一種高蟲(chóng)草素含量的北蟲(chóng)草菌株選育方法及生產(chǎn)工藝的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及北蟲(chóng)草菌株選育方法領(lǐng)域，尤其涉及一種高蟲(chóng)草素含量的北蟲(chóng)草菌株 選育方法及生產(chǎn)工藝。
【背景技術(shù)】
[0002] 北蟲(chóng)草又稱(chēng)為蛹蟲(chóng)草、北冬蟲(chóng)夏草，隸屬于真菌界的子囊菌門(mén)、肉座菌目、麥角菌 科，是蟲(chóng)草屬的模式種，與冬蟲(chóng)夏草屬同種，全球廣泛分布。北蟲(chóng)草在鱗翅目昆蟲(chóng)上的子囊 座與蟲(chóng)體的藥用價(jià)值與冬蟲(chóng)夏草相似，是我國(guó)極具開(kāi)發(fā)價(jià)值的藥用滋補(bǔ)真菌，可以作為冬 蟲(chóng)夏草的代用品。近年來(lái)隨著研宄人員對(duì)北蟲(chóng)草滋補(bǔ)保健功效和多種藥用價(jià)值的認(rèn)識(shí)，其 開(kāi)發(fā)利用研宄倍受關(guān)注，并在藥理有效成分及人工栽培等各方面取得了很大的進(jìn)展?，F(xiàn)在 主栽食用菌品種育種工作開(kāi)展的很多，但是北蟲(chóng)草新菌株的選育工作報(bào)道較少。現(xiàn)在市場(chǎng) 上北蟲(chóng)草商品多為尖頭和棒狀品種，而市場(chǎng)對(duì)子囊座膨大狀同時(shí)蟲(chóng)草素高的商品草有需 求。
[0003] 真菌的交配型是控制其交配親和性和有性生殖的遺傳基礎(chǔ)。已知真菌的交配型 系統(tǒng)分為同宗配合和異宗配合2大類(lèi)。同宗配合是一種自體可孕的有性生殖方式，即該 真菌不需要兩個(gè)不同來(lái)源的菌絲交配，只由同一有性孢子萌發(fā)生成的初級(jí)菌絲就可獨(dú)立 完成有性生活史。同宗配合分成初級(jí)同宗配合（primaryhomothallism)和次級(jí)同宗配 合（secondaryhomothallism)。異宗配合是一種自體不孕的有性生殖方式，S卩由同一有 性孢子萌發(fā)形成的初級(jí)菌絲不能獨(dú)立完成有性生活史，只有通過(guò)兩個(gè)不同交配型的有性 孢子萌發(fā)生成的初生菌絲之間的交配，才能完成有性生活史。異宗配合根據(jù)控制交配型 的不親和性因子是一對(duì)還是兩對(duì)，也可分為兩類(lèi)：具有一對(duì)不親和性因子的二極性異宗配 合（bipolarheterothallism)和具有兩對(duì)不親和性因子的四極性異宗配合（tetrapolar heterothallism)。就同一菌株所產(chǎn)生的有性孢子間的交配而言，二極性異宗配合菌的可親 和率為50%，而四極性異宗配合菌的可親和率為25%，北蟲(chóng)草屬于二極性異宗配合真菌， 在有性生殖過(guò)程會(huì)帶來(lái)遺傳重組缺失突變等，使有性后代發(fā)生各種變異，通過(guò)子囊孢子的 分離和配對(duì)雜交，使我們有可能從中篩選到子囊座膨大蟲(chóng)草素高的北蟲(chóng)草。
[0004] 北蟲(chóng)草在有性生殖過(guò)程中往往會(huì)發(fā)生染色體水平和基因水平上遺傳變異染色體 水平上的變異，主要是因?yàn)橄x(chóng)草在有性生殖過(guò)程中發(fā)生質(zhì)配核配和減數(shù)分裂所致；而基因 水平上的變異主要是由于蛹蟲(chóng)草在生長(zhǎng)過(guò)程中受到營(yíng)養(yǎng)條件和環(huán)境條件的誘變所致，所以 即使是來(lái)自同一子實(shí)體的不同子囊孢子菌株間在菌落顏色形態(tài)生長(zhǎng)速率等性狀上也存在 一定差異，各自產(chǎn)生子實(shí)體的能力也不盡相同。試驗(yàn)表明菌落顏色為杏橙色的單孢子一般 是可孕的而且產(chǎn)子實(shí)體的能力較強(qiáng)，配對(duì)后比單獨(dú)培養(yǎng)時(shí)產(chǎn)子實(shí)體的能力更強(qiáng)，菌落顏色 為淡檸檬黃色的單孢子一般是不可孕的，配對(duì)后一部分是可孕的有些產(chǎn)子實(shí)體的能力也很 強(qiáng)，將單孢子對(duì)峙培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)在單孢子間有扇形雜交區(qū)的配對(duì)培養(yǎng)產(chǎn)生子實(shí)體的能力強(qiáng)， 沒(méi)有扇形雜交區(qū)的單孢子配對(duì)培養(yǎng)產(chǎn)生子實(shí)體的能力弱。
[0005] 現(xiàn)有技術(shù)通過(guò)組織分離（北蟲(chóng)草菌種的培育方法，CN102550290A;北蟲(chóng)草 最佳組織分離期篩選方法，CN103250566A;蛹蟲(chóng)草優(yōu)良菌種的篩選和穩(wěn)定繁殖方法，CN1710063)、分生孢子雜交（利用交配型對(duì)蛹蟲(chóng)草菌株復(fù)壯和提高子實(shí)體產(chǎn)量的方法， CN103609331A;)、多孢雜交（一種蛹蟲(chóng)草菌種的培養(yǎng)方法，CN102017866A)可以基本實(shí)現(xiàn)普 通北蟲(chóng)草和孢子粉的生產(chǎn)。但組織分離由于多次的無(wú)性繁殖，菌株中含有大量的衰退變異 菌，使菌種活力明顯降低，表現(xiàn)為生長(zhǎng)變慢、轉(zhuǎn)色變慢、產(chǎn)量下降等；利用分生孢子和多孢雜 交存在菌株純度不足，出草良品率低等問(wèn)題。
[0006] 鑒于上述缺陷，本發(fā)明創(chuàng)作者經(jīng)過(guò)長(zhǎng)時(shí)間的研宄和實(shí)踐終于獲得了本創(chuàng)作。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的在于提供一種高蟲(chóng)草素含量的北蟲(chóng)草菌株選育方法及生產(chǎn)工藝，用 以克服上述技術(shù)缺陷。
[0008] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供一種高蟲(chóng)草素含量的北蟲(chóng)草菌株選育方法，該具體 過(guò)程為：
[0009] 步驟a，優(yōu)良單孢子菌株選育；
[0010] 將成熟子實(shí)體倒懸于PDA培養(yǎng)基上方，自然彈射，18-22°c避光培養(yǎng)2-3天，可見(jiàn)星 芒狀萌發(fā)點(diǎn)，選取單個(gè)萌發(fā)點(diǎn)，挑取多于100株于PDA斜面培養(yǎng)基上；20-23°C避光培養(yǎng)15 天后，光照3天，選擇30株在PDA斜面培養(yǎng)基上萌發(fā)快、長(zhǎng)勢(shì)旺，菌絲粗壯，見(jiàn)光轉(zhuǎn)色快，色 濃的菌株，轉(zhuǎn)接至培養(yǎng)皿，20-23°C避光培養(yǎng)，挑選20株準(zhǔn)備子實(shí)體培養(yǎng)；
[0011] 步驟b，制備液體菌種；
[0012] 取500ml三角瓶，每瓶加200ml液體培養(yǎng)基，接種約0. 5cm2斜面菌種，置搖床 16-23°C避光培養(yǎng)，100r?mirT1震蕩培養(yǎng)4天；觀察液體是否渾濁，若渾濁則剔除；
[0013] 步驟c，出草實(shí)驗(yàn)；
[0014] 將所得的液體菌種通過(guò)一定比例配對(duì)轉(zhuǎn)接于瓶裝小麥培養(yǎng)基上，于18-20°C避光培養(yǎng)7-15天，菌絲長(zhǎng)滿培養(yǎng)基后，培養(yǎng)溫度調(diào)制20-23 °C，見(jiàn)光培養(yǎng)，光照強(qiáng)度 5001X-20001x，持續(xù)光照1-3天，轉(zhuǎn)色后在膜上打孔通風(fēng)，光照改為每天12小時(shí)，濕度控制 在65-85 %，培養(yǎng)40天后，選擇子囊座膨大顯著采收并測(cè)定蟲(chóng)草素含量；
[0015] 步驟d，選擇子囊膨大狀菌株；
[0016] 觀察成熟子實(shí)體子囊座膨大程度，選取子囊座膨大顯著且蟲(chóng)草素含量高的菌株， 從子囊座組織分離得到純化菌株，轉(zhuǎn)接到PDA斜面培養(yǎng)基，采用小麥培養(yǎng)基再次進(jìn)行出草 試驗(yàn)；若上述20株菌株未出現(xiàn)子囊座膨大的菌株，則繼續(xù)將剩余的菌，繼續(xù)進(jìn)行出草試驗(yàn)， 篩選子囊座膨大蟲(chóng)草素含量高菌株；
[0017] 觀察成熟子實(shí)體子囊座膨大程度，選取子囊座膨大顯著的菌株，從子囊座組織分 離得到純化菌株，轉(zhuǎn)接到PDA斜面培養(yǎng)基，采用小麥培養(yǎng)基再次進(jìn)行出草試驗(yàn)；若上述20株 菌株未出現(xiàn)子囊座膨大的菌株，則繼續(xù)將剩余的菌，繼續(xù)進(jìn)行出草試驗(yàn)，篩選子囊座膨大蟲(chóng) 草素含量高菌株。
[0018] 進(jìn)一步地，上述步驟b中的液體培養(yǎng)基為：玉米粉1-3%、土豆1-3%、葡萄糖 1-3%、蛋白胨 0? 1-3%、磷酸二氫鉀 0? 05-0. 5%、硫酸鎂 0? 01-0. 05%、水 89-96. 9%，121°C 滅菌30min。
[0019] 進(jìn)一步地，上述步驟c中的小麥的固體培養(yǎng)基：小麥1000g、豆柏10-100g、葡萄 糖10-50g、蛋白胨10-50g、磷酸二氫鉀l-5g、硫酸鎂0. 1-0. 5g、磷酸二氫鉀l-5g、硫酸鎂 0? 1-0. 5g、VB2-片、VB6-片、含水量 55-65%，121°C滅菌 30min。
[0020] 本發(fā)明還提供一種高蟲(chóng)草素含量的北蟲(chóng)草菌株的生產(chǎn)工藝，該具體過(guò)程為：
[0021] 步驟al，制作培養(yǎng)基，其配方為：小麥1千克，豆柏0. 05千克，蟲(chóng)草專(zhuān)用促生劑35 克，水1. 5千克；
[0022] 步驟a2,配制方法：將蟲(chóng)草專(zhuān)用促生劑放入水中，攪至完全溶解即成營(yíng)養(yǎng)液；每盒 小麥按450克、水0. 7升分裝入塑料盒；分裝完后用耐高溫塑料膜將每個(gè)塑料盒蓋嚴(yán)并用耐 高溫松緊繩扎一道；
[0023] 步驟a3,滅菌：滅菌鍋內(nèi)加適量水，把培養(yǎng)料盒放入滅菌鍋，升溫至100°C-121 °C， 保持1-8小時(shí)；取出，冷卻后移入接種室；用優(yōu)質(zhì)氣霧消毒劑或常規(guī)方法密閉消毒30分鐘， 即可穿戴消毒衣服進(jìn)入接種室接種；
[0024] 步驟a4,接種：進(jìn)入接種室應(yīng)迅速關(guān)好門(mén)；接種工具、菌種外壁、操作人員雙手，用 75%酒精擦拭或浸沾消毒；采用液體菌種；在無(wú)菌條件下，打開(kāi)封口材料，用接種槍將液體 種噴勾即可；接種量視容器大小而定，或在液體菌種中加入一定比例的無(wú)菌水或無(wú)菌營(yíng)養(yǎng) 液再接種的；
[0025] 步驟a5,管理：萌發(fā)室內(nèi)最初將溫度保持16_20°C遮光萌發(fā)8-15天；當(dāng)菌絲生長(zhǎng) 至培養(yǎng)基1/2-2/3時(shí)，將溫度升至20°C并進(jìn)行劃菌；將盒從萌發(fā)室轉(zhuǎn)入培養(yǎng)室，每天24小 時(shí)光照轉(zhuǎn)色1-3天，當(dāng)培養(yǎng)基轉(zhuǎn)為橘紅和出現(xiàn)菌絲突起時(shí)，給予10_15°C的溫差刺激，溫度 提高到20-23°C;對(duì)培養(yǎng)室消毒30分鐘，然后在塑料膜上用工具點(diǎn)6-18個(gè)孔，濕度保持 65-85%，室內(nèi)適量通氣為子座生長(zhǎng)提供足夠氧氣；
[0026] 步驟a6,采收：子座呈橘紅色或橘黃色球狀不再生長(zhǎng)時(shí)，總培養(yǎng)時(shí)間控制在50-70 天；打開(kāi)盆口用小刀或剪刀將其從基部采下，放入潔凈器具內(nèi)及時(shí)烘干或晾干，勿暴曬以免 褪色，干燥后存放。
[0027] 與現(xiàn)有技術(shù)相比本發(fā)明的有益效果在于，本發(fā)明技術(shù)能夠?qū)崿F(xiàn)北蟲(chóng)草品種的多樣 化，優(yōu)選出子囊座膨大且蟲(chóng)草素含量高的北蟲(chóng)草菌；外形似蝌蚪，具有很好的市場(chǎng)前景。由 于菌種的特殊性，工業(yè)化生產(chǎn)要求