本發(fā)明涉及一種藤三七離體再生體系建立的方法，屬于植物組織培養(yǎng)技術領域，主要應用于藤三七種苗繁殖。

背景技術：

藤三七(boussingaultiagracilismiersvar．baselloidesbail．)，為落葵科(basellaceae)落葵薯屬(boussingaultiah．b．k．)植物，原名心形落葵薯，別稱落葵薯、洋落葵、川七、土川七、藤子三七、小年藥、土三七、馬德拉藤、金錢珠、中枝蓮、田三七等，原產巴西，我國江蘇、浙江、福建、四川、貴州、云南等地均有栽培。藤三七為多年生纏繞草質藤本植物，莖蔓肉質，呈圓形至橢圓形，初期為淺紫紅色，纏繞性強，節(jié)間易發(fā)生不定根。

由于藤三七中具有各新黃烷醇和抗hiv活性成分等，所以具有相當高的藥用保健價值，并且富含各種維生素，作為一種新興蔬菜,市場對其需求量增加。迄今為止，在國外和國內的某些省份已經有了比較完整的栽培管理理論和技術，其繁殖方式主要是以扦插為主，不能滿足市場的要求，而無性繁殖會導致病毒累積，品質退化。前人對藤三七的離體培養(yǎng)已有部分研究，其中包括蔣向輝和肖樹林分別以藤三七嫩葉和帶芽莖段為外植體，通過愈傷組織手段建立組培快繁體系，為藤三七在這一領域的研究奠定基礎，但是愈傷組織分化成苗需要一定時間，而且也容易發(fā)生變異，作為商業(yè)化推廣，有一定限制。而本發(fā)明以帶芽莖段作外植體直接誘導不定芽，避免了愈傷組織這個過程，可以縮短周期，減少變異，更具有商業(yè)推廣前景。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種藤三七離體再生體系建立的方法，避免了愈傷組織這個過程，可以縮短周期，減少變異，更具有商業(yè)推廣前景。

為實現(xiàn)上述目的，采用以下技術方案：

一種藤三七離體再生體系建立的方法，包括以下步驟：

(1)藤三七外植體的獲得；

(2)初代培養(yǎng)；

(3)繼代增殖培養(yǎng)；

(4)生根培養(yǎng)；

(5)煉苗移栽。

步驟(1)所述的藤三七外植體的獲得方法為：取2~3cm帶葉芽的野生藤三七莖段，用自來水沖洗30min；首先用75%的酒精消毒30秒；用無菌水沖洗1~2次；再將莖段放入0.1%的升汞中消毒4-12min；然后將外植體撈出放入無菌水中浸泡2min，再用無菌水分別沖洗4-5次；最后將藤三七莖段播種入ms培養(yǎng)基中培養(yǎng)獲得不定芽。放置在白光條件下，光照強度1500lx，光照時間14h/d，培養(yǎng)溫度為25±2℃，培養(yǎng)15d獲得不定芽。

步驟(2)所述的初代培養(yǎng)為：從長勢一致的試管材料中取大小相同的不定芽作為外植體，接種在ms培養(yǎng)基中，放置在白光條件下培養(yǎng)。光照強度1500lx，光照時間14h/d，培養(yǎng)溫度為25±2℃，培養(yǎng)25d。

步驟(3)繼代增殖培養(yǎng)方法為：以ms為基本培養(yǎng)基，添加6-ba1.6mg/l和naa0.6mg/l；從步驟（2）中接種25d的無菌苗切取帶葉芽莖段2-3cm接入以上培養(yǎng)基中；置于培養(yǎng)室中培養(yǎng)。放置在白光條件下，光照強度1500lx，光照時間14h/d，培養(yǎng)溫度為25±2℃，培養(yǎng)3周。

步驟(4)所述的生根培養(yǎng)方法為：從步驟（3）中長勢一致的試管材料中取大小相同的不定芽作為外植體，接種ms培養(yǎng)基加iba1.5mg/l進行生根培養(yǎng)，放置在白光條件下培養(yǎng)。光照強度1500lx，光照時間14h/d，培養(yǎng)溫度為25±2℃，培養(yǎng)15d。

步驟(5)所述的煉苗移栽方法為：將經過生根培養(yǎng)后長勢較一致的生根幼苗從培養(yǎng)室中取出，放置在室溫下進行煉苗處理，一天后打開瓶蓋，再放置三天，然后取出洗去根上的培養(yǎng)基，栽種于菜園土栽培基質中。

本發(fā)明的優(yōu)點在于：傳統(tǒng)方法中以藤三七嫩葉和帶芽莖段為外植體，愈傷組織分化成苗需要一定時間，而且也容易發(fā)生變異，作為商業(yè)化推廣，有一定限制。而本發(fā)明以帶芽莖段作外植體直接誘導不定芽，避免了愈傷組織這個過程，且增殖系數(shù)高達15.31±0.28，還沒有報道超過此系數(shù)，可以縮短育苗周期，減少變異，種苗商品性高，更具有商業(yè)推廣前景。

附圖說明

圖1無菌體系的建立。

圖2初代培養(yǎng)的過程。

圖3繼代增殖的過程。

圖4移栽的結果圖。

具體實施方式

實施例1

1.藤三七外植體的獲得

取藤三七根部以上10cm左右至離莖頂端10cm左右部位，剪成2~3cm帶葉芽莖段為外植體，用自來水沖洗30min。首先用75%的酒精消毒30秒；用無菌水沖洗2次；再將莖段放入0.1%的升汞中消毒8min；然后將外植體撈出放入無菌水中浸泡2min，再用無菌水分別沖洗5次。最后將藤三七莖段播種入ms培養(yǎng)基中培養(yǎng)獲得不定芽，放置在白光條件下，光照強度1500lx，光照時間14h/d，培養(yǎng)溫度為25±2℃，培養(yǎng)15d。

2.初代培養(yǎng)

從長勢一致的試管材料中取大小相同的不定芽作為外植體，接種在ms培養(yǎng)基中，然后放置在白光條件下培養(yǎng)，光照強度1500lx，光照時間14h/d，培養(yǎng)溫度為25±2℃，培養(yǎng)25d。獲得藤三七試管苗初代材料。

3.繼代增殖培養(yǎng)

將步驟2中的藤三七初代培養(yǎng)苗接種在附加6-ba1.6mg/l和naa0.6mg/l的ms培養(yǎng)基上，放置在白光條件下進行培養(yǎng)，光照強度1500lx，光照時間14h/d，培養(yǎng)溫度為25±2℃，培養(yǎng)3周。藤三七不定芽的誘導效果較好，增殖系數(shù)可達15.31±0.28。

4.生根培養(yǎng)

從步驟3中的藤三七試管苗接種在ms+1.5mg/liba培養(yǎng)基中，放置在白光條件下，光照強度1500lx，光照時間14h/d，培養(yǎng)溫度為25±2℃，培養(yǎng)15d。生根效果好，試管苗生根率達到94.44%。

5.馴化移栽

藤三七試管苗放置在室溫下進行煉苗處理，一天后打開瓶蓋，再放置三天，從培養(yǎng)瓶中取出，洗去根部培養(yǎng)基，移入菜園土栽培基質中，保濕遮陰，成活率達95%以上。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例，凡依本發(fā)明申請專利范圍所做的均等變化與修飾，皆應屬本發(fā)明的涵蓋范圍。

技術特征：

技術總結
本發(fā)明提供了一種藤三七離體再生體系建立的方法，包括：1）無菌體系建立，距離頂端10cm以下的藤三七莖段用HgCl2消毒8min效果最好；2）初代培養(yǎng)，以MS為基本培養(yǎng)基在白光條件下有利于藤三七莖段伸長生長；3）繼代增殖培養(yǎng)，藤三七試管苗在MS+6?BA?1.6mg/L+NAA?0.6mg/L培養(yǎng)基上增殖效果最好，增殖系數(shù)可達15.31±0.28；4）生根培養(yǎng)：在白光條件下，MS+1.5mg/LIBA培養(yǎng)基對誘導藤三七試管苗生根效果較好，試管苗生根率達到94.44%。5）移栽，煉苗4天后，移栽到菜園土栽培基質上，成活率可達95%。

技術研發(fā)人員：劉生財;賴鐘雄;邵根水;許國輝;程春振;林玉玲;陳裕坤;張梓浩
受保護的技術使用者：福建農林大學
技術研發(fā)日：2017.07.29
技術公布日：2017.09.29