本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種黑莓苗木的快速繁殖方法。

背景技術(shù)：

黑莓(Rubus spp.Blackberry)是薔薇科(Rosaceae)懸鉤子屬(Rubus)植物。其果實(shí)成熟后，果實(shí)較大，呈紫紅色，口感酸爽，且營(yíng)養(yǎng)異常豐富，具有人體所必須的各種氨基酸、糖類(lèi)和維生素，并且還含有大量的過(guò)氧化物歧化酶(SOD)，對(duì)人體免疫力的提高，血液凝固的促進(jìn)，以及衰老的延緩等有著重要的作用。近代以來(lái)，隨著果酒和罐頭的投資發(fā)展，黑莓漿果獨(dú)具有的果香和酸甜味道可以作為好原料，并且由于黑莓果營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高、保健作用明顯，在國(guó)內(nèi)外被稱(chēng)之為“黑鉆石”，是目前備受關(guān)注的世界第三代新興小果類(lèi)果樹(shù)，具有極高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力。

在19世紀(jì)的初期，黑莓的種植是在北美洲的大部分地區(qū)，20世紀(jì)80年代中期，江蘇省中國(guó)科學(xué)院植物研究所對(duì)這些果樹(shù)進(jìn)行考察，將其優(yōu)良品種于1986年引入我國(guó)。黑莓的優(yōu)良品種具有較好的水土保持作用，并且耐干旱，耐鹽堿，易栽培，近年來(lái)在我國(guó)發(fā)展十分迅速，在我國(guó)南方貧瘠丘陵山地種植面積不斷擴(kuò)大，深受當(dāng)?shù)剞r(nóng)民的青睞，是他們發(fā)家致富的首選經(jīng)濟(jì)果樹(shù)。

種植面積的增大，意味著苗木需求量的增加，因此短期獲得大量健壯苗木是急需解決的問(wèn)題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明以黑莓品種朝植8號(hào)的莖段位外植體進(jìn)行離體培養(yǎng)，對(duì)培養(yǎng)基中激素配比進(jìn)行了研究，目的是挑選出適合黑莓品種朝植8號(hào)快速繁殖的方法，以此來(lái)獲得大量的具有優(yōu)良性狀的黑莓植株。

本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：黑莓苗木的快速繁殖方法，方法如下：

1)消毒滅菌：取長(zhǎng)度為2-3cm且?guī)в幸秆康暮谳o段，進(jìn)行消毒滅菌，得接種莖段；優(yōu)選的，所述的消毒滅菌為：將長(zhǎng)度為2-3cm且?guī)в幸秆康暮谳o段，用自來(lái)水沖洗，再用洗衣粉浸泡20分鐘后，轉(zhuǎn)入超潔凈工作臺(tái)，用體積分?jǐn)?shù)75％乙醇浸泡30s，無(wú)菌水沖洗3-4次，然后用體積分?jǐn)?shù)0.1％的HgCl₂溶液浸泡8min，再用無(wú)菌水沖洗3-4次，用吸水紙吸干表面水分。

2)初代培養(yǎng)：以含30g/L蔗糖和8g/L瓊脂的MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，添加0.5-1.5mg/L的6-BA和0-0.2mg/L的NAA作為初代培養(yǎng)基，將經(jīng)過(guò)消毒滅菌的接種莖段接種到初代培養(yǎng)基中，于溫度25±2℃，光照時(shí)間15h/d，光照度3000lx，相對(duì)濕度70％的條件下培養(yǎng)。

優(yōu)選的，所述的初代培養(yǎng)基中，添加1.0mg/L的6-BA。

3)繼代培養(yǎng)：以含30g/L蔗糖和8g/L瓊脂的MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，添加0.5-2.0mg/L的6-BA或0.30-1.0mg/L的NAA作為繼代培養(yǎng)基，將經(jīng)過(guò)初代培養(yǎng)的接種莖段，從基部切下后分成單芽并接種到繼代培養(yǎng)基中，于溫度25±2℃、光照時(shí)間15h/d、光照度3000lx、相對(duì)濕度約70％的條件下培養(yǎng)。

優(yōu)選的，所述的繼代培養(yǎng)基中，添加1.0mg/L的6-BA或0.30mg/L的NAA。

4)生根培養(yǎng)：以含20g/L蔗糖和8g/L瓊脂的1/2MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，添加0.05-1.00mg/L的NAA作為生根培養(yǎng)基，將經(jīng)過(guò)繼代培養(yǎng)的芽從基部切下，分成單芽后接入生根培養(yǎng)基中，于溫度25±2℃、光照時(shí)間15h/d、光照度3000lx、相對(duì)濕度70％的條件下培養(yǎng)。

優(yōu)選的，所述的生根培養(yǎng)基添加0.10mg/L的NAA。

上述的黑莓苗木的快速繁殖方法，所述的黑莓為黑莓朝植8號(hào)。

本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明在MS培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，通過(guò)培養(yǎng)基成分激素配比的優(yōu)化，獲得黑莓朝植8號(hào)快速繁殖的培養(yǎng)基，以此來(lái)獲得大量具有優(yōu)良性狀黑莓植株，通過(guò)本發(fā)明的方法繁殖植株可有效的縮短成苗培養(yǎng)周期，并且經(jīng)過(guò)快速繁殖的植株生根數(shù)量較多且根較為粗壯，可大大的提高移栽成活率。

附圖說(shuō)明

圖1是實(shí)施例2在1.00mg/L的6-BA的初代培養(yǎng)基上黑莓品種朝植8號(hào)莖段萌芽情況。

圖2是實(shí)施例2在1.00mg/L的6-BA的初代培養(yǎng)基上黑莓品種朝植8號(hào)展葉情況。

圖3是實(shí)施例2在1.00mg/L的6-BA的繼代培養(yǎng)基上黑莓品種朝植8號(hào)不定芽增殖和芽長(zhǎng)情況。

圖4是實(shí)施例3在0.30mg/L的NAA的繼代培養(yǎng)基上黑莓品種朝植8號(hào)不定芽增殖和芽長(zhǎng)情況。

圖5是實(shí)施例2在0.10mg/L的NAA的生根培養(yǎng)基外植體生根情況。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1 黑莓苗木的快速繁殖方法

1、消毒滅菌

選擇生理狀態(tài)相似的若干枝條，剪成長(zhǎng)度為2-3cm并且?guī)в幸秆康那o段，然后用自來(lái)水沖洗20分鐘，再于適量的洗衣粉中浸泡20分鐘后，轉(zhuǎn)入超潔凈工作臺(tái)，用體積分?jǐn)?shù)75％乙醇浸泡30s，無(wú)菌水沖洗3-4次，然后用體積分?jǐn)?shù)0.1％的HgCl₂溶液浸泡8min，再用無(wú)菌水沖洗3-4次，用吸水紙吸干表面水分，此莖段為接種莖段。

2、初代培養(yǎng)

以含有30g/L蔗糖和8g/L瓊脂的MS培養(yǎng)基(PH 5.8)為基本，如表1添加不同質(zhì)量濃度的6-BA和NAA作為初代培養(yǎng)基，將經(jīng)過(guò)消毒滅菌并修剪后的黑莓朝植8號(hào)外植體分別接種于初代培養(yǎng)基中，每個(gè)處理接種5瓶，每瓶接種3個(gè)莖段，并設(shè)置三次重復(fù)。置于溫度(25±2)℃，光照時(shí)間15h/d，光照度3000lx，相對(duì)濕度70％的條件下培養(yǎng)。15d后統(tǒng)計(jì)萌芽率，并分別于接種后的第15d和第30d測(cè)量芽長(zhǎng)，培養(yǎng)40d后統(tǒng)計(jì)增殖系數(shù)。

萌芽率＝(萌發(fā)腋芽的外植體數(shù)/接種的外植體數(shù))×100％

增殖系數(shù)＝增值腋芽數(shù)/接種芽總數(shù)

平均芽長(zhǎng)＝(分化芽總長(zhǎng)/分化總芽數(shù))×100％

生根率＝(生根芽數(shù)/接種芽總數(shù))×100％

表1

由表1可見(jiàn)，在初代培養(yǎng)基中添加NAA不利于腋芽的萌發(fā)和生長(zhǎng)，僅需添加適量的6-BA即可獲得較好的培養(yǎng)效果。黑莓品種朝植8號(hào)帶腋芽莖段在初代培養(yǎng)基添加了1.00mg/L的6-BA的MS培養(yǎng)基(含30g/L蔗糖和8g/L瓊脂，pH 5.8)中萌芽率和增殖系數(shù)最高，并且長(zhǎng)勢(shì)最好，即15d和30d的平均芽長(zhǎng)分別達(dá)到0.95cm和1.33cm。因此優(yōu)選，初代培養(yǎng)基為以含30g/L蔗糖和8g/L瓊脂的MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，添加1.00mg/L的6-BA。

3、繼代培養(yǎng)

以含30g/L蔗糖和8g/L瓊脂的MS培養(yǎng)基(pH 5.8)為基礎(chǔ)，如表2，添加0.5-2.0mg/L的6-BA或0.30-1.0mg/L的NAA作為繼代培養(yǎng)基，將經(jīng)過(guò)初代培養(yǎng)的健壯不定芽，從基部切下后分成單芽并接種到繼代培養(yǎng)基中，每處理接種5瓶，每瓶3個(gè)不定芽，各設(shè)置重復(fù)3次，于溫度25±2℃、光照時(shí)間15h/d、光照度3000lx、相對(duì)濕度約70％的條件下培養(yǎng)，35d后統(tǒng)計(jì)不定芽的生長(zhǎng)和增殖情況。

表2

由表2可以看出，在6-BA添加量為0.50、1.00和2.00mg/L的3組培養(yǎng)基中，在6-BA質(zhì)量濃度為1.00mg/L的培養(yǎng)基上不定芽的增殖系數(shù)最高，達(dá)到3.67。隨6-BA質(zhì)量濃度的提高，平均芽長(zhǎng)逐漸減小，在6-BA添加量為1.0mg/L的培養(yǎng)基上平均芽長(zhǎng)最大，達(dá)到2.10cm。在NAA添加量為0.30、0.50和1.00mg/L的3組培養(yǎng)基中，NAA添加量為0.30mg/L時(shí)，不定芽增殖系數(shù)最高，達(dá)到1.79；并且在NAA添加量為0.30mg/L的培養(yǎng)基上不定芽的平均芽長(zhǎng)最大，達(dá)到2.73cm。說(shuō)明在增殖培養(yǎng)基中NAA添加量較高不利于不定芽的生長(zhǎng)。因此，在黑莓品種朝植8號(hào)的繼代培養(yǎng)基中，優(yōu)選，添加質(zhì)量濃度為1.00mg/L的6-BA，或添加質(zhì)量濃度為0.30mg/L的NAA。

4、生根培養(yǎng)

以含20g/L蔗糖和8g/L瓊脂的1/2MS培養(yǎng)基(pH 5.8)為基礎(chǔ)，分別添加質(zhì)量濃度為0.05、0.10、0.50和1.00mg/L的NAA作為生根培養(yǎng)基，將經(jīng)過(guò)繼代培養(yǎng)且長(zhǎng)勢(shì)較好的芽從基部切下，分成單芽后接入生根培養(yǎng)基中，每處理接種5瓶，每瓶接種3個(gè)芽，各重復(fù)3次。于溫度25±2℃、光照時(shí)間15h/d、光照度3000lx、相對(duì)濕度70％的條件下培養(yǎng)，30d后觀察生根情況。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：當(dāng)NAA濃度為0.10mg/L時(shí)，外植體生根較快，生根多且壯，當(dāng)NAA濃度為0.50mg/L時(shí)，外植體生根慢并且氣生根較多，當(dāng)NAA濃度為1.00mg/L時(shí)，外植體生根較慢，生根少但較長(zhǎng)。因此，優(yōu)選，生根培養(yǎng)基中添加0.10mg/L的NAA。

實(shí)施例2

1、消毒滅菌

選擇生理狀態(tài)相似的若干枝條，剪成長(zhǎng)度為2-3cm并且?guī)в幸秆康那o段，然后用自來(lái)水沖洗20分鐘，再于適量的洗衣粉中浸泡20分鐘后，轉(zhuǎn)入超潔凈工作臺(tái)，用體積分?jǐn)?shù)75％乙醇浸泡30s，無(wú)菌水沖洗3-4次，然后用體積分?jǐn)?shù)0.1％的HgCl₂溶液浸泡8min，再用無(wú)菌水沖洗3-4次，用吸水紙吸干表面水分，此莖段為接種莖段。

2、初代培養(yǎng)

以含有30g/L蔗糖和8g/L瓊脂的MS培養(yǎng)基(PH 5.8)為基礎(chǔ)，添加1.0mg/L的6-BA作為初代培養(yǎng)基，將經(jīng)過(guò)消毒滅菌并修剪后的黑莓朝植8號(hào)外植體分別接種于初代培養(yǎng)基中，每個(gè)處理接種5瓶，每瓶接種3個(gè)莖段，并設(shè)置三次重復(fù)。置于溫度(25±2)℃，光照時(shí)間15h/d，光照度3000lx，相對(duì)濕度70％的條件下培養(yǎng)。培養(yǎng)4d后萌芽，12d后展葉，如圖1和圖2所示，結(jié)果顯示，以黑莓品種朝植8號(hào)帶腋芽莖段為外植體進(jìn)行初代離體培養(yǎng)時(shí)，添加1.00mg/L 6-BA的MS培養(yǎng)基(含20g/L蔗糖和8g/L瓊脂，pH 5.8)較為適宜，芽的萌發(fā)和生長(zhǎng)達(dá)到最好狀態(tài)。

3、繼代培養(yǎng)

以含30g/L蔗糖和8g/L瓊脂的MS培養(yǎng)基(pH 5.8)為基礎(chǔ)，添加1.00mg/L的6-BA作為繼代培養(yǎng)基，將經(jīng)過(guò)初代培養(yǎng)的健壯不定芽，從基部切下后分成單芽并接種到繼代培養(yǎng)基中，每處理接種5瓶，每瓶3個(gè)不定芽，各設(shè)置重復(fù)3次，于溫度25±2℃、光照時(shí)間15h/d、光照度3000lx、相對(duì)濕度約70％的條件下培養(yǎng)。培養(yǎng)35d后，黑莓品種朝植8號(hào)不定芽在1.00mg/L 6-BA的繼代培養(yǎng)基上的增殖和芽長(zhǎng)情況，如圖3所示，結(jié)果顯示，以黑莓品種朝植8號(hào)不定芽為外植體進(jìn)行繼代離體培養(yǎng)，添加質(zhì)量濃度為1.00mg/L的6-BA的MS繼代培養(yǎng)基(含20g/L蔗糖和8g/L瓊脂，pH 5.8)時(shí)，平均芽長(zhǎng)最長(zhǎng)，且芽較為健壯，因此，此培養(yǎng)基的激素濃度最適合芽的生長(zhǎng)和增殖。

4、生根培養(yǎng)

以含20g/L蔗糖和8g/L瓊脂的1/2MS培養(yǎng)基(pH 5.8)為基礎(chǔ)，添加0.10mg/L的NAA作為生根培養(yǎng)基，將經(jīng)過(guò)繼代培養(yǎng)且長(zhǎng)勢(shì)較好的芽從基部切下，分成單芽后接入生根培養(yǎng)基中，每處理接種5瓶，每瓶接種3個(gè)芽，各重復(fù)3次。于溫度25±2℃、光照時(shí)間15h/d、光照度3000lx、相對(duì)濕度70％的條件下培養(yǎng)。培養(yǎng)30d后，黑莓品種朝植8號(hào)外植體在0.10mg/LNAA的生根培養(yǎng)基的生根情況如圖5所示，結(jié)果顯示，以以黑莓品種朝植8號(hào)不定芽為外植體進(jìn)行生根培養(yǎng)時(shí)，添加0.10m g/LNAA的1/2M S培養(yǎng)基(含20g/L蔗糖和8g/L瓊脂，pH 5.8)更為合適，此濃度下的培養(yǎng)基生根快，根多且較粗壯，對(duì)生根有著一定的促進(jìn)作用。

實(shí)施例3

1、消毒滅菌：方法同實(shí)施例2

2、初代培養(yǎng)：方法同實(shí)施例2

3、繼代培養(yǎng)

以含30g/L蔗糖和8g/L瓊脂的MS培養(yǎng)基(pH 5.8)為基礎(chǔ)，添加0.30mg/L的NAA作為繼代培養(yǎng)基，將經(jīng)過(guò)初代培養(yǎng)的健壯不定芽，從基部切下后分成單芽并接種到繼代培養(yǎng)基中，每處理接種5瓶，每瓶3個(gè)不定芽，各設(shè)置重復(fù)3次，于溫度25±2℃、光照時(shí)間15h/d、光照度3000lx、相對(duì)濕度約70％的條件下培養(yǎng)。培養(yǎng)35d后，黑莓品種朝植8號(hào)不定芽在0.30mg/LNAA的繼代培養(yǎng)基上的增殖和芽長(zhǎng)情況，如圖4所示，結(jié)果顯示，以黑莓品種朝植8號(hào)不定芽為外植體進(jìn)行繼代離體培養(yǎng)，添加質(zhì)量濃度為0.30mg/L的NAA的MS繼代培養(yǎng)基(含20g/L蔗糖和8g/L瓊脂，pH 5.8)時(shí)，不定芽的增殖系數(shù)最高，并且平均芽長(zhǎng)最長(zhǎng)，最適合芽的生長(zhǎng)和增殖。

4、生根培養(yǎng)：方法同實(shí)施例2。培養(yǎng)30d后，黑莓品種朝植8號(hào)外植體在0.10mg/LNAA的生根培養(yǎng)基中進(jìn)行生根培養(yǎng)，生根快，根多且較粗壯。