一種朝鮮淫羊藿組培快速繁殖方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種朝鮮淫羊藿組培快速繁殖方法，包括如下步驟:外植體選擇與消毒，培養(yǎng)基的配制，誘導(dǎo)培養(yǎng)，增殖培養(yǎng)，生根培養(yǎng)，組培苗的馴化與移栽。本發(fā)明不受地理環(huán)境和季節(jié)的限制、遺傳背景一致，可在短期內(nèi)形成大量?jī)?yōu)良試管苗，解決了目前朝鮮淫羊藿還處于野生狀態(tài)，人工繁育栽培周期長(zhǎng)、生長(zhǎng)環(huán)境要求嚴(yán)格、大面積種植困難，為朝鮮淫羊藿的規(guī)?；a(chǎn)種植提供可靠的技術(shù)途徑。
【專利說明】一種朝鮮淫羊藿組培快速繁殖方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及淫羊藿繁殖方法，特別涉及一種朝鮮淫羊藿組培快速繁殖方法。

【背景技術(shù)】
[0002]朝鮮淫羊藿(Epimedium koreanum Nakai)為小檗科淫羊藿屬植物，系多年生宿根性草本，是我國(guó)重要的藥用資源。朝鮮淫羊藿主要分布在吉林省東部和遼寧省東部，黑龍江和吉林交界的地區(qū)也有少量分布，淫羊藿不僅可以補(bǔ)腎陽(yáng)、強(qiáng)筋骨、祛風(fēng)濕，而且還有抗衰老、提高免疫力、抑制腫瘤等功效，為最具開發(fā)潛力的中藥之一。
[0003]朝鮮淫羊藿以采集野生植物資源為主，隨著需求量的增大，采集和消耗量已超過自然資源的再生能力，導(dǎo)致物種瀕危。淫羊藿有有性繁殖和無性繁殖兩種方式，我國(guó)朝鮮淫羊藿存在種子休眠現(xiàn)象，休眠期8-10個(gè)月，且發(fā)芽率低，實(shí)生苗生長(zhǎng)緩慢。無性繁殖以移栽野生植株的分株繁殖的方法進(jìn)行，該方法不僅需要有大量基礎(chǔ)苗，而且容易造成病毒積累，影響優(yōu)良種苗的遺傳特性。朝鮮淫羊藿的人工栽培困難，有繁殖系數(shù)低、用種量大、易退化和變種等難題。采用植物組織培養(yǎng)方法可以在短期內(nèi)快速繁殖多種植物，不僅繁殖率高，且因?yàn)槠涫菬o性繁殖，可以保持原繁殖母株的優(yōu)良性狀，近年來在生產(chǎn)上應(yīng)用越來越廣。關(guān)于遼寧產(chǎn)朝鮮淫羊藿的研宄較少，朝鮮淫羊藿組培困難，由于朝鮮淫羊藿生長(zhǎng)在林下蔭濕的環(huán)境中，外植體地下隱芽受土壤及氣候的影響攜帶的細(xì)菌和真菌較多，尤其是內(nèi)生菌較多，外植體的污染率較高，這也是朝鮮淫羊藿組培快繁技術(shù)的難點(diǎn)之一，目前尚無朝鮮淫羊藿快速繁殖研宄，因此，其快速繁殖迫在眉睫。實(shí)現(xiàn)朝鮮淫羊藿組織培養(yǎng)能提供大量的優(yōu)質(zhì)無病毒種苗，是提高其繁殖率的有效途徑，且能嚴(yán)格控制藥材質(zhì)量，便于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)，對(duì)實(shí)現(xiàn)朝鮮淫羊藿的可持續(xù)利用具有重要意義。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種朝鮮淫羊藿的組培快速繁殖方法。
[0005]本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是:一種朝鮮淫羊藿組培快速繁殖方法，包括如下步驟:
[0006](I)外植體選擇與消毒:春季4月下旬，取朝鮮淫羊藿野生根莖，帶有完整越冬芽，且越冬芽飽滿，以根部分蘗芽作為外植體，經(jīng)表面消毒后備用；
[0007](2)培養(yǎng)基的配制:配制基本培養(yǎng)基、誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基、繼代增殖培養(yǎng)基、生根培養(yǎng)基I號(hào)、生根培養(yǎng)基2號(hào)；
[0008](3)誘導(dǎo)培養(yǎng):在無菌條件下切下0.5-lcm的芽，將經(jīng)表面消毒的根部分蘗芽莖段芽向上接種于誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基中，培養(yǎng)30-45天后，誘導(dǎo)分蘗芽萌芽，然后分化出叢生芽；
[0009](4)增殖培養(yǎng):當(dāng)叢生芽長(zhǎng)至2-3cm時(shí)，在無菌條件下將叢生芽切成單株，接入繼代增殖培養(yǎng)基中，培養(yǎng)30-45天增殖出不定芽；根據(jù)對(duì)組培苗數(shù)量的要求，每隔30-45天按同樣方法進(jìn)行組培苗再增殖培養(yǎng)；
[0010](5)生根培養(yǎng):將生長(zhǎng)至3_5cm的組培苗，接種到生根培養(yǎng)基中進(jìn)行生根培養(yǎng)；所述組培苗先在生根培養(yǎng)基I號(hào)培養(yǎng)條件下培養(yǎng)7天后，再轉(zhuǎn)至生根培養(yǎng)基2號(hào)中，誘導(dǎo)其生根；
[0011](6)組培苗的馴化與移栽:當(dāng)組培苗生長(zhǎng)至5_8cm時(shí)，先進(jìn)行組培苗的馴化，再移栽入草炭、珍珠巖、蛭石的混合基質(zhì)中。
[0012]優(yōu)選的，所述步驟(I)中的表面消毒包括如下處理步驟:首先在流水下沖洗3h，用洗衣粉清洗表面附屬物，置于超凈工作臺(tái)中無菌水清洗2遍，75 %乙醇表面消毒30s，然后用無菌水沖洗5遍；再用0.1 %的氯化未消毒2min，用無菌水沖洗3遍，用手術(shù)刀剝?nèi)ネ鈱颖Ｗo(hù)層，再在0.1 %氯化未中浸泡2min，最后用無菌水沖洗3_5次。
[0013]優(yōu)選的，所述培養(yǎng)基的組分和含量如下:
[0014](I)基本培養(yǎng)基:WPM培養(yǎng)基+蔗糖或白糖30g/L+瓊脂4.5g/L，調(diào)節(jié)pH值為
5.6-5.8 ；
[0015](2)誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基:基本培養(yǎng)基 +6-BA 0.5-1.5mg/L+IBA 0.1-0.5mg/L+GA30.3-lmg/L ；
[0016](3)繼代增殖培養(yǎng)基:基本培養(yǎng)基 +6-BA 0.5-1.5mg/L+IBA 0.3-0.5mg/L ；
[0017](4)生根培養(yǎng)基:
[0018]生根培養(yǎng)基I號(hào):1/2WPM培養(yǎng)基+蔗糖或白糖15g/L+瓊脂4.5g/L+IBA
0.3-0.5mg/L ；
[0019]生根培養(yǎng)基2號(hào):1/2WPM培養(yǎng)基+蔗糖或白糖15g/L+瓊脂4.5g/L。
[0020]優(yōu)選的，所述培養(yǎng)基的組分和含量如下:
[0021](I)基本培養(yǎng)基:WPM培養(yǎng)基+蔗糖或白糖30g/L+瓊脂4.5g/L，調(diào)節(jié)pH值為5.8 ;
[0022](2)誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基:基本培養(yǎng)基 +6-BA 1.5mg/L+IBA 0.5mg/L+GA30.5mg/L ；
[0023](3)繼代增殖培養(yǎng)基:基本培養(yǎng)基+6-BA 1.5mg/L+IBA 0.5mg/L ；
[0024](4)生根培養(yǎng)基:
[0025]生根培養(yǎng)基I號(hào):1/2WPM培養(yǎng)基+蔗糖或白糖15g/L+瓊脂4.5g/L+IBA 0.3mg/L ；
[0026]生根培養(yǎng)基2號(hào):1/2WPM培養(yǎng)基+蔗糖或白糖15g/L+瓊脂4.5g/L。
[0027]優(yōu)選的，所述方法的培養(yǎng)條件為:光照強(qiáng)度為1500-30001x，光照時(shí)間為12h/d，培養(yǎng)室溫度為22±2o Co
[0028]優(yōu)選的，所述混合基質(zhì)由草炭:珍珠巖:蛭石按體積比2:1:1配制而成。
[0029]本發(fā)明的有益效果是:
[0030](I)以芽為外植體，通過叢生芽途徑建立朝鮮淫羊藿的快繁體系。
[0031](2)利用組織培養(yǎng)技術(shù)，生產(chǎn)朝鮮淫羊藿種苗，有不受地理環(huán)境和季節(jié)的限制、遺傳背景一致、保存了母體的全部?jī)?yōu)良性狀、且遺傳性狀穩(wěn)定、生長(zhǎng)周期短等優(yōu)點(diǎn)。同時(shí)，結(jié)合莖尖培養(yǎng)方法可以去除植物病毒、提高藥材質(zhì)量和產(chǎn)量。
[0032](3)建立朝鮮淫羊藿組培快繁技術(shù)體系，可在短期內(nèi)形成大量?jī)?yōu)良試管苗，解決了目前朝鮮淫羊藿還處于野生狀態(tài)，人工繁育栽培周期長(zhǎng)、生長(zhǎng)環(huán)境要求嚴(yán)格、大面積種植困難，為朝鮮淫羊藿的規(guī)?；a(chǎn)種植提供可靠的技術(shù)途徑。

【具體實(shí)施方式】
[0033]下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明，但不能作為本發(fā)明的限定。
[0034]實(shí)施例1
[0035]一種朝鮮淫羊藿組培快速繁殖方法，包括如下步驟:
[0036](I)外植體選擇與消毒:春季4月下旬，取朝鮮淫羊藿野生根莖，帶有完整越冬芽，且越冬芽飽滿，以根部分蘗芽作為外植體，首先在流水下沖洗3h，用洗衣粉清洗表面附屬物，置于超凈工作臺(tái)中無菌水清洗2遍，75%乙醇表面消毒30s，然后用無菌水沖洗5遍；再
0.1 %的氯化汞消毒2min，用無菌水沖洗3遍，用手術(shù)刀剝?nèi)ネ鈱颖Ｗo(hù)層，再在0.1%氯化汞中浸泡2min，最后用無菌水沖洗3次，備用；
[0037](2)培養(yǎng)基的配制:
[0038]a、基本培養(yǎng)基:WPM培養(yǎng)基+蔗糖30g/L+瓊脂4.5g/L，調(diào)節(jié)pH值為5.8 ；
[0039]b、誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基:基本培養(yǎng)基 +6-BA 0.5mg/L+IBA 0.3mg/L+GA30.5mg/L ；
[0040]c、繼代增殖培養(yǎng)基:基本培養(yǎng)基+6-BA 1.0mg/L+IBA 0.5mg/L ；
[0041]d、生根培養(yǎng)基:
[0042]生根培養(yǎng)基I號(hào):1/2WPM培養(yǎng)基+蔗糖15g/L+瓊脂4.5g/L+IBA 0.5mg/L ；
[0043]生根培養(yǎng)基2號(hào):1/2WPM培養(yǎng)基+蔗糖15g/L+瓊脂4.5g/L。
[0044](3)誘導(dǎo)培養(yǎng):在無菌條件下切下0.5-lcm的芽，將經(jīng)表面消毒的根部分蘗芽莖段芽向上接種于誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基中，培養(yǎng)40天后，誘導(dǎo)分蘗芽萌芽，然后分化出叢生芽；培養(yǎng)條件為:溫度22±2°C，光照12h/d，光照強(qiáng)度30001x。
[0045](4)增殖培養(yǎng):當(dāng)叢生芽長(zhǎng)至2-3cm時(shí)，再在無菌條件下將叢生芽切成單株接入繼代增殖培養(yǎng)基中進(jìn)行增殖培養(yǎng)，在培養(yǎng)條件下培養(yǎng)40天增殖出不定芽；每隔40天按同樣方法進(jìn)行幼苗再增殖培養(yǎng)；培養(yǎng)條件為:溫度22±2°C，光照12h/d，光照強(qiáng)度30001x。
[0046](5)生根培養(yǎng):先將生長(zhǎng)達(dá)3_5cm的組培苗接種到生根培養(yǎng)基I號(hào)中培養(yǎng)7天，再轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基2號(hào)中培養(yǎng)，誘導(dǎo)其生根；培養(yǎng)條件為:溫度22±2°C，光照12h/d，光照強(qiáng)度 20001xo
[0047](6)組培苗的馴化與移栽:當(dāng)組培苗長(zhǎng)到5_8cm，苗基部長(zhǎng)出3_5根細(xì)根后，先進(jìn)行組培苗的馴化，再移栽入草炭:珍珠巖:蛭石的體積比為2:1:1基質(zhì)的營(yíng)養(yǎng)缽中。
[0048]實(shí)施例2
[0049]一種朝鮮淫羊藿組培快速繁殖方法，包括如下步驟:
[0050](I)外植體選擇與消毒:春季4月下旬，取朝鮮淫羊藿野生根莖，帶有完整越冬芽，且越冬芽飽滿，以根部分蘗芽作為外植體，首先在流水下沖洗3h，用洗衣粉清洗表面附屬物，置于超凈工作臺(tái)中無菌水清洗2遍，75%乙醇表面消毒30s，然后用無菌水沖洗5遍；再
0.1 %的氯化汞消毒2min，用無菌水沖洗3遍，用手術(shù)刀剝?nèi)ネ鈱颖Ｗo(hù)層，再在0.1%氯化汞中浸泡2min，最后用無菌水沖洗3次，備用；
[0051](2)培養(yǎng)基的配制:
[0052]a、基本培養(yǎng)基:WPM培養(yǎng)基+蔗糖30g/L+瓊脂4.5g/L，調(diào)節(jié)pH值為5.8 ；
[0053]b、誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基:基本培養(yǎng)基 +6-BA 1.5mg/L+IBA 0.5mg/L+GA30.5mg/L ；
[0054]c、繼代增殖培養(yǎng)基:基本培養(yǎng)基+6-BA 1.5mg/L+IBA 0.5mg/L ；
[0055]d、生根培養(yǎng)基:
[0056]生根培養(yǎng)基I號(hào):1/2WPM培養(yǎng)基+蔗糖15g/L+瓊脂4.5g/L+IBA 0.3mg/L ；
[0057]生根培養(yǎng)基2號(hào):1/2WPM培養(yǎng)基+蔗糖15g/L+瓊脂4.5g/L。
[0058](3)誘導(dǎo)培養(yǎng):在無菌條件下切下0.5-lcm的芽，將經(jīng)表面消毒的根部分蘗芽莖段芽向上接種于誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基中，培養(yǎng)40天后，誘導(dǎo)分蘗芽萌芽，然后分化出叢生芽；培養(yǎng)條件為:溫度22±2°C，光照12h/d，光照強(qiáng)度30001x。
[0059](4)增殖培養(yǎng):當(dāng)叢生芽長(zhǎng)至2-3cm時(shí)，再在無菌條件下將叢生芽切成單株接入繼代增殖培養(yǎng)基中進(jìn)行增殖培養(yǎng)，在培養(yǎng)條件下培養(yǎng)40天增殖出不定芽；每隔40天按同樣方法進(jìn)行幼苗再增殖培養(yǎng)；培養(yǎng)條件為:溫度22±2°C，光照12h/d，光照強(qiáng)度30001x。
[0060](5)生根培養(yǎng):先將生長(zhǎng)達(dá)3_5cm的組培苗接種到生根培養(yǎng)基I號(hào)中培養(yǎng)7天，再轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基2號(hào)中培養(yǎng)，誘導(dǎo)其生根；培養(yǎng)條件為:溫度22±2°C，光照12h/d，光照強(qiáng)度 20001xo
[0061](6)組培苗的馴化與移栽:當(dāng)組培苗長(zhǎng)到5_8cm，苗基部長(zhǎng)出3_5根細(xì)根后，先進(jìn)行組培苗的馴化，再移栽入草炭:珍珠巖:蛭石的體積比為2:1:1基質(zhì)的營(yíng)養(yǎng)缽中。
[0062]以上對(duì)本發(fā)明的實(shí)施例進(jìn)行了詳細(xì)說明，但所述內(nèi)容僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，不能被認(rèn)為用于限定本發(fā)明的實(shí)施范圍。凡依本發(fā)明申請(qǐng)范圍所作的均等變化與改進(jìn)等，均應(yīng)仍歸屬于本發(fā)明的專利涵蓋范圍之內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.一種朝鮮淫羊藿組培快速繁殖方法，其特征在于:包括如下步驟: (1)外植體選擇與消毒:春季4月下旬，取朝鮮淫羊藿野生根莖，帶有完整越冬芽，且越冬芽飽滿，以根部分蘗芽作為外植體，經(jīng)表面消毒后備用； (2)培養(yǎng)基的配制:配制基本培養(yǎng)基、誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基、繼代增殖培養(yǎng)基、生根培養(yǎng)基I號(hào)、生根培養(yǎng)基2號(hào)； (3)誘導(dǎo)培養(yǎng):在無菌條件下切下0.5-lcm的芽，將經(jīng)表面消毒的根部分蘗芽莖段芽向上接種于誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基中，培養(yǎng)30-45天后，誘導(dǎo)分蘗芽萌芽，然后分化出叢生芽； (4)增殖培養(yǎng):當(dāng)叢生芽長(zhǎng)至2-3cm時(shí)，在無菌條件下將叢生芽切成單株，接入繼代增殖培養(yǎng)基中，培養(yǎng)30-45天增殖出不定芽；根據(jù)對(duì)組培苗數(shù)量的要求，每隔30-45天按同樣方法進(jìn)行組培苗再增殖培養(yǎng)； (5)生根培養(yǎng):將生長(zhǎng)至3-5cm的組培苗，接種到生根培養(yǎng)基中進(jìn)行生根培養(yǎng)；所述組培苗先在生根培養(yǎng)基I號(hào)培養(yǎng)條件下培養(yǎng)7天后，再轉(zhuǎn)至生根培養(yǎng)基2號(hào)中，誘導(dǎo)其生根； (6)組培苗的馴化與移栽:當(dāng)組培苗生長(zhǎng)至5-8cm時(shí)，先進(jìn)行組培苗的馴化，再移栽入草炭、珍珠巖、蛭石的混合基質(zhì)中。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種朝鮮淫羊藿組培快速繁殖方法，其特征在于:所述步驟(I)中的表面消毒包括如下處理步驟:首先在流水下沖洗3h，用洗衣粉清洗表面附屬物，置于超凈工作臺(tái)中無菌水清洗2遍，75%乙醇表面消毒30s，然后用無菌水沖洗5遍；再用0.1 %的氯化汞消毒2min，用無菌水沖洗3遍，用手術(shù)刀剝?nèi)ネ鈱颖Ｗo(hù)層，再在0.1%氯化汞中浸泡2min，最后用無菌水沖洗3_5次。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種朝鮮淫羊藿組培快速繁殖方法，其特征在于:所述培養(yǎng)基的組分和含量如下: (I)基本培養(yǎng)基:WPM培養(yǎng)基+蔗糖或白糖30g/L+瓊脂4.5g/L，調(diào)節(jié)pH值為5.6-5.8 ； ⑵誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基:基本培養(yǎng)基+6-BA 0.5-1.5mg/L+IBA 0.1-0.5mg/L+GA30.3-lmg/L ； (3)繼代增殖培養(yǎng)基:基本培養(yǎng)基+6-BA0.5-1.5mg/L+IBA 0.3-0.5mg/L ； (4)生根培養(yǎng)基: 生根培養(yǎng)基I號(hào):1/2WPM培養(yǎng)基+蔗糖或白糖15g/L+瓊脂4.5g/L+IBA 0.3-0.5mg/L ； 生根培養(yǎng)基2號(hào):1/2WPM培養(yǎng)基+蔗糖或白糖15g/L+瓊脂4.5g/L。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種朝鮮淫羊藿組培快速繁殖方法，其特征在于:所述培養(yǎng)基的組分和含量如下: (1)基本培養(yǎng)基:WPM培養(yǎng)基+蔗糖或白糖30g/L+瓊脂4.5g/L，調(diào)節(jié)pH值為5.8 ； (2)誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基:基本培養(yǎng)基+6-BA 1.5mg/L+IBA 0.5mg/L+GA3 0.5mg/L ； (3)繼代增殖培養(yǎng)基:基本培養(yǎng)基+6-BA1.5mg/L+IBA 0.5mg/L ； (4)生根培養(yǎng)基: 生根培養(yǎng)基I號(hào):1/2WPM培養(yǎng)基+蔗糖或白糖15g/L+瓊脂4.5g/L+IBA 0.3mg/L ； 生根培養(yǎng)基2號(hào):1/2WPM培養(yǎng)基+蔗糖或白糖15g/L+瓊脂4.5g/L。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種朝鮮淫羊藿組培快速繁殖方法，其特征在于:所述方法的培養(yǎng)條件為:光照強(qiáng)度為1500-30001x，光照時(shí)間為12h/d，培養(yǎng)室溫度為22±2°C。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種朝鮮淫羊藿組培快速繁殖方法，其特征在于:所述 混合基質(zhì)由草炭:珍珠巖:蛭石按體積比2:1:1配制而成。
【文檔編號(hào)】A01H4/00GK104488723SQ201410825519
【公開日】2015年4月8日 申請(qǐng)日期:2014年12月25日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月25日
【發(fā)明者】楊鎮(zhèn), 龔娜, 李學(xué)龍, 王娜, 陳珣, 劉國(guó)麗, 肖軍, 曹君, 肖偉, 宋艷雨, 李躍 申請(qǐng)人:遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院微生物工程中心