)間插序列3’端的共有套索序列(PuCTPuAC)。
Trichodiene合成酶是一種由380個(gè)氨基酸(MW＝44562)構(gòu)成的酸性蛋白質(zhì)(計(jì)算的等電點(diǎn)＝5.37)。
采用Clustal方法(Higgins，1989，CABIOS 5151-153)對(duì)trichodiene合成酶的推測(cè)氨基酸序列進(jìn)行比較比對(duì)，所述方法使用了有一個(gè)相同性表格和以下多重比對(duì)參數(shù)的LASERGENETMMEGALIGNTM軟件(DNASTAR，Inc.，Madison，WI)缺口罰分為10，缺口長(zhǎng)度罰分為10，成對(duì)比對(duì)參數(shù)為Ktuple＝1，缺口罰分＝3，窗口＝5，以及對(duì)角線＝5。
比較比對(duì)表明Fusarium venenatum ATCC 20334 trichodiene合成酶的推測(cè)氨基酸序列與早熟禾鐮孢trichodiene合成酶(Fekete etal.，1997，真菌病理學(xué)13891-97)(SEQ ID NO.3)相同性大約為96.3％。
實(shí)施例5pJRoy36的構(gòu)建構(gòu)建pJRoy36以便在Fusarium venenatum中表達(dá)Thermomyceslanuginosus(以前稱為Humicola lanuginosa)木聚糖酶。
利用剪接重疊延伸的技術(shù)使1.2kb尖鐮孢胰蛋白酶啟動(dòng)子與1.1kb尖鐮孢胰蛋白酶終止子(SP3S7)融合在一起從而構(gòu)建pDM181。在啟動(dòng)子和終止子之間插入一個(gè)含有SwaI，KpnI和PacI限制位點(diǎn)的多接頭作為重疊PCR策略的一個(gè)步驟。在啟動(dòng)子5’末端加上一個(gè)XhoI位點(diǎn)，保留天然的EcoRI位點(diǎn)。經(jīng)PCR反應(yīng)在終止子3’末端引入EcoRI，HindIII和NsiI位點(diǎn)。
利用以下引物由質(zhì)粒pJRoy20(Royer等，1995，生物技術(shù)131479-1483)制備含有尖鐮孢胰蛋白酶啟動(dòng)子-1208至-1以及一個(gè)25堿基對(duì)的多接頭的PCR片段引物1(有義)XhoIEcoRI5′-GAGCTCGAGGAATTCTTACAAACCTTCAAC-3’
引物2(反義)PacIKpnI SwaI5′-TTAATTAAGGTACCTGAATTTAAATGGTGAAGAGATAGATATCCAAG-3’100μl PCR反應(yīng)體系中含有1X Pwo緩沖液(Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN)，dATP、dCTP、dGTP和dTTP各200μM，10ng pJRoy20和5單位Pwo DNA聚合酶(Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN)。所用PCR條件為95℃ 3分鐘，然后以95℃ 30秒、50℃ 1分鐘，72℃ 1分鐘作25個(gè)循環(huán)。最后的延伸循環(huán)為72℃ 5分鐘。
采用相同的PCR條件，利用以下引物由質(zhì)粒pJRoy20制備第二個(gè)PCR片段，該片段含有尖鐮孢胰蛋白酶啟動(dòng)子-5到-1位堿基、一個(gè)25堿基對(duì)的多接頭以及1060堿基對(duì)的尖鐮孢胰蛋白酶基因3’非翻譯區(qū)(終止子區(qū)域)引物3(有義)SwaI KpnIPacI5′-TCACCATTTAAATTCAGGTACCTTAATTAAATTCCTTGTTGGAAGCGTCGA-3’引物4(反義)NsiI HindIII EcoRI5′-TGGTATGCATAAGCTTGAATTCAGGTAAACAAGATATAATTT-3’用0.2μl第一次PCR(啟動(dòng)子)反應(yīng)體系和3μl第二次(終止子)反應(yīng)體系作為模板以及引物1和4獲得最后的2.3kb重疊PCR片段，該片段含有尖鐮孢胰蛋白酶啟動(dòng)子-1208到-1位、25堿基對(duì)多接頭以及1060堿基對(duì)的尖鐮孢胰蛋白酶終止子。所用PCR條件是95℃ 3分鐘，隨后以95℃ 30秒、62℃ 1分鐘以及72℃ 3分鐘作30個(gè)循環(huán)。最后的延伸循環(huán)是72℃ 5分鐘。該反應(yīng)中還使用了Pwo DNA聚合酶。
用EcoRI消化得到的2.3kb片段(含有胰蛋白酶啟動(dòng)子、多接頭和胰蛋白酶終止子)并連接至EcoRI消化的含有bar基因的載體pMT1612(WO9726330)從而產(chǎn)生pDM181(圖3)。
所述木聚糖酶片段同樣經(jīng)PCR制備。含有Thermomyceslanuginosus木聚糖酶基因cDNA的質(zhì)粒pHD414(WO 93/11249)作為模板。用PCR引物5和6在木聚糖酶編碼序列的5’末端導(dǎo)入序列CCACC，在3’末端導(dǎo)入PacI位點(diǎn)。
引物5(有義)5’-CCACCATGGTCGGCTTTACCCCCGTT-3，引物6(反義)5’-GGTTAATTAATTAGCCCACGTCAGCAACGGT-3’PacI所用PCR條件是95℃3分鐘，隨后以95℃ 1分鐘、62℃ 1分鐘以及72℃3分鐘作25個(gè)循環(huán)。反應(yīng)體積如前面的描述。其中包含5％v/v的DMSO。
用PacI消化得到的0.7kb木聚糖酶片段并連接至用SwaI/PacI消化的pDM181形成質(zhì)粒pJRoy36(圖4)。
實(shí)施例6構(gòu)建Fusarium venenatum JRoy36-19B并表達(dá)木聚糖酶基因如下制備Fusarium venenatum CC1-3的孢子用來(lái)自補(bǔ)充了2.5％葡萄糖和2.5mM硝酸鈉的1X Vogels培養(yǎng)板(2.5％Noble瓊脂)的10個(gè)瓊脂塊接種含有500ml RA生孢培養(yǎng)基的搖瓶，于28℃，150rpm培養(yǎng)2到3天。經(jīng)Miracloth(Calbiochem，San Diego，CA)收集孢子，并在Sorvall RC-5B離心機(jī)(E.I.DuPont De Nemours and Co..Wilmington，DE)中于7000rpm離心20分鐘。用無(wú)菌蒸餾水將沉淀的孢子洗兩次，重懸于少量水中，然后用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。
如下制備原生質(zhì)體用4×107個(gè)Fusarium venenatum CC1-3孢子接種100ml YEPG培養(yǎng)基，并于24℃、150rpm培養(yǎng)16小時(shí)。將培養(yǎng)物在Sorvall RT 6000D(E.I.DuPont Dc Nemours and Co.，Wilmington，DE)于3500rpm離心7分鐘。用30ml 1M MgSO4將沉淀洗兩次，重懸于15ml溶于1M MgSO4的5mg/ml NOVOZYME 234TM(批號(hào)PPM 4356，NovoNordisk A/S，Bagsvserd，Denmark)中。將培養(yǎng)物于24℃和150rpm保溫至形成原生質(zhì)體。向原生質(zhì)體消化液中加入35ml 2M山梨醇，混合物于2500rpm離心10分鐘。將沉淀重新懸浮，用STC洗兩次，于2000rpm離心10分鐘以便沉淀原生質(zhì)體。用血球計(jì)數(shù)板計(jì)原生質(zhì)體數(shù)，重懸于8∶2∶0.1的STC∶SPTC∶DMSO溶液至終濃度為1.25×107個(gè)原生質(zhì)體/ml。將原生質(zhì)體在Nalgene Cryo 1℃ Freezing Container(VWRScientific，Inc.San Francisco，CA)中控速冷凍后，保存于-80℃。
在冰上融化Fusarium venenatum CC1-3的冷凍原生質(zhì)體。向50ml無(wú)菌聚丙烯試管中加入5μg實(shí)施例5中描述的pJRoy36和5μg肝素(5mg/mlSTC)。加入100μl原生質(zhì)體，輕輕混勻，并在冰上保持30分鐘。加入1ml SPTC，于室溫溫育20分鐘。加入25ml 40℃的COVE頂層瓊脂糖(補(bǔ)充了10-25mM硝酸鈉代替10mM乙酰胺和10mM氯化銫)后，將混合物倒在一個(gè)空的150mm直徑平板上，于室溫保溫過(guò)夜。然后將25ml 40℃COVE頂層瓊脂糖(補(bǔ)充了10-25mM硝酸鈉代替10mM乙酰胺和10mM氯化銫，并且每ml含有10mg BASTATM)倒在平板上面，于室溫溫育長(zhǎng)達(dá)14天。除草劑BASTATM中的活性成分是膦絲菌素。BASTATM購(gòu)自AgrEvo(Hoechst Schering，Rodovre，Denmark)，使用前用酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)提取兩次，氯仿∶異戊醇(24∶1)提取一次。
將轉(zhuǎn)化子平板(如上述COVE下層，COVE-BASTATM覆蓋上層)中的瓊脂栓塊接種到含有30ml M400Da培養(yǎng)基的搖瓶中，并于30℃，150rpm培養(yǎng)7天。在7天中從搖瓶中取樣，分析上清液中的木聚糖酶活性。
如下確定木聚糖酶活性。將90μl含有溶于0.1M磷酸鈉(pH6.0)緩沖液的0.5％AZO-WAXTM(Megazyme，Dublin，Ireland)的底物溶液加入10μl各份在0.1M磷酸鈉(pH6.0)緩沖液中適當(dāng)稀釋的酶樣品溶液中，從而起始反應(yīng)。反應(yīng)體系于50℃保溫30分鐘，然后加入500μl已經(jīng)用0.55μl濃鹽酸酸化的乙醇來(lái)終止反應(yīng)。將得到的混合物在室溫保持至少10分鐘，但不超過(guò)60分鐘。然后將樣品于12,000rpm離心2分鐘。取200μl每份上清液轉(zhuǎn)移到微量培養(yǎng)板上，并于600nm測(cè)定光吸收。利用標(biāo)準(zhǔn)曲線，對(duì)照購(gòu)自Novo Nordisk A/S(Bagsvaerd，Denmark)的BIOFEED WHEATTM標(biāo)準(zhǔn)品計(jì)算活性。標(biāo)準(zhǔn)曲線是加入10、20、40、60、80、90和100μl標(biāo)準(zhǔn)液(1.0 FXU/ml)繪制的。為此，首先制備10 FXU/ml的標(biāo)準(zhǔn)液，然后用0.1M磷酸鈉緩沖液(pH6.0)1∶10稀釋作為工作標(biāo)準(zhǔn)液。利用線性回歸繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)包括一個(gè)空白樣(以緩沖液代替酶)。
在木聚糖酶檢測(cè)結(jié)果的基礎(chǔ)上，挑選出單個(gè)轉(zhuǎn)化菌落，命名為pJRoy36-19.B。
實(shí)施例7構(gòu)建pJRoy40制備缺失質(zhì)粒pJRoy40，該質(zhì)粒含有由BglII位點(diǎn)連接在一起的Fusarium venenatum tri5基因的大約1.5kb 5’側(cè)翼DNA和1.5kb 3’側(cè)翼DNA。用NotI和BglII消化實(shí)施例3中描述過(guò)的pSO129和pSO130。將含有載體pZLl加上tri5 DNA之0-1694位堿基的5.5kb的pSO130片段與1.5kb的pSO129片段連接在一起，后一個(gè)片段對(duì)應(yīng)tri5 DNA之5413-6946位堿基加上一個(gè)小多接頭。這樣產(chǎn)生了pJRoy40(圖5)，它含有1.5kb的tri5 5’DNA和1.7kb的tri5 3’DNA。tri5的編碼區(qū)是2475-3678位堿基。接近3.7kb的包含整個(gè)tri5編碼區(qū)的DNA被去掉了。
實(shí)施例8構(gòu)建tri5∷amdS缺失片段用BglII消化pJRoy40，這樣在5’和3’區(qū)之間形成連接點(diǎn)。用Klenow片段按照Sambrook等(1989，同前)的描述補(bǔ)平末端，使用TAE緩沖液經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳純化被線性化的載體，并經(jīng)瓊脂糖酶處理。然后如Sambrook等(1989，同前)所述用小牛腸堿性磷酸酶處理載體。從pBANe20(圖6)中分離amdS基因，并作為補(bǔ)平片段插入pJRoy40的BglII位點(diǎn)從而得到pLC30(圖7)。
用QIAquick凝膠提取試劑盒從pLC30經(jīng)凝膠純化分離含有tri5缺失盒的5670 bp EcoRI片段。用凝膠純化過(guò)的缺失片段轉(zhuǎn)化Fusariumvenenatum JRoy36-19B的原生質(zhì)體。
實(shí)施例9構(gòu)建tri5雜交探針經(jīng)PCR擴(kuò)增獲得DIG標(biāo)記的探針。對(duì)于5’探針(“tri5側(cè)翼探針″)，擴(kuò)增反應(yīng)體系含有以下成分50ng pSO130，DIG標(biāo)記的dATP、dCTP、dGTP和dTTP各100mM，引物tri55’探針5’-AACTGGAAAGACCTGTGGGC-3’(bp928-947)和pSO130 5’-1442探針5’-GGGAAATAGTGTCACGCGGTA-3’(bp1379-1399)各50pmole，2單位Taq DNA聚合酶以及1x Taq DNA聚合酶緩沖液。反應(yīng)體系在設(shè)定30個(gè)循環(huán)的Perkin-Elmer熱循環(huán)儀中保溫，每個(gè)循環(huán)為95℃ 1分鐘、55℃ 1分鐘，72℃ 90秒。用GenElute SpinColumns(Supelco，Bellefonte，CA)將得到的片段(“tri5側(cè)翼探針″)經(jīng)凝膠分離，根據(jù)制造商的說(shuō)明用DIG Quantification Test Strips(Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN)定量。
制備開(kāi)放讀碼框探針(″tri5開(kāi)放讀碼框探針″)的條件相同，只是使用以下引物引物970590 5’-GGACAACAGCCGAACTCAAAC-3’(bp2036-2057)和引物970478 5’-GTGCTGCGGATAAGGTTC-3’(bp2919-2937)。同上將得到的片段(″tri5開(kāi)放讀碼框探針″)分離并純化。
按照上面的描述通過(guò)擴(kuò)增相同PCR產(chǎn)物來(lái)制備熒光素標(biāo)記的探針。按照制造商的說(shuō)明，用QlAquick凝膠提取試劑盒將產(chǎn)物凝膠純化。利用用于熒光成像儀(Amersham，Sunnyvale，CA)的“Random PrimeLabeling Module”，按照制造商的說(shuō)明將純化過(guò)的片段標(biāo)記上熒光素。
實(shí)施例10用缺失片段取代Fusarium venenatum JRoy36-19B的天然tri5基因如下制備Fusarium venenatum JRoy36-19B的孢子用來(lái)自瓊脂平板(每ml含有5mg BASTATM)的10個(gè)瓊脂栓塊接種含有500ml RA生孢培養(yǎng)基的搖瓶，于28℃，150rpm培養(yǎng)2到3天。經(jīng)Miracloth收集孢子，并在Sorvall RC-5B離心機(jī)中于7000rpm離心20分鐘。用無(wú)菌蒸餾水將沉淀的孢子洗兩次，重懸于少量水中，然后用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。
如下制備原生質(zhì)體用4×107個(gè)Fusarium venenatum JRoy36-19B的孢子接種100ml YEG培養(yǎng)基，并于24℃、150rpm培養(yǎng)16小時(shí)。將培養(yǎng)物在Sorvall RT 6000D中于3500rpm離心7分鐘。沉淀用30ml 1M MgSO4洗兩次，重懸于20ml溶于1M MgSO4的5mg/ml NOVOZYME 234TM中。將培養(yǎng)物于24℃和150rpm保溫至形成原生質(zhì)體。向原生質(zhì)體消化液中加入35ml 2M山梨醇，混合物于2500rpm離心10分鐘。將沉淀重新懸浮，用STC洗兩次，于2000rpm離心10分鐘以便沉淀原生質(zhì)體。用血球計(jì)數(shù)板計(jì)原生質(zhì)體數(shù)，重懸于8∶2∶0.1的STC∶SPTC∶DMSO溶液至終濃度為1.25×107個(gè)原生質(zhì)體/ml。將原生質(zhì)體在Nalgene Cryo 1℃ FreezingContainer中控速冷凍后，保存于-80℃。
在冰上融化Fusarium venenatum JRoy36-19B的冷凍原生質(zhì)體。向50ml無(wú)菌聚丙烯試管中加入5μg實(shí)施例8中描述的凝膠純化過(guò)的tri5缺失片段。加入100μl原生質(zhì)體，輕輕混勻，并在冰上保持30分鐘。加入1ml SPTC，于室溫溫育20分鐘。加入25ml 40℃的COVE頂層瓊脂糖后，將混合物倒在一個(gè)150mm直徑COVE瓊脂平板上。轉(zhuǎn)化平板于室溫溫育長(zhǎng)達(dá)14天。
在COVE平板上生長(zhǎng)需要具有利用乙酰胺作為氮源的能力，這就表明整合了amdS基因，由此挑選出轉(zhuǎn)化子。有超過(guò)145個(gè)轉(zhuǎn)化子(來(lái)自20次轉(zhuǎn)化)在COVE平板上生長(zhǎng)，檢測(cè)其中20個(gè)轉(zhuǎn)化子的4，15-diacetoxyscirpenol(DAS)產(chǎn)量。
按照以下方案誘導(dǎo)產(chǎn)生DAS。通過(guò)將2升Fernbach搖瓶中的500ml RA生孢培養(yǎng)基接種上12個(gè)從基本培養(yǎng)基平板上切下來(lái)的瓊脂栓塊(5×5mm)來(lái)制備孢子儲(chǔ)液。Fernbach搖瓶于28℃、150rpm培養(yǎng)40小時(shí)。然后經(jīng)無(wú)菌Miracloth將培養(yǎng)物收集到50ml無(wú)菌Falcon試管中，用血球計(jì)數(shù)玻片計(jì)數(shù)后將濃度調(diào)到2×107個(gè)孢子/ml。孢子儲(chǔ)液可立即或于5℃儲(chǔ)存1或兩周后使用。
將2ml 2×107孢子/ml孢子儲(chǔ)液(新制備的或者存放了1或兩周的)接種到裝在250ml有擋板的玻璃搖瓶中的50ml MYRO培養(yǎng)基中，作3份。搖瓶于28℃、220rpm，在光照下培養(yǎng)7天。7天后，用無(wú)菌Miracloth將每個(gè)搖瓶的內(nèi)容物過(guò)濾，測(cè)量其pH，進(jìn)行DAS分析前儲(chǔ)存在-20℃。
通過(guò)略有改進(jìn)的McCormick等(1990，同前)的方法提取DAS并定量。用兩體積的乙酸乙酯(2.0ml)將無(wú)細(xì)胞Fusarium venenatum培養(yǎng)液樣品(1.0ml)提取兩次。將合并在一起的有機(jī)提取物在氮?dú)饬飨抡舭l(fā)至干燥，并用50微升TriSil/TBT(Pierce Chemical Co.，Rockford，IL)于80℃衍生60分鐘。然后用己烷將最后的樣品體積調(diào)到0.5ml。
在配備了30米DB-1柱(J&W Scientific.Folsom，CA；直徑250微米，膜厚0.25微米)和FID檢測(cè)器的Hewlett-Packard 6890氣相色譜儀上分析1微升樣品。注射步驟使用不分拆模式(splitless mode)，具有260℃入口，氮?dú)廨d體氣體流速1.2ml/min.?？鞠涑绦蚴瞧鹗紲囟?80℃；以30℃每分鐘加熱到210℃；以5℃每分鐘加熱到260℃；維持終溫度2分鐘。對(duì)蛇形菌素進(jìn)行的鑒定和定量基于購(gòu)自Sigma ChemicailCo.(St Louis，MO)的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行。在此情況下，DAS的檢測(cè)極限為2ppm。
所檢測(cè)的20個(gè)轉(zhuǎn)化子中有12個(gè)不產(chǎn)生可檢測(cè)到的DAS。將來(lái)自這12個(gè)轉(zhuǎn)化子的COVE平板瓊脂栓塊按照以下方案接種到三個(gè)搖瓶中分析木聚糖酶。用種子逐級(jí)放大方法來(lái)接種搖瓶培養(yǎng)物。給補(bǔ)充了5mgBASTATM/ml的30ml Vogels培養(yǎng)基中接種來(lái)自每株受測(cè)菌的新鮮平板瓊脂栓塊，然后于28℃、200rpm培養(yǎng)3天。再用150μl每種培養(yǎng)物接種含有5mg BASTATM/ml的30ml NY50培養(yǎng)基。于28℃、200rpm生長(zhǎng)2天后，取1.5ml每種培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到30ml不含BASTATM的NYU35培養(yǎng)基中，在相同條件下培養(yǎng)4-7天。在第4-7天從搖瓶中取樣，分析上清液的木聚糖酶活性。然后將木聚糖酶產(chǎn)量最高的3個(gè)菌株作Southern分析以便證實(shí)tri5基因已缺失。
用Vistra試劑盒(Amersham，Arlington，IL)和Rapid Hyb Kit(Amersham，Arlington，IL)按照制造商的說(shuō)明作Southern雜交。Fusarium venenatum JRoy36-19B推斷缺失子的真菌基因組DNA是用DNeasy Plant Mini試劑盒(Qiagen，Chatsworth，CA)按照制造商的說(shuō)明制備的。用Sphl和Dral消化1μg基因組DNA并在瓊脂糖凝膠上電泳。變性和中和后，用Turboblotter(Schleicher & Schuell，Keene，NH)將基因組DNA轉(zhuǎn)移至Hybond-N+膜(Amersham.Arlington，IL)上。與Rapid Hyb在60℃預(yù)雜交后，將膜與變性探針(見(jiàn)下文)在60℃過(guò)夜雜交。按照制造商的說(shuō)明將膜顯影，用STORM860(Molecular Dynamics.Sunnyvale，CA)掃描。
“tri5側(cè)翼探針”(熒光素標(biāo)記的，實(shí)施例9)與amdS插入片段上游的5’側(cè)翼區(qū)756個(gè)核苷酸雜交?！皌ri5開(kāi)放讀碼框探針″(熒光素標(biāo)記的，實(shí)施例9)與tri5 ATG下游大約450個(gè)核苷酸雜交。
Southern雜交的結(jié)果證實(shí)了在3個(gè)DAS陰性、高產(chǎn)木聚糖酶轉(zhuǎn)化子Fusarium venenatum LyMC4、LyMC19和LyMC21中tri5基因缺失。與tri5的5’側(cè)翼區(qū)雜交的探針與一個(gè)條帶發(fā)生雜交，該條帶對(duì)應(yīng)缺失構(gòu)建體的大小，但該探針不與對(duì)應(yīng)天然tri5基因的條帶雜交，這表明缺失構(gòu)建體已取代了該區(qū)域。此外，與tri5開(kāi)放讀碼框結(jié)合的探針沒(méi)有與這些菌株雜交，表明基因已丟失。
實(shí)施例11以膦絲菌素抗性選擇生長(zhǎng)的Fusarium venenatum LyMC4、LyMC19和LyMC21的木聚糖酶產(chǎn)生Fusarium venenatum LyMC4、LyMC19和LyMC21從實(shí)施例10中描述的原始COVE轉(zhuǎn)化平板上傳代培養(yǎng)到含有5mg/ml BASTATM的平板上，并于28℃培養(yǎng)7-10天。按照實(shí)施例10中概括描述的木聚糖酶檢測(cè)法，用來(lái)自這些分離物的BASTATM平板的瓊脂栓塊接種3個(gè)搖瓶。在第4、5、6和7天從搖瓶中取樣，檢測(cè)上清液。
按照實(shí)施例6的描述測(cè)定第4、5、6和7天從搖瓶中取出的樣品的木聚糖酶活性。Fusarium venenatum LyMC4和LyMC19與親本菌株Fusarium venenatum JRoy36-19B產(chǎn)生的木聚糖酶量相當(dāng)或高于它，進(jìn)一步分析這些菌株。
實(shí)施例12分析木聚糖酶高產(chǎn)缺失子Fusarium venenatum LyMC4和LyMC19
如實(shí)施例6所述在BASTATM培養(yǎng)基上挑出兩個(gè)Fusarium venenatum高產(chǎn)菌株LyMC4和LyMC19的單孢子分離物。維持對(duì)每個(gè)菌株的5個(gè)單孢子分離物的膦絲菌素抗性選擇。
如實(shí)施例10所述對(duì)得自這5個(gè)單孢子分離物的基因組DNA進(jìn)行Southern雜交分析。
Southern雜交證實(shí)所有單孢子分離物中均缺失了tri5基因。用與tri5基因缺失區(qū)上游結(jié)合的熒光素標(biāo)記探針(″Tri5側(cè)翼探針″)進(jìn)行探測(cè)時(shí)，與Fusarium venenatum JRoy36-19B的天然tri5區(qū)條帶的大小相比，所有菌株都有一個(gè)對(duì)應(yīng)著缺失盒大小的條帶。親本菌株Fusariumvenenatum LyMC19有一個(gè)對(duì)應(yīng)著野生型tri5基因的微弱條帶，這可能說(shuō)明少數(shù)核未發(fā)生缺失。但是，所有得自該菌株的單孢子分離物都有缺失。當(dāng)同樣是這些菌株與能結(jié)合tri5開(kāi)放讀碼框的熒光素標(biāo)記探針(“Tri5開(kāi)放讀碼框探針”)雜交時(shí)，只有Fusarium venenatumJRoy36-19B和Fusarium venenatum LyMC19有與tri5的開(kāi)放讀碼框?qū)?yīng)的條帶。Fusarium venenatum LyMC 19的該條帶非常微弱，該菌株的單孢子分離物都沒(méi)有條帶，說(shuō)明可能在單孢子純化之前，多數(shù)核就已缺失了tri5基因。來(lái)自兩次雜交的數(shù)據(jù)表明在所有單孢子分離物中tri5開(kāi)放讀碼框都已被amdS缺失盒取代。
實(shí)施例13Fusarium venenatum LyMC4和LyMC19的衍生菌株的DAS檢測(cè)利用實(shí)施例10中描述的方案分析單孢子分離物Fusariumvenenatum LyMC4.B、LyMC4.C、LyMC19.2和LyMC19.5，親本菌株Fusarium venenatum LyMC4和LyMC19，以及對(duì)照菌株的DAS產(chǎn)量。
所有菌株生長(zhǎng)在3套搖瓶中，在同一輪中進(jìn)行檢測(cè)。每次檢測(cè)的結(jié)果列于表1，最后1欄顯示平均DAS產(chǎn)量。在能誘導(dǎo)野生型Fusariumvenenatum菌株#93(BBA 64537，Biologische Bundensanstalt furLand-und Fortswirtschaft，Berlin，Germany)高產(chǎn)DAS的條件下，tri5缺失的菌株都沒(méi)有產(chǎn)生可檢測(cè)量的DAS。
表1.LyMC4和LyMC19單孢子分離物的DAS產(chǎn)量F.venenatum菌株 DAS產(chǎn)量平均DAS產(chǎn)量(ppm) (ppm)a. b. c.
#93 347 355 301 334A3/5136 15 91 47CC1-3 29 26 24 26JRoy36-19B24 29 24 26LyMC4 0 0 0 0LyMC4.B 0 0 0 0LyMC4.C 0 0 0 0LyMC190 0 0 0LyMC19.2 0 0 0 0LyMC19.5 0 0 0 01得自Dr.Anthony Trinici(Universitv of Manchester，Manchester，England)的Fusarium venenatum Quorn種子瓶。
實(shí)施例14Fusarium venenatum LyMC4.B、LyMC4.C、LyMC19.2和LyMC19.5的發(fā)酵Fusarium venenatum LyMC4.B、LyMC4.C、LyMC19.2和LyMC19.5的發(fā)酵在2升發(fā)酵罐中于30℃進(jìn)行8天，發(fā)酵罐所含培養(yǎng)基每升有20g蔗糖、2.0g MgSO4·7H2O、2.0g KH2PO4、2.0g檸檬酸·H2O、2.0g CaCl2·2H2O、0.5ml AMG微量金屬溶液(滅菌前將pH調(diào)至4.5)，以及過(guò)濾除菌的每升含有2.5g尿素的混合物和培養(yǎng)基滅菌并冷卻后加入的30ml大豆維生素混合物。補(bǔ)料是蔗糖和尿素的分批高溫滅菌混合物。
與類似的Fusarium venenatum JRoy36-19B發(fā)酵相比，所有單孢子分離物產(chǎn)生等量的木聚糖酶。
實(shí)施例15構(gòu)建Fusarium venenatum N-2通過(guò)在氯酸鉀培養(yǎng)基上進(jìn)行選擇，由Fusarium venenatum CCl-3形態(tài)學(xué)突變體制備Fusarium venenatum菌株N-2。菌株能在補(bǔ)充了2％葡萄糖和10mM亞硝酸鈉、酒石酸銨、次黃嘌呤或者尿酸的1X Vogels培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，卻不能在補(bǔ)充2％葡萄糖和10mM硝酸鈉的1X Vogels培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，這證明它有niaD表現(xiàn)型。
實(shí)施例16構(gòu)建tri5缺失構(gòu)建體pJRoy41用BglII消化pJRoy40，按照Sambrook等(1989，同前)所述用Klenow片段補(bǔ)平末端。使用TAE緩沖液經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳純化線性化的載體，并經(jīng)過(guò)瓊脂糖酶處理。然后按照Sambrook等(1989，同前)所述用小牛腸堿性磷酸酶處理載體。用NotI和SrfI消化從pNit3(Fu和Marzluf，1987，同前)中取下粗糙脈孢菌的nit3基因。限制酶反應(yīng)體系用Klenow片段處理，并進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳，電泳使用TAE緩沖液。利用瓊脂糖酶分離含有nit3基因的4886bp片段。
將nit3基因片段克隆至pJRoy40的填平的BglII位點(diǎn)從而產(chǎn)生pJRoy41(圖8)。在這個(gè)載體中，F(xiàn)usarium venenatum基因組中含有tri5基因的3.7kb片段被含有粗糙脈孢菌nit3基因的4.9kb片段代替。
實(shí)施例17Fusarium venenatum N-2的轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)化子分析以2種不同方式制備用于產(chǎn)生Fusarium venenatum N-2的原生質(zhì)體的生物質(zhì)。對(duì)第1批，用5個(gè)Fusarium venenatumN-2瓊脂栓塊(1cm)接種50ml YEPG培養(yǎng)基，于26℃和150rpm培養(yǎng)3天。用其中10ml培養(yǎng)物另外接種100ml YEPG培養(yǎng)液，在制備原生質(zhì)體前于200rpm、28℃培養(yǎng)20小時(shí)。制備第2批原生質(zhì)體時(shí)，將Fusarium venenatum N-2瓊脂栓塊接種到RA生孢培養(yǎng)基中，該培養(yǎng)基含有0.1M Na2HPO4和0.1M NH4H2PO4來(lái)代替硝酸鈉，再加上0.05％葡萄糖。培養(yǎng)物于28℃和200rpm生長(zhǎng)4天。用10ml第1級(jí)培養(yǎng)物接種含有500ml培養(yǎng)液的Fernbach搖瓶，培養(yǎng)液每升含有10g琥珀酸、0.1M NH4H2PO4、0.1M K2HPO4、1x COVE鹽和0.5g葡萄糖，將搖瓶于26℃、150rpm培養(yǎng)65小時(shí)。從該培養(yǎng)物中獲得大約108個(gè)孢子。用這些孢子接種50ml YEPG培養(yǎng)基，于24℃、150rpm生長(zhǎng)13.5小時(shí)。如實(shí)施例6所述制備原生質(zhì)體并保存在-80℃。
用pJRoy41(不切割，在多接頭的NotI位點(diǎn)線性化或者是在3’側(cè)翼序列中的NheI位點(diǎn)線性化)轉(zhuǎn)化Fusarium venenatum N-2的原生質(zhì)體。如實(shí)施例6所述用pJRoy41進(jìn)行轉(zhuǎn)化，不同的是將反應(yīng)體系用50ml 40℃的上層培養(yǎng)基鋪在空的150mm平板上，該上層培養(yǎng)基含有1x COVE鹽、0.8M蔗糖、25mM硝酸鈉和1％低熔點(diǎn)瓊脂糖。
由經(jīng)NotI消化的pJRoy41獲得4個(gè)轉(zhuǎn)化子；由經(jīng)NheI消化的pJRoy41得到2個(gè)，未消化質(zhì)粒得到32個(gè)。
實(shí)施例18推測(cè)的Fusarium venenatum tri5缺失轉(zhuǎn)化子的基因組DNA的制備采用以下方案從實(shí)施例17描述的推測(cè)的Fusarium venenatum tri5缺失轉(zhuǎn)化子中制備基因組DNA。所述轉(zhuǎn)化子在25ml YEG培養(yǎng)基中于30℃、250rpm生長(zhǎng)72小時(shí)。然后經(jīng)Miracloth過(guò)濾收集菌絲體，用25ml 10mMTris-1mM EDTA(TE)緩沖液洗1次，從菌絲上吸去多余的緩沖液，隨后冷凍在液氮中。將冷凍的菌絲在電咖啡磨中磨成細(xì)粉，將粉末加入一次性塑料離心管中的20ml TE緩沖液和5ml 20％w/v十二烷基硫酸鈉(SDS)中。將混合物輕輕地顛倒幾次以確保混勻，用等體積的苯酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1v/v/v)抽提兩次。加入醋酸鈉(3M溶液)至終濃度0.3M，然后加入2.5體積的冰冷乙醇沉淀核酸。將試管在15,000×g離心30分鐘收集核酸沉淀，沉淀風(fēng)干30分鐘，然后重懸于0.5ml TE緩沖液中。加入無(wú)DNase的核糖核酸酶A至濃度為100mg/ml，混合物于37℃保溫30分鐘。然后加入200mg/ml的蛋白醇K，混合物于37℃再保溫1小時(shí)。最后，用苯酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1v/v/v)將混合物抽提兩次，然后如前所述用醋酸鈉和乙醇沉淀DNA。將DNA沉淀在真空下干燥，重懸于TE緩沖液，儲(chǔ)存在4℃待用。
實(shí)施例19PCR篩選tri5基因缺失作PCR預(yù)篩來(lái)檢驗(yàn)實(shí)施例17中分離到的轉(zhuǎn)化子中是否缺失了tri5基因。所設(shè)計(jì)的反應(yīng)中使用的引物能從完整tri5 DNA擴(kuò)增出一個(gè)1.1kb的條帶，但無(wú)法由那些tri5編碼區(qū)已被nit3基因取代的DNA擴(kuò)增出條帶。使用引物551 5’-CGGTATCGAATGTACTCGAG-3’(Tri5 bp 2524-2544)和510 5’-CCCATGGTGTGAACACC-3’(tri5 bp 1397-1414)進(jìn)行PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系含有2.5μl DMSO、1μl Taq DNA聚合酶、2.5mM的dATP、dCTP、dGTP和dTTP各5μl，5μl 10xPCR緩沖液、0.5-1μg轉(zhuǎn)化子基因組DNA(實(shí)施例18)，上述引物50pmol/μl各2μl，及適量的水補(bǔ)至50μl。進(jìn)行反應(yīng)使用1個(gè)循環(huán)的97℃ 5分鐘、55℃ 1分鐘、72℃ 1分鐘，然后以97℃1分鐘，55℃ 1分鐘，72℃ 1分鐘作30個(gè)循環(huán)。
將未能產(chǎn)生1.1kb條帶(對(duì)應(yīng)完整的tri5基因)的轉(zhuǎn)化子培養(yǎng)在補(bǔ)充了25mM NaNO3的液體Vogels培養(yǎng)基中，并如實(shí)施例10的描述進(jìn)行DAS分析。在這些生長(zhǎng)條件下，某些轉(zhuǎn)化子沒(méi)有產(chǎn)生可測(cè)水平的DAS，而陽(yáng)性對(duì)照一致產(chǎn)生大約10ppm的DAS(表2)。
表2.推測(cè)的tri5缺失子的DAS和Southern分析一覽表菌株 DAS(ppm) tri5 5’探針 tri5 orf探針CC1-3 10 5.9 +N2-119ND 5.9 +N2-1 ND*7.1 -N2-8 ND 7.1 -N2-13 ND 7.1 -N2-103ND 7.1 -N2-106ND 7.1 -N2-118ND 7.1 NT**N2-10111 5.9，7.1 +N2-10219 5.9，7.1 +N2-10418 5.9，7.1 +N2-10535 5.9，7.1 +
*ND沒(méi)有檢測(cè)到**ND未測(cè)對(duì)在診斷性PCR反應(yīng)中沒(méi)有產(chǎn)生1.1kb條帶的菌株也進(jìn)行了Southern分析。如實(shí)施例18所述制備的推測(cè)Fusarium venenaturntri5缺失菌株的基因組DNA用DraI/SphI消化。片段在1％瓊脂糖凝膠上用TAE緩沖液經(jīng)電泳分離。以5X SSC作為虹吸轉(zhuǎn)膜緩沖液將DNA過(guò)夜轉(zhuǎn)移至Nytran Plus膜上。膜在DIG Easy Hyb中于65℃預(yù)雜交2小時(shí)。用DIG標(biāo)記的″tri5側(cè)翼探針″(實(shí)施例9)作雜交。隨后將膜于室溫在2XSSC-0.1％SDS中洗兩次，各15分鐘，然后于68℃在0.1X SSC-0.1％SDS中洗兩次，各15分鐘。按照常規(guī)DIG方法，將洗過(guò)的膜處理并在室溫對(duì)Kodak X-OMAT AR膠片曝光大約1小時(shí)，然后按制造商的說(shuō)明用KonicaQX-70自動(dòng)膠片處理機(jī)顯影。
當(dāng)使用DIG標(biāo)記的″tri5側(cè)翼探針″時(shí)，用DraI/SphI消化的野生型菌株的基因組DNA含有一個(gè)5932bp的雜交條帶，缺失質(zhì)粒中有一個(gè)7100bp的雜交條帶。5.9kb條帶對(duì)應(yīng)著野生型tri5基因，而7.1kb條帶對(duì)應(yīng)著nit3基因取代了tri5基因的DNA。有幾個(gè)轉(zhuǎn)化子產(chǎn)生了分別對(duì)應(yīng)完整tri5基因和缺失質(zhì)粒的兩個(gè)條帶。在這些菌株中，缺失片段發(fā)生了異位整合，因此tri5基因未被缺失。然而，F(xiàn)usarium venenatum轉(zhuǎn)化子N2-1、N2-8、N2-113、N2-103、N2-106和N2-118都只含有指示著缺失質(zhì)粒的7.1kb條帶。
來(lái)自這些推測(cè)缺失子的基因組DNA還與DIG標(biāo)記的“tri5開(kāi)放讀碼框探針”(實(shí)施例9)進(jìn)行了雜交。除1例外，所有那些在與5’探針雜交時(shí)顯示標(biāo)志缺失質(zhì)粒的單個(gè)條帶的菌株都不含有能與tri5的開(kāi)放讀碼框探針雜交的條帶。由表3可見(jiàn)，多數(shù)被DAS分析確定為tri5缺失子的菌株也被Southern分析確定為tri5缺失子。這一數(shù)據(jù)表明Fusariumvenenatum菌株N2-1、N2-8、N2-113、N2-103和N2-106的tri5基因缺失。
實(shí)施例20在Fasarium venenatum中產(chǎn)生無(wú)nit3標(biāo)記的tri5缺失通過(guò)用含有來(lái)自缺失構(gòu)建體pJRoy40(實(shí)施例7)的5’和3’側(cè)翼DNA的EcoRI片段轉(zhuǎn)化Fusarium venenatum N2-8菌株來(lái)去掉該缺失子中的nit3基因。原生質(zhì)體制備和轉(zhuǎn)化如實(shí)施例10所述進(jìn)行。加入10ml補(bǔ)充有0.8M蔗糖作為滲透劑的YEPG培養(yǎng)基后，使轉(zhuǎn)化反應(yīng)體系于室溫再生24小時(shí)。然后將再生原生質(zhì)體濃縮，在無(wú)菌水中經(jīng)離心(10分鐘，2000×g)清洗，以5×106/ml的密度鋪到氯酸鉀培養(yǎng)基上。氯酸鹽培養(yǎng)基上長(zhǎng)出幾百個(gè)菌落。對(duì)其中的100個(gè)菌落根據(jù)它們?cè)趤喯跛徕c、酒石酸銨、次黃嘌呤和尿酸上生長(zhǎng)的能力以及不能在硝酸鈉上生長(zhǎng)的能力進(jìn)行分析。鑒定到大約50個(gè)niaD突變體。
用“tri5側(cè)翼探針”如實(shí)施例9所述對(duì)其中的20個(gè)突變體進(jìn)行Southern分析。1個(gè)轉(zhuǎn)化子(N2-8-1)含有一個(gè)表明丟失了nit3基因的條帶。對(duì)niaD突變體(N2)、nit3/tri5取代的菌株N2-8和推測(cè)的切除菌株N2-8-1重復(fù)進(jìn)行Southern雜交。來(lái)自這些菌株的DNA用NheI和NruI消化，并用“tri5側(cè)翼探針”檢測(cè)。結(jié)果顯示在N2菌株中存在一個(gè)6436bp的條帶，它與野生型tri5基因是一致的；nit3/tri5取代菌株N2-8中有一個(gè)7604bp的條帶，與nit3取代了tri5基因的情況符合。在切除菌株N2-8-1中雜交條帶的大小降到2718bp，與nit3基因被切除的情況相符。
實(shí)施例21在Fusarium venenatum菌株MLY3中產(chǎn)生無(wú)amdS標(biāo)記的tri5缺失如圖9所示在Fusarium venenatum表達(dá)宿主MLY3的基因組中產(chǎn)生未標(biāo)志的tri5缺失。首先將tri5基因缺失，然后用側(cè)翼是分離自米曲霉pyrG基因(WO9812300)上游區(qū)的重復(fù)DNA序列的amdS基因代替它。然后通過(guò)生長(zhǎng)在含有氟乙酰胺的平板上來(lái)挑選amdS基因被去除的分離物。
通過(guò)在構(gòu)巢曲霉amdS基因的側(cè)翼導(dǎo)入同向重復(fù)序列，并將得到的amdS盒亞克隆到tri5缺失載體pJRoy40(實(shí)施例5)中從而構(gòu)建質(zhì)粒pLC31b。
起始步驟是制備pJRoy43，該質(zhì)粒含有pNEB193(New EnglandBiolabs)，其中PacI和XbaI位點(diǎn)被一個(gè)SwaI位點(diǎn)代替。為了達(dá)到這一目的，通過(guò)將下面兩個(gè)寡核苷酸一起退火來(lái)形成一個(gè)在5’末端含有BamHI位點(diǎn)，在中部有SwaI位點(diǎn)，在3’端有SalI位點(diǎn)的多接頭5’-GATCGATTTAAAT-3’5’-TCGAATTTAAATC-3’將產(chǎn)生的接頭連接到已經(jīng)用BamHI和SalI消化的pNEB193中從而形成pJRoy43。
接下來(lái)，選擇米曲霉pryG基因上游一個(gè)230bp的區(qū)域作為Fusariumvenenatum中的重復(fù)序列。用以下兩組引物對(duì)-引物3和4以及引物5和6將米曲霉pyrG質(zhì)粒pJaL335(WO 98/12300)中的這一區(qū)域擴(kuò)增成兩個(gè)不同產(chǎn)物引物35′-CGAATTTCATATTTAAATGCCGACCAGCAGACGGCCCTCG-3′引物45′-GCGATATCATGATCTCTCTGGTACTCTTCG-3′引物55′-GCGATATCATCGACCAGCAGACGGCCCTCG-3′引物65′-GCGTTTAAACATGATCTCTCTGGTACTCTTCG-3′用大約40-50ng基因組DNA作為模板來(lái)制備擴(kuò)增反應(yīng)體系(50μl)，所述基因組DNA是用DNeasy Plant Mini試劑盒制備的。每個(gè)反應(yīng)體系含有以下成分40-50ng基因組DNA、引物3和4或者引物5和6各50pmol、dATP、dCTP、dGTP和dTTP各200μM、1X Taq DNA聚合酶緩沖液和2.5單位的Taq DNA聚合酶。將反應(yīng)體系在如下設(shè)定的Perkin-Elmer480型熱循環(huán)儀中溫育第1輪在94℃ 2.5分鐘，72℃ 2.5分鐘；第2-26輪分別為94℃ 45秒，50℃ 45秒，72℃ 2分鐘；第27輪為94℃ 45秒，50℃ 45秒，72℃ 10分鐘。
在1％瓊脂糖凝膠上分離反應(yīng)產(chǎn)物，分離出大約230bp的片段。第一PCR產(chǎn)物(大約230bp的片段)在5’末端含有SwaI位點(diǎn)，3’末端含有EcoRV位點(diǎn)，而第二PCR產(chǎn)物(大約230bp的片段)在5’末端含有EcoRV位點(diǎn)，3’末端含有PmeI位點(diǎn)。將這兩個(gè)純化過(guò)的重復(fù)片段首先用EcoRV消化，然后連接在一起。純化(苯酚-氯仿抽提和乙醇沉淀)后，用PmeI和SwaI消化連接產(chǎn)物從而產(chǎn)生一個(gè)大約500bp的片段，將該片段經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳和瓊脂糖酶處理純化。
將得到的片段克隆至用PmeI和SwaI消化的pJRoy43以產(chǎn)生pJRoy44(圖10)。該載體含有所述兩個(gè)230bp的重復(fù)片段，它們被一個(gè)EcoRV位點(diǎn)分開(kāi)，側(cè)翼是SwaI和PmeI位點(diǎn)。
從p3SR2(Kelly和Hynes，1985，EMBO雜志4475-479)的亞克隆中分離到一個(gè)含有amdS基因和調(diào)控區(qū)的EcoRI片段，用Klenow片段將其制成平末端，連接到用EcoRV消化的pJRoy44中產(chǎn)生pJRoy47(圖11)。用SwaI和PmeI消化該載體，將含有側(cè)翼是如上所述的同向重復(fù)序列的amdS基因的片段連接到用BglII消化、Klenow處理過(guò)的JRoy40中產(chǎn)生pLC31b(圖12)，在該質(zhì)粒中含有tri5編碼區(qū)的3.7kb片段已被含有側(cè)接有230bp重復(fù)序列的構(gòu)巢曲霉amdS基因的3kb片段取代。
然后用EcoRI消化得到的質(zhì)粒pLC31b，在轉(zhuǎn)化前用Qiaquick凝膠提取試劑盒(Qiagen，Chatsworth，CA)純化含有tri5缺失盒的6.1kbEcoRI片段。
如實(shí)施例6所述制備Fusarium venenatum MLY3的原生質(zhì)體，然后用凝膠純化過(guò)的6.1kb EcoRI缺失片段轉(zhuǎn)化。將轉(zhuǎn)化子鋪COVE平板以便挑選amdS基因整合的轉(zhuǎn)化子。在得到的3個(gè)轉(zhuǎn)化子中通過(guò)Southern雜交證明天然tri5基因已被缺失盒取代。使用制造商提供的Amersham(Arlington，IL)Vistra and Rapid Hyb方案或者BochringerMannheim DIG System方案作Southern雜交。推測(cè)的缺失子的真菌基因組DNA利用DNeasy Plant Mini Kit(Qiagen Chatsworth，CA)來(lái)制備。按照制造商的說(shuō)明將膜顯影，對(duì)于探針是熒光素標(biāo)記的用STORM860(Molecular Dynamics，Sunnyvale，CA)掃描膜，或者對(duì)于DIG標(biāo)記的探針對(duì)膠片曝光?！皌ri5側(cè)翼探針”在amdS插入點(diǎn)上游765個(gè)核苷酸的5’側(cè)翼區(qū)域內(nèi)發(fā)生雜交。
將全部3個(gè)轉(zhuǎn)化子生孢，并用顯微操作儀分離單孢子。再使這3個(gè)缺失轉(zhuǎn)化子的各3個(gè)單孢子分離物(共9株菌)生孢子。將已證實(shí)的tri5缺失子的1×106個(gè)孢子鋪到9個(gè)150mm含有氟乙酰胺培養(yǎng)基的平板之一上，這樣來(lái)挑選出丟失amdS標(biāo)記的菌株。將這些平板在室溫下培養(yǎng)長(zhǎng)達(dá)2周。形成的菌落在COVE平板和新的氟乙酰胺平板上進(jìn)行傳代培養(yǎng)。在氟乙酰胺平板上生長(zhǎng)良好，而在COVE平板上生長(zhǎng)差或者不生長(zhǎng)的菌落作進(jìn)一步分析。在308個(gè)能在氟乙酰胺平板上生長(zhǎng)的分離物(FA+)中，有3個(gè)不能在COVE平板上生長(zhǎng)(COVE-)，1個(gè)在COVE平板上生長(zhǎng)非常弱，但它們?cè)诜阴０菲桨迳虾芎?。Southern雜交顯示這3個(gè)COVE-菌株仍含有amdS基因，而在COVE上生長(zhǎng)弱的那個(gè)菌株有一個(gè)與“環(huán)出”預(yù)計(jì)大小相符的條帶。將這個(gè)命名為L(zhǎng)yMC1的缺失子生孢子，從單孢子中獲得3個(gè)分離物。Southern印跡結(jié)果證實(shí)在一個(gè)轉(zhuǎn)化子和來(lái)自該轉(zhuǎn)化子的3個(gè)孢子純化分離物L(fēng)yMC1A、LyMC1B和LyMC1C中tri5缺失，amdS基因丟失。如實(shí)施例6所述制備3個(gè)轉(zhuǎn)化子的孢子，但要使用Vogels硝酸鹽培養(yǎng)基，并于24℃培養(yǎng)72小時(shí)。用顯微操作儀分離單孢子。
重復(fù)序列間的同源重組應(yīng)造成整個(gè)amdS基因的缺失。為了證實(shí)完全丟失了該基因，用以下分別與tri5基因的3’和5’側(cè)翼區(qū)雜交的引物PCR擴(kuò)增該缺失區(qū)GAGa3.35′-GGTAGCACGAGTGTCTGG-3′Tox5’5′-AACTGGAAAGACCTGTGGGC-3′用大約40-50ng各個(gè)缺失子的基因組DNA作為模板來(lái)制備擴(kuò)增反應(yīng)體系(50μl)，所述基因組DNA是用DNeasy Plant Mini試劑盒制備的。每個(gè)反應(yīng)體系含有以下成分40-50ng基因組DNA，正向引物和反向引物各50pmol，dATP、dCTP、dGTP和dTTP各200μM、1X Taq DNA聚合酶緩沖液和2.5單位的Taq DNA聚合酶。將反應(yīng)體系在如下設(shè)定的Perkin-Elmer480型熱循環(huán)儀中溫育第1輪在94℃ 2.5分鐘，72℃ 2.5分鐘；第2-26輪分別為94℃ 45秒，50℃ 45秒，72℃ 2分鐘；第27輪為94℃ 45秒，50℃ 45秒，72℃ 10分鐘。
在1％瓊脂糖凝膠上分離反應(yīng)產(chǎn)物，從凝膠上切下一個(gè)990bp的產(chǎn)物條帶，依照制造商的說(shuō)明克隆到來(lái)自TOPO TA克隆試劑盒(Invitrogen，Carlsbad，CA)的pCR2.1中，然后用它轉(zhuǎn)化One ShotTOP10細(xì)胞(Invitrogen，Carlsbad，CA)。用Qiagen QIAprep-8試劑盒從得到的轉(zhuǎn)化子中制備DNA，并用EcoRI限制酶消化進(jìn)行分析。將質(zhì)粒在ABI PRISM 377 DNA測(cè)序儀(ABI，F(xiàn)oster City，CA)上測(cè)序。缺失區(qū)的PCR擴(kuò)增和測(cè)序證明發(fā)生了一個(gè)完全的環(huán)出，只有一個(gè)230bp的重復(fù)片段留在tri5基因位點(diǎn)。這個(gè)重復(fù)片段含有5’重復(fù)序列的5’末端和3’重復(fù)序列的3’末端，這說(shuō)明在兩個(gè)重復(fù)序列之間發(fā)生了同源重組。
如實(shí)施例10所述測(cè)定3個(gè)經(jīng)孢子純化的缺失子、Fusariumvenenatum MLY3和野生型Fusarium venenatum菌株BBA 64537的DAS產(chǎn)量，但要使用Vogels硝酸鹽培養(yǎng)基來(lái)生孢子。表3顯示了該分析的DAS結(jié)果。3個(gè)tri5缺失子LyMC1A、LyMC1B或LyMC1C都未產(chǎn)生可檢測(cè)量的DAS，而野生型Fusarium venenatum菌株BBA64537和Fusariumvenenatum MLY3產(chǎn)生了可檢測(cè)量的DAS。
表3.tri5缺失的Fusarium venena tum菌株的DAS分析菌株DAS(ppm)*3個(gè)數(shù)值的均值(+/-S.E.)BBA 64537 318(+/-31)MLY329(+/-11)LyMC1A ＜2LyMC1B ＜2LyMC1C ＜2*檢測(cè)極限2ppm.
生物材料的保藏以下生物材料已根據(jù)布達(dá)佩斯條約保藏在農(nóng)業(yè)研究機(jī)構(gòu)專利培養(yǎng)物保藏中心(Northern Regional Research Center(NRRL)，Peoria，Illinois)，并給予了下列保藏號(hào)保藏物保藏號(hào) 保藏日期大腸桿菌DH5α pTri5NRRL B-300291998年5月6日菌株的保藏保證在該申請(qǐng)的待審期間，由根據(jù)37 C.F.R.ξ1.14和35 U.S.C.ξ122授權(quán)的專利與商標(biāo)委員會(huì)確定的人員可以獲得該保藏物。保藏物代表所述保藏菌株的基本純培養(yǎng)物。在本申請(qǐng)的副本或其后續(xù)申請(qǐng)?zhí)峤坏膰?guó)家，可以根據(jù)外國(guó)專利法索要該保藏物。但應(yīng)當(dāng)明白，保藏物的可用性并不構(gòu)成對(duì)損害由政府行為授予的專利權(quán)來(lái)實(shí)施本發(fā)明的許可。
此處描述和請(qǐng)求保護(hù)的發(fā)明并不限于文中具體公開(kāi)的實(shí)施方案的范圍，因?yàn)檫@些實(shí)施方案僅用于闡述本方面的幾個(gè)方面。任何等同的實(shí)施方案都應(yīng)看作在本發(fā)明范圍內(nèi)。的確，由前面的描述，對(duì)文中顯示和描述的發(fā)明進(jìn)行各種改進(jìn)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見(jiàn)的。這些改變同樣應(yīng)視為落在所附權(quán)利要求書(shū)的范圍內(nèi)。
文中引用了許多參考文獻(xiàn)，此處均是全文引入作為參考。
序列表<110>John C.RoyerLynne M.ChristiansonGregory A.GambettaHoward BrodySuzanne M.OtaniWendy T.Yoder<120>在單端孢菌毒素缺陷的絲狀真菌突變細(xì)胞中產(chǎn)生異源多肽的方法<130>5563.204-WO<140>待定<141>1999-05-20<150>09/082,217<151>1998-05-20<160>3<170>FastSEQ for Windows Version 3.0<210>1<211>6946<212>DNA<213>鐮孢<400>1gaattctctc agtcggcctc atctggcagg tgctaatata ttctacccgc gcttggctac 60ctatgccaca cacaaagctt catgtttggt tcatatcgta tactcgcttc aacagttctg 120cgggtacgac tctcgtatgg atgtaataaa caaatgttcc gacctattat gccgagttac 180cgtggacaat tatcgggccg gaaaagaatg catttgtgaa ttgtaatcct gcctgtttgt 240ggagtgataa gtgacatatt ggaaaagtcg tcaagcaatt ggaggtttca tcaactgtgg 300agtcatcgtt ttgggcaaac aatactatgt agggtaggct tctgctgcag catcaatgac 360tcgtttggat cgagtccttt tgttgccaag gcgtatgggg cctgcaggga acgagtcagt 420cgtatcaggc cggtgaggca aatgccgttt cgcagcagct atcatttgtc gcgggatttt 480cgcgaagctt tgcgtgacga gtcaaatccg cacatcttga ttcatgagtt gttgaattta 540gctgttcatt cgtgagtggc taaagcgtat ctagtcgatt gtcaaattca gacttgacag 600gtcccttgat gaatgagacg tcggatgtcc ctagccgaga tgcggattgt gacaacggaa 660gagacagggg cagggttcat gggtgttgaa ccttgttcac tgaaacggtg atgtctttgg 720tctacaaagt atccttcaca tgtctctgtt cccagaccac gtggttattc tggcatccgg 780gtcctattga ttggctgatt tcttgcactg atacatacaa ataagtccaa gactgtattc 840tactggcaaa attatgccga caaggggaaa tcattctgaa ttagtgatga agcatgccgt 900cgaagccgaa gagaaacttt gcgcagcaac tggaaagacc tgtgggctgt agagcgcaca 960gcacggtagt aagacctacg gccctggtat catggttgta gcctcttccg tattgctcac1020atatccaccg gttttctaca taaacagtct gagtcctgat agtggatatt atatcttcca1080ggacctagtc taggtagtag tcggcatttg aaacgcctag tggcaagaga tcgcttagcc1140tccagcctgg caatatcgcg gcttcctcag gttgtaccac gaatgatgat ctcaattgtg1200cttcccctgt cgtgaatttg ctagtgcgac gggacttgcc aggcttacgg cacctacaag1260tcgcgccagc cttctgacag tgattgtatg caagatcgtc attagttatg attaagcttt1320gataaacaag agcgccacag cctttcttta actccgacaa cctcaacggt gacatgcata1380ccgcgtgaca ctatttccca tggtgtgaac accatcaatg acttagagta gataaccact1440tgaaacttct agaaatgtcc aagaaactac actcagtgtt tcatagaact aagacaatgt1500tcattgaagg atgggatttg agactccgta ctgcttcacc tcggaaaata agcactgttt1560agcacccgtt aagccaagtc cttcaaacgt ggggacggat ttaaccaaca gcagagtgga1620taagcctgta ctctactcat tgaatgtata taatacattg ctaggtacat acgcagcttt1680
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195 200 205Glu Ile Thr Ser Ala Ile Ala Gln Met Glu Asn Trp Met Val Trp Val210 215 220Asn Asp Leu Met Ser Phe Tyr Lys Glu Phe Asp Asp Glu Arg Asp Gln225 230 235 240Ile Ser Leu Val Lys Asn Tyr Val Val Ser Asp Glu Ile Thr Leu His245 250 255Glu Ala Leu Glu Lys Leu Thr Gln Asp Thr Leu His Ser Ser Lys Gln260 265 270Met Val Ala Val Phe Ser Asp Lys Asp Pro Gln Val Met Asp Thr Ile275 280 285Glu Cys Phe Met His Gly Tyr Val Thr Trp His Leu Cys Asp His Arg290 295 300Tyr Arg Leu Asn Glu Ile Tyr Glu Lys Val Lys Gly Gln Lys Thr Glu305 310 315 320Asp Ala Gln Lys Phe Cys Lys Phe Tyr Glu Gln Ala Ala Asn Val Gly325 330 335Ala Val Ser Pro Ser Glu Trp Ala Tyr Pro Pro Ile Ala Gln Leu Ala340 345 350Asn Ile Arg Ser Lys Asp Val Lys Asp Val Lys Asp Val Lys Glu Ile355 360 365Gln Lys Pro Leu Leu Ser Ser Ile Glu Leu Val Glu370 375 380<210>3<211>377<212>PRT<213>鐮孢<400>3Met Glu Asn Phe Pro Thr Glu Tyr Phe Leu Asn Thr Ser Val Arg Leu1 5 10 15Leu Glu Tyr Ile Arg Tyr Arg Asp Ser Asn Tyr Thr Arg Glu Glu Arg20 25 30Ile Glu Asn Leu His Tyr Ala Tyr Asn Lys Ala Ala His His Phe Ala35 40 45Gln Pro Arg Gln Gln Gln Leu Leu Iys Val Asp Pro Lys Arg Leu Gln50 55 60Ala Ser Leu Gln Thr Ile Val Gly Met Val Val Tyr Ser Trp Ala Lys65 70 75 80Val Ser Lys Glu Cys Met Ala Asp Leu Ser Ile His Tyr Thr Tyr Thr85 90 95Ieu Val Leu Asp Asp Ser Ser Asp Asp Pro Tyr Ala Ala Met Met Asn100 105 110Tyr Phe Asn Asp Leu Gln Ala Gly Arg Glu Gln Ala His Pro Trp Trp115 120 125Ala Leu Val Asn Glu His Phe Pro Asn Val Leu Arg His Phe Gly Pro130 135 140Phe Cys Ser Leu Asn Leu Ile Arg Ser Thr Leu Asp Phe Phe Glu Gly145 150 155 160Cys Trp Ile Glu Gln Tyr Asn Phe Gly Gly Phe Pro Gly Ser His Asp165 170 175Tyr Pro Gln Phe Leu Arg Arg Met Asn Gly Leu Gly His Cys Val Gly180 185 190Ala Ser Leu Trp Pro Lys Glu Gln Phe Asp Glu Arg Ser Leu Phe Leu195 200 205Glu Ile Thr Ser Ala Ile Ala Gln Met Glu Asn Trp Met Val Trp Val210 215 220Asn Asp Leu Met Ser Phe Tyr Lys Glu Phe Asp Asp Glu Arg Asp Gln225 230 235 240
Ile Ser Leu Val Lys Asn Tyr Val Val Ser Asp Glu Ile Ser Leu His245 250 255Glu Ala Leu Glu Lys Leu Thr Gln Asp Thr Leu His Ser Ser Lys Gln260 265 270Met Val Ala Val Phe Ser Asp Lys Asp Pro Gln Val Met Val Thr Ile275 280 285Glu Cys Phe Met His Gly Tyr Val Thr Trp His Leu Cys Asp His Arg290 295 300Tyr Arg Leu Asn Glu Ile Ser Glu Lys Val Lys Glu Gln Lys Thr Glu305 310 315 320Asp Ala Gln Lys Phe Cys Lys Phe Tyr Glu Gln Ala Ala Asn Val Gly325 330 335Ala Val Ser Pro Ser Glu Trp Ala Tyr Pro Pro Val Ala Gln Leu Ala340 345 350Asn Val Arg Ser Lys Asp Val Lys Asn Val Lys Gln Ile Glu Lys Pro355 360 365Leu Leu Ser Ser Ile Glu Leu Val Glu370 37權(quán)利要求
1.一種制備分泌異源多肽的方法，包括(a)在有利于多肽產(chǎn)生的條件下培養(yǎng)親本絲狀真菌細(xì)胞的突變體，其中(i)該突變體包含編碼所述分泌的異源多肽的第一核酸序列和含有對(duì)至少一個(gè)參與產(chǎn)生單端孢菌毒素之基因的修飾的第二核酸序列，(ii)培養(yǎng)在相同條件下時(shí)，該突變體產(chǎn)生的單端孢菌毒素少于親本絲狀真菌細(xì)胞；和(b)從培養(yǎng)基中分離所述多肽。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述絲狀真菌細(xì)胞是支頂孢屬，曲霉屬，短梗霉屬，隱球酵母屬，線黑粉菌屬，鐮孢屬，赤霉屬，腐質(zhì)霉屬，Magnaporthe，毛霉屬，毀絲霉屬，漆斑菌屬，Neocallimastix，脈孢菌屬，擬青霉屬，青霉屬，Piromyces，皺褶菌屬，踝節(jié)菌屬，熱子囊菌屬，梭孢殼屬，Tolypocladium或者木霉屬菌株。
3.權(quán)利要求1的方法，其中所述絲狀真菌細(xì)胞是鐮孢屬菌株。
4.權(quán)利要求3的方法，其中所述鐮孢屬細(xì)胞是Fusariumvenenatum細(xì)胞。
5.權(quán)利要求4的方法，其中所述Fusarium venenatum細(xì)胞是Fusarium venenatum ATCC20334。
6.權(quán)利要求4的方法，其中所述Fusarium venenatum細(xì)胞是一種形態(tài)學(xué)突變體。
7.權(quán)利要求6的方法，其中所述Fusarium venenatum細(xì)胞是Fusarium venenatum ATCC20334的形態(tài)學(xué)突變體。
8.權(quán)利要求1-7任何一項(xiàng)所述的方法，其中的基因選自tri3、tri4、tri5、tri6、tri11、tri12、tri101。
9.權(quán)利要求1-8任何一項(xiàng)所述的方法，其中的基因是tri5或trichodiene合成酶基因。
10.權(quán)利要求1-9任何一項(xiàng)所述的方法，其中的基因是tri3基因。
11.權(quán)利要求1-10任何一項(xiàng)所述的方法，其中的基因是tri4基因。
12.權(quán)利要求1-11任何一項(xiàng)所述的方法，其中的基因是tri6基因。
13.權(quán)利要求1-12任何一項(xiàng)所述的方法，其中的基因是tri11基因。
14.權(quán)利要求1-13任何一項(xiàng)所述的方法，其中的基因是tri12基因。
15.權(quán)利要求1-14任何一項(xiàng)所述的方法，其中的基因是tri101基因。
16.權(quán)利要求1-15任何一項(xiàng)所述的方法，其中的突變細(xì)胞培養(yǎng)在相同條件下時(shí)，比親本絲狀真菌細(xì)胞產(chǎn)生的單端孢菌毒素少至少大約25％。
17.權(quán)利要求1-16任何一項(xiàng)所述的方法，其中的突變細(xì)胞不產(chǎn)生單端孢菌毒素。
18.權(quán)利要求1-17任何一項(xiàng)所述的方法，其中的絲狀真菌細(xì)胞包含至少兩個(gè)拷貝的第一核酸序列。
19.權(quán)利要求1-18任何一項(xiàng)所述的方法，其中的異源多肽是一種激素、激素變體、酶、受體或其一部分、抗體或其一部分或者是一種報(bào)道蛋白。
20.權(quán)利要求19的方法，其中所述酶是氧化還原酶、轉(zhuǎn)移酶、水解酶、裂解酶、異構(gòu)酶或連接酶。
21.權(quán)利要求20的方法，其中所述酶是氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、過(guò)氧化氫酶、纖維素酶、幾丁質(zhì)酶、角質(zhì)酶、環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶、脫氧核糖核酸酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、轉(zhuǎn)化酶、漆酶、脂酶、甘露糖苷酶、齒斑葡聚糖酶、氧化酶、果膠水解酶、過(guò)氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶或木聚糖酶。
22.權(quán)利要求1-21任何一項(xiàng)所述的方法，其中的突變細(xì)胞還包含1或多個(gè)第三核酸序列的1或多個(gè)修飾，這些修飾使所述1或多個(gè)第三核酸序列的表達(dá)減少或消除。
23.權(quán)利要求22的方法，其中所述1或多個(gè)第三核酸序列獨(dú)立地編碼一種選自下組的酶氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、過(guò)氧化氫酶、纖維素酶、幾丁質(zhì)酶、角質(zhì)酶、環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶、脫氧核糖核酸酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、轉(zhuǎn)化酶、漆酶、脂酶、甘露糖苷酶、齒斑葡聚糖酶、氧化酶、果膠水解酶、過(guò)氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶和木聚糖酶。
24.權(quán)利要求22的方法，其中所述1或多個(gè)第三核酸序列獨(dú)立編碼氨肽酶、羧肽酶或蛋白酶。
25.權(quán)利要求1-24任何一項(xiàng)所述的方法，其中包含對(duì)至少一個(gè)參與產(chǎn)生單端孢菌毒素之基因的修飾的第二核酸序列未被選擇標(biāo)記標(biāo)志。
26.一種絲狀真菌細(xì)胞的單端孢菌毒素缺陷型突變細(xì)胞，其中包含編碼一種分泌的異源多肽的第一核酸序列和含有對(duì)至少一個(gè)負(fù)責(zé)產(chǎn)生單端孢菌毒素之基因的修飾的第二核酸序列，該突變體培養(yǎng)在相同條件下時(shí)比其親本絲狀真菌細(xì)胞產(chǎn)生的單端孢菌毒素少。
27.權(quán)利要求26的突變細(xì)胞，其中所述絲狀真菌細(xì)胞是支頂孢屬，曲霉屬，短梗霉屬，隱球酵母屬，線黑粉菌屬，鐮孢屬，赤霉屬，腐質(zhì)霉屬，Magnaporthe，毛霉屬，毀絲霉屬，漆斑菌屬，Neocallimastix，脈孢菌屬，擬青霉屬，青霉屬，Piromyces，皺褶菌屬，踝節(jié)菌屬，熱子囊菌屬，梭孢殼屬，Tolypocladium或者木霉屬菌株。
28.權(quán)利要求26的突變細(xì)胞，其中所述絲狀真菌細(xì)胞是鐮孢屬菌株。
29.權(quán)利要求28的突變細(xì)胞，其中所述鐮孢屬細(xì)胞是Fusariumvenenatum細(xì)胞。
30.權(quán)利要求29的突變細(xì)胞，其中所述Fusarium venenatum細(xì)胞是Fusarium venenatum ATCC20334。
31.權(quán)利要求29的突變細(xì)胞，其中所述Fusarium venenatum細(xì)胞是一種形態(tài)學(xué)突變體。
32.權(quán)利要求31的突變細(xì)胞，其中所述Fusarium venenatum細(xì)胞是Fusarium venenatum ATCC20334的形態(tài)學(xué)突變體。
33.權(quán)利要求26-32任何一項(xiàng)所述的突變細(xì)胞，其中的基因選自tri3、tri4、tri5、tri6、tri11、tri12、tri101。
34.權(quán)利要求26-33任何一項(xiàng)所述的突變細(xì)胞，其中的基因是tri5或trichodiene合成酶基因。
35.權(quán)利要求26-34任何一項(xiàng)所述的突變細(xì)胞，其中的基因是tri3基因。
36.權(quán)利要求26-35任何一項(xiàng)所述的突變細(xì)胞，其中的基因是tri4基因。
37.權(quán)利要求26-36任何一項(xiàng)所述的突變細(xì)胞，其中的基因是tri6基因。
38.權(quán)利要求26-37任何一項(xiàng)所述的突變細(xì)胞，其中的基因是tri11基因。
39.權(quán)利要求26-38任何一項(xiàng)所述的突變細(xì)胞，其中的基因是tri12基因。
40.權(quán)利要求26-39任何一項(xiàng)所述的突變細(xì)胞，其中的基因是tri101基因。
41.權(quán)利要求26-40任何一項(xiàng)所述的突變細(xì)胞，其中突變細(xì)胞培養(yǎng)在相同條件下時(shí)，比親本絲狀真菌細(xì)胞產(chǎn)生的單端孢菌毒素少至少大約25％。
42.權(quán)利要求26-41任何一項(xiàng)所述的突變細(xì)胞，其中突變細(xì)胞不產(chǎn)生單端孢菌毒素。
43.權(quán)利要求26-42任何一項(xiàng)所述的突變細(xì)胞，其中的絲狀真菌細(xì)胞包含至少兩個(gè)拷貝的第一核酸序列。
44.權(quán)利要求26-43任何一項(xiàng)所述的突變細(xì)胞，其中的異源多肽是一種激素、激素變體、酶、受體或其一部分、抗體或其一部分或者是一種報(bào)道蛋白。
45.權(quán)利要求44的突變細(xì)胞，其中所述酶是氧化還原酶、轉(zhuǎn)移酶、水解酶、裂解酶、異構(gòu)酶或連接酶。
46.權(quán)利要求45的突變細(xì)胞，其中所述酶是氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、過(guò)氧化氫酶、纖維素酶、幾丁質(zhì)酶、角質(zhì)酶、環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶、脫氧核糖核酸酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、轉(zhuǎn)化酶、漆酶、脂酶、甘露糖苷酶、齒斑葡聚糖酶、氧化酶、果膠水解酶、過(guò)氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶或木聚糖酶。
47.權(quán)利要求26-46任何一項(xiàng)所述的突變細(xì)胞，其中的突變細(xì)胞還包含對(duì)1或多個(gè)第三核酸序列的1或多個(gè)修飾，這些修飾使所述1或多個(gè)第三核酸序列的表達(dá)減少或消除。
48.權(quán)利要求27的突變細(xì)胞，其中所述1或多個(gè)第三核酸序列獨(dú)立地編碼一種酶選自下組的氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、過(guò)氧化氫酶、纖維素酶、幾丁質(zhì)酶、角質(zhì)酶、環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶、脫氧核糖核酸酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、轉(zhuǎn)化酶、漆酶、脂酶、甘露糖苷酶、齒斑葡聚糖酶、氧化酶、果膠水解酶、過(guò)氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶和木聚糖酶。
49.權(quán)利要求47的突變細(xì)胞，其中所述1或多個(gè)第三核酸序列獨(dú)立編碼一種氨肽酶、羧肽酶或蛋白酶。
50.權(quán)利要求26-49任何一項(xiàng)所述的突變細(xì)胞，其中包含對(duì)至少一個(gè)參與產(chǎn)生單端孢菌毒素之基因的修飾的第二核酸序列未被選擇標(biāo)記標(biāo)志。
51.獲得權(quán)利要求26-50任何一項(xiàng)所述突變細(xì)胞的方法，包括(a)向親本絲狀真菌細(xì)胞中導(dǎo)入一個(gè)核酸序列，該核酸序列包含對(duì)至少一個(gè)負(fù)責(zé)產(chǎn)生單端孢菌毒素的基因的修飾；和(c)對(duì)來(lái)自步驟(a)的突變體進(jìn)行鑒定，其中該突變體培養(yǎng)在相同條件下時(shí)比其親本絲狀真菌細(xì)胞產(chǎn)生的單端孢菌毒素少。
52.一種得自Fusarium venenatum菌株的分離的trichodiene合成酶，其選自下組(a)具有與SEQ ID NO2至少97％相同性的氨基酸序列的trichodiene合成酶；(b)具有SEQ ID NO2氨基酸序列之trichodiene合成酶的包含1或多個(gè)氨基酸的取代、缺失和/或插入的變體；(c)(a)或(b)的等位基因變體；以及(d)(a)或(c)的具有trichodiene合成酶活性的片段。
53.權(quán)利要求52的trichodiene合成酶，其具有與SEQ ID NO2至少97％相同性的氨基酸序列。
54.權(quán)利要求52的trichodiene合成酶，其包含氨基酸序列SEQID NO2或其片段。
55.權(quán)利要求52的trichodiene合成酶，其包含氨基酸序列SEQID NO2。
56.權(quán)利要求52-55任何一項(xiàng)的trichodiene合成酶，其得自Fusarium venenatum ATCC20334。
57.權(quán)利要求52的trichodiene合成酶，其由大腸桿菌NRRLB-30029中包含的質(zhì)粒pTri5攜帶的核酸序列編碼。
58.一種分離的核酸序列，其包含編碼權(quán)利要求52-57任何一項(xiàng)所述的trichodiene合成酶的核酸序列。
59.一種包含權(quán)利要求58所述核酸序列以及與之可操縱地連接的1或多個(gè)指導(dǎo)在合適表達(dá)宿主中產(chǎn)生trichodiene合成酶的調(diào)控序列的核酸構(gòu)建體。
60.一種包含權(quán)利要求59所述核酸構(gòu)建體的重組表達(dá)載體。
61.一種包含權(quán)利要求59所述核酸構(gòu)建體的重組宿主細(xì)胞。
62.一種制備權(quán)利要求52-57任何一項(xiàng)所述trichodiene合成酶的方法，包括(a)培養(yǎng)Fusarium venenatum菌株來(lái)制備包含trichodiene合成酶的上清液；和(b)回收trichodiene合成酶。
63.一種制備trichodiene合成酶的方法，包括(a)在適合產(chǎn)生trichodiene合成酶的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求61所述的宿主細(xì)胞；和(b)回收trichodiene合成酶。
64.一種獲得突變細(xì)胞的方法，包括(a)向具有編碼第一基因產(chǎn)物的第一核酸序列的親本細(xì)胞中導(dǎo)入第一核酸構(gòu)建體，該第一核酸構(gòu)建體包含作為選擇標(biāo)記的硝酸還原酶基因和對(duì)第一核酸序列的修飾，其中第一核酸構(gòu)建體摻入到親本細(xì)胞的基因組中，從而以修飾過(guò)的第一核酸序列取代內(nèi)源的第一核酸序列，使得在相同條件下培養(yǎng)時(shí)，第一基因產(chǎn)物的產(chǎn)量較之親本細(xì)胞減少；和(b)選擇來(lái)自步驟(a)的有硝酸還原酶基因并且第一基因產(chǎn)物產(chǎn)量減少的突變細(xì)胞。
65.權(quán)利要求64的方法，其中還包括(c)在培養(yǎng)條件下選擇來(lái)自步驟(b)的硝酸還原酶基因被缺失的突變細(xì)胞。
66.權(quán)利要求64的方法，其中還包括(c)向來(lái)自步驟(b)的突變細(xì)胞導(dǎo)入包含第二核酸序列的第二核酸構(gòu)建體，所述第二核酸序列含有被修飾的第一核酸序列的5’和3’區(qū)，但缺少硝酸還原酶基因，其中該第二構(gòu)建體摻入到親本細(xì)胞的基因組中，以所述第二核酸序列取代被修飾的第一核酸序列；以及(d)在培養(yǎng)條件下挑選來(lái)自步驟(c)的缺失硝酸還原酶基因的突變細(xì)胞。
67.通過(guò)權(quán)利要求64-66任何一項(xiàng)所述方法獲得的突變細(xì)胞。
68.一種制備多肽的方法，包括(a)在有利于所述多肽產(chǎn)生的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求67所述包含編碼該多肽的核酸序列的突變細(xì)胞；以及(b)從突變細(xì)胞的培養(yǎng)基中分離該多肽。
69.一種向細(xì)胞內(nèi)含有的靶核酸序列中引入改變的方法，包括(a)通過(guò)向親本細(xì)胞內(nèi)導(dǎo)入核酸構(gòu)建體來(lái)獲得該親本細(xì)胞的突變細(xì)胞，所述核酸構(gòu)建體包含硝酸還原酶選擇標(biāo)記基因，側(cè)翼是核苷酸序列重復(fù)區(qū)，形成標(biāo)記盒，其中所述重復(fù)區(qū)包含靶DNA 5’緊鄰的核苷酸序列或3’緊鄰的核苷酸序列；并且其中當(dāng)側(cè)翼核苷酸序列重復(fù)區(qū)含有靶DNA 5’的核苷酸序列時(shí)，該核酸構(gòu)建體還在標(biāo)記盒的3’相鄰處包含具靶DNA序列3’的核苷酸序列的另一核苷酸序列；當(dāng)側(cè)翼核苷酸序列重復(fù)區(qū)含有靶DNA 3’的核苷酸序列時(shí)，該核酸構(gòu)建體還在標(biāo)記盒的5’相鄰處包含具靶DNA序列5’的核苷酸序列的另一核苷酸序列；(b)選擇來(lái)自步驟(a)的有硝酸還原酶基因的突變細(xì)胞；(c)在能使硝酸還原酶基因通過(guò)側(cè)翼核苷酸序列重復(fù)區(qū)之間的重組而缺失的條件下培養(yǎng)挑選出來(lái)的突變細(xì)胞，(d)選擇靶核酸序列中具有改變的突變細(xì)胞，其中該突變細(xì)胞內(nèi)硝酸還原酶基因已被缺失。
70.由權(quán)利要求69所述方法獲得的突變細(xì)胞。
71.一種制備多肽的方法，包括(a)在有利于所述多肽產(chǎn)生的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求70所述的包含編碼該多肽的核酸序列的突變細(xì)胞；以及(b)從突變細(xì)胞的培養(yǎng)基中分離該多肽。
全文摘要
本發(fā)明涉及制備多肽的方法，包括(a)在有利于多肽產(chǎn)生的條件下培養(yǎng)親本絲狀真菌細(xì)胞的突變體，其中(i)該突變體包含編碼所述多肽的第一核酸序列和含有對(duì)至少一個(gè)參與產(chǎn)生單端孢菌毒素之基因的修飾的第二核酸序列，(ii)培養(yǎng)在相同條件下時(shí)，該突變體產(chǎn)生的單端孢菌毒素少于親本絲狀真菌細(xì)胞；和(b)從培養(yǎng)基中分離所述多肽。本發(fā)明還涉及絲狀真菌細(xì)胞的突變體以及獲得突變細(xì)胞的方法。本發(fā)明又涉及分離的trichodiene合成酶及編碼該酶的分離的核酸序列。本發(fā)明另外涉及包含所述核酸序列的核酸構(gòu)建體、載體和宿主細(xì)胞，以及制備trichodiene合成酶的方法。本發(fā)明最后涉及包含對(duì)基因進(jìn)行了無(wú)標(biāo)記修飾的突變細(xì)胞以及獲得和利用這樣的突變細(xì)胞的方法。
文檔編號(hào)C12P21/02GK1500882SQ0315880
公開(kāi)日2004年6月2日 申請(qǐng)日期1999年5月20日 優(yōu)先權(quán)日1998年5月20日
發(fā)明者J·C·羅耶, J C 羅耶, L·M·克里斯琴森, 克里斯琴森, G·A·甘貝塔, 甘貝塔, H·布魯?shù)? 車, S·M·奧塔尼, 奧塔尼, W·T·約德, 約德 申請(qǐng)人:諾沃奇梅茲生物技術(shù)有限公司