本發(fā)明涉及一種富含1-脫氧野尻霉素的北蟲(chóng)草的培養(yǎng)方法，屬于食用菌栽培
技術(shù)領(lǐng)域：
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背景技術(shù)：
：冬蟲(chóng)夏草，被稱為“神草”，具有催眠鎮(zhèn)靜、益肝腎、補(bǔ)虛損、防癌、抗癌、止血、化痰、平喘等多種功效，與人參、鹿茸并稱為中國(guó)的三大滋補(bǔ)品。而北冬蟲(chóng)夏草(cordycepsmilitaris)簡(jiǎn)稱北蟲(chóng)草，是寄生于夜蛾科等蛹體上，不同于冬蟲(chóng)夏草的另一種蟲(chóng)草，它分布于世界各地，是既可食用又可藥用的一種真菌，可在一定程度上代替冬蟲(chóng)夏草使用。由于野生蟲(chóng)草資源匱乏，專家學(xué)者們致力于人工北蟲(chóng)草的相關(guān)研究，以滿足人們?nèi)找嬖鲩L(zhǎng)的消費(fèi)需求。研究表明，人工栽培北蟲(chóng)草是可行的，獲得的人工北蟲(chóng)草同樣具有補(bǔ)益功效,同時(shí)在免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗癌、抗氧化等方面藥效較佳。分析其活性成分發(fā)現(xiàn)，蟲(chóng)草素和蟲(chóng)草腺苷等含量均不低于野生的蟲(chóng)草。?？粕?morus.l)植物具有藥食功能，桑葉早被我國(guó)藥典收錄,并被國(guó)家食品與藥品監(jiān)督管理局正是收錄為既是食品又是藥品目錄。在《神農(nóng)本草經(jīng)》中就被譽(yù)為“神仙草”，其味苦、性寒，具有補(bǔ)血、疏風(fēng)、散熱、益肝通氣、降壓、利尿消渴等功效；現(xiàn)代醫(yī)學(xué)也證明桑葉在降血糖、降血壓、降血脂、抗炎、抗病毒、抗衰老以及減肥方面均有顯著效果。因此，以桑葉為主要原料的食品、保健品深受消費(fèi)者青睞。已有研究證明，桑葉中的1-脫氧野尻霉素(1-deoxynojirimycin,1-dnj)具有對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用，是桑葉具有降血糖、治療糖尿病功效的主要活性成分，此外1-dnj還具有抗病毒、抗腫瘤轉(zhuǎn)移等藥理作用。鑒于此，dnj已成為近幾年天然活性物質(zhì)的研究熱點(diǎn)。中醫(yī)臨床上常將北蟲(chóng)草與各種中藥配伍使用以達(dá)到協(xié)同增效的目的，蟲(chóng)草主要?dú)w肺腎兩經(jīng)，所以凡是肺上有病的，比如久咳勞嗽、有肺癆的人來(lái)說(shuō)，服用之后的作用非常明顯。蟲(chóng)草和中藥沙參、川貝母、麥冬、陳皮、茯苓、阿膠、桑葉等配伍，不但可以止血化痰，還具有抗腫瘤、保肝、降血糖等作用，但患者在配伍使用中藥時(shí)常常因服用量大、服用不便，導(dǎo)致中斷使用藥物，為此提高北蟲(chóng)草的利用率、簡(jiǎn)化中醫(yī)配伍用藥是必須首先解決的問(wèn)題。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供了一種富含桑葉有效成分1-脫氧野尻霉素及其衍生物的北蟲(chóng)草的培養(yǎng)方法，目的是簡(jiǎn)化中醫(yī)配伍用藥，減少用藥量，同時(shí)提高北蟲(chóng)草的藥用價(jià)值。一種富含桑葉有效活性成分的北蟲(chóng)草的培養(yǎng)方法，包括如下步驟：(1)向培養(yǎng)基中加入富含桑葉有效活性成分的原料，滅菌，制得富集培養(yǎng)基；(2)取蛹蟲(chóng)草子實(shí)體，經(jīng)培養(yǎng)，制備北蟲(chóng)草菌液；(3)將步驟(2)制得的北蟲(chóng)草菌液接種于步驟(1)制得的富集培養(yǎng)基中，在溫度20～22℃、相對(duì)濕度58～62％條件下暗培養(yǎng)3～5天；然后在白天20～22℃、夜晚8～12℃的條件下培養(yǎng)2.5～3.5天，期間白天采用太陽(yáng)散射光照射，夜晚用日光燈照射；然后在溫度20℃～22℃、相對(duì)濕度不低于85％的條件下進(jìn)行出草管理14～16天；收獲即得。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(1)中富含桑葉有效活性成分的原料為：桑葉粉、桑葉水提物和/或鮮桑葉勻漿。進(jìn)一步優(yōu)選的，所述的桑葉粉粒度不小于0.2mm2；所述桑葉水提物為新鮮桑葉與水按料液比1:(4～6)的比例混合后，單位g/l，超聲波提取0.4～0.6h，離心，取上清，即得；所述的鮮桑葉勻漿為新鮮桑葉與水按料液比1:(3～5)的比例混合，單位g/l，勻漿，即得。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(1)中培養(yǎng)基為小麥培養(yǎng)基，組分如下：小麥25～35g，水35～45ml，勻漿后進(jìn)行封口、高壓滅菌。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(1)中富含桑葉有效活性成分的原料與培養(yǎng)基的質(zhì)量比為(1～4):(3～10)。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(2)中培養(yǎng)的具體步驟如下：將蛹蟲(chóng)草子實(shí)體消毒后，用無(wú)菌水洗凈，去除表層，取中間部位組織塊切成組織片，接種于固體培養(yǎng)基中，于25℃黑暗培養(yǎng)7天；然后感光培養(yǎng)4天，選取轉(zhuǎn)色為橘黃色的菌絲接種于液體菌種培養(yǎng)基中，黑暗條件下，繼續(xù)于25℃培養(yǎng)3天，每天在恒溫?fù)u床上以200r/min振蕩1h，制得菌絲干重比為0.2～0.8mg/ml的北蟲(chóng)草菌液。進(jìn)一步優(yōu)選的，所述步驟(2)中的消毒為浸入質(zhì)量濃度為0.1％的氯化汞溶液中3min；進(jìn)一步優(yōu)選的，述步驟(2)中的組織片厚度為0.1mm；進(jìn)一步優(yōu)選的，所述步驟(2)中的固體培養(yǎng)基，每升組分如下：土豆200g煮水20分鐘取濾液，瓊脂20g，葡萄糖20g，蛋白胨5g，磷酸二氫鉀3g，硫酸鎂3g，加水定容至1000ml，ph自然。進(jìn)一步優(yōu)選的，所述步驟(2)中的液體菌種培養(yǎng)基，每升組分如下：葡萄糖20g，蛋白胨30g，磷酸二氫鉀3g，硫酸鎂3g，加水定容至1000ml，ph自然。進(jìn)一步優(yōu)選的，所述步驟(2)中菌絲干重比為0.5mg/ml。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(3)中接種為無(wú)菌接種，接種前，先用紫外線對(duì)富集培養(yǎng)基滅菌15min；接種前先對(duì)北蟲(chóng)草菌液稀釋2～4倍。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(3)中，接種量為富集培養(yǎng)基體積的5～10％。有益效果1、本發(fā)明通過(guò)在傳統(tǒng)的北蟲(chóng)草的小麥培養(yǎng)基中加入桑葉或者桑葉的提取物，培養(yǎng)北蟲(chóng)草，獲得的富含桑葉活性成分1-脫氧野尻霉素的北蟲(chóng)草；且經(jīng)過(guò)測(cè)定，其所含1-脫氧野尻霉素的比例符合中醫(yī)配伍用藥，減少用藥量，同時(shí)顯著提高了北蟲(chóng)草的藥用價(jià)值。2、本發(fā)明培育出的富含桑葉活性成分的北蟲(chóng)草，檢測(cè)出桑葉獨(dú)有的生物堿成分-1-脫氧野尻霉素，為食品、保健品和藥品提供了更有利用價(jià)值的蟲(chóng)草原料；附圖說(shuō)明圖1是實(shí)施例1制得的北蟲(chóng)草中檢測(cè)得到的蟲(chóng)草素和腺苷的高效液相色譜圖；圖2是實(shí)施例1制得的北蟲(chóng)草中檢測(cè)得到的1-脫氧野尻霉素(1-dnj)的高效液相色譜圖；具體實(shí)施方式下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案做進(jìn)一步闡述，但本發(fā)明所保護(hù)范圍不限于此。生物原料來(lái)源桑葉購(gòu)自山東省蠶業(yè)研究所煙臺(tái)綠寶蠶用飼料廠。小麥為普通市售產(chǎn)品，購(gòu)自山東省蠶業(yè)研究所。蛹蟲(chóng)草子實(shí)體購(gòu)自中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心，菌種編號(hào)cgmcc5.700；平菇子實(shí)體購(gòu)自中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心，菌種編號(hào)cgmcc5.370；猴頭菇子實(shí)體購(gòu)自中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心，菌種編號(hào)cgmcc5.739；蛹蟲(chóng)草子實(shí)體、平菇子實(shí)體和猴頭菇子實(shí)體也可市場(chǎng)購(gòu)得。實(shí)施例中所述固體培養(yǎng)基，每升組分如下：土豆200g煮水20分鐘取濾液，瓊脂20g，葡萄糖20g，蛋白胨5g，磷酸二氫鉀3g，硫酸鎂3g，加水定容至1000ml，ph自然。實(shí)施例中所述液體菌種培養(yǎng)基，每升組分如下：葡萄糖20g，蛋白胨30g，磷酸二氫鉀3g，硫酸鎂3g，加水定容至1000ml，ph自然。實(shí)施例1一種富含桑葉有效活性成分的北蟲(chóng)草的培養(yǎng)方法，步驟如下：(1)將干桑葉粗粉碎至約0.5cm2，按照桑葉粉與小麥質(zhì)量比3:10的比例加入到小麥培養(yǎng)基中，121℃滅菌1.5h后，取出，冷卻，制得富集培養(yǎng)基；所述小麥培養(yǎng)基，組分為：小麥30g，水40ml。(2)將蛹蟲(chóng)草子實(shí)體置入0.1％(質(zhì)量百分比)氯化汞溶液中消毒3min后，用無(wú)菌水洗凈，刮掉表層取中間部位組織塊切成0.1mm組織片，接種于固體培養(yǎng)基中于25℃黑暗培養(yǎng)7天；然后感光培養(yǎng)4天，選取轉(zhuǎn)色為橘黃色的菌絲接種于液體菌種培養(yǎng)基中，黑暗條件下，繼續(xù)于25℃培養(yǎng)3天，每天在恒溫?fù)u床上以200r/min培養(yǎng)1小時(shí)，制的菌絲干重為0.5mg/ml的北蟲(chóng)草菌液；(3)取步驟(1)制得的富集培養(yǎng)基，紫外線滅菌15分鐘后，取步驟(2)菌液稀釋3倍后，于無(wú)菌操作臺(tái)中按體積百分比的10％接種，經(jīng)過(guò)發(fā)菌期(溫度為20-22℃，相對(duì)濕度60％，光線為黑暗)、感光轉(zhuǎn)色期(白天20℃-22℃，晚上10℃；光線白天利用太陽(yáng)光散射光，晚上開(kāi)啟日光燈補(bǔ)充光照；每天通風(fēng)2次，每次半小時(shí))、出草期管理(溫度20℃-22℃，相對(duì)濕度85％以上，光線為全明)、收獲得富含桑葉有效活性成分的北蟲(chóng)草；上述富含桑葉有效活性成分的北蟲(chóng)草在40℃的低溫烘干后，避光低溫保存。實(shí)施例2一種富含桑葉有效活性成分的北蟲(chóng)草的培養(yǎng)方法，步驟如下：(1)將按照料液比為1:5(單位g/l)超聲波提取的桑葉水提物，加入到小麥培養(yǎng)基中，小麥與桑葉水提物的質(zhì)量比3:4，121℃滅菌1.5h后，立刻取出，冷卻，制得富集培養(yǎng)基；所述小麥培養(yǎng)基，組分為：小麥30g，水40ml。(2)將蛹蟲(chóng)草子實(shí)體置入0.1％(質(zhì)量百分比)氯化汞溶液中消毒3min后，用無(wú)菌水洗凈，刮掉表層取中間部位組織塊切成0.1mm組織片，接種于固體培養(yǎng)基中于25℃黑暗培養(yǎng)7天；然后感光培養(yǎng)4天，選取轉(zhuǎn)色為橘黃色的菌絲接種于液體菌種培養(yǎng)基中，黑暗條件下，繼續(xù)于25℃培養(yǎng)3天，每天在恒溫?fù)u床上以200r/min培養(yǎng)1小時(shí)，制得接種菌液，制的菌絲干重為0.5mg/ml的北蟲(chóng)草菌液；(3)取步驟(1)制得的富集培養(yǎng)基，紫外線滅菌15分鐘后，取步驟(2)菌液稀釋3倍后，于無(wú)菌操作臺(tái)中按體積百分比的5％接種，經(jīng)過(guò)發(fā)菌期(溫度為20-22℃，相對(duì)濕度60％，光線為黑暗)、感光轉(zhuǎn)色期(白天20℃-22℃，晚上10℃；光線白天利用太陽(yáng)光散射光，晚上開(kāi)啟日光燈補(bǔ)充光照；每天通風(fēng)2次，每次半小時(shí))、出草期管理(溫度20℃-22℃，相對(duì)濕度85％以上，光線為全明)、收獲得富含桑葉有效活性成分的北蟲(chóng)草；上述富含桑葉有效活性成分的北蟲(chóng)草在40℃的低溫烘干后，避光低溫保存。實(shí)施例3一種富含桑葉有效活性成分的北蟲(chóng)草的培養(yǎng)方法，步驟如下：(1)將鮮桑葉勻漿后，按照質(zhì)量比1:3加入到小麥培養(yǎng)基中，121℃滅菌1.5h后，立刻取出，冷卻，制得富集培養(yǎng)基；所述小麥培養(yǎng)基，組分為：小麥30g，水40ml。(2)將蛹蟲(chóng)草子實(shí)體置入0.1％(質(zhì)量百分比)氯化汞溶液中消毒3min后，用無(wú)菌水洗凈，刮掉表層取中間部位組織塊切成0.1mm組織片，接種于固體培養(yǎng)基中于25℃黑暗培養(yǎng)7天；然后感光培養(yǎng)4天，選取轉(zhuǎn)色為橘黃色的菌絲接種于液體菌種培養(yǎng)基中，黑暗條件下，繼續(xù)于25℃培養(yǎng)3天，每天在恒溫?fù)u床上以200r/min培養(yǎng)1小時(shí)，制得接種菌液，制的菌絲干重為0.5mg/ml的北蟲(chóng)草菌液；(3)取步驟(1)制得的富集培養(yǎng)基，紫外線滅菌15分鐘后，取步驟(2)菌液稀釋3倍后，于無(wú)菌操作臺(tái)中按體積百分比的8％接種，經(jīng)過(guò)發(fā)菌期(溫度為20-22℃，相對(duì)濕度60％，光線為黑暗)、感光轉(zhuǎn)色期(白天20℃-22℃，晚上10℃；光線白天利用太陽(yáng)光散射光，晚上開(kāi)啟日光燈補(bǔ)充光照；每天通風(fēng)2次，每次半小時(shí))、出草期管理(溫度20℃-22℃，相對(duì)濕度85％以上，光線為全明)、收獲得富含桑葉有效活性成分的北蟲(chóng)草；上述富含桑葉有效活性成分的北蟲(chóng)草在40℃的低溫烘干后，避光低溫保存。對(duì)比例1(1)將小麥培養(yǎng)基在121℃滅菌1.5h后，立刻取出，冷卻，制得小麥培養(yǎng)基；所述小麥培養(yǎng)基，組分為：小麥30g，水40ml。(2)將蛹蟲(chóng)草子實(shí)體置入0.1％(質(zhì)量百分比)氯化汞溶液中消毒3min后，用無(wú)菌水洗凈，刮掉表層取中間部位組織塊切成0.1mm組織片，接種于固體培養(yǎng)基中于25℃黑暗培養(yǎng)7天；然后感光培養(yǎng)4天，選取轉(zhuǎn)色為橘黃色的菌絲接種于液體菌種培養(yǎng)基中，黑暗條件下，繼續(xù)于25℃培養(yǎng)3天，每天在恒溫?fù)u床上以200r/min培養(yǎng)1小時(shí)，制得接種菌液，制的菌絲干重為0.5mg/ml的北蟲(chóng)草菌液；(3)取步驟(1)制得的小麥培養(yǎng)基，紫外線滅菌15分鐘后，取步驟(2)菌液稀釋3倍后，于無(wú)菌操作臺(tái)中接種，經(jīng)過(guò)發(fā)菌期(溫度為20-22℃，相對(duì)濕度60％，光線為黑暗)、感光轉(zhuǎn)色期(白天20℃-22℃，晚上10℃；光線白天利用太陽(yáng)光散射光，晚上開(kāi)啟日光燈補(bǔ)充光照；每天通風(fēng)2次，每次半小時(shí))、出草期管理(溫度20℃-22℃，相對(duì)濕度85％以上，光線為全明)、收獲得富含桑葉有效活性成分的北蟲(chóng)草；上述富含桑葉有效活性成分的北蟲(chóng)草在40℃的低溫烘干后，避光低溫保存。對(duì)比例2如實(shí)施例2所述的培養(yǎng)方法，不同之處在于，將蛹蟲(chóng)草子實(shí)體替換為平菇子實(shí)體。對(duì)比例3如實(shí)施例2所述的培養(yǎng)方法，不同之處在于，將蛹蟲(chóng)草子實(shí)體替換為猴頭菇子實(shí)體。試驗(yàn)例檢測(cè)方法參見(jiàn)“用反相高效液相色譜-紫外檢測(cè)法測(cè)定1-脫氧野尻霉素的含量”《蠶業(yè)科學(xué)》2006年第01期，“高效液相色譜法測(cè)定蟲(chóng)草中蟲(chóng)草素和腺苷含量的研究”，《山東蠶業(yè)》2009第2期中所述方法，檢測(cè)實(shí)施例1～3及對(duì)比例1的相關(guān)數(shù)據(jù)。結(jié)果如表1所示。表1蟲(chóng)草素(mg/g)腺苷(mg/g)1-脫氧野尻霉素(mg/g)實(shí)施例14.92.50.05實(shí)施例24.52.70.17實(shí)施例34.22.80.1對(duì)比例14.32.60對(duì)比例202.50對(duì)比例302.60.08結(jié)果分析由表1的結(jié)果可以看出，對(duì)比例1和實(shí)施例1-3中的蟲(chóng)草素和腺苷均有一定的差別，但是差別未達(dá)到顯著性差異；對(duì)比例1中的1-脫氧野尻霉素中沒(méi)有1-dnj，但是實(shí)施例中均檢測(cè)到不同含量的1-dnj,說(shuō)明北蟲(chóng)草菌對(duì)桑葉中的1-dnj具有富集作用，從而培養(yǎng)出了具有?；钚猿煞值谋毕x(chóng)草，但是1-dnj的含量不同主要是由于北蟲(chóng)草菌對(duì)于干桑葉、桑葉提取物以及鮮桑葉勻漿中活性成分的富集量不同，參照已有的藥方：“沙參15，貝母12，麥冬15，陳皮6，茯苓12，阿膠10，桑葉12，蟲(chóng)草6”的量進(jìn)行折算，認(rèn)為實(shí)施例2中桑葉提取物的添加可以達(dá)到藥方中的要求。對(duì)比例2-3和實(shí)施例2的結(jié)果可以看出，菌對(duì)1-脫氧野尻霉素的富集具有特異性，在相同的培養(yǎng)條件下，平菇?jīng)]有富集作用，而猴頭菇雖然有富集作用，但顯著低于北蟲(chóng)草。當(dāng)前第1頁(yè)12