一種密毛小花苣苔組培葉片兩步成苗方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ]本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地，涉及一種密毛小花苣苔組培葉片兩步成苗方 法。
【背景技術(shù)】
[0002] 密毛小花苣苔為苦苣苔科小花苣苔屬植物，多年生小草本，根狀莖圓柱形近垂直， 葉片草質(zhì)形狀心狀卵形或心形，有花，花期4月。中國特有珍稀植物，特產(chǎn)廣西柳江，生于石 灰?guī)r山陡崖上或洞口陰處，海拔約為200m，全草在民間供藥用，可治療跌打損傷，燙傷，瘡癤 等癥，2004年被收入《中國植物紅皮書》。
[0003] 密毛小花苣苔分布區(qū)域極其狹窄，目前僅在廣西柳江地區(qū)石灰?guī)r山陡崖上發(fā)現(xiàn)少 量植株，由于生長環(huán)境惡劣缺少水肥，加之其種子細(xì)小，萌發(fā)需要的溫度范圍、濕度范圍和 土壤酸堿度范圍比較小，自然界難以進行有性繁殖，急需建立有效的繁育和保護體系，本發(fā) 明旨在通過組織培養(yǎng)技術(shù)葉片兩步成苗法對密毛小花苣苔種質(zhì)資源進行有效的繁育和保 護，是目前對密毛小花苣苔育苗最便捷、穩(wěn)定的手段，可以節(jié)約大量的人力、物力和場地，便 于種質(zhì)交換和轉(zhuǎn)移，避免有害病蟲的人為傳播。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明目的在于提供一種密毛小花苣苔組培葉片兩步成苗方法，能夠短時間內(nèi)提 供大量優(yōu)質(zhì)適合栽培的密毛小花苣苔種苗。
[0005] 為了實現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，本發(fā)明提供了如下技術(shù)方案： 一種密毛小花苣苔組培葉片兩步成苗法，其特征在于： (1) 葉片誘導(dǎo)分化不定芽培養(yǎng):取密毛小花苣苔幼嫩葉片，在75%乙醇中表面消毒30~ 45 s，無菌水2~3次，投入0.1% Hcl2 5 min,無菌水2~3次，0.1% Hch 3min，無菌水2~3次沖 洗干后切分為含主脈0.5 cmXl cm大小接種在誘導(dǎo)及分化培養(yǎng)基上，在溫度為22~26°C， 光照強度1800~2600 lux，光照時間為8~10小時/天的條件下，10~15天葉片分化出不定芽； (2) 不定芽壯苗生根培養(yǎng):選擇密毛小花苣苔葉片分化1~1.5個月，幼嫩葉片上分化出 具有2片以上葉子、高2~3 cm不定芽接種到壯苗生根培養(yǎng)基，在溫度為22~26 °C，光照強 度2000~2800 lux，光照時間為8~10小時/天的條件下進行培養(yǎng)，1~2個月不定芽長至高3~ 6cm的無菌苗，平均生根4條以上、根長2.5~5cm，生根率達98.4%。
[0006] 所述誘導(dǎo)及分化培養(yǎng)基為：以M S為基本培養(yǎng)基，每升添加6-芐氨基嘌呤（6-B A)1~2.0mg、3-吲哚乙酸（ΙΑΑ)0·3 ~1.0 mg、激動素(ΚΤ)0·2~0.5 mg、瓊脂3.8~4.5g和 蔗糖20~25§，？11值5.8~6.0。
[0007] 所述壯苗生根培養(yǎng)基為：以1/2M S為基本培養(yǎng)基，每升添加 6-芐氨基嘌呤(6-B A) 0.2~0.5mg、吲噪丁酸（IBA)l.O~2.0mg、活性炭(AC)0.5mg，瓊脂3.8~4.5g和蔗糖 25~30g, pH值5.8~6.0。
[0008] 采用本發(fā)明所述方法得到的種苗健壯、成活率高，能夠短時間內(nèi)提供大量優(yōu)質(zhì)適 合栽培的密毛小花苣苔種苗，并減少了配制培養(yǎng)基和轉(zhuǎn)瓶的步驟，節(jié)約了大量人力物力，因 此簡單易行、生產(chǎn)成本降低，有效解決了密毛小花苣苔規(guī)?；缂胺N質(zhì)資源保存問題。
【具體實施方式】
[0009] 下面結(jié)合實施例對本發(fā)明的技術(shù)方案進一步說明。
[0010] -種密毛小花苣苔組培葉片兩步成苗法法，包括以下步驟： (1)葉片誘導(dǎo)分化不定芽培養(yǎng):取密毛小花苣苔幼嫩葉片，在75%乙醇中表面消毒30~ 45 s,無菌水2~3次，投入0.1% Hch 5 min,無菌水2~3次，0.1% Hch 3min,無菌水2~3 次沖洗干后切分為0.5 cmXl cm大小接種在誘導(dǎo)及分化培養(yǎng)基上，在溫度為22~26°C，光 照強度1800~2600 lux,光照時間為8~10小時/天的條件下，10~15天葉片分化出不定芽。 表i不同激素對不定芽數(shù)的影響

[0011] 最佳的不定芽誘導(dǎo)及分化培養(yǎng)基為:MS+6-BA 1.5 mg/L+IAA0.1 mg/L+ KT 0.1 mg/L〇
[0012] (2)不定芽壯苗生根培養(yǎng):選擇密毛小花苣苔葉片分化I~1.5個月，幼嫩葉片上分 化出具有2片以上葉子、高2~3 cm不定芽接種到壯苗生根培養(yǎng)基，在溫度為22~26°C，光照 強度2000~2800 lux，光照時間為8~10小時/天的條件下進行培養(yǎng)，1~2個月不定芽長至 高4~6cm的無菌苗，平均生根4條以上、根長2.5~4.5cm，生根率達98.4%。 表2不同激素水平對不定芽生麗敫暴的影響

[0013] 最佳的壯苗生根培養(yǎng)基為 1/2MS+6-BA 0.5 mg/L+IBA1.5 mg/L+ AC1.0 mg/L。
[0014] 備注:6-BA(6-芐氨基嘌呤），KT(激動素），IAA(吲哚乙酸），IBA(吲哚丁酸），AC (活性炭）。
【主權(quán)項】
1. 一種密毛小花苣苔葉片組培兩步成苗方法，其特征在于： (1) 葉片誘導(dǎo)分化不定芽培養(yǎng)：取密毛小花苣苔幼嫩葉片，在75%乙醇中表面消毒30~ 45 s，無菌水2~3次，投入0.1% Hcl2 5 min,無菌水2~3次，0.1% Hcl2 3min，無菌水2~3次沖 洗干后切分為含主脈0.5 cmXI cm大小接種在誘導(dǎo)及分化培養(yǎng)基上，在溫度為22~26°C， 光照強度1800~2600 lux，光照時間為8~10小時/天的條件下，10~15天葉片分化出不定芽； (2) 不定芽壯苗生根培養(yǎng):選擇密毛小花苣苔葉片分化1~1.5個月，幼嫩葉片上分化出 具有2片以上葉子、高2~3 cm不定芽接種到壯苗生根培養(yǎng)基，在溫度為22~26 °C，光照強 度2000~2800 lux，光照時間為8~10小時/天的條件下進行培養(yǎng)，1~2個月不定芽長至高3~ 6cm的無菌苗，平均生根4條以上、根長2.5~5cm，生根率達98.4%。2. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:所述誘導(dǎo)及分化培養(yǎng)基為：以M S為基本培 養(yǎng)基，每升添加6-芐氨基嘌呤1~2.0mg、3-吲哚乙酸0.3~1.0 mg、激動素0.2~0.5 mg、瓊 脂3.8~4.5§和蔗糖20~25§，？11值5.8~6.0。3. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:所述壯苗生根培養(yǎng)基為：以1/2M S為基本培 養(yǎng)基，每升添加6-芐氨基嘌呤0.2~0.5mg、吲哚丁酸1.0~2.0mg、活性炭0.5mg，瓊脂 3 · 8~4 · 5g和蔗糖25~30g，p Η 值5 · 8~6 · 0。
【專利摘要】一種密毛小花苣苔葉片組培兩步成苗方法：取密毛小花苣苔幼嫩葉片作為外植體進行滅菌處理，將其切分成含主脈0.5 cm×1 cm大小后接種到誘導(dǎo)及分化培養(yǎng)基上，1~1.5個月后選擇幼嫩葉片上分化出2片以上葉子、高2~3cm的不定芽苗轉(zhuǎn)接到壯苗生根培養(yǎng)基上，1~2個月后無菌苗每株生根4條以上、根長2.5~5ｃｍ，生根率達98.4%。采用本發(fā)明所述方法得到的種苗健壯、成活率高，可在短期內(nèi)提供大量密毛小花苣苔的優(yōu)質(zhì)種苗，并減少了配制培養(yǎng)基和轉(zhuǎn)瓶的步驟，節(jié)約了大量人力物力，因此簡單易行、生產(chǎn)成本降低，有效解決了密毛小花苣苔規(guī)模化育苗及種質(zhì)資源保存問題。
【IPC分類】A01H4/00
【公開號】CN105706928
【申請?zhí)枴緾N201610108414
【發(fā)明人】李翠, 郭曉云, 張占江, 李林軒, 韋坤華, 韋瑩, 繆劍華, 王一諾, 肖冬
【申請人】廣西壯族自治區(qū)藥用植物園