使用RNAi控制有害生物的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及使用雙鏈RNA分子來控制有害生物侵襲的方法。本發(fā)明提供了產(chǎn)生表達所述雙鏈RNA分子的轉(zhuǎn)基因細胞的方法，以及含有此類分子或經(jīng)此類分子處理過的組合物和商品產(chǎn)品。
【專利說明】使用RNAi控制有害生物的方法
[0001] 本申請為2006年9月18日提交的、發(fā)明名稱為"使用RNAi控制有害生物的方 法"的PCT申請PCT/IB2006/004008的分案申請，所述PCT申請進入中國國家階段的日期為 2008 年 5 月 16 日，申請?zhí)枮?200680042927. 5。 發(fā)明領(lǐng)域
[0002] -般而言，本發(fā)明涉及對有害生物（pest)侵襲的遺傳學(xué)控制。更具體地，本發(fā)明 涉及重組技術(shù)，用于阻遏或抑制有害生物中祀編碼序列的表達。
[0003] 導(dǎo)論
[0004] 昆蟲和其它有害生物可能通過其叮咬或刺導(dǎo)致?lián)p傷甚至死亡。此外，很多有害生 物傳播導(dǎo)致疾病的細菌和其它病原體。例如，蚊子傳播導(dǎo)致拒疾、黃熱病、腦炎和其它疾病 的病原體。腹股溝結(jié)鼠疫或黑死病是感染大鼠和其它曬齒動物的細菌導(dǎo)致的。用于控制顯 微有害生物侵襲的組合物已經(jīng)W抗生素、抗病毒和抗真菌組合物的形式提供。通常地，其被 應(yīng)用于有害生物駐留的表面，或者W小丸、散劑、片劑、糊劑或膠囊劑的形式施用給受侵襲 的動物。。
[0005] 商業(yè)作物通常是昆蟲攻擊的目標。過于數(shù)十年來已經(jīng)做出了相當(dāng)?shù)倪M展，開發(fā)出 了高效的方法和組合物用于控制植物中的昆蟲侵襲?；瘜W(xué)殺蟲劑對于根除有害生物侵襲非 常有用。然而，使用化學(xué)殺蟲劑有若干種缺點。它們不僅有可能對于環(huán)境有害，而且，化學(xué) 殺蟲劑還不是選擇性的，其對于非祀標動物群和植物群可能造成損害?；瘜W(xué)殺蟲劑持續(xù)存 在于環(huán)境中，通常代謝得很慢（如果有代謝）。它們在食物鏈中積累，特別是高等食肉動物 物種中。該些化學(xué)殺蟲物質(zhì)的積累導(dǎo)致對該些物質(zhì)抗性的發(fā)展，并且它們可能在進化梯中 高等的物種中，成為誘變劑和/或致癌物，導(dǎo)致不可逆的和有害的遺傳修飾。
[0006] 因為與化學(xué)殺蟲劑相關(guān)的該些危險，已經(jīng)開發(fā)了生物學(xué)手段來控制有害生物侵 襲。例如，使用來自蘇云金芽抱桿菌炬acillus thuringiensis)的化y3A蛋白質(zhì)進行生物 學(xué)控制已能有效控制馬鈴墓甲蟲幼蟲，其可作為噴霧到葉上的制劑或者作為在馬鈴墓葉中 表達的制劑來使用。備選的生物劑是雙鏈RNA (dsRNA)。過去數(shù)年來，通過RNA干擾在多細 胞生物中對基因的下調(diào)（也稱"基因沉默"）已成為良好完善的技術(shù)。
[0007] RNA干擾（RNAi)提供了用于控制基因表達的潛在的強大工具，因為其能特異性祀 向選擇，并且W顯著高的效率進行祀向mRNA遏制。RNAi指通過短干擾RNA(SiRNA)介導(dǎo) 的序列特異性轉(zhuǎn)錄后基因沉默狂amore，P.等人，Cell 101 :25-33(2000) ;Fire，A.等人， 化1:腳6 391 :806(1998);化milton 等人，Science 286,950-951(1999) ;Lin 等人，化1:腳6 402 ; 128-129 (1999))。雖然RNAi的機制還沒有獲得完全表征，但是人們認為，細胞中dsRNA 的存在通過激活核糖核酸酶III切酶來觸發(fā)RNAi Gamore,P.等人，（2000) ;Hammond等人， 化化re 404,293(2000))。切酶將的dsRNA加工為短片段，其被稱為短干擾RNA(SiRNA), 其為大約21至大約23個核巧酸長，包含約19個堿基對雙鏈體狂amore等人，（2000); E化ashir等人，Genes Dev.，15,188 (2001))。遞送進細胞后，SiRNA分子與內(nèi)切核酸酶復(fù)合 物相關(guān)聯(lián)，該復(fù)合體通常被稱為RNA誘導(dǎo)性沉默復(fù)合物巧ISC)，其將SiRNA的反義鏈和細胞 mRNA基因祀帶到一起。RISC切割mRNA，然后所述mRNA釋放并被降解。重要地，然后RISC 能降解祀mRNA的額外拷貝。
[0008] 因此，本發(fā)明提供了通過阻遏、延遲或降低特定有害生物中的基因表達來控制有 害生物侵襲的方法和組合物。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 在一個方面，本發(fā)明提供了經(jīng)分離的多核巧酸序列，其包含SEQ ID NO ;1、3、5、 7、9、11、13、15、17、19、21、23、49-158、159、160、163、168、173、178、183、188、193、198、203、 208、215、220、225、230、247、249、251、253、255、257、259、275-472、473、478、483、488、493、 498、503、513、515、517、519、521、533-575、576、581、586、591、596、601、603、605、607、609、 621-767、768、773、778、783、788、793、795、797、799、801、813-862、863、868、873、878、883、 888、890、892、894、896、908-1040、1041、1046、1051、1056、1061、1071、1073、1075、1077、 1079、1081'1083、1085、1087、1089、1091'1093、1095、1097、1099、1101'1103、1105、1107、 1109、1111、1113、1161-1571、1572、1577、1582、1587、1592、1597、1602、1607、1612、1617、 1622、1627、1632、1637、1642、1647、1652、1657、1662、1667、1672、1677、1682、1684、1686、 1688、1690、1腳2、1694、1696、1698、1700、1702、1704、1730-2039、2040、2045、2050、2055、 2060、2065、2070、2075、2080、2085、2090、2095、2100、2102、2104、2106、2108、2120-2338、 2339、2：344、2349、2354、2359、2364、2366、2368、2370、2372、2384-2460、2461、2466、2471、 2476和2481中示出的核酸序列。在一種實施方案中，從多核巧酸序列的表達產(chǎn)生雙鏈核糖 核巧酸序列，其中，有害生物與所述核糖核巧酸序列的接觸能抑制所述有害生物的生長。在 又一實施方案中，所述序列的接觸抑制與所述序列充分互補的核巧酸序列的表達。在另一 實施方案中，用該多核巧酸轉(zhuǎn)化細胞。在還一實施方案中，所述細胞是細菌、酵母或藻類細 胞。在再一實施方案中，食物產(chǎn)品，例如，膽藏谷類、寵物食品或粉末巧克力，包含經(jīng)該多核 巧酸轉(zhuǎn)化的細胞。在又一實施方案中，組合物，例如噴霧劑、粉末、團塊（pellet)、凝膠、膠 囊、食物產(chǎn)品、衣物袋和圖書包含該多核巧酸。在又一實施方案中，本發(fā)明提供了包含該多 核巧酸的殺蟲劑。在另一實施方案中，本發(fā)明提供了保護物體免受有害生物侵襲的方法，所 述物體例如木材、樹、圖書粘合物、布和食物膽藏容器，所述方法包括用包含所述多核巧酸 的組合物處理所述表面。
[0010] 在另一實施方案中，本發(fā)明提供了與 SEQ ID NO ;1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、 21、23、49-158、159、160、163、168、173、178、183、188、193、198、203、208、215、220、225、 230、247、249、251、253、255、257、259、275-472、473、478、483、488、493、498、503、513、515、 517、519、521、533-575、576、581、586、591、596、601、603、605、607、609、621-767、768、773、 778、783、788、793、795、797、799、801、813-862、863、868、873、878、883、888、890、892、894、 896、908-1040、1041'1046、1051'1056、1061'1071'1073、1075、1077、1079、1081'1083、 1085、1087、1089、1091、1093、1095、1097、1099、1101、1103、1105、1107、1109、1111、1113、 1161-1571、1572、1577、1582、1587、1592、1597、1602、1607、1612、1617、1622、1627、1632、 1637、1642、1647、1652、1657、1662、1667、1672、1677、1682、1684、1686、1688、1690、1692、 1694、1696、1698、1700、1702、1704、1730-2039、2040、2045、2050、2055、2060、2065、2070、 2075、2080、2085、2090、2095、2100、2102、2104、2106、2108、2120-2338、2339、2344、2349、 2354、2359、2364、2366、2368、2370、2372、2384-2460、2461、2466、2471、2476 和 2481 示出的 核酸序列具有至少70%序列同一性的多核巧酸序列。在一種實施方案中，從多核巧酸序列 的表達產(chǎn)生雙鏈核糖核巧酸序列，其中，有害生物與所述核糖核巧酸序列的接觸能抑制所 述有害生物的生長。在又一實施方案中，所述序列的接觸抑制與所述序列充分互補的核巧 酸序列的表達。在另一實施方案中，用該多核巧酸轉(zhuǎn)化細胞。在還一實施方案中，所述細胞 是細菌、酵母或藻類細胞。在再一實施方案中，食物產(chǎn)品，例如，膽藏谷類、寵物食品或粉末 巧克力，包含經(jīng)該多核巧酸轉(zhuǎn)化的細胞。在又一實施方案中，組合物，例如噴霧劑、粉末、團 塊、凝膠、膠囊、食物產(chǎn)品、衣物袋和圖書包含該多核巧酸。在又一實施方案中，本發(fā)明提供 了包含該多核巧酸的殺蟲劑。在另一實施方案中，本發(fā)明提供了保護物體免受有害生物侵 襲的方法，所述物體例如木材、樹、圖書粘合物、布和食物膽藏容器，所述方法包括用包含所 述多核巧酸的組合物處理所述表面。
[0011] 在另一個方面，本發(fā)明提供了控制有害生物侵襲的方法，所述方法包括：將有 害生物暴露給下述組合物，所述組合物包含能抑制有害生物生物學(xué)活性的多核巧酸序 列。在一種實施方案中，所述多核巧酸序列是SEQ ID N0;l、3、5、7、9、ll、13、15、17、19、 21、23、49-158、159、160、163、168、173、178、183、188、193、198、203、208、215、220、225、 230、247、249、251、253、255、257、259、275-472、473、478、483、488、493、498、503、513、515、 517、519、521、533-575、576、581、586、591、596、601、603、605、607、609、621-767、768、773、 778、783、788、793、795、797、799、801、813-862、863、868、873、878、883、888、890、892、894、 896、908-1040、1041'1046'1051'1056、1061'1071'1073'1075、1077、1079'1081'1083、 1085、1087、1089、1091、1093、1095、1097、1099、1101、1103、1105、1107、1109、1111、1113、 1161-1571、1572、1577、1582、1587、1592、1597、1602、1607、1612、1617、1622、1627、1632、 1637、1642、1647、1652、1657、1662、1667、1672、1677、1682、1684、1686、1688、1690、1692、 1694、1696、1698、1700、1702、1704、1730-2039、2040、2045、2050、2055、2060、2065、2070、 2075、2080、2085、2090、2095、2100、2102、2104、2106、2108、2120-2338、2339、2344、2349、 2354、2359、2364、2366、2368、2370、2372、2384-2460、2461、2466、2471、2476 和 2481 示出的 任意序列。
[0012] 在另一實施方案中，本發(fā)明提供了經(jīng)分離的核巧酸序列、雙鏈核糖核巧酸序列、細 胞、組合物或殺蟲劑用于預(yù)防或處理侵襲，例如昆蟲、線蟲或真菌侵襲的用途。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0013] 圖I-LD ;馬鈴墓葉甲在用dsRNA處理過的人工食物上的存活。向第二幼蟲期的昆 蟲喂飼用50 y 1局部應(yīng)用的dsRNA (祀或奸P對照）溶液處理過的膳食。膳食在7天后被含 有局部應(yīng)用dsRNA的新鮮膳食替換。在第2、5、7、8、9和13天評定存活昆蟲的數(shù)量。計算相 對于第0天（檢測開始時）的存活幼蟲百分比。祀LD006 ;(SEQ ID N0;178);祀LD007(SEQ ID NO :183) ；|E LDOlO (SEQ ID NO： 188) ；|ELD011(SEQ ID NO ： 193) ；|ELD014(SEQ ID NO： 198) ;gfp dsRNA(SEQ ID NO :235)。
[0014] 圖2-LD ;馬鈴墓葉甲在用dsRNA處理過的人工膳食上的存活。向第二幼蟲期的 昆蟲喂飼用50 y 1局部應(yīng)用的dsRNA (祀或奸P對照）溶液處理過的膳食。膳食僅在7天 后被新鮮膳食替換。在第2、5、6、7、8、9、12和14天評定存活昆蟲的數(shù)量。計算相對于第0 天（檢測開始時）的存活幼蟲百分比。祀LDOOl ;(SEQ ID N0;163);祀LD002(SEQ ID NO: 168);祀 LD003(SEQ ID N0;173);祀 LD015(SEQ ID N0;215);祀 LD016(SEQ ID N0;220); gfp dsRNA(SEQ ID NO :235)。
[0015] 圖3-LD ;在用dsRNA處理過的馬鈴墓葉盤上的馬鈴墓葉甲幼蟲平均重量。向第二 幼蟲期的昆蟲喂飼用20 y 1局部應(yīng)用的dsRNA (祀LD002或奸P對照）溶液（1化g/ y 1)處 理過的葉盤。2天后，每天都將昆蟲轉(zhuǎn)移到未經(jīng)處理的葉上。
[001引 圖4-LD ;馬鈴墓葉甲在用祀LDOHdsRNA的較短形式和多聯(lián)體dsRNA處理過的人 工膳食上的存活。向第二幼蟲期的昆蟲喂飼經(jīng)50 y 1局部應(yīng)用的dsRNA(g巧或祀）溶液處 理過的膳食。在第3、4、5、6和7天評定存活昆蟲的數(shù)量。計算相對于第0天（檢測開始 時）的存活幼蟲百分比。
[0017] 圖5-〇);馬鈴墓葉甲幼蟲在用不同濃度的祀0)002(3)、祀0)007化）、祀0)010(。）、 祀 LDOll (d)、祀 LD014 (e)、祀 LD015 (f)、LD016 (g)和祀 LD027 化）的 dsRNA 處理過的人工膳 食上的存活。向第二幼蟲期的昆蟲喂飼經(jīng)50 y 1局部應(yīng)用的dsRNA溶液處理過的膳食。膳 食在7天后被含有局部應(yīng)用dsRNA的新鮮膳食替換。W常規(guī)間隔評定存活昆蟲的數(shù)量。計 算相對于第0天（檢測開始時）的存活幼蟲百分比。
[0018] 圖6-LD ;表達dsRNA祀LDOlO的大腸桿菌巧.coli)菌株對馬鈴墓甲蟲--馬鈴 墓葉甲幼蟲存活隨時間的影響。在單獨的基于人工膳食的生物測定中，對兩種細菌菌株進 行了測試；（a)AB309-105 ;針對PGBNJ003和PGN29的數(shù)據(jù)點代表了來自5個不同細菌克隆 的平均死亡率的值，化)化2UDE3);針對PGBNJ003和PGN29的數(shù)據(jù)點代表了分別來自5個 不同和1個單細菌克隆的平均死亡率的值。誤差條代表標準差。
[001引圖7-LD ;侵襲后12天，大腸桿菌菌株的不同克?。╝)AB309-105和化）表達dsRNA 祀LDOlO的化21 (DE3)對馬鈴墓甲蟲--馬鈴墓葉甲幼蟲存活的影響。數(shù)據(jù)點是針對pGN29 和PGBNJ003而言每個克隆的平均死亡率的值。攜帶有質(zhì)粒PGBNJ003的AB309-105的克隆 1在該時間點顯示出針對CPB的100%死亡率。誤差條代表標準差。
[0020] 圖8-LD ;侵襲后7天，大腸桿菌菌株的不同克隆（a)AB309-105和化）表達dsRNA 祀LDOlO的化21 (DE3)對馬鈴墓甲蟲--馬鈴墓葉甲幼蟲存活者的生長和發(fā)育的影響。數(shù) 據(jù)點是基于表10的數(shù)據(jù)針對每個克隆（對于PGN29而言1個克隆，對于PGBNJ003而言5 個克?。┑模テ骄紫x重量值。僅給予膳食的處理代表100%正常的幼蟲重量。
[0021] 圖9-LD ;在侵襲后7天用產(chǎn)生雙鏈RNA的細菌噴霧過的馬鈴墓植物上，馬鈴墓甲 蟲一馬鈴墓葉甲幼蟲的存活。對幼蟲存活者的數(shù)量加W計數(shù)，表示為％死亡率的形式。所 用的細菌宿主菌株是RNaseIII-缺陷型菌株AB309-105。昆蟲基因祀是LD010。
[0022] 圖IO-LD ;在侵襲后11天用產(chǎn)生dsRNA的細菌噴霧的馬鈴墓植物上喂飼的馬鈴墓 甲蟲一馬鈴墓葉甲幼蟲存活者的生長/發(fā)育延遲。所用的細菌宿主菌株是RNaseIII-缺 陷型菌株AB309-105。數(shù)據(jù)圖表示為正常幼蟲重量的百分比；僅給予膳食的處理被視為正 常幼蟲重量的100%。昆蟲基因祀是LD010。誤差條代表標準差。
[002引 圖Il-LD ;在侵襲后7天通過產(chǎn)生雙鏈RNA的細菌導(dǎo)致的、對馬鈴墓甲蟲--馬鈴 墓葉甲幼蟲引起的馬鈴墓損傷的抗性。左邊是用7個單位的含PGN29質(zhì)粒的細菌AB309-105 噴霧的植物；右邊是用7個單位的含PGBNJ003質(zhì)粒的細菌AB309-105噴霧的植物。一個單 位被定義為在600nm處OD值為1的Iml細菌息浮液的等同物。昆蟲基因祀是LD010。
[0024] 圖12-LD ;在用dsRNA處理過的馬鈴墓葉盤上馬鈴墓葉甲成蟲的存活。最初兩天 用雙鏈RNA處理過的葉盤來喂飼年輕的昆蟲成蟲，之后將它們放在未經(jīng)處理的馬鈴墓葉子 上。常規(guī)評定存活昆蟲的數(shù)量；活著并且看起來正常移動的昆蟲被記為可移動的昆蟲；活 著但是看起來病態(tài)并且移動緩慢的昆蟲被記為瀬死的昆蟲一該些昆蟲一旦被背朝下放 置無法自己翻過身來。祀LD002(SEQ ID N0;168);祀LD010(SEQ ID N0;188);祀LD014(SEQ ID N0;198);祀 LD016(SEQ ID N0;220) ;gfp dsRNA(SEQ ID N0;235)。
[002引圖13-LD ;產(chǎn)生祀雙鏈RNA的細菌對馬鈴墓葉甲幼蟲的影響。將50 ylOD為I的 經(jīng)熱處理細菌（表達dsRNA(SEQ ID NO :188))的息浮液局部應(yīng)用到48孔板每個孔中的固 體人工膳食上。將L2期的(PB幼蟲放置于每個孔中。在第7天，對于含有下述物質(zhì)的板中 的CPB幼蟲取圖，其中含有（a)含有表達祀10雙鏈RNA的細菌的膳食，化）具有攜帶有空 載體PGN29的細菌的膳食W及（C)僅膳食。
[0026] 圖14-LD;在昆蟲侵襲之前，局部應(yīng)用到馬鈴墓葉上的不同量的滅活大腸桿菌 AB309-105菌株（攜帶質(zhì)粒PGBNJ003)對于(PB幼蟲存活和生長的影響。向10只Ll幼蟲喂 飼經(jīng)處理的馬鈴墓，喂飼7天。噴霧到植物上的細菌息浮液的量為；0. 2抓、0. 08U、0. 025U、 0. 008U的祀10 W及0. 25U的pGN29 (陰性對照，還包括Milli-Q水）。一個單位（U)被定 義為；與在600nm光密度值為1的Iml培養(yǎng)物中存在的細菌等同的量。噴霧到每株植物上 的總體積為1.6ml。昆蟲基因祀是LD010。
[0027] 圖15-LD ;侵襲后7天，攜帶質(zhì)粒PGBNJ003的滅活大腸桿菌AB309-105菌株導(dǎo)致 的CPB幼蟲對馬鈴墓損傷的抗性。（a)水，化)0. 2抓攜帶PGN29的大腸桿菌AB309-105， (C)O. 02抓攜帶PGBNJ003的大腸桿菌AB309-105，（d)0. 008U攜帶PGBNJ003的大腸桿菌 AB309-105。一個單位（U)被定義為；與在600nm光密度值為1的Iml培養(yǎng)物中存在的細菌 等同的量。噴霧到每株植物上的總體積為1.6ml。昆蟲基因祀是LD010。
[0028] 圖I-PC ;攝入的碑IdsRNA對辣根猿葉甲幼蟲存活和生長的影響。向新生（neonate) 幼蟲喂飼用25 y 1局部應(yīng)用的0. 1 y g/ y 1 dsRNA (祀或奸P對照）溶液處理過油菜葉盤。 2天后，將昆蟲轉(zhuǎn)移到新鮮的用dsRNA處理過的葉盤上。第4天，針對每種處理收集來自一 份重復(fù)的幼蟲，將其放進含有新鮮的未經(jīng)處理的油菜葉子的Petri培養(yǎng)皿中。在第2、4、7、 9和11天，對昆蟲加W評定。（a)墨西哥豆瓢蟲幼蟲在用dsRNA處理過的油菜葉盤上的存 活。計算相對于第0天（檢測開始時）的存活幼蟲百分比。化）在用dsRNA處理過的油菜 葉盤上辣根猿葉甲幼蟲的平均重量。將來自每份重復(fù)實驗的昆蟲一起稱重，確定每只幼蟲 的平均重量。誤差條代表標準差。祀I=SEQ ID N0;473;祀3;SEQ ID N0;478;祀5;SEQ ID NO :483 ;祀 10 ;SEQ ID NO :488 ;祀 14 ;SEQ ID NO :493 ;祀 16 ;SEQ ID NO :498 ;祀 27 : 沈Q ID NO :503 ;gfP dsRNA ;SEQ ID NO :235。
[002引圖2-PC ;在用不同濃度的（a)祀PCOlO和（b)祀PC027的dsRNA處理過的油菜葉 盤上辣根猿葉甲的存活。將新生幼蟲放到用25 y 1局部應(yīng)用的dsRNA溶液處理過的葉盤上。 在第2天將昆蟲轉(zhuǎn)移到新鮮的經(jīng)處理葉盤上。對祀PCOlO而言在第4天，對祀PC027而言 在第5天，將昆蟲轉(zhuǎn)移到未經(jīng)處理的葉上。針對PCOlO在第2、4、7、8、9和11天，針對PC027 在第2、5、8、9和12天，評定存活昆蟲的數(shù)量。計算相對于第0天（檢測開始時）的存活幼 蟲百分比。
[0030] 圖3-PC ;表達dsRNA祀PCOlO的大腸桿菌菌株AB309-105對白芥葉甲蟲--辣根 猿葉甲幼蟲存活隨時間的影響。針對每種處理的數(shù)據(jù)點代表來自3份不同重復(fù)的平均死亡 率的值。誤差條代表標準差。祀10 =SEQ ID NO ;488。
[0031] 圖I-EV ;墨西哥豆瓢蟲幼蟲在用dsR化處理過的豆葉盤上的存活。向新生幼蟲喂 飼用25 y 1局部應(yīng)用的1 y g/ y 1 dsRNA(祀或奸P對照）溶液處理過的豆葉盤。2天后， 將昆蟲轉(zhuǎn)移到新鮮的用dsRNA處理過的葉盤上。第4天，收集來自一種處理的幼蟲，將其放 進含有新鮮的未經(jīng)處理的豆葉的塑料盒中。在第2、4、6、8和10天，對昆蟲的死亡率加W評 定。計算相對于第0天（檢測開始時）的存活幼蟲百分比。祀5 =SEQ ID NO ;576;祀10: 沈Q ID NO ;586 ;祀 15 ;SEQ ID NO ;591 ;祀 16 ;SEQ ID NO ;596 ;gfp ds RNA ;SEQ ID NO : 235。
[003引圖2-EV ;攝入的祀dsRNA對于墨西哥豆瓢蟲成蟲存活W及對食芙菜豆葉的昆蟲損 傷的抗性的影響。（a)墨西哥豆瓢蟲成蟲在用dsRNA處理過的豆葉上的存活。向成蟲喂飼 用75 ill局部應(yīng)用的0. 1 y g/ ill dsRNA(祀或奸P對照）溶液處理過的豆葉盤。24小時 后，將昆蟲轉(zhuǎn)移到新鮮的用dsRNA處理過的葉盤上。再24小時后，收集來自一種處理的成 蟲，將其放進含有盆栽的新鮮未經(jīng)處理整株豆植株的塑料盒里。在第4、5、6、7、8和11天 評定昆蟲的死亡率。計算相對于第0天（檢測開始時）的存活成蟲百分比。祀10 =SEQ ID NO ;586 ;革己 15 ;SEQ ID NO ;591 ;革己 16 ;SEQ ID NO ;596 ;gfp ds RNA ;SEQ ID NO ;235?；?通過dsRNA導(dǎo)致的對墨西哥豆瓢蟲成蟲引起的豆葉損傷的抗性。在第9天，針對葉的損傷 對含有來自一種處理（見（a))的昆蟲的整株植物進行目視檢查。（i)祀10 ;(ii)祀15; (iii)祀 16 ; (iv)gfp dsRNA ; (V)未經(jīng)處理的。
[0033] 圖I-TC ;赤擬谷盜幼蟲在用祀14的dsRNA處理過的人工膳食上的存活。向新生 幼蟲喂飼含有Img dsRNA祀14的基于面粉/奶混合物的膳食。對照是膳食中的水（沒有 dsRNA)。針對每種處理采用四份重復(fù)，每份重復(fù)為10只第一齡蟲。在第6、17、31、45和60 天，評定昆蟲的存活（作為平均百分比值）。計算相對于第0天（檢測開始時）的存活幼蟲 百分比。誤差條代表標準差。祀TC014;SEQ ID N0;878。
[0034] 圖I-MP ;攝入的祀27dsRNA對于桃閩蛹的存活的影響。將第一齡蟲放進喂飼室中， 其中含有50 y 1具2 y g/ y 1 dsRNA (祀27或奸P dsRNA對照）的液體膳食。對每種處理 而言，使用5個喂飼室，每個喂飼室中10只齡蟲。在生物測定開始后8天評定存活者的數(shù) 量。誤差條代表標準差。祀 MP027;SEQ ID N0;1061 ;gfp ds RNA;SEQ ID N0;235。
[00巧]圖I-NL ;褐飛風(fēng)在用dsRNA處理過的液體人工膳食上的存活。在分別的生物測定 中，向第一至第二幼蟲期的蛹喂飼補充有2mg/ml dsRNA祀溶液的膳食；(a)化002、化003、 化005、化010 ;化）化009、化016 ;(。）化014、化018 ;(屯化013、化015、化021。將昆蟲在祀上 的存活與僅用膳食W及用含有同樣濃度的奸P dsRNA對照的膳食時的情況相比。膳食每兩 天被含有dsRNA的新鮮膳食替換。每天評定存活昆蟲的數(shù)量。
[0036] 圖2-NL;褐飛風(fēng)在用不同濃度的祀dsRNA化002處理的液體人工膳食上的存活。 向第一至第二幼蟲期的蛹喂飼補充有1、〇. 2、0. 08和0. 04mg/ml (最終濃度）化002的膳食。 膳食每兩天被含有dsRNA的新鮮膳食替換。每天評定存活昆蟲的數(shù)量。
[OOW] 發(fā)明詳沐
[0038] 本發(fā)明提供了控制有害生物侵襲的手段，該是通過將有害生物暴露給祀編碼序列 來實現(xiàn)的，所述序列能對有害生物中必要的生物學(xué)功能造成轉(zhuǎn)錄后阻遏或抑制。在暴露給 祀序列之后，祀形成了 dsRNA，所述dsRNA對應(yīng)于重要的有害生物基因的部分或全部，其引 起了通過RNA干擾（RNAi)對有害生物祀的下調(diào)。作為對mRNA下調(diào)的結(jié)果，dsRNA防止了 祀有害生物蛋白的表達，進而導(dǎo)致有害生物的死亡、生長停止或不育。
[0039] 本發(fā)明可用于想要抑制有害生物的生存能力、生長、發(fā)育或繁殖，或者想要減少有 害生物的病原性或感染性的任何領(lǐng)域。實踐中的應(yīng)用包括但不限于，（1)保護植物免受有 害生物侵襲，（2)用于人和動物的藥物或獸醫(yī)學(xué)用途（例如，用于控制、治療或預(yù)防人類和 動物中的有害生物侵襲）；（3)保護材料免遭有害生物導(dǎo)致的損傷；W及（4)保護易腐爛材 料（例如，食物、種子等）免遭有害生物導(dǎo)致的損傷。
[0040] 向有害生物施用雙鏈核糖核酸分子或者將有害生物暴露給所述分子產(chǎn)生下述性 質(zhì)中的一種或多種：有害生物進食減少；有害生物生存能力降低；有害生物死亡；對有害生 物分化和發(fā)育的抑制；有害生物的有性繁殖，肌肉形成，保幼激素形成，保幼激素調(diào)節(jié)，離子 調(diào)節(jié)和轉(zhuǎn)運，細胞膜電位保持，氨基酸生物合成，氨基酸降解，精子形成，信息素合成，信息 素感知，觸角形成，翅膀形成，腿形成、發(fā)育和分化，卵形成，幼蟲成熟，消化酶形成，血淋己 合成，血淋己保持，神經(jīng)傳遞，細胞分裂，能量代謝，呼吸，調(diào)亡W及真核細胞細胞骨架結(jié)構(gòu) 的任何組分（例如，肌動蛋白和微管蛋白）能力的消失或降低。該些性質(zhì)中的任何一種或 任何組合能導(dǎo)致對有害生物侵襲的有效抑制。
[0041] 本申請文件中使用的所有技術(shù)術(shù)語是通常用于生物化學(xué)、分子生物學(xué)和農(nóng)學(xué)領(lǐng) 域中的，因此，它們是本發(fā)明所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員所理解的。該些技術(shù)術(shù)語可在，例如 MOLECULAR 化ONING ;A LABORATORY MANUAL,第 3 版，卷 1-3,編著，Sambrook 和 Russel, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y.，2001、CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY,編著 Ausubel 等人，Greene Publishing Associates 311(1111巧-11116'3。1611。6，爬￥化'1^，1988(及定期更新）、5冊^?1?01'0〇)1^5^]\?)1^6(：化八1? BIOLOGY ;A COMPENDIUM OF METHODS FROM CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, 第 5 版，卷 1-2,編著 Ausubel 等人，化hn Wil巧&Sons，Inc. ,2002、GENOME ANALYSIS ;A LABORATORY MANUAL,卷 1-2,編著 Green 等人，Cold Spring 化 rbor L 油 oratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y.，1997 中找到。
[0042] 使用PCR的多種技術(shù)被描述于，例如，Innis等人，PCR PROTOCOLS ;A GUIDE TO METHODS AND AP化ICATIONS，Academic Press, San Diego, 1990 和 Dieffenbach 和 Dveksler，PCR PRIMER ;A LABORATORY MANUAL,第 2 版，Cold Spring 化rbor L油oratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. ,2003中。可通過已知技術(shù)從已知序列獲得PCR-引物 對，所述技術(shù)例如使用用于該目的的計算機程序，例如Primer,版本0. 5,1991，Whitehead Institute for Biomedical Research, Cambridge, Md 用于核酸化學(xué)合成的方法在例如 Beaucage&Caruthers, Te1:ra. Letts. 22:1859-62(1981)和 Matteucci&Caruthers, J. Am. Chem. Soc. 103 :3185(1981)中討論過。
[004引 限制性酶消化、磯酸化、連接和轉(zhuǎn)化按照Sambrook等人，MOLECULAR化ONING ;A LABORATORY MANUAL,第 2 版（1989) ,Cold Spring 化 rbor L 油 oratory Press 所述來進 行。如無其它指明，用于細菌細胞生長和保持的所有試劑和材料都從阿爾德里克化學(xué)公司 (Al化ich Qiemicals) (Milwaukee, Wis. )、DIFCO 實驗室值IFCO L油oratories)值etroit, Mich.)、英杰生命科學(xué)公司（Invitrogen) (Gaithersburg, Md.)或西格瑪化學(xué)公司（Sigma Chemical Company) (St. Louis, Mo.)獲得。
[0044] 生物學(xué)活性指蛋白質(zhì)或版的生物學(xué)行為和影響及其對有害生物的表現(xiàn)。例如，本 發(fā)明的RNAi可防止特定mRNA的翻譯，由此抑制所述mRNA編碼的蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性或者 有害生物的其它生物學(xué)活性。
[0045] 在本說明書中，RNAi分子可抑制有害生物中的生物學(xué)活性，產(chǎn)生下述性質(zhì)中的一 種或多種：有害生物進食減少；有害生物生存能力降低；有害生物死亡；對有害生物分化和 發(fā)育的抑制；有害生物的有性繁殖，肌肉形成，保幼激素形成，保幼激素調(diào)節(jié)，離子調(diào)節(jié)和轉(zhuǎn) 運，細胞膜電位保持，氨基酸生物合成，氨基酸降解，精子形成，信息素合成，信息素感知，觸 角形成，翅膀形成，腿形成、發(fā)育和分化，卵形成，幼蟲成熟，消化酶形成，血淋己合成，血淋 己保持，神經(jīng)傳遞，細胞分裂，能量代謝，呼吸，調(diào)亡W及真核細胞細胞骨架結(jié)構(gòu)的任何組分 (例如，肌動蛋白和微管蛋白）能力的消失或降低。
[0046] 互補DNA(CDNA)指從成熟的mRNA模板合成的單鏈DNA。雖然有若干種方法，但是 最通常是使用逆轉(zhuǎn)錄酶該種酶從成熟（經(jīng)完全剪接的）mRNA來合成cDNA。該酶在mRNA的 單鏈上進行操作，基于RNA堿基對（A、U、G、C)與其DNA互補體（T、A、C、G)的配對產(chǎn)生所述 mRNA的互補DNA。兩條核酸鏈的堿基中有至少85%配對時，該兩條鏈就是充分巧補的。
[0047] 想要的《核昔酸：本發(fā)明的想要的多核昔酸是遺傳元件，例如啟動子、增強子或 終止子，或?qū)⒃谄浠蚪M中包含想要的多核巧酸的經(jīng)轉(zhuǎn)化細胞中轉(zhuǎn)錄和/或翻譯的基因或 多核巧酸。如果想要的多核巧酸包含編碼蛋白質(zhì)產(chǎn)物的序列，編碼區(qū)域可與調(diào)控元件（例 女口，啟動子和終止子）有效地連接，所述調(diào)控元件能使得相關(guān)聯(lián)的信使RNA轉(zhuǎn)錄本和/或想 要的多核巧酸編碼的蛋白質(zhì)產(chǎn)物表達。因此，"想要的多核巧酸"可包含該樣的基因：其W 5'-至3'-方向有效地連接啟動子、編碼蛋白質(zhì)的基因和終止子?；蛘?，想要的多核巧酸 可包含"正義"或"反義"方向的基因或其片段，其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生可能影響到宿主細胞中內(nèi)源基因 表達的核酸。想要的多核巧酸還可基于轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生雙鏈RNA產(chǎn)物，在此基礎(chǔ)上起始對所述想 要的多核巧酸相關(guān)聯(lián)的基因的RNA干擾。本發(fā)明的想要的多核巧酸可被放置于載體中，使 得左右邊界序列側(cè)翼連接于想要的多核巧酸或在其任何一側(cè)。本發(fā)明設(shè)想將一種或多種想 要的多核巧酸穩(wěn)定整合進至少一種宿主細胞的基因組。想要的多核巧酸可經(jīng)突變或者是其 野生型序列的變體。應(yīng)當(dāng)理解，想要的多核巧酸的全部或部分可整合進宿主的基因組。還 應(yīng)當(dāng)理解，術(shù)語"想要的多核巧酸"包括一種或多種此類多核巧酸。因此，本發(fā)明的載體可 包含一種、兩種、H種、四種、五種、六種、走種、八種、九種、十種或更多種想要的多核巧酸。
[0048] "暴露"包括下述任何方法，通過所述方法，使得有害生物與dsRNA相接觸，其中， 所述dsRNA包含經(jīng)退火的互補鏈，其中之一具有與將被下調(diào)的有害生物祀基因核巧酸序列 的至少一部分互補的核巧酸序列?？赏ㄟ^直接攝?。ɡ缤ㄟ^進食）將有害生物暴露給 dsRNA，該不需要dsRNA在有害生物中表達。或者，有害生物可與包含dsRNA的組合物接觸。 例如，有害生物可與用包含dsRNA的組合物處理過的表面或材料接觸。dsRNA可W被原核 (例如但不限于，細菌）或真核（例如但不限于，酵母）宿主細胞或宿主生物表達。
[0049] 外源；在提到核酸時，"外源"表示核酸源自非宿主生物。根據(jù)本發(fā)明，外源DNA或 RNA表示天然存在于病毒、哺乳動物、魚或鳥的遺傳構(gòu)成中但是在待轉(zhuǎn)化的宿主中并非天然 存在的核酸。因此，外源核酸是該樣的核酸，其編碼例如經(jīng)轉(zhuǎn)化宿主并不天然產(chǎn)生的多膚。 外源核酸不一定編碼蛋白質(zhì)產(chǎn)物。
[0050] 基里指該樣的多核巧酸序列，其包含對于多膚或前體的生產(chǎn)來說必要的控制和編 碼序列。多膚可由全長編碼序列或編碼序列的任何部分所編碼。基因可組成連續(xù)的編碼序 列，或者其可包括通過合適的剪接點結(jié)合的一個或多個內(nèi)含子。此外，基因可在編碼或非翻 譯區(qū)域含有一種或多種修飾，該可能會影響到表達產(chǎn)物的生物學(xué)活性或化學(xué)結(jié)構(gòu)、表達速 率或表達控制方式。此類修飾包括但不限于；一個或多個核巧酸的突變、插入、缺失和取代。 在該方面，此類經(jīng)修飾的基因可被稱為"天然"基因的"變體"。
[0051] 遺傳元件；"遺傳元件"是件何軍要的(discreet)核巧酸序列，其例如但不限于， 啟動子、基因、終止子、內(nèi)含子、增強子、間隔區(qū)、5'-非翻譯區(qū)域、3'-非翻譯區(qū)域或重組 酶識別位點。
[0052] 遺傳修飾;通過應(yīng)用分子生物學(xué)和細胞生物學(xué)的方法，將核酸穩(wěn)定引入某些生物 的基因組。
[005引"基因遏巧r或"對基因表達的下調(diào)"或"對基因表達的抑巧r可互換使化其指廟 來自祀基因的蛋白質(zhì)產(chǎn)物和/或mRNA產(chǎn)物的水平上可測量的或可觀察到的基因表達的降 低，或可探測到的基因表達的完全消失。當(dāng)祀基因的下調(diào)或抑制發(fā)生但對有害生物的其它 基因沒有明顯影響的時候，對基因表達的下調(diào)或抑制是"特異性的"。
[0054] 根據(jù)祀基因的性質(zhì)，可通過使用分子技術(shù)，例如，RNA溶液雜交、核酸酶保護、 Nodhern雜交、逆轉(zhuǎn)錄、微陣列基因表達監(jiān)測、抗體結(jié)合、酶聯(lián)免疫吸附測定巧LISA)、 Western印跡、放射性免疫測定巧IA)、其它免疫測定或英光活化細胞分析（FAC巧測量mRNA 或蛋白質(zhì)表達，或通過對細胞或整個有害生物進行表型分析，來驗證對有害生物細胞中基 因表達的下調(diào)或抑制。
[0055] 在本文中使用時，裸子植物指產(chǎn)生種子但沒有子房的種子植物。裸子植物的實例 包括針葉樹、蘇鐵、銀杏和麻黃。
[0056] 在本文中使用時，同源性涉及序列；如果蛋白質(zhì)或核巧酸序列顯示出"顯著"水平 的序列相似性或更優(yōu)選地序列同一性，那么所述蛋白或核酸序列就可能是同源的。真正同 源的序列通過來自共同祖先基因的趨異相關(guān)聯(lián)。序列同源物可W是兩種類型的；（i)同源 物存在于不同物種中時，它們被認為是直向同源物，例如，在小鼠和人中的a-珠蛋白基因 是直向同源物；（ii)旁系同源物（paralogue)是在單種物種中的同源基因，例如，小鼠中的 a-珠蛋白和目-珠蛋白基因是旁系同源物。
[0057] 宿主細胞指該樣的微生物、原核細胞、真核細胞或作為單細胞實體培養(yǎng)的細胞系， 其可W或已經(jīng)用作為重組載體或其它多核巧酸傳遞的受體，包括已被轉(zhuǎn)染的原始細胞的子 代。由于天然的、偶然的或刻意的突變，單個細胞的子代在形態(tài)，或基因組DNA或總DNA互 補的方面并不一定與原始親本完全相同。
[0058] 引入；在本文中使用時，指核酸序列插入細胞，該通過包括感染、轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo) 在內(nèi)的方法來實現(xiàn)。
[0059] 本文中使用的昆蟲有害生物包括但不限于：來自鱗翅目（Lepidoptera)的，例 女口，長翅卷蛾屬物種（Acleris spp.)、褐帶卷蛾屬物種（Adoxo地yes spp.)、透翅蛾屬物種 (Aegeria spp.)、地虎屬物種（Agrotis spp.)、棉葉蟲（Al油ama argillaceae)、Amylois spp.、梨豆夜蛾（Anticarsia gemmatalis)、黃卷蛾屬物種（Archips spp)、卷蛾屬物種 (Argyrotaenia spp.)、銀紋夜蛾屬物種（Autographa spp.)、Busseola fusca、干果斑頓 (Cadra cautella)、桃蛙果蛾（Carposina nipponensis)、禾草頓屬物種（Qiilo spp.)、色 卷蛾屬物種（化oristoneura spp.)、葡萄果蠢蛾（Clysia ambiguella)、縱卷葉野頓屬物 種（Cnaphalocrocis spp.)、云卷蛾屬物種（Cn邱hasia spp.)、Coch)dis spp.、稍蛾屬物種 (Coleophora spp.)、大萊頓（Oocidolomia binotalis)、蘋果異形小卷蛾（Oyptophlebia Ieucotreta)、小卷蛾屬物種（Cydia spp.)、桿草頓屬物種Oiatraea spp.)、蘇丹棉鈴 蟲Oiparopsis castanea)、金即鉆屬物種巧arias spp.)、粉斑頓屬物種巧phestia spp.)、花小卷蛾屬物種巧ucosma spp.)、女貞細卷蛾巧upoecilia ambiguell)、黃毒蛾 屬物種肋iproctis spp.)、切夜蛾屬物種（；Euxoa spp.)、小食也蟲屬物種（Grapholita spp.)、Hedya nubiferana、實夜蛾屬物種（}felio化is spp.)、萊也野頓（}fellula undalis)、美國白蛾（Hyphantria cunea)、番茄蠢蛾化eiferia Iycopersicella)、方靠紋 潛蛾（Xeucoptera scitella)、柯扁財屬物種（Xithocollethis spp.)、葡萄花翅小卷蛾 (Xobesia botrana)、毒蛾屬物種（Xymantria spp.)、潛蛾屬物種（Xyonetia spp.)、天幕 毛蟲屬物種（Malacosoma spp.)、甘藍夜蛾（Mamestra brassicae)、煙草天蛾（Manduca sexta)、秋尺蛾屬物種（Operophtera spp.)、玉米頓（Ostrinia Nubilalis)、超小卷蛾屬 物種巧ammene spp.)、褐卷蛾屬物種巧andemis spp.)、小眼夜蛾巧anolis flammea)、紅 鈴麥蛾巧ectinophora gossypiella)、馬鈴墓麥蛾腳Ithorimaea operculella)、萊粉蝶 巧ieris rapae)、粉蝶屬物種巧ieris spp.)、萊蛾巧Iutella ；Kylostella)、Rrays spp.、 白禾頓屬物種（Scii^pophaga spp.)、蛙莖野蛾屬物種（Sesamia spp.)、長須卷蛾屬物種 (Sparganothis spp.)、灰翅夜蛾屬物種（Spodoptera spp.)、Synan化edon spp?、異舟蛾屬 物種（Thaumetopoea spp.)、卷蛾屬物種（Tortrix spp.)、粉斑夜蛾（Trichoplusia ni)和 巢蛾屬物種燈ponomeuta spp.);
[0060] 來自稍翅目（Coleoptera)的，例如，叩頭蟲屬物種（Agriotes SPP.)、花象屬物 種（Anthonomus spp.)、甜萊隱食甲（Atomaria linearis)、甜萊腔跳甲（Qiaetocnema tibialis)、根頭象甲屬物種（Cosmopolites spp.)、象蟲屬物種（Curculio spp.)、皮蠢 屬物種Oermestes spp.)、食植瓢蟲屬物種巧pilachna spp. )、Eremnus spp?、馬鈴墓葉 甲（L邱tinotarsa decemlineata)、稻水象屬物種（Xissorhoptrus spp.)、觸金龜屬物種 (Melolon化a spp.)、Oryca邱hilus 鄧P.、耳嗦象屬物種（Otiorhynchus spp.)、Phlyctinus spp.、弧麗金龜屬物種（；P〇pillia spp.)、十節(jié)跳甲屬物種（；Psylliodes spp.)、蛙長蠢屬 物種（Rhizopertha spp.)、金龜甲科（Scarabeidae)、米象屬物種（Sitophilus spp.)、 Sitotroga spp.、粉蟲屬物種（Tenebi'io spp.)、擬谷盜屬物種（Tribolium spp.)和斑皮蠢 屬物種（Trogoderma spp.);
[0061] 來自直翅目（Orthoptera)的，例如娜屬物種（Blatta spp.)、小娜屬物 種化IattelIa spp.)、峻帖屬物種（Gryllotalpa spp.)、馬德拉斐娜（Xeucophaea maderae)、飛幢屬物種（Xocusta spp.)、大娜屬物種（[Periplaneta ssp.)和沙鎮(zhèn)幢屬物種 (Schistocerca spp.);
[0062] 來自等翅目（Isoptera)的，例如散白蟻屬物種Gteticulitemes ssp);
[0063] 來自曬蟲目（；Psocoptera)的，例如動曬屬物種（Xiposcelis spp.);
[0064] 來自動目（Anoplura)的，例如血動屬物種（Haematopinus spp.)、毛動屬物種 (Linognathus spp.)、動屬物種巧ediculus spp.)、瘦綿財屬物種巧emphigus spp.)和倭 財屬物種腳lylloxera spp.);
[006引來自食毛目（Mallophaga)的，例如Damalinea spp.和曬毛動屬物種 (Trichodectes spp.);
[0066] 來自縷翅目（Tliysanoptera)的，例如花萄馬屬物種^ranklinella spp.)、籬萄 馬屬物種（Hercino化rips spp.)、帶萄馬屬物種（Taeniothrips spp.)、節(jié)瓜萄馬（Thrips palmi)、煙萄馬（Thrips tabaci)和南非黃硬萄馬（Scii'tothrips aurantii);
[0067] 來自異翅目版teroptera)的，例如，奧蟲屬物種（Cimex spp.)、狄盲曝 (Distantiella theobroma)、棉紅曝屬物種 Oysdercus spp.)、Euchis化SSPP?、扁盾曝屬 物種巧urygaster spp.)、稻緣曝屬物種(Xeptocorisa spp.)、綠曝屬物種（Nezara spp.)、 皮曝屬物種巧iesma spp.)、紅獵曝屬物種（Rhodnius spp.)、可可褐盲曝（Satdbergella singularis)、黑曝屬物種（Scotinophara spp.)、錐獵曝屬物種（Triatoma spp.)、盲曝 科物種（Miridae family spp.)，例如豆芙草盲曝（Lygus hesperus)和美洲牧草盲曝 (Lygus Iineoloris)、長曝科物種（Xygaeidae family spp.)例如美洲谷桿長曝化 Iissus Ieucopterus)和曝科物種巧entatomidae family spp.);
[0068] 來自同翅目（Homoptera)的，例如，棉粉動（Aleurothrixusfloccosus)、萊粉動 (Aleyrodes brassicae)、腎圓盾階屬物種（Aonidiella spp.)、財科（Aphididae)、財屬物 種（Aphis spp.)、圓盾階屬物種（Aspidio化S spp.)、甘墓粉動化emisia tabaci)、蠟階 屬物種（Ceroplaster spp.)、Qiiysomphalus aonidium、網(wǎng)巧草葉圓階（Qiirsomphalus dictyosperm;L)、褐軟蠟階（Coccus hesperidum)、綠小葉婢屬物種（Empoasca spp.)、 Eriosoma larigerum、斑葉蟲單屬物種（Erythroneura spp. )、Gascardia spp.、灰飛動 屬物種（Xaodelphax spp. )、Lacanium corni、蟲厲盾階屬物種（Xepidosaphes spp.)、 Macrosiphus spp.、瘤財屬物種（Myzus spp. )、Nehotettix spp.、褐飛動屬物種 (Nilaparvata spp. )、Paratoria spp.、瘦綿財屬物種（Pemphigus, spp)、臀紋粉階 屬物種（Planococcus spp.)、白盾階屬物種（[Pseudaulacaspis spp.)、粉階屬物種 (Pseudococcus spp.)、木動屬物種（psylla ssp. )、Pulvinaria aethiopica、笠圓盾階 屬物種（Quadraspidiotus spp.)、鑑管財屬物種（Rhopalosiphum spp.)、珠蠟階屬物 種（Saissetia spp.)、帶葉蟲單屬物種（Scaphoideus spp.)、二叉財屬物種（Schizaphis spp.)、谷網(wǎng)財屬物種（Sitobion spp.)、溫室粉動（Trialeurodes vaporariorum)、非洲木 動（Trioza eiytreae)和矢尖階（Unaspis citri);
[0069] 來自膜翅目（Hymenoptera)的，例如Acromyrmex、美切葉蟻屬物種（Atta spp.)、 麥莖蜂屬物種（Cephus spp.)、松葉蜂屬物種Oiprion spp.)、松葉蜂科Oiprionidae)、 Gilpinia polytoma、李實蜂屬物種（Hoplocampa spp.)、毛蟻屬物種(Xasius sppp.)、小家 蟻（Monomorium pharaonis)、新松葉蜂屬物種（Neodiprion spp)、火蟻屬物種（Solenopsis spp.)和胡蜂屬物種（Vespa ssp.);
[0070] 來自雙翅目（Diptera)的，例如，伊蚊屬物種（Aedes spp. )、An^erigona soccata、全北毛蟻化；Lbio hoi'tulanus)、紅頭麗M (Calliphora eiythroc邱hala)、蠟實 蟲畢屬物種（Ceratitis spp.)、金蟲畢屬物種（Chiysomyia spp.)、庫蚊屬物種（Culex spp.)、 黃蟲畢屬物種（Cuterebra spp.)、寡鬚實蟲畢屬物種Oacus spp.)、黑尾果蟲畢Orosophila melanogaster)、廁蟲畢屬物種^annia spp.)、胃蟲畢屬物種（Gastrophilus spp.)、舌蟲畢屬 物種（Glossina spp.)、牛禍屬物種（Hypoderma spp.)、Hyppobosca spp.、斑潛禍屬物種 (Liriomysa spp.)、綠禍屬物種（Lucilia spp.)、黑潛禍屬物種（Melanagromyza spp.)、 家蟲電屬物種（Musca ssp.)、狂禍屬物種（Oestrus spp.)、Orseolia spp.、歐洲麥桿蟲電 (Oscinella frit)、天仙子泉禍任egomyia hyoscyami)、草種禍屬物種（Phorbia spp.)、 蘋繞實禍巧hagoletis pomonella)、覃蚊屬物種（Sciara spp.)、廢禍屬物種（Stomo;sys spp.)、化蟲屬物種（T油anus spp.)、Tannia spp.和大蚊屬物種（Tipula spp.);
[00川來自圣目（Si地onaptera)的，例如角葉圣屬物種（Ceratophyllus spp.)和鼠疫 圣狂enopsylla cheopis)擬及
[0072] 來自 t嬰尾目（Hiysanura)的，例如衣魚（X巧isma saccharina)。
[0073] 單子葉植物（monocotyledonous plant,英文也作monocot)是開花植物，其具有 含一片子葉的胚，平行葉脈，花的各部分為3的倍數(shù)。單子葉植物的實例包括但不限于：草 坪草、玉米、稻、燕麥、小麥、大麥、高梁、紅n蘭、鸞尾、百合、蔥和蹤擱。
[0074] 有害生物或祀有害生物是指：昆蟲、蜘蛛類、甲殼類、真菌、細菌、病毒、線蟲、扁形 動物、蝴蟲、燒蟲、鉤蟲、緣蟲、錐蟲、血吸蟲、狂禍、跳圣、壁風(fēng)、峨和風(fēng)等，它們是人類環(huán)境中 遍布的。有害生物可攝入或接觸用雙鏈基因遏制劑轉(zhuǎn)化的植物產(chǎn)生的一種或多種細胞、組 織或產(chǎn)物，W及用雙鏈基因遏制劑處理過的材料或表面。
[00巧]線蟲或蝴蟲是最常見的動物口之一，其具有超過20, 000種不同的已知物種（超過 15, 000種是寄生的）。它們在淡水、海洋和陸地環(huán)境中普遍存在，在該些環(huán)境中，它們在個 體數(shù)量和物種數(shù)量上通常都超過其它動物，在遠至南極和海溝的地方都能發(fā)現(xiàn)它們。此外， 有大量的寄生形式，包括大多數(shù)植物和動物中的病原體。
[0076] 特別感興趣的線蟲有害生物包括，例如犬鉤口線蟲（A.caninum)、錫蘭鉤口線蟲 (A. Ce}dancium)、搶轉(zhuǎn)血矛線蟲化.Conto;rtus)、奧斯特線蟲（0. Ostertagi)、漂亮新小桿 線蟲（C. eIegans)、C. briggsae、P. pacificus、糞類圓線蟲（S. Stercoralis)、鼠類圓線蟲 (S. Ratti)、P. trichosuri、花生根結(jié)線蟲（M. Arenaria)、奇氏根結(jié)線蟲（M. Qiitwoodi)、 北方根結(jié)線蟲（M. Hapla)、南方根結(jié)線蟲（M. Incognita)、爪哇根結(jié)線蟲（M. Javanica)、 M.paraensis、馬鈴墓金線蟲（G. Rostochiensis)、馬鈴墓白線蟲（G. Pallida)、大豆胞囊 線蟲化Glycines)、甜菜胞囊線蟲化Schattii)、穿刺短體線蟲化化netrans)、傷殘短 體線蟲（P.^lnus)、香蕉穿孔線蟲化.SimiIis)、Z. punctata、豬蝴蟲（A. Suum)、犬弓蟲回 蟲（T. Canis)、馬來絲蟲化Mala}d)、犬惡絲蟲值.Immitis)、旋盤尾絲蟲（0. Volvulus)、 狐毛首線蟲化化Ipis)、旋毛線蟲化Spiralis)、標準劍線蟲狂.Index)、十二指腸鉤 口線蟲（A. Duodenale)、人蝴蟲（A. Lumbricoides) W及來自下述屬的物種：滑刃線蟲 屬（Aphelenchoides)、珍珠線蟲屬（化。〇化113)、莖線蟲屬值it}denchus)、長針線蟲屬 (Longidorus)、毛刺線蟲屬（Trichodorus)和傘滑刃線蟲屬炬ursaphelenchus)。
[0077] 正常細胞是指未轉(zhuǎn)化表型的細胞或表現(xiàn)出待檢測組織類型的未轉(zhuǎn)化細胞形態(tài)的 細胞。
[0078] 有效地連接；將兩個或多個分子W下述方式組合起來，所述方式使得在組合中它 們可W在細胞中正確發(fā)揮功能。例如，當(dāng)啟動子能控制結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄時，啟動子就是與結(jié) 構(gòu)基因有效地連接的。
[0079] 直向同源物是通過來自共同祖先的垂直演化相關(guān)的基因，它們編碼在不同物種中 具有相同功能的蛋白質(zhì)。由于它們在物種形成事件后分離，因此，直向同源物可能有所差 異，但是通常具有序列和結(jié)構(gòu)水平上的相似性。源自共同祖先并且編碼具有相似功能的蛋 白質(zhì)的兩個基因被稱為直向同源物。對直向同源物的鑒定對于可靠預(yù)測新測序基因組中基 因的功能來說是關(guān)鍵的。
[0080] "有害生物控制劑"或"基因遏制劑"指包含第一 RNA片斷和第二RNA片斷的特定 RNA分子，其中，第一和第二RNA片斷之間的互補性導(dǎo)致兩條片斷能在體內(nèi)和體外雜交，形 成雙鏈分子。通常，其優(yōu)選可W包括連接和穩(wěn)定第一和第二序列的第H RNA片斷，從而可 形成莖，其中通過第H片段將第一和第二片段的各一端連接在一起W形成環(huán)，從而整個結(jié) 構(gòu)形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)，甚至更緊密地雜交結(jié)構(gòu)可形成莖環(huán)有結(jié)（stem-loop knotted)結(jié)構(gòu)?；?者，可在沒有第H片斷的情況下形成對稱發(fā)夾，其中，沒有設(shè)計的環(huán)，但是就立體理由來說， 當(dāng)莖足夠長到能穩(wěn)定自身的時候，發(fā)夾將產(chǎn)生其自身的環(huán)。通常，第一和第二RNA片斷將處 于RNA分子的長度內(nèi)，是各自的充分倒置重復(fù)序列，并通過第H RNA片斷連到一起。對于在 被dsRNA分子的攝入所遏制的祀昆蟲有害生物中從祀基因轉(zhuǎn)錄來的祀RNA而言，第一和第 二片斷總是（并非分別）對應(yīng)于所述祀RNA的正義和反義序列。
[0081] 有害生物控制劑還可W是經(jīng)充分純化（或分離）的核酸分子，更具體地，來自基因 組DNA (曲NA)或CDNA文庫的核酸分子或其核酸片段分子?；蛘?，片段可包含具有大約15 至大約250個核巧酸殘基（更優(yōu)選地，大約15至大約30個核巧酸殘基）的更小的寡核巧 酸。
[0082] 殺蟲劑指意欲用來防止、破壞、擊退或減輕任何有害生物的任何物質(zhì)或物質(zhì)的混 合物。殺蟲劑可W是化學(xué)物質(zhì)或生物劑，其用于抵抗與人類競爭食物、破壞財產(chǎn)、傳播疾病 或令人討厭的有害生物，包括昆蟲、病原體、雜草、線蟲和微生物。
[0083] 表型是生物的區(qū)別特性或特征，可根據(jù)本發(fā)明通過將一種或多種"想要的多核巧 酸"和/或可篩選/選擇標記整合進經(jīng)轉(zhuǎn)化生物的至少一個細胞來對其加W改變。"想要的 多核巧酸"和/或標記可通過對經(jīng)轉(zhuǎn)化細胞或整個生物的大量遺傳、分子、生物化學(xué)、生理或 形態(tài)特征或?qū)傩灾械娜魏我环N加W修飾，向經(jīng)轉(zhuǎn)化的生物表型賦予變化。
[0084] 植物和植物組織；"植物"是植物界的多種光合、真核、多細胞生物中的任何生物， 其特征性地產(chǎn)生胚，含有葉綠體并且具有纖維素細胞壁?？筛鶕?jù)本發(fā)明的方法，對植物的 一部分，即"植物組織"加W處理，W預(yù)防植物或植物部分上的有害生物侵襲?？筛鶕?jù)本發(fā) 明，來處理很多合適的植物組織，其包括但不限于；體細胞胚、花粉、葉、莖、愈傷組織、甸旬 莖、微塊莖（micro化bers)和枝條。因此，本發(fā)明預(yù)想對被子植物和裸子植物的處理，所述 植物例如，金合歡、首薦、蘋果、杏、朝鮮葫、白蠟樹、天口冬、鱷梨、香蕉、大麥、菜豆、甜菜、禪 木、山毛棒、黑霉、藍霉、挪菜、抱子甘藍、甘藍、卡諾拉油菜、甜瓜、胡蘿K木墓、花挪菜、雪 松、谷類、芹菜、栗、禮、大白菜、冊喬、克萊n氏小枯橘、立葉草、咖啡、谷物、棉、班豆、黃瓜、 柏木、茄子、偷、宦賣菜、按樹、茵香、無花果、冷杉、老鶴草、葡萄、葡萄抽、落花生、酸漿、橡膠 鐵杉、山核桃、羽衣甘藍、縣猴桃、孽藍、落葉松、窩宦、韭蔥、削i、來樣、洋槐、松、鐵線藤、玉 米、芒果、械樹、瓜、泰、磨茹、白芥、堅果、橡樹、燕麥、秋葵、蔥、枯、觀賞植物或花或樹、番木 瓜、蹤擱、歐芹、歐洲防風(fēng)草、魏豆、桃、花生、梨、沼澤植物、胡椒、柿樹、木豆、松、鳳梨、車前 草、李、石惱、馬鈴墓、西葫蘆、菊宦、蘿K油菜、息鉤子、稻、黑麥、高梁、柳樹、大豆、玻菜、云 杉、南瓜、草霉、糖蘿K甘藏、向日葵、甘墓、甜玉米、紅枯、茶、煙草、番茄、樹、黑小麥、草坪 草、憲青、蔓生植物、核桃、豆瓣菜、西瓜、小麥、墓葫、紅豆杉和夏南瓜。
[0085] 根據(jù)本發(fā)明，"植物組織"還包括植物細胞。植物細胞包括息浮培養(yǎng)物、脫腑體、胚、 分生組織區(qū)域、愈傷組織、葉、根、枝條、配子體、抱子體、花粉、種子和小抱子。植物組織可W 是多種成熟期的，其可生長于液體或固體培養(yǎng)物中，或者生長于罐、溫室或田間的±壤或適 當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基中。植物組織還可指此類植物、種子、子代、繁殖體（無論有性還是無性產(chǎn)生的） W及任何該些的后續(xù)傳代物（descendent)(例如插條或種子）的任何克隆。
[0086] 啟動子意欲表示與RNA聚合酶和/或其它轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件結(jié)合的核酸，優(yōu)選地，DNA。 和任何啟動子一樣，本發(fā)明的啟動子將協(xié)助或控制DNA或RNA的轉(zhuǎn)錄，W從與所述啟動子有 效地連接的核酸分子產(chǎn)生mRNA分子。如前文所述，產(chǎn)生的RNA可編碼蛋白質(zhì)或多膚，或者 編碼RNA干擾或反義分子。
[0087] 多核巧酸是該樣的核巧酸序列，其包含基因編碼序列或其片段、啟動子、內(nèi)含子、 增強子區(qū)域、聚腺巧酸化位點、翻譯起始位點、5'或3'非翻譯區(qū)域、報道基因、可選擇標記 等。多核巧酸可包含單鏈或雙鏈DNA或RNA。多核巧酸可包含經(jīng)修飾的堿基或經(jīng)修飾的主 鏈。多核巧酸可W是基因組、RNA轉(zhuǎn)錄本（例如mRNA)或經(jīng)加工的核巧酸序列（例如cDNA)。 多核巧酸可包含正義或反義方向的序列。
[0088] 經(jīng)分離的多核巧酸是并非處于其天然狀態(tài)的多核巧酸序列，例如，所述多核巧酸 包含并非在自然界中發(fā)現(xiàn)的核巧酸序列，或者所述多核巧酸與其通常接近的核巧酸序列分 開，或者所述多核巧酸與其通常不接近的核巧酸序列相鄰。
[0089] 重組核巧酸序列指該樣的核酸分子，其含有通過誘變、限制性酶等進行的操作產(chǎn) 生的遺傳工程修飾。
[0090] RNA干擾（RNAU指通過短干擾RNA(SiRNA)介導(dǎo)的、對基因表達（蛋白質(zhì)合成）的 序列特異性或基因特異性遏制。
[0091] 序列同一性；在本文中使用時，在提到兩條核酸序列的上下文中，"序列同一性"或 "同一性"包括指；當(dāng)在特定區(qū)域上為最大程度對應(yīng)而比對時兩條序列中相同的殘基。
[0092] 在本文中使用時，序列同一性百分比表示；通過在比較窗口上比較兩條最優(yōu)比對 的序列所確定的值，其中，為了對兩條序列進行最優(yōu)比對，比較窗口中多核巧酸序列的部分 較之對照序列（不包含添加或缺失）而言可包含添加或缺失（即，空位）。通過下述方法來 計算百分比：測定在兩條序列中出現(xiàn)相同核酸堿基的位置數(shù)量，W產(chǎn)生匹配的位置，用所述 匹配位置數(shù)除W比較窗口中的位置總數(shù)，并將結(jié)果乘W 100,產(chǎn)生序列同一性百分比。
[0093] "序列同一性"具有本領(lǐng)域認可的含義，可使用公開的技術(shù)來計算。見 COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY, Lesk,編著（Oxford 化iversity Press,1988)、 BIOCOMPUTING JNFORMATICS AND GENOME PRCUECTS， Smith,編著（Academic Press, 1993)、COMPUT邸 ANALYSIS OF 沈卵ENCE DATA,部分 LGriffin&Griffin，編著，（Humana Press, 1994)、沈卵ENCE ANALYSIS IN MOLECULAR BIOLOGY, Von Heinje 編著，Academic Press (1987)、SEQ 肥 NCE ANALYSIS PRIMER, Gr 化 skov&Devereux，編著.（Macmillan Stockton Press, 1991)和 Carill〇(&Lipton，SIAM J.Applied Math.48:1073(1988)。通 常用來測定兩條序列間同一性或相似性的方法包括但不限于GUIDE TO HUGE COMPUT邸S， Bishop,編著，（Academic Press，1994)和上文 Carill〇(&Lipton 中公開的。用于測定同 一性和相似性的方法被編碼為計算機程序。用于測定兩條序列間同一性和相似性的優(yōu) 選計算機程序方法包括但不限于GCG程序包值evereux等人，Nucleic Acids Research 12 :387 (1984))、BLASTP、BLASTN、FASTA (Atschul 等人。J. Mol. Biol. 215 :403(1990))和 FASTDB 炬rutlag 等人，Comp. App. Biosci. 6 :237 (1990)) O
[0094] 短發(fā)夾RNA(ShRNA)是該樣的短單鏈RNA，其具有高度二級結(jié)構(gòu)，使得RNA鏈的一部 分可形成發(fā)夾環(huán)。
[0095] 短干擾RNA (SiRNA)指大約10至大約30個核巧酸長的雙鏈RNA分子，其具有特異 性干擾基因蛋白質(zhì)表達的能力并由此得名。
[0096] 祀序列指有害生物中被選來通過雙鏈RNA技術(shù)遏制或抑制的核巧酸序列。祀序列 編碼有害生物中重要的特性或生物學(xué)活性。
[0097] 轉(zhuǎn)錄終止子；通常，本發(fā)明的表達DNA構(gòu)建體具有轉(zhuǎn)錄終止區(qū)域，其位于轉(zhuǎn)錄起始 調(diào)控區(qū)域的反向端?？删蚼RNA的穩(wěn)定性（W增強表達）和/或就加到基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物上的 聚腺巧酸化尾的添加，來選擇轉(zhuǎn)錄終止區(qū)域。當(dāng)H鏈終止密碼子中的任何一個進入核糖體 上的A位點時，剛產(chǎn)生的多膚的翻譯就終止了。翻譯終止密碼子是UAA、UAG和UGA。
[0098] 轉(zhuǎn)化；通過其將核酸穩(wěn)定插入進生物基因組的工藝?？墒褂帽绢I(lǐng)域公知的多種方 法，在天然或人工條件下進行轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化可能依賴于用于將核酸序列插入原核或真核宿主 細胞的任何已知方法，其包括；微生物介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化、病毒感染、whiskers、電穿孔、顯微注射、 聚己二醇處理、熱激、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染和粒子轟擊。
[0099] 轉(zhuǎn)基因生物包含至少一個其中已穩(wěn)定整合了外源核酸的細胞。根據(jù)本發(fā)明 的轉(zhuǎn)基因生物例如是細菌或真核（例如酵母）宿主細胞或宿主生物。細菌可W選自 革蘭氏陰性和革蘭氏陽性細菌，例如但不限于埃希氏菌屬物種巧SChericMa SPP.) (例如大腸桿菌巧.coli))、芽抱桿菌屬物種炬acillus spp.)(例如蘇云金芽抱桿菌 (B.thuringiensis))、根瘤菌屬物種（Miizobium spp.)、乳桿菌屬物種（Lactobacilllus spp.)、乳球菌屬物種（Lactococ州S spp.)等。酵母可W選自酵母屬物種（Saccharomyces spp.)O
[0100] 變體：在本文中使用時，"變體"應(yīng)當(dāng)被理解為表示與特定基因或蛋白質(zhì)的標準 或給定核巧酸或氨基酸序列有所不同的核巧酸序列。術(shù)語"同等型（iso化rm)"、"同種型 (isotype)"和"類似物"也表示核巧酸序列的"變體"形式。"變體"還可指"經(jīng)改組的基 因"，例如Maxygen名下的專利中描述的。
[0101] 應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明并不限于本文描述的特定方法、方案、載體和試劑等，該些都可 W變化。還應(yīng)當(dāng)理解，本文所用的術(shù)語僅用于描述特定實施方案的目的，而非意欲限制本發(fā) 明的范圍。應(yīng)當(dāng)注意，除非上下文明確另外指示，在本文和所附權(quán)利要求中使用時，單數(shù)形 式"一個/ 一種"和"該個/該種"（"a"、"an"和"the")包括復(fù)數(shù)。因此，例如，提到"一 種基因/基因"時也表示一種或多種基因，并且包括本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其等同物等。
[0102] I.祀有害生物
[0103] 本發(fā)明提供了控制有害生物侵襲的方法和構(gòu)建體，該是通過向有害生物施用（或 暴露于）祀編碼序列來實現(xiàn)的，所述序列能對有害生物中必要的生物學(xué)功能加W轉(zhuǎn)錄后阻 遏或抑制。在本文中使用時，術(shù)語"有害生物"指昆蟲、蜘蛛類、甲殼類、真菌、細菌、病毒、線 蟲、扁形動物、蝴蟲、燒蟲、鉤蟲、緣蟲、錐蟲、血吸蟲、狂禍、跳圣、壁風(fēng)、峨和風(fēng)等，其是人環(huán) 境中普遍存在的。有害生物可攝入或接觸用雙鏈基因遏制劑轉(zhuǎn)化的生物產(chǎn)生的一種或多種 細胞、組織或產(chǎn)物，W及用雙鏈基因遏制劑處理過的表面或材料。
[0104] "有害生物抗性"性狀是使得宿主對有害生物攻擊（通常，造成宿主的損傷）有抗 性的轉(zhuǎn)基因宿主的特征。此類有害生物抗性可W是天然突變導(dǎo)致的，或者，更通常是賦予有 害生物抗性的重組DNA的慘入導(dǎo)致的。為向轉(zhuǎn)基因宿主給予有害生物抗性，可W例如將重 組DNA轉(zhuǎn)錄為RNA分子，其在重組宿主的組織或液體中形成dsRNA分子。所述dsRNA分子 部分地由RNA片段組成，所述RNA片段與喜好在重組宿主上進食的有害生物中DNA序列編 碼的相應(yīng)RNA片斷相同。祀有害生物中的基因表達被所述dsRNA遏制，并且對祀有害生物 中基因表達的遏制導(dǎo)致宿主對有害生物具有抗性。
[0105] 合適的有害生物包括導(dǎo)致對另一生物的損傷的任何生物。本發(fā)明特別包括昆蟲、 線蟲和真菌有害生物。
[0106] 在本文中使用時，昆蟲可W是任何昆蟲，該表示屬于動物界的任何生物，更具 體地，屬于節(jié)肢動物口（Arthropoda)任何生物、W及屬于昆蟲綱（Insecta)或蛛形綱 (Arachnida)的任何生物。本發(fā)明的方法可應(yīng)用于所有昆蟲，所述昆蟲對于RNA干擾導(dǎo)致的 基因沉默來說是易感的，并且能使得雙鏈RNA從它們的直接環(huán)境被內(nèi)在化。
[0107] 在本發(fā)明的一種實施方案中，昆蟲可W屬于下述的目：峨目（Acari)、蜘蛛 目（Araneae)、風(fēng)目（Anoplura)、銷翅目（Coleoptera)、彈尾目（Collembola)、革翅目 (Dermaptera)、網(wǎng)翅目值ictyoptera)、雙尾目值iplura)、雙翅目值iptera)、紡足目 (Embioptera)、蜂雌目巧地emeroptera)、型噓目（G巧Iloblatodea)、半翅目化emiptera)、 同翅目化omoptera)、膜翅目（Hymenoptera)、等翅目（Isoptera)、鱗翅目（Lepidoptera)、 食毛目（Mallophaga)、長翅目（Mecoptera)、脈翅目（Neuroptera)、蛹艇目（Odonata)、直翅 目（Orthoptera)、竹節(jié)蟲目（F*hasmida)、橫翅目（Plecoptera)、原尾目（Pro1:ura)、曬蟲目 (Psocoptera)、圣目（Si地onaptera)、風(fēng)目（Si地unculata)、製尾目（Hiysanura)、搶翅目 (Strepsiptera)、製翅目（Hiysanoptera)、毛翅目（Trichoptera)和缺翅目狂oraptera)。 [010引在本發(fā)明的優(yōu)選但非限制性的實施方案和方法中，昆蟲選自
[0109] (1)是植物有害生物的昆蟲，其例如但不限于；褐飛風(fēng)屬物種（Nilaparvata spp.)(例如褐飛風(fēng)（N. Lugens)(褐稻風(fēng)））；灰飛風(fēng)屬物種（Laodelphax spp.)(例如灰飛 風(fēng)（L. Striatellus)(灰飛風(fēng)））；黑尾葉蠟屬物種（Nephotettix spp.)(例如二點黑尾葉蠟 (N. Virescens)或黑尾葉蠟（N. Cincticeps)(青葉蠟）或二條黑尾葉蠟（N.nigropic1:us) (稻葉蠟））；白背飛風(fēng)屬物種（Sogatella spp.)(例如白背飛風(fēng)（^SJurciferaH白背飛 風(fēng)））；桿長賠屬物種炬Iissus spp.)(例如美洲谷桿長賠炬.Ieucopterus Ieucopterus) (美洲谷桿長賠））；黑賠屬物種（Scotino地ora spp.)(例如S. vermi化late (稻黑賠））； 綠賠屬物種（Acrosternum spp.)(例如擬綠賠A. hi Iare (擬綠賠））；稻弄蝶屬物種 (Parnara spp.)(例如直紋稻弄蝶化Guttata)(直紋稻弄蝶））；禾草頓屬物種煙Iilo spp.)(例如二化頓（C. Suppressalis)(稻二化頓（rice striped stem borer))、臺灣稻 頓（C.Auricilius)(金線二化頓（gold-fringed stem borer))或 C.polyc虹ysus(黑 頭二化頓（dark-headed stem bored))) ;Qiilotraea spp.(例如 C.polyc虹ysa(水 稻蛙也蟲（rice sta化borer)));蛙莖夜蛾屬物種（Sesamia spp.)(例如稻蛙莖夜 蛾化Inferens)(大頓））；蛙禾頓屬物種（TiTpoiTza spp.)(例如T. innotata (白稻 H化頓（white rice borer))或H化頓（T. IncertulasH H化頓））；縱卷葉野頓屬 物種（Giaphalocrocis spp.)(例如稻縱卷葉野頓（C.Medinalis)(稻縱卷葉野頓））； 潛蟲電屬物種（Agromyza spp.)(例如日本稻潛禍（A. Oryzae)(日本稻潛禍）或美洲泰 潛葉禍（A. Parvicornis)(潛葉禍））；桿草頓屬物種值iatraea spp.)(例如小藏頓 值.Saccharalis)(小藏頓）或西南玉米桿草頓化Grandiosella)(玉米桿草頓））；頓嶺 夜蛾屬物種（Narnaga spp.)(例如N. aenescens(稻頓嶺））；黃夜蛾屬物種狂anthodes SPP.)(例如舉紋黃夜蛾化Transversa)(舉紋黃夜蛾））；灰翅夜蛾屬物種（Spodoptera spp.)(例如草地貪夜蛾化化Ugiperda)(秋天行軍蟲）、甜菜夜蛾（S. Exigua)(甜菜夜 蛾）、灰翅夜蛾僅Littoralis)(月斑虎甲（climbing州tworm))或S.praefica(西部黃 條行軍蟲（western yellowstriped armyworm)));秘夜蛾屬物種（Mythi皿a spp.)(例如 粘蟲（Mythmna(Pseudaletia) seperata(行軍蟲））；鈴夜蛾屬物種化elicove巧a spp.) (例如谷實夜蛾化.Zea)(棉鈴蟲（corn earworm)));肖葉甲屬物種（Colaspis spp.) (例如C. brunnea(葡萄肖葉甲））；稻水象屬物種（Lissorhoptrus spp.)(例如稻水象甲 (L. Oryzophilus)(稻水象甲））；稻象屬物種巧chinocnemus spp.)(例如稻象巧.Squamos) (稻象））；Diclodispa spp.(例如D. armigera(稻鐵甲））；禾谷負泥蟲屬物種（Oulema spp.)(例如水稻負泥蟲化化yzae)(葉甲）；米象屬物種（Sitophilus spp.)(例如米 象化化yzae)(稻象蟲））；瘦蚊屬物種（Pachydiplosis spp.)(例如稻瘦蚊化化yzae) (稻瘦蚊））；水禍屬物種（Hy化ellia spp.)(例如麥葉毛眼水禍化Griseola)(大麥 水蟲電）或日稻毛眼水禍化.Sasakii)(稻桿潛禍（rice stem maggot)));黃潛禍屬物種 (Chlorops spp.)(例如稻黃潛禍（C. Oryzae)(桿禍））；桿野頓屬物種（Ostrinia spp.) (例如玉米頓化Nubilalis)(歐洲玉米鉆也蟲））；地虎屬（Agrotis spp.)(例如小地老虎 (A.ipsilon)(小地老虎））；Elasmopalpus spp.(例如南美玉米苗斑頓化 Lignosellus) (小玉米莖蛙蟲（lesser cornsta化borer)));梳爪叩頭蟲屬物種（Melanotus spp.) (金針蟲）；圓頭犀金龜屬物種（Cycloce地ala spp.)(例如C. borealis (北方假面金龜 子（northern masked chafer))，或 C. immaculata(南方假面金龜子（southern masked chafer)));弧麗金龜屬物種（Popillia spp.)(例如日本弧麗金龜（P. Japonica)(日本 弧麗金龜））；跳甲屬物種（化aetocnema spp.)(例如玉米銅色跳甲（C. Pulicaria)(玉米 銅色跳甲））；龍頸象屬物種（S地enophorus spp.)(例如玉米長瞭象化MaidisH玉米長 瞭象））；溢管閩屬物種煙iopalosi地um spp.)(例如玉米閩化MaidisH玉米閩））；圓 尾閩屬物種（Anuraphis spp.)(例如 A.maidiradicis (玉米根閩（corn root aphid))); 黑幢屬物種（Melanoplus spp.)(例如紅足黑幢（M.化murrubrum)(紅足黑幢）、特異黑幢 (M-Differentialis)(特異黑幢）或遷飛黑幢（M. Sanguinipes)(遷飛黑幢））；種禍屬物種 (Hylemya spp.)(例如灰地種禍化.Pla1:ura)(灰地種禍））；呆葫馬屬物種（Anaphotbips spp.)(例如黃呆葫馬（A. Obscrurus)(黃呆葫馬））；火蟻屬物種（Solenopsis spp.) (例如竊蟻僅Milesta)(盜竊蟻））；或葉峨屬物種（Tetranychus spp.)(例如二點葉 峨化化ticae)(二點葉峨）、朱砂葉峨化Cinn油arinus)(朱砂葉峨））；鈴夜蛾屬物 種化elicove巧a spp.)(例如谷實夜蛾化.Zea)(棉鈴蟲（cotton bollworm))，或棉鈴 蟲化 Armigera)(美洲棉鈴蟲））；Pectino地ora spp.(例如紅鈴麥蛾（P. Gossypiella) (棉花紅鈴蟲））；金剛鉆屬物種巧arias spp.)(例如翠紋金剛鉆化Vittella)(翠 紋金剛鉆））；實夜蛾屬物種化eliothis spp.)(例如煙芽夜蛾化.Virescens)(煙青 蟲））；花象屬物種（Anthonomus spp.)(例如墨西哥棉鈴象（A. Grandis)(棉子象鼻 蟲））；Pseudatomoscelis spp.(例如棉偽斑腿盲賠（P. SeriaUisH棉偽斑腿盲賠））；結(jié) 翅粉風(fēng)屬物種（Trialeurodes spp.)(例如結(jié)翅粉風(fēng)Cr.Abutiloneus)(結(jié)翅粉風(fēng)）、溫 室粉Il (T. Vaporariorum)(溫室粉風(fēng)））；小粉風(fēng)屬物種炬emisia spp.)(例如銀葉粉風(fēng) (B. Argentifolii)(銀葉粉風(fēng)））；閩屬物種（Aphis spp.)(例如棉閩（A. Gossypii)(棉 閩）、A.mellifera);草盲賠屬物種（Lygus spp.)(例如美國牧草盲賠（LLineolaris) (美國牧草盲賠）或豆芙草盲賠（L. Hesperus)(西牧草盲賠（western tarnished plant bug)));美洲賠屬物種巧uschiS化S spp.)(例如斑點美洲賠巧.conspersus)(斑點美 洲賠））；Qil〇roc虹oa spp.(例如賽氏賠（C. Sa}d)(賽氏賠））；綠賠屬物種（Nezara spp.)(例如稻綠賠（N. Viri化la)(稻綠賠））；葫馬屬物種（Thrips spp.)(例如蔥葫馬 (T. T油aci)(蔥葫馬（onion trips)));花葫馬屬物種（RranMiniella spp.)(例如煙褐葫 馬化化sea)(煙褐葫馬），或西方花葫馬（F. Occidentalis)(西方花葫馬））；馬鈴墓葉甲 屬物種（Leptinotarsa spp.)(例如馬鈴墓葉甲（LDecemlineata)(馬鈴墓葉甲）、偽馬 鈴墓葉甲（L.化ncta)(偽馬鈴墓葉甲）或L texana(泰克斯偽馬鈴墓葉甲（Texan false potato beetle)));合爪負泥蟲屬物種（Lema spp.)(例如H條負泥蟲（L. Trilineata) (H條負泥蟲））；跳甲屬物種巧pitrix spp.)(例如馬鈴墓跳甲化化cumeris)(馬鈴墓 跳甲）、煙草跳甲巧.Hirtipennis)(跳甲）或塊莖跳甲巧.Tuberis)(塊莖跳甲））；豆完 菁屬物種巧Picauta spp.)(例如北美豆完菁化Vittata)(北美豆完菁））；綠小葉蠟屬物 種（Empoasca spp.)(例如蠶豆小綠葉蠟巧.F油ae)(黑豆閩））；瘤閩屬物種（Myzus spp.) (例如桃閩（M. Persicae)(桃閩））；墓個木風(fēng)屬物種（Paratrioza spp.)(例如馬鈴墓木 風(fēng)（P. Cockerelli)(木風(fēng)））；單葉叩甲屬物種（Conoderus spp.)(例如C. falli (南方 馬鈴墓鐵線蟲（sou;rthe;rn potato wireworm))或叩頭甲（C. Vespe;rtinus)(煙草鐵線蟲 (tobacco wireworm))) ;Phthorimaea spp.(例如馬鈴墓麥蛾化 Operculella)(馬鈴墓 麥蛾））；長管閩屬物種（Macrosi地um spp.)(例如大戟長管閩（M. Euphorbiae)(馬鈴墓 蟲牙））；Thyanta spp.(例女口 T. pallidovirens (redshouldered stinkbug)) ；Phthorimaea spp.(例如馬鈴墓麥蛾化化erculella((馬鈴墓麥蛾））；鈴夜蛾屬物種化elicove巧a spp.)(例如谷實夜蛾化.Zea)(美洲柿鈴蟲（tomato fruitworm)) ;Keiferia spp.(例如番 茄蠢蛾Klycopersicella(番茄蠢蛾））；Limonius spp.(鐵線蟲（wireworm));天蛾屬物種 (Manduca spp.)(例如煙草天蛾（M. Sexta)(煙草天蛾），或番茄天蛾（M. Quinquemaculata) (番茄天蛾））；斑潛禍屬物種（Liriomyza spp.)(例如蔬菜斑潛禍（L. Sativae)、H 葉草斑潛禍（L. Trifolli)或南美斑潛禍（L. Huidobrensis)(斑潛禍））；果禍屬物種 值roso地ilia spp.)(例如黑尾果蟲電值.Melanogaster)、D. yakuba、D. pseudoobs州ra 或D. simulans);步甲屬物種（Car油US spp.)(例如粒步甲（C. granulatus));搖蚊屬物 種（Qiironomus spp.)(例如 C. tentanus);巧頭圣屬物種（Ctenoce地alides spp.)(例 如貓巧頭圣（C.Felis)(貓圣））；非耳瞭象屬物種值iaprepes spp.)(例如甘藏根頓蟲 (D. Abbrevia化S)(根象鼻蟲））；齒小蠢屬物種（Ips spp.)(例如美松齒小蠢（I. Pini)(美 松齒小蠢））；擬谷盜屬物種（Tribolium spp.)(例如赤擬谷盜化化Staneum)(赤擬谷 盜））；舌禍屬物種（Glossina spp.)(例如刺舌禍（G. MorsitansH采采禍））；按蚊屬物種 (Anopheles spp.)(例如岡比亞按蚊（A. Gambiae)(拒蚊））；鈴夜蛾屬物種化elicove巧a spp.)(例如棉鈴蟲化Armigera)(非洲棉鈴蟲））；無網(wǎng)長管財屬物種（Acyi'thosiphon spp.)(例如豆無網(wǎng)長管財（A. pisum) ( 5宛豆財））；蜜蜂屬物種（Apis spp.)(例如意大利 蜂（A. Melifera)(蜜蜂））；Homalodisca spp.(例如玻璃葉婢巧.coagulate)(玻璃翅葉 蟲單））；伊蚊屬物種（Aedes SPP.)(例如埃及伊蚊（Ae. Aegypti)(埃及伊蚊））；蠶蛾屬物種 化ombyx spp.)(例如家蠶化Mori)(家蠶）、野桑蠶化Mandarina));飛幢屬物種(Xocusta spp.)(例如飛幢（L Migratoria)(飛幢））；牛婢屬物種化oophilus spp.)(例如微小牛 婢化 Microplus)(具環(huán)牛婢））；A can化oscurria spp.(例如 A.gomesiana(紅毛褐鳥 蟲（red-haired chololate bird eater))) ;Diploptera spp.(例如 D. Punctata(太平洋 甲蟲蜂鄉(xiāng)（pacific beetle cockroach)));毒蝶屬物種（}feliconius spp.)(例如瓦氏袖 蝶巧.Erato)(紅型花蝶（red passion flower butterfly))或墨爾波蝶巧.Melpomene) (郵差蝶（postman butterfly)));象蟲屬物種（Curculio spp.)(例如歐洲棟象 (C.glandium)(橡實象甲（acorn weevil)));萊蛾屬物種（[Plutella spp.)(例如萊蛾 巧.Xylostella)(萊蛾（diamontback mo 化)））；純眼婢屬物種（Amblyomma spp.)(例如 彩飾純眼婢（A. Variegatum)(具環(huán)牛婢））；巧蠶屬物種（Anteraea spp.)(例如半目大蠶 蛾（A. Yamamai)(蠶蛾（silkmo化)））；Belgica spp.(例如南極百吉卡蚊化 Antartica))、 Bemisa spp.(例如 B. Tabaci)、Bicyclus spp.、Biphillus spp?、瘤背豆象屬物種 (Callosobruchus spp.)、色卷蛾屬物種（Qioristoneura spp.)、虎甲屬物種（Cicindela spp.)、庫蚊屬物種（Culex spp.)，庫朦屬（Culicoides spp.)、枯木動屬物種 Oiaphorina spp.)、非耳嗦象屬物種 Oiapr邱es spp. )、Euclidia spp.、舌蟲畢屬物種（Glossina spp.)、 幡蟲率屬物種（Gryllus spp.)、紋石蛾屬物種（Hydropsyche spp. )、±吉了屬物種CJulodis spp. )、Lonomia spp.、羅嶺屬物f中（Lutzomyia spp. )、Lysiphebus spp、Meladema spp、覃 甲屬物種（Mycetophagus spp.)、金小蜂屬物種（Nasonia spp.)、Oncometopia spp?、鳳 蝶屬物種（^apilio spp.)、動屬物種（[Pediculus spp.)、谷斑頓屬物種（；Plodia spp.)、 Rhynchosciara spp. ^Sphaerius spp.、聲蟲牙屬物牙中(Toxoptera spp.)、Trichoplusa spp.、 和阿蚊屬物種（Armigeres spp.)(例如騷擾阿蚊（A. Suba化別US));
[0110] (2)能侵襲或損傷人和/或動物的昆蟲，例如但不限于具有穿刺吸晚型口器的那 些，如半翅目和一些膜翅目和雙翅目中發(fā)現(xiàn)的，例如，蚊、蜂、黃蜂、動、圣和媽蟻，W及節(jié)肢 類的成員，例如壁動和觸，觸（Arcarina)(壁動和觸）目、綱或科的，例如代表性的科軟婢 科（Argasidae)、皮刺觸科 〇)ermanyssidae)、硬婢科（Ixodidae)、癢觸科巧soroptidae) 或巧觸科（Sarcoptidae) W及代表性的物種純眼婢屬屬物種（Amblyomma spp.)、暗眼婢 屬物種（Anocentor spp.)、銳緣婢屬物種（Argas spp.)、牛婢屬物種化oophilus spp.)、 姬馨觸屬物種間ieyletiel Ia spp.)、皮觸屬物種（Chorioptes spp.)、蠕形觸屬物種 (Demodex spp.)、革婢屬物種 〇)ermacentor spp.)、皮刺觸屬物種 〇)ermanyssus spp.)、 Haemophysalis spp.、璃眼婢屬物種（Hyalomma spp.)、硬婢屬物種（Ixodes spp.)、 Lynxacarus spp.、Mesostigmata spp.、耳觸屬物種（Notoedres spp.)、純緣婢屬物種 (OrniUhodoros spp.)、禽刺觸屬物種（OrniUhonyssus spp.)、耳壁動屬物種（Otobius spp.)、耳觸屬物種（otodectes spp.)、肺刺觸屬物種（[Pneumonyssus spp.)、癢觸屬物種 巧soroptes spp.)、扇頭婢屬物種（Rhipicephalus spp.)、巧觸屬物種（Sarcoptes spp.) 或恙觸屬物種（Trombicula spp.);動目（Anoplura)(吸晚和叮咬動），例如，代表性的 物種種牛羽風(fēng)屬物種炬ovicola spp.)、血風(fēng)屬物種化aematopinus spp.)、毛風(fēng)屬物種 (Linognathus spp.)、禽風(fēng)屬物種（Menopon spp.)、風(fēng)屬物種（Pedi州Ius spp.)、瘦綿閩 屬物種（Pemphigus spp.)、木風(fēng)屬物種（Phylloxera spp.)或盲風(fēng)屬物種（Solenopotes SPP.);雙翅目（禍），例如，代表性的物種伊蚊屬物種（Aedes SPP.)、按蚊屬物種 (Anopheles spp.)、麗禍屬物種（Calli地ora spp.)、金禍屬物種（Qiirsomyia spp.)、斑 化屬物種煙iiTsops spp.)、錐禍屬物種（Cochliomyia spp.)、庫蚊屬物種（Culex spp.)、 庫朦屬物種（化Iicoides spp.)、黃禍屬物種（Qiterebra spp.)、皮禍屬物種值ermatobia spp.)、胃禍屬物種（Gastrophilus spp.)、舌禍屬物種（Glossina spp.)、黑角禍屬物種 化aematobia spp.)、麻化屬物種化aematopota spp.)、風(fēng)禍屬物種化ippobosca spp.)、牛 蟲電屬物種（Hypoderma spp.)、綠禍屬物種（Lucilia spp.)、擾角禍物種（Lyperosia spp.)、 蠟蟲電屬物種（Melophagus spp.)、狂禍屬物種（Oestrus spp.)、綠禍屬（Phaenicia spp.)、 白嶺屬F*hlebotomus spp.、玻璃禍屬化ormiaspp.、麻禍屬物種（Sarco地aga spp.)、咖 屬物種（Simulium spp.)、廢禍屬物種（Stomo;sys spp.)、化蟲屬物種（Tabanus spp.)、 Tannia spp.或大蚊屬物種（Tipula spp.);食毛目（羽風(fēng)），例如，代表性的物種Damalina spp.、貓羽風(fēng)屬物種（Felicola spp.)、袋鼠風(fēng)屬物種化eterodoxus spp.)或曬毛風(fēng) 屬物種（Trichodectes SPP.);或圣目（無翅昆蟲），例如，代表性的物種角葉圣屬物種 (Ceratophyllus spp.)、spp.、圣屬物種（Pulex spp.)或客圣屬物種狂enopsylla spp); 莫蟲科（Cimicidae)(莫蟲（true bugs))，例如，代表性的種莫蟲屬物種（Cimex spp.)、 Tritominae spp.'Rhodinius spp.或錐獵賠屬物種（Triatoma spp);
[0111] W及
[011引 做導(dǎo)致不想看到的對基底或材料的損傷的昆蟲，例如，攻擊食物、種子、木材、畫、 塑料、布等的昆蟲。
[0113] 本發(fā)明的方法可應(yīng)用于所有線蟲，其對于RNA干擾導(dǎo)致的基因沉默來說是易感 的，并且能使得雙鏈RNA從它們的直接環(huán)境被內(nèi)在化。
[0114] 在本發(fā)明的一種實施方案中，線蟲可W屬于異皮科化eteroderidae)，包括胞囊線 蟲屬化eterodera)和球胞囊線蟲屬（Globodera)。
[0115] 在本發(fā)明的優(yōu)選但非限制性的實施方案和方法中，昆蟲選自下述組，該組包括但 不限于：
[0116] (1)是植物病原性線蟲的線蟲，例如但不限于：根結(jié)線蟲屬物種（Meloidogyne spp.)(例如南方根結(jié)線蟲（M. Incognita)、爪哇根結(jié)線蟲（M. Javanica)、禾草根結(jié)線蟲 (M. Graminicola)、花生根結(jié)線蟲（M. Arenaria)、奇氏根結(jié)線蟲（M. Qiitwoodi)、北方根結(jié) 線蟲（M. Hapla)或M. paranaensis);胞囊線蟲屬物種化eterodera spp.)(例如水稻胞囊 線蟲化oryzae)、大豆胞囊線蟲化Glycines)、玉米胞囊線蟲化.Zeae)或甜菜胞囊線蟲 化.Schachtii));球胞囊線蟲屬物種（Globodera spp.)(例如馬鈴墓白線蟲（G. Pallida) 或馬鈴墓金線蟲佑.Rostochiensis));腎形線蟲屬物種（Rotylenchulus spp.)(例如 腎形線蟲化Reniformis));短體線蟲屬物種（Pratylenchus spp.)(例如咖啡短體線蟲 (P. coffeae)、玉米短體線蟲（P. Zeae)或古迪短體線蟲（P. goodeyi));穿孔線蟲屬物種 (Rado地olus spp.)(例如香蕉穿孔線蟲化.Similis));潛根線蟲屬物種化irschmaniella spp.)(例如稻潛根線蟲化化yzae));鉤口線蟲屬物種（An巧Iostoma spp.)(例如犬鉤口 線蟲（A. caninum)、錫蘭鉤口線蟲（A. C巧lanicum)、十二指腸鉤口線蟲（A. Duodenale)或管 形鉤口線蟲（A. Tubaeforme));異尖（Anisakid);滑刃線蟲屬物種（Aphelenchoides spp.) (例如水稻干尖線蟲（A. Besseyi));貓蝴蟲（Ascarids);蝴蟲屬物種（Ascaris spp.)(例 如豬蝴蟲（A. Simm)或A. Iumbridoides);刺線蟲屬物種炬elonolaimus spp.);布魯絲蟲屬 物種炬rugia spp.)(例如馬來絲蟲化Malayi)或彭亨絲蟲炬.P址angi));傘滑刃線蟲屬 物種炬ursaphelenchus spp.);新桿狀線蟲屬物種（Caenorh油ditis spp.)(例如漂亮新 小桿線蟲（C. elegans)、C. briggsae 或 C. remanei);梭菌屬物種（Clostridium spp.)(例 如丙麗下醇梭菌（C. Acetobut^ixum));古柏線蟲屬物種（Cooperia spp.)(例如腫孔古柏 線蟲（C. Onco地ora));輪線蟲屬物種（Criconemoides spp.);杯口屬物種（切athostomum spp.)(例如碗狀杯 口線蟲（C. Catinatum)、冠狀杯 口線蟲（C. Corona1:um)或C. patera1:um); 杯環(huán)屬物種（切Iicocyclus spp.)(例如鮮明杯環(huán)線蟲（C. Insigne)、細頸杯環(huán)線蟲 (C. ^ssatus)或C. radiatus);杯冠屬物種（切Iicoste地anus spp.)(例如高氏杯冠線 蟲（C. Goldi)或長傘杯冠線蟲（C. Longibursa1:us));裂頭屬（Di地}dlobot虹ium);惡絲 蟲屬物種值irofilaria spp.)(例如犬惡絲蟲值.Immitis));莖線蟲屬物種值it^enchus spp.)(例如續(xù)斷雙墊刃線蟲值.Dipsaci)、馬鈴墓腐爛線蟲值.Destructor)或水稻莖線蟲 (D. Angustus));燒蟲屬物種巧nterobius spp.)(例如蠕形住腸燒蟲化Vermi州laris)); 血矛線蟲屬物種（化emonchus spp.)(例如搶轉(zhuǎn)血矛線蟲化Contortus));螺旋線蟲 屬物種化elicot}denchus spp.);紐帶線蟲屬物種（Hoplolaimuss卵.）；光絲蟲屬物種 (Litomosoides spp.)(例如棉鼠絲蟲（LSigmodontis));長針線蟲屬物種（Longidorus spp.)(例如大體長針線蟲（L. Macrosoma));板口線蟲屬物種（Necator spp.)(例如 美洲板口線蟲（N. Americanus));日本圓線蟲屬物種（Nippostrong5dus spp.)(例如 己西鉤蟲（N. Brasiliensis));盤尾絲蟲屬物種（Onchocerca spp.)(例如旋盤尾絲蟲 (0. Volvulus));胃線蟲屬物種（Ostertagia spp.)(例如奧斯特線蟲（0. Ostertagi)); Parastrongyloides spp.(例如 P.trichosuri);類毛刺線蟲屬物種（Paratrichodorus spp.)(例如較小類毛刺線蟲化Minor)或圓形類毛刺線蟲（P. Teres));擬馬鹿圓線蟲 屬物種（Parelaphostrong5dus spp.)(例如薄副鹿圓線蟲（P. Tenuis)) ;Rado地ulus spp.;盾線蟲屬物種（S州tellonerna. spp.);類圓線蟲屬物種（Strongyloides spp.) (例如鼠類圓線蟲化Ratti)或糞類圓線蟲僅Stercoralis));背帶線蟲屬物種 (Teladorsagia spp.)(例如 T.cir 州 mcincta);弓蟲回線蟲屬物種（Toxascaris spp.)(例 如獅弓蝴線蟲（T. Ieonina));弓蝴蟲屬物種（Toxocara spp.)(例如犬弓蝴蟲（T. Canis) 或貓弓蝴蟲（T. Cati);毛線蟲屬物種（Trichinella spp.)(例如T.britovi、旋毛線 蟲（T. Spiralis)或T.spirae);毛刺線蟲屬物種（Trichodorus spp.)(例如相似毛刺 線蟲（T.Similis));鞭蟲屬物種（Trichuris spp.)(例如鼠鞭蟲Cr.Muris)、狐毛首線 蟲化化1口13)或鞭形鞭蟲化Trichiura));小墊刃線蟲屬物種（Tylenchulus spp.); 矮化線蟲屬物種（T}dencho;rhynchus spp.);鉤蟲屬物種（Uncinaria spp.)(例如小頭 鉤蟲屬扣.Stenoce地ala));吳策線蟲屬物種（Wuchereria spp.)(例如班氏吳策線蟲 (W-Bancrofti));劍線蟲屬物種狂iphinema spp.)(例如標準劍線蟲（Xlndex)或美洲劍 線蟲狂.Americanum))。
[0117] (2)能侵襲人的線蟲，例如但不限于蠕形住腸線蟲巧nterobius vermi州laris)， 該是能導(dǎo)致燒蟲病的燒蟲；似引蝴線蟲（Ascaris lumbridoides)，導(dǎo)致蝴蟲病的大腸道 蟲回蟲；板口線蟲屬（Necator)和鉤口線蟲屬（Ancylostoma),兩種類型的鉤蟲，其導(dǎo)致鉤 蟲??；鞭形鞭蟲（Trichuris trichiura)，導(dǎo)致鞭蟲病的鞭蟲；導(dǎo)致類圓線蟲病的糞類圓 線蟲（Strongyloides stercoralis) ; W及導(dǎo)致旋毛蟲病的 Trichonella spirae;馬來絲 蟲炬rugia mala^)和班氏吳策線蟲（Wuchereria bancrofti),它們是與蟲感染（已知 有淋己性絲蟲病及其多種表現(xiàn)，象皮腫）相關(guān)的絲蟲線蟲，W及旋盤尾絲蟲的nchocerca volvulus),其導(dǎo)致盤尾絲蟲病。線蟲向人的轉(zhuǎn)移還可通過在受感染的動物或人上進食的食 血蚊蟲發(fā)生；
[om] 做能感染動物的線蟲，所述動物包括但不限于：狗（鉤蟲，例如犬鉤蟲 (Anc}dostoma caninum)或小頭鉤蟲屬（Uncinaria Stenocephala),蝴蟲，例如犬弓蟲回 線蟲（Toxocara canis)或獅弓蝴線蟲（Toxascaris Ieonina)或鞭蟲，例如狐毛首線 蟲（Trichuris vulpis))、貓（鉤蟲，例如管形鉤 口線蟲（Anc}dostoma tubaeforme),蟲回 蟲，例如貓弓蝴蟲（Toxocara cati))、魚（緋魚蟲或婚魚蟲，例如異尖（Anisakid),或緣 蟲，例如裂頭屬值吐的11〇13〇1:虹ium))、綿羊（金針蟲，例如搶轉(zhuǎn)血矛線蟲化aemonchus contortus))和牛（胃腸道蟲，例如，奧斯特線蟲（Ostertagia OStertagi)、腫孔古柏線蟲 (Cooperia oncophora))；
[0119] (4)導(dǎo)致不想看到的對基底或材料的損傷的線蟲，例如，攻擊食物、種子、木材、 畫、塑料、布等的線蟲。此類線蟲的例子包括但不限于根結(jié)線蟲屬物種（Meloidogyne spp.)(例如南方根結(jié)線蟲（M. Incognita)、爪哇根結(jié)線蟲（M. Javanica)、禾草根結(jié)線蟲 (M-Graminicola)、花生根結(jié)線蟲（M. Arenaria)、奇氏根結(jié)線蟲（M. Qiitwoodi)或北方根結(jié) 線蟲（M. Hapla));胞囊線蟲屬物種化eterodera spp.)(例如水稻胞囊線蟲化.cxryzae)、 大豆胞囊線蟲化Glycines)、玉米胞囊線蟲化.Zeae)或甜菜胞囊線蟲化.Schachtii)); 球胞囊線蟲屬物種佑Iobodera spp.)(例如馬鈴墓白線蟲佑.化Ilida)或馬鈴墓金 線蟲（G. Rostochiensis));莖線蟲屬物種值itylenchus spp.)(例如續(xù)斷雙墊刃線 蟲值.Dipsaci)、馬鈴墓腐爛線蟲值.Destructor)或水稻莖線蟲O. Angustus));刺 線蟲屬物種炬elonolaimus spp.);腎形線蟲屬物種（Rotylenchulus spp.)(例如腎 形線蟲化Reniformis));短體線蟲屬物種（Pratylenchus spp.)(例如咖啡短體線蟲 (P. coffeae)、古迪短體線蟲化goodeyi)或玉米短體線蟲（P. Zeae));穿孔線蟲屬物種 (Radopholus spp.)(例如香蕉穿孔線蟲巧.Similis));潛根線蟲屬物種化irschmaniella spp.)(例如稻潛根線蟲化Oryzae));滑刃線蟲屬物種（Aphelenchoides spp.) (例如水稻干尖線蟲（A. Besseyi));輪線蟲屬物種（化iconemoides spp.);長針線 蟲屬物種（Longidorus spp.);螺旋線蟲屬物種化elicot}denchus spp.);紐帶線 蟲屬物種化oplolaimus spp.);劍線蟲屬物種狂iphinema spp.);類毛刺線蟲屬物 種（Paratrichodorus spp.)(例如較小類毛刺線蟲化Minor));矮化線蟲屬物種 (Tylenchorhynchus spp.)；
[0120] (5)傳播病毒的線蟲（例如，大體長針線蟲（Longidorus macrosoma);傳播禮屬壞 死環(huán)斑病毒（prunus necrotic ring spot virus)，美洲會Ij線蟲（Xiphinema americanum): 傳播煙草環(huán)斑病毒（tobacco ring spot virus)，Paratrichadorus teres ;傳播魏豆早枯 病毒（pea early browning virus),或者相似毛刺線蟲（Trichodorus similis);傳播煙草 脆裂病毒（tobacco rattle virus))。
[0121] 特別感興趣的真菌有害生物包括但不限于下述這些。在本發(fā)明的一種實施方案 中，真菌可W是霉菌，或者更特別地，絲狀真菌。在本發(fā)明的其它一些實施方案中，真菌可W 是酵母。
[0122] 在一種實施方案中，真菌可W是子囊菌真菌，gp，屬于子囊菌（Ascomycota) 口的 真菌。
[0123] 在本發(fā)明的優(yōu)選但非限制性的實施方案中，真菌細胞選自：
[0124] (1)源自植物病原性真菌的細胞或植物病原性真菌細胞，其例如但不限于：小 枝頂抱屬物種（Acremoniella spp.)、鏈格抱屬物種（Alternaria spp.)(例如蕓苔 生鏈格抱（Alternaria brassicola)或索蘭尼（氏）鏈格抱（Alternaria solani))、 殼二抱屬物種（Ascochyta spp.)(例如魏豆殼二抱（Ascochyta pisi))、葡萄抱屬物 種化Otrytis spp.)(例如灰葡萄抱化Otrytis cinerea)或富克葡萄抱化Otryotinia fuckeliana))、枝抱屬物種（Cladosporium spp.)、尾抱屬物種（Cercospora spp.) (例如菊池尾抱（Cercospora kikuchii)或 Cercospora zaea-maydis)、枝抱屬物 種（Cladosporium spp.)(例如黃枝抱（Cladosporium fulvum))、刺盤抱屬物種 (Colletotrichum spp.)(例如豆刺盤抱（Colletotrichum Iindemu 化 ianum))、彎抱屬 物種（Curvularia spp.)、色二抱屬物種化iplodia spp.)(例如玉米色二抱Oiplodia maydis))、白粉菌屬物種（Erysiphe spp.)(例女口 Erysiphe graminis f. sp. graminis、大 麥白粉菌（Erysiphe graminis f. sp. hordei)或邑宛豆白粉菌（Erysiphe pisi) )、Erwinia armylovora、鑲抱屬物種（F'usarium spp.)(例如雪腐鑲抱（F'usarium nivale)、擬分 支抱鑲抱（Fusarium sporotrichioides)、尖鑲抱（Fusarium oxysporum)、禾本科鑲抱 (Fusarium graminearum)、Fusarium germinearum、大刀窄廉抱（Fusarium cuImorum)、腐 皮鑲抱（Fusarium solani)、串珠鑲抱（Fusarium moniliforme)或粉紅鑲抱（Fusarium roseum))、頂囊殼屬物種（Gaeumanomyces spp.)(例如小麥禾頂囊殼（Gaeumanomyces graminis f. sp. tritici))、赤霉屬物種（GiLbberella spp.)(例如玉蜀泰赤霉（GiLbberella zeae))、長蠕抱屬物種 Gfelminthosporium spp.)(例如 Helminthosporium turcicum、 炭色長蠕抱(Helminthosporium c過rbonum)、玉蜀泰長蠕抱(Helminthosporium m過vdis) 或水稻小球菌棱病菌（Helmin化osporium sigmoideum))、稻小球腔菌（X邱tosphaeria salvinii)、殼球抱屬物種（Macrophomina spp.)(例如萊豆殼球抱（Macrophomina phaseolina))、Magnaportha spp.(例如稻磕病菌（Magnaporthe OTyzae))、球腔菌屬物種 (Mycosphaerella spp.)、從赤殼屬物種（Nectria spp.)(例如 Nectria heamatococca)、 霜霉屬物種（[Peronospora spp.)(例如東北霜霉巧eronospora manshurica)或煙草霜 霉巧eronospora tabacina))、莖點霉屬物種腳ioma spp.)(例如泰萊莖點霉腳ioma betae))、層誘菌屬物種卿iakopsora spp.)(例如豆墓層誘菌卿iakopsora pachyrhizi))、 瘤梗抱屬物種腳iymatotrichum spp.)(例如多主瘤梗抱腳iymatotrichum omnivorum))、 疫霉屬物種腳iytoph化ora spp.)(例如棒疫霉腳iytoph化ora cinnamomi)、惡疫霉 (Phytophthora cactorum) (Phytophthora phaseoli) ^(Phytophthora parasitica)、巧枯褐腐疫霉（Phytophthora citrophthora)、Phytophthora megasperma f.sp.soiae 或致病疫霉卿iytoph化ora infestans))、單軸霉屬物種巧Iasmopara spp.) (例如葡萄生單軸霉巧Iasmopara viticola))、叉絲單囊殼屬物種巧odosphaera spp.) (例如白叉絲單囊殼巧odosphaera leucotricha))、柄誘菌屬物種巧uccinia spp.)(例 如高梁柄誘菌巧uccinia sor組i)、條形柄誘菌巧uccinia striiformis)、小麥禾柄誘菌 巧Uccinia graminis f.sp.tritici)、天口冬屬柄誘菌巧Uccinia asparagiL)、隱匿柄誘菌 巧Uccinia recondita)或落花生柄誘菌巧Uccinia arachidis))、腐霉屬物種巧ythium spp.)(例如瓜果腐霉巧ythium aphanidermatum))、棱腔菌屬物種巧yrenophora spp.) (例如偃麥草棱腔菌巧yrenophora tritici-r邱entens)或圓棱腔菌巧yrenophora teres))、梨抱屬物種（[Pyricularia spp.)(例如稻梨抱（[Pyricularia OTyzae))、腐霉屬 物種巧^hium spp.)(例如終極腐霉巧^hium ultimum))、Rhincosporium secalis、絲 棱菌屬物種（Rhizoctonia spp.)(例如立枯絲棱菌（Rhizoctonia solani)、稻枯斑絲棱菌 (Rhizoctonia OTyzae)或禾谷絲棱菌（Rhizoctonia cerealis))、根霉屬物種（Rhizopus spp.)(例如華根霉（Rhizopus chinensid))、Scerotium spp.(例如 Scerotium rolfsii)、 棱盤菌屬物種（Sclerotinia spp.)(例如棱盤菌（Sclerotinia sclerotiorum))、殼針抱屬 物種（Septoria spp.)(例如番茄殼針抱（Septoria Iycopersici)、大豆殼針抱（Septoria glycines)、穎枯殼針抱（S邱toria nodorum)或小麥殼針抱（S邱toria tritici))、根串珠 霉屬物種（Thielaviopsis spp.)(例如根串珠霉（Thielaviopsis basicola))、腥黑粉菌 屬物種巧illetia spp.)、木霉屬物種巧richoderma spp.)(例如綠色木霉巧richoderma virde))、鉤絲殼屬物種（Uncinula spp.)(例如葡萄鉤絲殼（Uncinula necator))、玉蜀 泰黑粉菌（Ustilago maydis)(例如玉蜀泰黑粉病）、黑星菌屬物種（VenUiria spp.)(例 如蘋果黑星菌（VenUiria inaequalis)或梨黑星菌（VenUiria pirina))、或輪枝抱屬物 種（Verticillium spp.)(例如大麗花輪枝抱（Verticillium dahliae)或黃萎輪枝抱 (Verticillium albo-atrum));
[0125] (2)源自能侵襲人類的真菌的細胞或能侵襲人類的真菌細胞，其例如但不 限于：假絲酵母屬物種（Can化da spp.)，特別是白假絲酵母（Can化da a化icans); 皮膚真菌化ermatoph^es)，包括，表皮癖菌屬物種巧pidermoph^on spp.)、發(fā)癖 菌屬物種（Trichophyton spp)和小抱霉屬物種（Microsporum spp.);曲霉屬物種 (Aspergillus spp.)(特別是黃曲霉（Aspergillus fIavus)、煙曲霉（Aspergillus fumigatus)、構(gòu)巢曲霉（Aspergillus nidulans)、黑曲霉（Aspergillus niger)或zh 曲 霉（Aspergillus terreus));皮炎芽生菌化Iastomyces dermatitidis);己西副球抱子 菌（Paracoccidioides brasiliensis);粗球抱子菌（Coccidioides immitis);新型隱球 酵母（Cryptococcus neoformans);芙膜組織胞漿菌芙膜變種（}listoplasma capsulatum Var. Capsulatum)或芙膜組織胞漿菌杜波氏變種 Glistoplasma capsulatum Var. Duboisii);申克抱子絲菌（Sporo 化 rix schenckii);鑲抱屬物種（F'usarium spp.);短柄 靑霉（Scopulariopsis brevicaulis);產(chǎn)色芽生菌屬物種^onsecaea spp.);青霉屬物種 ([Penicillium spp.)或接合菌綱（Zygomycetes)組的真菌（特別是傘枝舉頭霉（Absidia corymbifera)、微小根毛霉（Rhizomucor pusillus)或少根根霉（Rhizopus arrhizus));
[0126] (3)源自能侵襲動物的真菌的細胞或能侵襲動物的真菌細胞，其例如但不限于： 假絲酵母屬物種、小抱霉屬物種（特別是狗小抱霉（Microsporum canis)或石膏狀小抱霉 (Microsporum gypseum))、須發(fā)癖菌（Trichophyton mentagrophytes)、曲霉屬物種或新型 隱球酵母；
[0127] 和
[0128] (4)導(dǎo)致不想看到的對基底或材料的損傷的真菌，例如，攻擊食物、種子、木材、 畫、塑料、布等的真菌的細胞或源自所述真菌的細胞。此類真菌的實例是霉菌，其包括但 不限于葡萄穗霉屬物種（Stachybotrys spp.)、曲霉屬物種、鏈格抱屬物種（Alternaria spp.)、枝抱屬物種（Cladosporium spp.)、青霉屬物種或白腐真菌（F>hane;rochaete chrysosporium)。
[0129] II.鑒定祀序列
[0130] 本發(fā)明提供了一種方法，用于鑒定和獲得包含用于生產(chǎn)dsRNA或SiRNA的核巧酸 序列的核酸。例如，此類方法包括：(a)用包含來自被祀向有害生物的核巧酸序列或其同源 物的全部或一部分的雜交探針去探測CDNA或基因組DNA文庫；化）鑒定出與雜交探針雜交 的DNA克??；（C)分離出步驟化）中鑒定的DNA克隆；W及（d)對包含步驟（C)中分離出的 克隆的CDNA或基因組DNA片段測序，其中，被測序的核酸分子轉(zhuǎn)錄RNA核巧酸序列或其同 源物的全部或相當(dāng)大部分。
[0131] 此外，本發(fā)明包括獲得下述核酸片段的方法，所述核酸片段包含用于生產(chǎn)dsRNA 或SiRNA的相當(dāng)大部分的核巧酸序列，所述方法包括；(a)合成第一和第二寡核巧酸引物， 其對應(yīng)于來自被祀向有害生物的核巧酸序列之一的一部分；W及化）使用步驟（a)的第一 和第二寡核巧酸引物，擴增克隆載體中的CDNA或基因組DNA模板，其中，被擴增的核酸分子 轉(zhuǎn)錄本發(fā)明的dsRNA或SiRNA的相當(dāng)大部分。
[0132] 在對本發(fā)明的實踐中，祀基因可源自導(dǎo)致對另一生物的損傷的任何有害生物。采 用若干種標準來選擇優(yōu)選的祀基因。所述基因是該樣的：其蛋白質(zhì)產(chǎn)物具有迅速的周轉(zhuǎn)率， 使得dsRNA抑制導(dǎo)致蛋白質(zhì)水平上的迅速減少。在某些實施方案中，選用下述基因是有好 處的，所述基因表達水平的小降低就會對受體有害生物造成有害影響。如果想要祀向?qū)挿?圍的昆蟲物種，則例如，選擇在該些物種間高度保守的基因。相反，為了賦予特異性的目的 而言，在本發(fā)明的某些實施方案中，選用該樣的基因，其含有在各昆蟲物種間，或昆蟲與其 它生物間保守程度較低的區(qū)域。在某些實施方案中，可能想要選用在其它生物中沒有已知 同源物的基因。
[0133] 本文中使用的術(shù)語"源自"指可從特定來源或物種獲得的特定的核巧酸序列，但是 不一定要直接從該特定來源或物種獲得。
[0134] 在一種實施方案中，選用在昆蟲腸中表達的基因。祀向在腸中表達的基因避免了 對在昆蟲內(nèi)部擴散dsRNA的需求。用于本發(fā)明的祀基因可包括，例如，與已知腸表達的、編 碼質(zhì)膜質(zhì)子V-ATPase的蛋白質(zhì)組分值OW等人，1997，；Dow，1999)的基因的核巧酸序列享 有充分同源性的那些。該蛋白質(zhì)復(fù)合體是上皮離子轉(zhuǎn)運的唯一增能劑（energizer)，并且負 責(zé)中腸腔的堿化。V-ATPase還在馬氏管中表達，馬氏管是昆蟲后腸的突起，其作用于液體平 衡W及W類似于哺乳動物腎臟器官的方式針對外來化合物解毒。
[0135] 在另一實施方案中，選用W重要方式參與昆蟲生長、發(fā)育和繁殖的基因。示例性的 基因包括但不限于；核糖體蛋白的結(jié)構(gòu)亞基和目-coatamer基因，CHD3基因。核糖體蛋白如 S4(化S4)和S9(化S9)是參與蛋白質(zhì)生物合成的核糖體的結(jié)構(gòu)組成成分，它們是胞質(zhì)小核 糖體亞基的組分，核糖體蛋白如L9和L19是參與定位到核糖體上的蛋白質(zhì)生物合成的核糖 體的結(jié)構(gòu)組成成分。漂亮新小桿線蟲中的目-coatamer基因編碼蛋白質(zhì)，其是形成膜小泡 外殼的多聚復(fù)合體的亞基。已在不同的生物體（例如擬南芥（Ar油idopsis thaliana)、黑 尾果禍和釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae))中發(fā)現(xiàn)了相似的序列。還在不同生物體 (例如，馬鈴墓葉甲（Leptinotarsa decemlineata)、辣根猿葉甲（Phaedon cochleariae)、 墨西哥豆瓢蟲巧pilachna varivetis)、墨西哥棉鈴象（Anthonomus grandis)、赤擬谷盜 (Tribolium castaneum)、桃蟲牙（Myzus persicae)、褐飛風(fēng)（Nilaparvata Iugens)、二化頓 (Qiilo suppressalis)、菜蛾（Plutella xylostella)和居屋艾幡（Acheta domesti州S)) 中發(fā)現(xiàn)了相關(guān)序列。用于本發(fā)明的其它祀基因可包括，例如，在生存能力、生長、發(fā)育、繁 殖和侵染性方面具有重要作用的那些基因。該些祀基因包括，例如持家基因、轉(zhuǎn)錄因子 W及昆蟲特異性基因或新桿狀線蟲屬（Caenorhabditis)或果禍屬值roso地ila)中的 致死敲除突變。用于本發(fā)明的祀基因還可W是來自其它生物體的那些，例如，來自線蟲 (例如，根結(jié)線蟲屬物種或胞囊線蟲屬物種）、其它昆蟲或蛛形綱（例如，馬鈴墓葉甲屬物 種（Leptinotarsa spp.)、猿葉甲屬物種（Phaedon spp.)、食植瓢蟲屬物種巧pilachna spp.)、花象屬物種（Anthonomus spp.)、擬谷盜屬物種（Tribolium spp.)、瘤閩屬物種、 褐飛風(fēng)屬物種（Nilaparvata spp.)、禾草頓屬物種（Chilo spp.)、菜蛾屬物種（Plutella SPP.)或Acheta SPP.)。此外，在本發(fā)明中用作為祀序列的核巧酸序列還可源自下述病毒、 細菌、真菌、昆蟲或真菌基因，所述基因的功能已從文獻中建立，其核巧酸序列與昆蟲基因 組中的祀基因共享充分相似性。
[0136] 對于可能成為本發(fā)明控制的祀的很多昆蟲來說，在關(guān)于大多數(shù)基因的序列方面 或特定基因突變導(dǎo)致的表型方面信息有限。因此，可基于模式生物（例如新桿狀線蟲屬 (Caenorh油ditis)或果禍屬值roso地ila))中或其它一些昆蟲物種中的相應(yīng)基因的可獲 得的可用信息來選擇基因。還可基于其基因已被表征過的其它物種（例如線蟲或真菌物 種）的可獲得的序列信息來選擇基因。在一些情況下，可能通過使用基因名或基因序列的 檢索數(shù)據(jù)庫（例如GenBank)來獲得來自祀昆蟲的相應(yīng)基因的序列。一旦獲得了序列，就可 W使用PCR來擴增昆蟲中被適當(dāng)選出的基因片斷，W用于本發(fā)明。
[0137] 為獲得來自昆蟲物種的相應(yīng)基因的DNA片斷，例如，可基于在漂亮新小桿線蟲或 果蟲電屬中，或其基因已被克隆的昆蟲中發(fā)現(xiàn)的序列，來設(shè)計PCR引物。對引物加W設(shè)計，W 擴增足夠長的DNA片斷，W用于本發(fā)明。選擇擴增條件使得即使引物并不精確匹配祀序列 但擴增仍能進行。或者，可使用已知的昆蟲基因作為探針，從制備自昆蟲有害生物物種的基 因組DNA或CDNA文庫，克隆出基因或其部分。用于進行PCR和從文庫克隆的技術(shù)是已知 的。在實施例中提供了關(guān)于基于W前從昆蟲物種中克隆出的基因序列來從祀昆蟲有害生物 物種分離出DNA片斷的工藝的詳細細節(jié)。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將認識到，可W用多種技術(shù) 來從昆蟲有害生物物種中分離出對應(yīng)于W前從其它物種分離出的基因的基因片斷。
[013引III.用于抑制或遏制祀基因的方法
[0139] 本發(fā)明提供了使用穩(wěn)定的dsRNA方法抑制一種或多種祀基因在祀有害生物中的 基因表達的方法。本發(fā)明特別可用于調(diào)節(jié)真核基因表達，特別是對下述有害生物中存在的 基因的表達加W調(diào)節(jié)，所述有害生物展示出大約4. 5至大約9. 5的消化系統(tǒng)抑水平，更優(yōu) 選地，大約5. 0至大約8. 0,進一步更優(yōu)選地，大約6. 5至大約7. 5。對于具有展示出上述范 圍之外的抑水平的消化系統(tǒng)的有害生物來說，可能需要使用無須攝入dsRNA分子的遞送方 法。
[0140] 本發(fā)明的方法包括將兩種或多種不同的雙鏈RNA或RNA構(gòu)建體同時或順序提供給 同一昆蟲，使得實現(xiàn)對多條祀基因的下調(diào)或抑制，或者使得實現(xiàn)對單個祀基因的更有效的 抑制。
[0141] 或者，通過提供擊中多條祀序列的一種雙鏈RNA來擊中多個祀，W及通過對應(yīng)于 祀基因的雙鏈RNA片段的超過一個拷貝的存在，來更高效地抑制單個祀。因此，在本發(fā)明的 一種實施方案中，雙鏈RNA構(gòu)建體包含多個dsRNA區(qū)域，每個dsRNA區(qū)域中的至少一條鏈包 含與昆蟲祀基因的祀核巧酸序列的至少一部分互補的核巧酸序列。根據(jù)本發(fā)明，RNA構(gòu)建 體中的dsRNA區(qū)域可與相同或不同的祀基因互補和/或dsRNA區(qū)域可與來自相同或不同昆 蟲物種的祀互補。由此，在植物宿主細胞中使用此類dsRNA構(gòu)建體，在植物中建立對單種或 多種昆蟲物種的更為有效的抗性。在一種實施方案中，雙鏈RNA區(qū)域包括與祀基因互補的 核巧酸序列的多個拷貝?；蛘撸琩sRNA擊中同一祀基因的超過一個祀序列。本發(fā)明由此包 括下述經(jīng)分離的雙鏈RNA構(gòu)建體，其包含與昆蟲祀的核巧酸序列的至少一部分互補的所述 核巧酸的至少兩個拷貝。開發(fā)了擊中多于一個上述祀的dsRNA或者針對不同的上述祀的不 同dsRNA的組合，并將它們用于本發(fā)明的方法。 申請人:在W02006/046148中描述了合適的 dsRNA核巧酸和dsRNA構(gòu)建體，該文獻W其全文引入本文。
[0142] 術(shù)語"擊中"及其各種時態(tài)形式是表示dsRNA的至少一條鏈與祀基因或核巧酸序 列互補（W及從而可W結(jié)合）的替換性措辭方式。
[0143] dsRNA的調(diào)節(jié)作用可應(yīng)用于有害生物中表達的多種基因，例如，負責(zé)細胞代謝或細 胞轉(zhuǎn)化的內(nèi)源基因，包括持家基因、轉(zhuǎn)錄因子和編碼涉及細胞代謝的多膚的其它基因。
[0144] 在本文中使用時，短語"對基因表達的抑制"或"抑制祀基因在有害生物細胞中的 表達"指來自所述祀基因的mRNA產(chǎn)物和/或蛋白質(zhì)水平不存在（或可觀察到的減少）。特 異性指能抑制祀基因但不會對細胞的其它基因造成影響W及不會對產(chǎn)生所述dsRNA分子 的細胞中的任何基因造成任何影響的能力。對祀基因在有害生物中的基因表達的抑制可能 導(dǎo)致有害生物中產(chǎn)生新的表型性狀。
[0145] "基因遏制"指用于降低基因轉(zhuǎn)錄為mRNA的水平和/或隨后mRNA的翻譯水平的任 何公知方法?；蚨糁七€意欲表示來自基因或編碼序列的蛋白質(zhì)表達的降低，該包括轉(zhuǎn)錄 后基因遏制和轉(zhuǎn)錄遏制。轉(zhuǎn)錄后基因遏制由從被祀向遏制的基因或編碼序列轉(zhuǎn)錄來的mRNA 的全部或部分與相應(yīng)的用于遏制的雙鏈RNA之間的同源性介導(dǎo)，其指細胞中可獲得來與核 糖體結(jié)合的mRNA可獲得的量的充分并且可測量到的降低。轉(zhuǎn)錄的RNA可W是正義向的，實 現(xiàn)所謂的共遏制，或者是反義向的，實現(xiàn)所謂的反義遏制，或者是雙向的，產(chǎn)生dsRNA,實現(xiàn) 所謂的RNA干擾（RNAi)。
[0146] 轉(zhuǎn)錄遏制由細胞中dsRNA基因遏制劑的存在介導(dǎo)，所述遏制劑展示出與啟動子 DNA序列或其互補序列的充分序列同一性，W實現(xiàn)被稱為啟動子反式遏制的效果?；蚨糁?可對與性狀相關(guān)的天然宿主基因有效，例如，提供給宿主降低的蛋白質(zhì)（天然基因編碼的） 水平，或增強或降低的受影響代謝物水平?；蚨糁七€可對下述有害生物中的祀基因有效， 所述有害生物可攝入或接觸含有基因遏制劑的材料，所述基因遏制劑具體地設(shè)計用來抑制 或遏制在有害生物細胞中一種或多種同源或互補序列的表達。
[0147] 在宿主中進行轉(zhuǎn)錄后基因遏制的有益方法既利用了正義方向也利用了反義方向 的轉(zhuǎn)錄RNA，它們作為例如發(fā)夾和莖和環(huán)結(jié)構(gòu)是穩(wěn)定的。用于實現(xiàn)轉(zhuǎn)錄后基因遏制的優(yōu)選 DNA構(gòu)建體是該樣的；其中，第一片斷編碼展示出反義方向的RNA，其展示出與被祀向遏制 的基因片斷的充分同一性，其與正義方向的第二片斷相連，所述第二片斷編碼展示出與第 一片斷充分互補的RNA。此類構(gòu)建體通過第一片斷與第二片斷的雜交W及來自連接兩條片 斷的核巧酸序列的環(huán)結(jié)構(gòu)形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)（見，W094/01550、W098/05770、US 2002/0048814 和 S 2003/0018993)。
[0148] 根據(jù)本發(fā)明的一種實施方案中，提供了下述核巧酸序列，其體外表達導(dǎo)致下述穩(wěn) 定的RNA序列的轉(zhuǎn)錄，所述RNA序列與有害生物中被祀向基因的RNA分子充分同源，所述有 害生物其包含有害生物基因組中核巧酸序列編碼的RNA序列）。在有害生物攝入穩(wěn)定的RNA 序列或暴露給dsRNA之后，對應(yīng)于祀有害生物細胞中祀基因的核巧酸序列即被下調(diào)。
[0149] 使用本發(fā)明的穩(wěn)定的dsRNA技術(shù)對祀基因的抑制是序列特異性的，因為對應(yīng)于 RNA的雙鏈體區(qū)域的核巧酸序列被祀向進行遺傳抑制。對于抑制而言，含有與祀基因的一部 分相同的核巧酸序列的RNA是優(yōu)選的。相對于祀序列而言具有插入、缺失和單點突變的RNA 序列也被認為是有效于抑制的。在對本發(fā)明的實施中，優(yōu)選地，抑制性dsRNA和祀基因的部 分至少享有大約80%的序列同一性，或者大約85%的序列同一性，或者大約90%的序列同 一性，或者大約95 %的序列同一性，或者大約99 %的序列同一性或者甚至大約100 %的序 列同一性?；蛘?，可將RNA的雙鏈體區(qū)域功能性定義為；能與祀基因轉(zhuǎn)錄本的一部分雜交的 核巧酸序列。展示出更高同源性但短于全長的序列能夠抵補較長但同源性較少的序列。相 同核巧酸序列的長度可W為至少大約25、50、100、200、300、400、500或者至少大約1000個 堿基。通常，應(yīng)當(dāng)使用超過20-100個核巧酸的序列，雖然超過大約200-300個核巧酸的序 列將是優(yōu)選的，并且超過大約500-1000個核巧酸的序列將是尤其優(yōu)選的，該取決于祀基因 的大小。本發(fā)明具有如下優(yōu)點：能耐受可能由于遺傳突變、株系多態(tài)性或進化趨異性預(yù)期的 序列變異。相對于祀基因的初級轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物或經(jīng)完全加工的mRNA來說，引入的核酸分子可W 無需是絕對同源的，可W無需是全長的。因此，本領(lǐng)域技術(shù)人員需要認識到，如本文所公開 的，為實踐本發(fā)明，RNA和祀基因之間無需100%的序列同一性。
[0150] IV.制備dsRNA的方法
[0151] 可體內(nèi)或體外合成dsRNA分子。可通過單條自身互補的RNA鏈或從兩條互補的RNA 鏈來形成dsRNA。細胞的內(nèi)源RNA聚合酶可介導(dǎo)體內(nèi)轉(zhuǎn)錄，或者，可用克隆的RNA聚合酶來 用于體內(nèi)或體外轉(zhuǎn)錄?？赏ㄟ^在器官、組織或細胞類型中的特異性轉(zhuǎn)錄；環(huán)境條件（例如， 感染、脅迫、溫度、化學(xué)誘導(dǎo)物）的刺激；和/或在發(fā)育期或年齡的工程轉(zhuǎn)錄（engineering transcription)來祀向抑制。RNA鏈可被聚腺巧酸化或者可不被聚腺巧酸化；RNA鏈可W 能夠通過細胞的翻譯設(shè)備翻譯為多膚，或者可W不能該樣。
[0152] 本領(lǐng)域技術(shù)人員可通過人工或自動反應(yīng)W化學(xué)或酶促方式產(chǎn)生本發(fā)明的RNA、 dsRNA、siRNA或miRNA，或在另一生物體中體內(nèi)產(chǎn)生。還可通過部分或全部的有機合成來產(chǎn) 生RNA ;可W通過體外酶促或有機合成引入任何經(jīng)修飾的核糖核巧酸。可通過細胞RNA聚 合酶或瞻菌體RNA聚合酶（例如，T3、T7、SP6)來合成RNA。表達構(gòu)建體的使用和產(chǎn)生都是 本領(lǐng)域已知的（見，例如，WO 97/32016 ;美國專利 No. 5, 593, 874、5, 698, 425、5, 712, 135、 5, 789, 214和5, 804, 693)。如果RNA是通過化學(xué)合成或者通過體外酶促合成的話，那么可 在引入細胞之前對RNA進行純化。例如，可使用溶劑或樹脂萃取、沉淀、電泳、色譜或其組合 從混合物中純化出RNA。可選地，可在不純化或盡量少純化的條件下使用RNA，W避免由于 樣品加工造成的損失。RNA可被干燥用于膽存，或者可溶解于水溶液中。溶液可含有緩沖液 或鹽，W促進雙鏈體的退火和/或穩(wěn)定。
[0153] V.多核巧酸序列
[0154] 根據(jù)本發(fā)明提供了下述核巧酸序列，其表達產(chǎn)生了與有害生物中被祀向基因的 RNA分子（包含有害生物基因組中核巧酸序列編碼的RNA序列）充分同源的RNA序列。因 此，dsRNA序列被攝入后，可獲得對有害生物細胞中祀基因的核巧酸序列的下調(diào)，該導(dǎo)致對 有害生物的保持、生存能力、增殖、繁殖和侵襲來說有害的影響。
[0155] 本文示出的每條"核巧酸序列"都表示為脫氧核糖核巧酸（縮寫為A、G、C和T)序 列。但是，核酸分子或多核巧酸的"核巧酸序列"對于RNA分子或多核巧酸而言表示脫氧核 糖核巧酸的序列，但是對于RNA分子或多核巧酸而言，其表示相應(yīng)的核糖核巧酸（A、G、C和 U)的序列，其中，給定的脫氧核巧酸序列中的每個胸巧脫氧核巧酸（T)被核糖核巧酸尿巧 扣）替換。
[0156] 在本文中使用時，"核酸"表示從5'到3'末端閱讀的脫氧核糖核巧酸或核糖核巧 酸堿基的單鏈或雙鏈聚合物。任選地，核酸還可含有下述非天然存在的核巧酸堿基或改變 的核巧酸堿基，其允許聚合酶的正確連讀，并且不會降低所述核酸編碼的多膚的表達。"核 巧酸序列"或"核酸序列"既指核酸的正義鏈也指其反義鏈，并且無論是單個單鏈狀態(tài)或處 于雙鏈體中的。
[0157] 術(shù)語"核糖核酸"（RNA)包括RNAi (抑制性RNA)、dsRNA (雙鏈RNA)、SiRNA (小干 擾RNA)、mRNA (信使RNA)、miRNA (微小RNA)、tRNA (轉(zhuǎn)移RNA，無論是否被相應(yīng)的醜基化氨 基酸加上電荷或卸掉電荷）和CRNA (互補RNA)，術(shù)語"脫氧核糖核酸"值NA)包括CDNA和 基因組DNA和DNA-RNA雜交體。
[015引本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)將詞匯一"核酸片斷"、"核巧酸片斷"或更一般性的"片 斷"理解為功能性術(shù)語，其包括基因組序列、核糖體RNA序列、轉(zhuǎn)移RNA序列、信使RNA序列、 操縱子序列W及更小的經(jīng)過改造的核巧酸序列，所述核巧酸序列表達或被改造來表達蛋白 質(zhì)、多膚或膚。
[0159]因此，本發(fā)明涉及經(jīng)分離的核酸分子，其包含下述多核巧酸，所述多核巧酸具有 選自沈Q ID N0;l、3、5、7、9、ll、13、15、17、19、21、23、49-158、159、160、163、168、173、178、 183、188、193、198、203、208、215、220、225、230、247、249、251、253、255、257、259、275-472、 473、478、483、488、493、498、503、513、515、517、519、521、533-575、576、581、586、591、596、 601、603、605、607、609、621-767、768、773、778、783、788、793、795、797、799、801、813-862、 863、868、873、878、883、888、890、892、894、896、908-1040、1041、1046、1051、1056、1061、 1071'1073、1075、1077、1079、1081'1083、1085、1087、1089、1091'1093、1095、1097、1099、 1101、1103、1105、1107、1109、1111、1113、1161-1571、1572、1577、1582、1587、1592、1597、 1602、1607、1612、1617、1622、1627、1632、1637、1642、1647、1652、1657、1662、1667、1672、 1677、1682、1684、1686、1688、1690、1692、1694、1696、1698、1700、1702、1704、1730-2039、 2040、2045'2050、2055'2060、2065'2070'2075'2080'2085'2090'2095'2100'2102、 2104、2106、2108、2120-2338、2339、2344、2349、2354、2359、2364、2366、2368、2370、2372、 2384-2460、2461、2466、2471、2476和2481的任何多核巧酸序列的序列。本發(fā)明還提供了 沈Q ID NO ;1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、49-158、159、160、163、168、173、178、183、 188、193、198、203、208、215、220、225、230、247、249、251、253、255、257、259、275-472、473、 478、483、488、493、498、503、513、515、517、519、521、533-575、576、581、586、591、596、601、 603、605、607、609、621-767、768、773、778、783、788、793、795、797、799、801、813-862、863、 868、873、878、883、888、890、892、894、896、908-1040、1041、1046、1051、1056、1061、1071、 1073、1075、1077、1079、1081'1083、1085、1087、1089、1091'1093、1095、1097、1099、1101、 1103、1105、1107、1109、1111、1113、1161-1571、1572、1577、1582、1587、1592、1597、1602、 1607、1612、1617、1622、1627、1632、1637、1642、1647、1652、1657、1662、1667、1672、1677、 1682、1684、1686、1688、1690、1692、1694、1696、1698、1700、1702、1704、1730-2039、2040、 2045、2050、2055、2060、2065、2070、2075、2080、2085、2090、2095、2100、2102、2104、2106、 2108、2120-2338、2339、2344、2349、2354、2359、2364、2366、2368、2370、2372、2384-2460、 2461、2466、2471、2476和2481的多核巧酸序列的功能性片段。本發(fā)明還提供了 SEQ ID NO ;1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、49-158、159、160、163、168、173、178、183、188、 193、198、203、208、215、220、225、230、247、249、251、253、255、257、259、275-472、473、478、 483、488、493、498、503、513、515、517、519、521、533-575、576、581、586、591、596、601、603、 605、607、609、621-767、768、773、778、783、788、793、795、797、799、801、813-862、863、868、 873、878、883、888、890、892、894、896、908-1040、1041、1046、1051、1056、1061、1071、1073、 1075、1077、1079、1081'1083、1085、1087、1089、1091'1093、1095、1097、1099、1101、1103、 1105、1107、1109、1111、1113、1161-1571、1572、1577、1582、1587、1592、1597、1602、1607、 1612、1617、1622、1627、1632、1637、1642、1647、1652、1657、1662、1667、1672、1677、1682、 1684、1686、1688、1690、1692、1694、1696、1698、1700、1702、1704、1730-2039、2040、2045、 2050、2055、2060、2065、2070、2075、2080、2085、2090、2095、2100、2102、2104、2106、2108、 2120-2338、2339、2344、2349、2354、2359、2364、2366、2368、2370、2372、2384-2460、2461、 2466、2471、2476和2481的任何多核巧酸序列的互補核酸或其片段，W及包含至少15個連 續(xù)堿基的核酸，其與 SEQ ID NO ;1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、49-158、159、160、163、 168、173、178、183、188、193、198、203、208、215、220、225、230、247、249、251、253、255、257、 259、275-472、473、478、483、488、493、498、503、513、515、517、519、521、533-575、576、581、 586、591、596、601、603、605、607、609、621-767、768、773、778、783、788、793、795、797、799、 801、813-862、863、868、873、878、883、888、890、892、894、896、908-1040、1041、1046、1051、 1056、1061、1071'1073、1075、1077、1079、1081'1083、1085、1087、1089、1091'1093、1095、 1097、1099、1101、1103、1105、1107、1109、1111、1113、1161-1571、1572、1577、1582、1587、 1592、1597、1602、1607、1612、1617、1622、1627、1632、1637、1642、1647、1652、1657、1662、 1667、1672、1677、1682、1684、1686、1688、1690、1692、1694、1696、1698、1700、1702、1704、 1730-2039、2040、2045、2050、2055、2060、2065、2070、2075、2080、2085、2090、2095、2100、 2102、2104、2106、2108、2120-2338、2339、2344、2349、2354、2359、2364、2366、2368、2370、 2372、2384-2460、2461、2466、2471、2476 和 2481 的任何多核巧酸序列雜交。
[0160]本發(fā)明還提供了本發(fā)明的 SEQ ID N0;l、3、5、7、9、ll、13、15、17、19、21、23、 49-158、159、160、163、168、173、178、183、188、193、198、203、208、215、220、225、230、247、 249、251、253、255、257、259、275-472、473、478、483、488、493、498、503、513、515、517、519、 521、533-575、576、581、586、591、596、601、603、605、607、609、621-767、768、773、778、 783、788、793、795、797、799、801、813-862、863、868、873、878、883、888、890、892、894、 896、908-1040、1041'1046'1051'1056、1061'1071'1073'1075'1077、1079、1081'1083、 1085、1087、1089、1091、1093、1095、1097、1099、1101、1103、1105、1107、1109、1111、1113、 1161-1571、1572、1577、1582、1587、1592、1597、1602、1607、1612、1617、1622、1627、1632、 1637、1642、1647、1652、1657、1662、1667、1672、1677、1682、1684、1686、1688、1690、1692、 1694、1696、1698、1700、1702、1704、1730-2039、2040、2045、2050、2055、2060、2065、2070、 2075、2080、2085、2090、2095、2100、2102、2104、2106、2108、2120-2338、2339、2344、2349、 2354、2359、2364、2366、2368、2370、2372、2384-2460、2461、2466、2471、2476 和 2481 的多 核巧酸序列的直向同源物序列及其互補序列和片段。因此，本發(fā)明包括下述祀基因，它們 是包含下述核巧酸序列的基因的昆蟲直向同源物，所述核巧酸序列如SEQ ID NO ;1、3、5、 7、9、11、13、15、17、19、21、23、49-158、159、160、163、168、173、178、183、188、193、198、203、 208、215、220、225、230、247、249、251、253、255、257、259、275-472、473、478、483、488、493、 498、503、513、515、517、519、521、533-575、576、581、586、591、596、601、603、605、607、609、 621-767、768、773、778、783、788、793、795、797、799、801、813-862、863、868、873、878、883、 888、890、892、894、896、908-1040、1041、1046、1051、1056、1061、1071、1073、1075、1077、 1079、1081'1083、1085、1087、1089、1091'1093、1095、1097、1099、1101'1103、1105、1107、 1109、1111、1113、1161-1571、1572、1577、1582、1587、1592、1597、1602、1607、1612、1617、 1622、1627、1632、1637、1642、1647、1652、1657、1662、1667、1672、1677、1682、1684、1686、 1688、1690、1692、1694、1696、1698、1700、1702、1704、1730-2039、2040、2045、2050、2055、 2060、2065、2070、2075、2080、2085、2090、2095、2100、2102、2104、2106、2108、2120-2338、 2339、2344、2349、2354、2359、2364、2366、2368、2370、2372、2384-2460、2461、2466、2471、 2476和2481中任何所示。舉例而言，昆蟲直向同源物可包含SEQ ID N0;49-123、275-434、 533-562、621-738、813-852、908-1010、1161-1437、1730-1987、2120-2290、2384-2438 中任 何所示的核巧酸序列，或其至少15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26或27個核巧酸的 片段。包含本發(fā)明的序列之一的至少巧bp (優(yōu)選至少nbp)片段的、昆蟲或蛛形綱直向同 源物基因或序列的非限制性列表在表4中給出。
[0161] 本發(fā)明還包括下述祀基因，它們是包含下述核巧酸序列的基因的線蟲直向同 源物，所述核巧酸序列如本發(fā)明的任何SEQ ID NO ;1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、 49-158、159、160、163、168、173、178、183、188、193、198、203、208、215、220、225、230、247、 249、251、253、255、257、259、275-472、473、478、483、488、493、498、503、513、515、517、519、 521、533-575、576、581、586、591、596、601、603、605、607、609、621-767、768、773、778、 783、788、793、795、797、799、801、813-862、863、868、873、878、883、888、890、892、894、 896、908-1040、1041'1046、1051'1056、1061'1071'1073、1075、1077、1079、1081'1083、 1085、1087、1089、1091、1093、1095、1097、1099、1101、1103、1105、1107、1109、1111、1113、 1161-1571、1572、巧77、1582、1587、1592、1597、1602、1607、1612、1617、1622、1627、1632、 1637、1642、1647、1652、1657、1662、1667、1672、1677、1682、1684、1686、1688、1690、1692、 1694、1696、1698、1700、1702、1704、1730-2039、2040、2045、2050、2055、2060、2065、2070、 2075、2080、2085、2090、2095、2100、2102、2104、2106、2108、2120-2338、2339、2344、2349、 2354、2359、2364、2366、2368、2370、2372、2384-2460、2461、2466、2471、2476 和 2481 中所 示。舉例而言，線蟲直向同源物可包含本發(fā)明的SEQ ID N0s;124-135、435-446、563、564、 739-751、853、854、1011-1025、1438-1473、1988-2001、2291-2298、2439-2440 中任何所示的 核巧酸序列，或者其至少15、16、17、18、19、20或21個核巧酸的片段。根據(jù)另一方面，本發(fā)明 由此包括本文所述的、用于控制生物體中線蟲生長或者用于防止線蟲侵襲對線蟲感染易感 的生物體的任何方法，所述方法包括：將線蟲細胞與下述雙鏈RNA相接觸，其中，所述雙鏈 RNA包含退火的互補鏈，其中之一具有與下述祀基因的核巧酸序列的至少一部分互補的核 巧酸序列，所述祀基因包含 SEQ ID NOs ;1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、49-158、159、 160、163、168、173、178、183、188、193、198、203、208、215、220、225、230、247、249、251、253、 255、257、259、275-472、473、478、483、488、493、498、503、513、515、517、519、521、533-575、 576、581、586、591、596、601、603、605、607、609、621-767、768、773、778、783、788、793、795、 797、799、801、813-862、863、868、873、878、883、888、890、892、894、896、908-1040、1041、 1046、1051'1056、1061'1071'1073、1075、1077、1079、1081、1083、1085、1087、1089、1091、 1093、1095、1097、1099、1101、1103、1105、1107、1109、1111、1113、1161-1571、1572、1577、 1582、1587、1592、1597、1602、1607、1612、1617、1622、1627、1632、1637、1642、1647、1652、 1657、1662、1667、1672、1677、1682、1684、1686、1688、1690、1692、1694、1696、1698、1700、 1702、1704、1730-2039、2040、2045、2050、2055、2060、2065、2070、2075、2080、2085、2090、 2095、2100、2102、2104、2106、2108、2120-2338、2339、2344、2349、2354、2359、2364、2366、 2368、2370、2372、2384-2460、2461、2466、2471、2476 和 2481 所示的任何序列的至少 17、 18、 19、20或21個核巧酸的片段，由此，所述雙鏈RNA被真菌攝取，并由此控制了生長或防 止了侵襲。本發(fā)明還涉及線蟲抗性轉(zhuǎn)基因植物，其包含SEQ ID N0;l、3、5、7、9、ll、13、15、 17、19、21、23、49-158、159、160、163、168、173、178、183、188、193、198、203、208、215、220、 225、230、247、249、251、253、255、257、259、275-472、473、478、483、488、493、498、503、513、 515、517、519、521、533-575、576、581、586、591、596、601、603、605、607、609、621-767、768、 773、778、783、788、793、795、797、799、801、813-862、863、868、873、878、883、888、890、892、 894、896、908-1040、1041、1046、1051、1056、1061、1071、1073、1075、1077、1079、1081、1083、 1085、1087、1089、1091、1093、1095、1097、1099、1101、1103、1105、1107、1109、1111、1113、 1161-1571、1572、1577、1582、1587、1592、1597、1602、1607、1612、1617、1622、1627、1632、 1637、1642、1647、1652、1657、1662、1667、1672、1677、1682、1684、1686、1688、1690、1692、 1694、1696、1698、1700、1702、1704、1730-2039、2040、2045、2050、2055、2060、2065、2070、 2075、2080、2085、2090、2095、2100、2102、2104、2106、2108、2120-2338、2339、2344、2349、 2354、2359、2364、2366、2368、2370、2372、2384-2460、2461、2466、2471、2476 和 2481 所示 的任何序列的至少17、18、19、20或21個核巧酸的片段。包含本發(fā)明的序列之一的至少 巧bp(優(yōu)選至少17bp)的片段的、線蟲直向同源物基因或序列的非限制性列表在表5中給 出。
[0162] 根據(jù)另一實施方案，本發(fā)明包括下述祀基因，它們是包含下述核巧酸序列的基 因的真菌直向同源物，所述核巧酸序列如本發(fā)明的SEQ ID N0;l、3、5、7、9、ll、13、15、17、 19、 21、23、49-158、159、160、163、168、173、178、183、188、193、198、203、208、215、220、225、 230、247、249、251、253、255、257、259、275-472、473、478、483、488、493、498、503、513、515、 517、519、521、533-575、576、581、586、591、596、601、603、605、607、609、621-767、768、773、 778、783、788、793、795、797、799、801、813-862、863、868、873、878、883、888、890、892、894、 896、908-1040、1041'1046'1051'1056'1061'1071'1073'1075'1077、1079、1081'1083、 1085、1087、1089、1091、1093、1095、1097、1099、1101、1103、1105、1107、1109、1111、1113、 1161-1571、1572、1577、1582、1587、1592、1597、1602、1607、1612、1617、1622、1627、1632、 1637、1642、1647、1652、1657、1662、1667、1672、1677、1682、1684、1686、1688、1690、1692、 1694、1696、1698、1700、1702、1704、1730-2039、2040、2045、2050、2055、2060、2065、2070、 2075、2080、2085、2090、2095、2100、2102、2104、2106、2108、2120-2338、2339、2344、2349、 2354、2359、2364、2366、2368、2370、2372、2384-2460、2461、2466、2471、2476 和 2481 中任何 所示。舉例而言，真菌直向同源物可包含SEQ ID NO;136-158、447-472、565-575、752-767、 855-862、1026-1040、1474-1571、2002-2039、2299-2338、2441-2460 中任何序列所示的核 巧酸序列，或者其至少17、18、19、20、21、22、23、24、25、26或27個核巧酸的片段。根據(jù)另 一方面，本發(fā)明由此包括本文所述的、用于控制細胞或生物體上真菌生長或者用于防止真 菌侵襲對真菌感染易感的細胞或生物體的任何方法，所述方法包括：將真菌細胞與下述雙 鏈RNA相接觸，其中，所述雙鏈RNA包含退火的互補鏈，其中之一具有與下述祀基因的核 巧酸序列的至少一部分互補的核巧酸序列，所述祀基因包含SEQ ID NO;l、3、5、7、9、ll、 13、15、17、19、21、23、49-158、159、160、163、168、173、178、183、188、193、198、203、208、215、 220、225、230、247、249、251、253、255、257、259、275-472、473、478、483、488、493、498、503、 513、515、517、519、521、533-575、576、581、586、591、596、601、603、605、607、609、621-767、 768、773、778、783、788、793、795、797、799、801、813-862、863、868、873、878、883、888、890、 892、894、896、908-1040、1041、1046、1051、1056、1061、1071、1073、1075、1077、1079、1081、 1083、1085、1087、1089、1091、1093、1095、1097、1099、1101、1103、1105、1107、1109、1111、 1113、1161-1571、1572、1577、1582、1587、1592、1597、1602、1607、1612、1617、1622、1627、 1632、1637、1642、1647、1652、1657、1662、1667、1672、1677、1682、1684、1686、1688、1690、 1692、1694、1696、1698、1700、1702、1704、1730-2039、2040、2045、2050、2055、2060、2065、 2070、2075、2080、2085、2090、2095、2100、2102、2104、2106、2108、2120-2338、2339、2344、 2349、2354、2359、2364、2366、2368、2370、2372、2384-2460、2461、2466、2471、2476 和 2481 所示的任何序列的至少17、18、19、20或21個核巧酸的片段，由此，所述雙鏈RNA被真菌 攝取，并由此控制了生長或防止了侵襲。本發(fā)明還涉及真菌抗性轉(zhuǎn)基因植物，其包含SEQ ID NO ;1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、49-158、159、160、163、168、173、178、183、188、 193、198、203、208、215、220、225、230、247、249、251、253、255、257、259、275-472、473、478、 483、488、493、498、503、513、515、517、519、521、533-575、576、581、586、591、596、601、603、 605、607、609、621-767、768、773、778、783、788、793、795、797、799、801、813-862、863、868、 873、878、883、888、890、892、894、896、908-1040、1041、1046、1051、1056、1061、1071、1073、 1075、1077、1079、1081'1083、1085、1087、1089、1091'1093、1095、1097、1099、1101'1103、 1105、1107、1109、1111、1113、1161-1571、1572、1577、1582、1587、1592、1597、1602、1607、 1612、1617、1622、1627、1632、1637、1642、1647、1652、1657、1662、1667、1672、1677、1682、 1684、1686、1688、1690、1692、1694、1696、1698、1700、1702、1704、1730-2039、2040、2045、 2050、2055、2060、2065、2070、2075、2080、2085、2090、2095、2100、2102、2104、2106、2108、 2120-2338、2339、2344、2349、2354、2359、2364、2366、2368、2370、2372、2384-2460、2461、 2466、2471、2476和2481所示的任何序列的至少17、18、19、20或21個的片段。包含本發(fā)明 的序列之一的至少巧bp(優(yōu)選至少nbp)的片段的、真菌直向同源物基因或序列的非限制 性列表在表6中給出。
[016引 在又一實施方案中，本發(fā)明的dsRNA分子包含SEQ ID N0;l、3、5、7、9、ll、13、15、 17、19、21、23、49-158、159、160、163、168、173、178、183、188、193、198、203、208、215、220、 225、230、247、249、251、253、255、257、259、275-472、473、478、483、488、493、498、503、513、 515、517、519、521、533-575、576、581、586、591、596、601、603、605、607、609、621-767、768、 773、778、783、788、793、795、797、799、801、813-862、863、868、873、878、883、888、890、892、 894、896、908-1040、1041、1046、1051、1056、1061、1071、1073、1075、1077、1079、1081、1083、 1085、1087、1089、1091、1093、1095、1097、1099、1101、1103、1105、1107、1109、1111、1113、 1161-1571、1572、1577、1582、1587、1592、1597、1602、1607、1612、1617、1622、1627、1632、 1637、1642、1647、1652、1657、1662、1667、1672、1677、1682、1684、1686、1688、1690、1692、 1694、1696、1698、1700、1702、1704、1730-2039、2040、2045、2050、2055、2060、2065、2070、 2075、2080、2085、2090、2095、2100、2102、2104、2106、2108、2120-2338、2339、2344、2349、 2354、2359、2364、2366、2368、2370、2372、2384-2460、2461、2466、2471、2476 和 2481 中的 任何序列，雖然 SEQ ID N0;l、3、5、7、9、ll、13、15、17、19、21、23、49-158、159、160、163、 168、173、178、183、188、193、198、203、208、215、220、225、230、247、249、251、253、255、257、 259、275-472、473、478、483、488、493、498、503、513、515、517、519、521、533-575、576、581、 586、591、596、601、603、605、607、609、621-767、768、773、778、783、788、793、795、797、799、 801、813-862、863、868、873、878、883、888、890、892、894、896、908-1040、1041、1046、1051、 1056、1061'1071、1073、1075、1077、1079、1081'1083、1085、1087、1089、1091'1093、1095、 1097、1099、1101、1103、1105、1107、1109、1111、1113、1161-1571、1572、1577、1582、1施7、 1592、1597、1602、1607、1612、1617、1622、1627、1632、1637、1642、1647、1652、1657、1662、 1667、1672、1677、1682、1684、1686、1688、1690、1692、1694、1696、1698、1700、1702、1704、 1730-2039、2040、2045、2050、2055、2060、2065、2070、2075、2080、2085、2090、2095、2100、 2102、2104、2106、2108、2120-2338、2339、2344、2：349、2354、2359、2364、2366、2368、2370、 2372、2384-2460、2461、2466、2471、2476和2481中示出的序列是非限制性的。本發(fā)明的 dsRNA分子可包含來自有害生物物種的任何連續(xù)的祀基因（例如，大約15至大約25或更 多，或大約15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25或更多個連續(xù)的核巧酸）。
[0164]"經(jīng)分離的"核酸分子表示已從其天然環(huán)境移出的核酸分子、DNA或RNA。例如，就 本發(fā)明的目的而言，DNA構(gòu)建體中含有的重組DNA分子就被認為是經(jīng)分離的。經(jīng)分離的DNA 分子的另外實例包括在異源宿主細胞中保持的重組DNA分子，或溶液中經(jīng)（部分或充分） 純化的DNA分子。經(jīng)分離的RNA分子包括本發(fā)明的DNA分子的體外RNA轉(zhuǎn)錄本。根據(jù)本發(fā) 明，經(jīng)分離的核酸分子還包括合成生產(chǎn)的那些分子。
[016引本發(fā)明的核酸分子可W是RNA(例如mRNA)的形式或DNA的形式，包括，例如，cDNA 或基因組DNA，它們是通過克隆獲得的或合成產(chǎn)生的。DNA或RNA可W是雙鏈或單鏈的。單 鏈DNA可W是編碼鏈，其也被稱為正義鏈，或者其可W是非編碼鏈，該也被稱為反義鏈。 [0166] VI.序列分析
[0167] 除非另有指明，本文中通過對DM分子進行測序測定的所有核巧酸序列都是用自 動DNA測序儀（例如來自應(yīng)用生物系統(tǒng)公司（Applied Biosystems, Inc.)的373型）測定 的。因此，如本領(lǐng)域中關(guān)于通過該自動手段測定的任何DNA序列而言已知的那樣，本文測定 的任何核巧酸序列可能含有一些錯誤。通常，通過自動方法測定的核巧酸序列與被測序DNA 分子的實際核巧酸序列有至少大約95%同一，更通常，至少大約96%至至少大約99. 9%同 一。可W通過本領(lǐng)域公知的其它手段，包括手動DNA測序法，來更為精確地測定實際序列。 如本領(lǐng)域中還已知的那樣，測定的核巧酸序列中較之實際序列的單個插入或缺失將引起在 核巧酸序列翻譯中移碼，從而，測定的核巧酸序列編碼的預(yù)測氨基酸序列可能從此類插入 或缺失之處開始與被測序DNA分子實際編碼的氨基酸序列完全不同。
[016引在另一方面，本發(fā)明提供了經(jīng)分離的核酸分子，其包含在嚴格雜交條件下與上文 所述的本發(fā)明核酸分子中多核巧酸的一部分雜交的多核巧酸。與多核巧酸的"一部分"雜 交的多核巧酸意指：與參照多核巧酸的至少大約15個核巧酸，更優(yōu)選地，至少大約20個核 巧酸，仍更優(yōu)選地，至少大約30個核巧酸，甚至更優(yōu)選地，超過30個核巧酸雜交的多核巧 酸值NA或RNA)。與參照片段雜交的該些片段可用作為診斷探針和引物。就本發(fā)明的目的 而言，當(dāng)兩條序列能在6XSSC，0. 5% SDS，5XDenhar化'S溶液和IOOy g非特異性運載體 (Carrier)DNA的雜交溶液中形成雙鏈復(fù)合體時，那么兩條序列就是能雜交的。見，Ausubel 等人，2. 9部分，supplement增刊27 (1994)。序列可在"中等嚴格度"下雜交，其被定義為： 在6XSSC，0.5% SDS，5XDenhar化'S溶液和IOOyg非特異性載體DNA的雜交溶液中，溫 度為6(TC。對"高嚴格度"雜交而言，溫度增加至68C。中等嚴格度雜交反應(yīng)之后，于室 溫下，在2XSSC加0.05% SDS中的溶液中對核巧酸洗涂5次，隨后在6(TC用0. IXSSC加 0. 1% SDS洗1小時。對于高嚴格度而言，洗涂溫度增加至68C。就本發(fā)明的目的而言，雜 交的核巧酸是使用Ing具有10, OOOcpm/ng的特異放射性的經(jīng)放射標記的探針探測到的那 些，其中，在-7(TC暴露給X-射線膠片不超過72小時后，雜交的核巧酸清晰可見。
[0169] 本申請涉及下述核酸分子，它們與SEQ ID NO ;1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、 21、23、49-158、159、160、163、168、173、178、183、188、193、198、203、208、215、220、225、 230、247、249、251、253、255、257、259、275-472、473、478、483、488、493、498、503、513、515、 517、519、521、533-575、576、581、586、591、596、601、603、605、607、609、621-767、768、773、 778、783、788、793、795、797、799、801、813-862、863、868、873、878、883、888、890、892、894、 896'908-1040、1041'1046、1051'1056'1061'1071'1073'1075'1077'1079、1081'1083、 1085、1087、1089、1091、1093、1095、1097、1099、1101、1103、1105、1107、1109、1111、1113、 1161-1571、1572、1577、1582、1587、1592、1597、1602、1607、1612、1617、1622、1627、1632、 1637、1642、1647、1652、1657、1662、1667、1672、1677、1682、1684、1686、1688、1690、1692、 1694、1696、1698、1700、1702、1704、1730-2039、2040、2045、2050、2055、2060、2065、2070、 2075、2080、2085、2090、2095、2100、2102、2104、2106、2108、2120-2338、2339、2344、2349、 2354、2359、2364、2366、2368、2370、2372、2384-2460、2461、2466、2471、2476 和 2481 中任 何序列所示的核酸序列至少 60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、 98%、99% 或 100% 同一。但是，優(yōu)選的是與 SEQ ID N0;l、3、5、7、9、ll、13、15、17、19、 21、23、49-158、159、160、163、168、173、178、183、188、193、198、203、208、215、220、225、 230、247、249、251、253、255、257、259、275-472、473、478、483、488、493、498、503、513、515、 517、519、521、533-575、576、581、586、591、596、601、603、605、607、609、621-767、768、773、 778、783、788、793、795、797、799、801、813-862、863、868、873、878、883、888、890、892、894、 896、908-1040、1041'1046'1051'1056'1061'1071'1073'1075'1077、1079、1081'1083、 1085、1087、1089、1091、1093、1095、1097、1099、1101、1103、1105、1107、1109、1111、1113、 1161-1571、1572、1577、1582、1587、1592、1597、1602、1607、1612、1617、1622、1627、1632、 1637、1642、1647、1652、1657、1662、1667、1672、1677、1682、1684、1686、1688、1690、1692、 1694、1696、1698、1700、1702、1704、1730-2039、2040、2045、2050、2055、2060、2065、2070、 2075、2080、2085、2090、2095、2100、2102、2104、2106、2108、2120-2338、2339、2344、2349、 2354、2359、2364、2366、2368、2370、2372、2384-2460、2461、2466、2471、2476 和 2481 所示的 核酸序列至少95 %、96 %、97 %、98 %、99 %或100 %同一的核酸分子。兩條核酸序列間的差 異可能發(fā)生于參照核巧酸序列的5'或3'末端的位置，或者該些末端位置之間的任何地 方，它們可W各自單獨地散布于參照序列的核巧酸中，或者散布在參照序列中的一個或多 個連續(xù)的組中。
[0170] 在實踐方面而言，任何特定核酸分子是否與參照核巧酸序列至少95%、96 %、 97%、98%或99%同一是指使用本領(lǐng)域公知的標準算法在兩個分子間進行的比較，該可W 使用公眾可獲得的計算機程序，例如BLASTN算法方便地測定。見，Altschul等人，Nucleic Acids Res. 25 :3389-:3402(1997)。
[0171] 在本發(fā)明的一種實施方案中，核酸包含具有大約15至大約30(例如，大約15、16、 17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30)個核巧酸的反義鏈，其中，所述反義鏈 與編碼下述蛋白質(zhì)的RNA序列或其一部分互補，所述蛋白質(zhì)能控制細胞周期或同源重組， 并且，其中，所述SiNA還包含具有大約15至大約30(例如，大約15、16、17、18、19、20、21、 22、23、24、25、26、27、28、29或30)個核巧酸的正義鏈，并且，其中，所述正義鏈和所述反義 鏈是不同的核巧酸序列，其中，每條鏈中至少大約15個核巧酸與另一條鏈互補。
[0172] 在一種實施方案中，本發(fā)明提供了能介導(dǎo)RNA干擾基因沉默的雙鏈核酸分子。在 另一實施方案中，本發(fā)明的SiNA分子由下述雙鏈體核酸分子構(gòu)成，所述核酸分子在包含大 約 15 至大約 30(例如，大約 15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30)個核 巧酸的寡核巧酸之間含有大約15至大約30個堿基對。在再一實施方案中，本發(fā)明的SiNA 分子包含具有大約1至大約32 (例如，大約1、2或3)個核巧酸的突出末端的雙鏈體核酸分 子，例如，大約21-核巧酸雙鏈體，其具有大約19個堿基對和3'端單核巧酸、二核巧酸或H 核巧酸突出端。在再一實施方案中，本發(fā)明的SiNA分子包含具有平端的雙鏈體核酸分子， 其中兩端均是平端，或者可選地，其末端之一是平末端。
[0173] 本發(fā)明的SiNA分子可包含經(jīng)修飾的核巧酸，并且同時保留介導(dǎo)RNAi的能力。經(jīng) 修飾的核巧酸可用于改善體外或體內(nèi)特征，例如，穩(wěn)定性、活性和/或生物利用性。例如，本 發(fā)明的SiNA分子可包含占SiNA分子中存在的核巧酸總數(shù)百分比的經(jīng)修飾核巧酸。同樣 地，一般而言，本發(fā)明的SiNA分子可包含大約5%至大約100%的經(jīng)修飾核巧酸（例如，大 約 5%、10%'15%'20%'25%'30%'35%'40%'45%'50%'55%'60%'65%'70%'75%、 80%、85%、90%、95%或100%的經(jīng)修飾核巧酸）。給定的31臟分子中存在的經(jīng)修飾核巧 酸的實際百分比將取決于SiNA中存在的核巧酸的總數(shù)。如果SiNA分子是單鏈的，那么百 分比修飾可基于單鏈SiNA分子中存在的核巧酸的總數(shù)。類似地，如果SiNA分子是雙鏈的， 那么，百分比修飾可基于正義鏈、反義鏈或正義和反義兩條鏈中存在的核巧酸的總數(shù)。
[0174] VII.核酸構(gòu)建體
[0175] 重組核酸載體，可W例如是線性質(zhì)?；蜷]合環(huán)狀質(zhì)粒。載體系統(tǒng)可W是單個載體 或質(zhì)粒或一起含有將引入細菌宿主基因組中的全部核酸的兩個或多個載體或質(zhì)粒。此外， 細菌載體可W是表達載體。例如，可在合適啟動子的控制下，將SEQ ID NO ;1、3、5、7、9、 11、13、15、17、19、21、23、49-158、159、160、161、162、163、168、173、178、183、188、193、198、 203、208、215、220、225、230、240-246、247、249、251、253、255、257、259、275-472、473、478、 483、488、493、498、503、508-512、513、515、517、519、521、533-575、576、581、586、591、596、 601、603、605、607、609、621-767、768、773、778、783、788、793、795、797、799、801、813-862、 863、868、873、878、883、888、890、892、894、896、908-1040、1041、1046、1051、1056、1061、 1066-1070、1071'1073、1075、1077、1079、1081'1083、1085、1087、1089、1091'1093、1095、 1097、1099、1101、1103、1105、1107、1109、1111、1113、1161-1571、1572、1577、1582、1587、 1592、1597、1602、1607、1612、1617、1622、1627、1632、1637、1642、1647、1652、1657、1662、 1667、1672、1677、1682、1684、1686、1688、1690、1692、1694、1696、1698、1700、1702、1704、 1730-2039、2040、2045、2050、2055、2060、2065、2070、2075、2080、2085、2090、2095、2100、 2102、2104、2106、2108、2120-2338、2339、2344、2349、2354、2359、2364、2366、2368、2370、 2372、2384-2460、2461、2466、2471、2476和2481示出的核酸分子或其片段適當(dāng)?shù)夭迦胼d 體，所述啟動子在一種或多種微生物宿主中發(fā)揮作用，W驅(qū)動所連的編碼序列或其它DNA 序列的表達。就此目的而言，很多種載體都是可獲得的，對合適的載體的選擇主要取決于將 插入載體的核酸的大小W及將用載體轉(zhuǎn)化的特定宿主細胞。每種載體都含有多種組分，該 取決于其功能（擴增DNA或表達DNA)和與其相容的特定宿主細胞。對于細菌轉(zhuǎn)化而言，載 體組分通常包括但不限于下述中的一種或多種；信號序列、復(fù)制起點、一種或多種可選擇標 記基因和誘導(dǎo)型啟動子，W允許外源DNA的表達。
[0176] 啟動子
[0177] 提到調(diào)控序列和結(jié)構(gòu)核巧酸序列時使用的"有效地連接"表示，調(diào)控序列能使得所 連接的結(jié)構(gòu)核巧酸序列受調(diào)控表達。"調(diào)控序列"或"控制元件"指位于結(jié)構(gòu)核巧酸序列上 游巧'非編碼序列）、內(nèi)部或下游（3'非翻譯序列）的核巧酸序列，其能影響轉(zhuǎn)錄的時間選 擇和水平或量、RNA加工或穩(wěn)定性或相關(guān)聯(lián)的結(jié)構(gòu)核巧酸序列的翻譯。調(diào)控序列可包括啟動 子、翻譯前導(dǎo)序列、內(nèi)含子、增強子、莖環(huán)結(jié)構(gòu)、阻抑物結(jié)合序列和聚腺巧酸化識別序列等。
[0178] 用于生產(chǎn)mRNA的表達載體還可含有誘導(dǎo)型啟動子，其可被宿主細菌生物體 識別，并且其與感興趣的核酸有效地連接，所述核酸編碼，例如，編碼玉米根蠻葉甲 (D. V. virgifera)mRNA的核酸分子或其片段。適用于細菌宿主的誘導(dǎo)型啟動子包括；目-內(nèi) 醜胺酶啟動子、大腸桿菌A瞻菌體化和PR啟動子和大腸桿菌半乳糖啟動子、阿拉伯糖啟 動子、堿性磯酸酶啟動子、色氨酸（trp)啟動子和乳糖操縱子啟動子及其變異W及雜合啟 動子，例如tac啟動子。但是，已知的其它細菌誘導(dǎo)型啟動子也是合適的。
[0179] 在某些實施方案中，基因可源自不同的昆蟲，W拓寬所述劑有效的昆蟲的范圍。 當(dāng)為了遏制或為了表達和遏制的組合祀向了多種基因時，可按照Fillatti,申請公開文本 No. US 2004-0029283的闡述和公開，來制造多順反子DNA元件。
[0180] 可選擇標記基因
[0181] 通常，本發(fā)明的重組DM載體或構(gòu)建體將包含可選擇標記，其賦予經(jīng)轉(zhuǎn)化的細胞 可選擇的表型?？蛇x擇標記還可用于選出含有編碼本發(fā)明的多膚或蛋白質(zhì)的外源核酸的細 胞。所述標記可編碼殺生物劑抗性，例如抗生素抗性（例如，卡那霉素、G418、博來霉素、潮 霉素等）?？蛇x擇標記的實例包括但不限于；neo基因，其編碼卡那霉素抗性，可使用卡那 霉素、G418等來加W選擇；bar基因，其編碼雙丙氨麟抗性；膳水解酶基因，其賦予對漠苯膳 的抗性；W及氨甲蝶嶺抗性的DHFR基因。此類可選擇標記的實例在美國專利5, 550, 318、 5, 633, 435、5, 780, 708 和 6, 118, 047 中有所闡述。
[0182] 本發(fā)明的重組載體或構(gòu)建體還可包括可篩選標記。可篩選標記可用于監(jiān)測表達。 示例性的可篩選標記包括；目-葡糖酵酸糖巧酶或UidA基因佑U巧，已知有多種顯色底物可 用于其編碼的酶（Jefferson，1987 Jefferson等人，1987);目-內(nèi)醜胺酶基因（Sutcliffe 等人，1978)，已知有多種顯色底物可用于該基因編碼的酶（例如，PADAC，顯色的頭抱菌 素）；英光素酶基因（Ow等人，1986);巧化基因狂Ukowsky等人，1983)，其編碼兒茶酷加雙 氧酶，該酶可轉(zhuǎn)化顯色的兒茶酷；a-淀粉酶基因（Ika化等人，1990);酪氨酸酶基因化atz 等人，1983)，其編碼能將酪氨酸氧化為DOPA和多己釀（進而縮合為黑色素）的酶；和a-半 乳糖巧酶，其催化顯色的a-半乳糖底物。
[0183] 可使用本領(lǐng)域中可獲得的方法，來容易地制備轉(zhuǎn)化載體。轉(zhuǎn)化載體包含一種或多 種下述核巧酸序列，所述序列能被轉(zhuǎn)錄為RNA分子并且與昆蟲基因組編碼的一種或多種核 巧酸序列充分同源和/或互補，從而，吸收所述RNA后，有害生物基因組中分別的核巧酸序 列中的至少一種的表達被下調(diào)。
[0184] VIII.用于遺傳工程的方法
[0185] 本發(fā)明包括將核巧酸序列引入生物，W使得一種或多種dsRNA分子W能抑制有害 生物的水平表達?？赏ㄟ^本領(lǐng)域已知用來將重組序列引入祀宿主細胞的標準流程，來將本 發(fā)明的多核巧酸和多膚引入宿主細胞，例如細菌或酵母細胞。此類流程包括但不限于：轉(zhuǎn) 染、感染、轉(zhuǎn)化、天然攝取、磯酸巧、電穿孔、顯微注射生物射彈和微生物介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方案。選 用的方法隨宿主生物而變化。
[0186] 本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因生物是該樣的生物，其包含其基因組中已穩(wěn)定整合了外源核酸的 至少一個細胞。因此，轉(zhuǎn)基因生物可僅在其結(jié)構(gòu)的某些部分含有經(jīng)遺傳修飾的細胞。
[0187] 因此，本發(fā)明還包括包含本文所述的任何核巧酸序列或重組DNA構(gòu)建體的轉(zhuǎn)基因 細胞或生物。本發(fā)明還包括原核細胞（例如但不限于，革蘭氏陽性和革蘭氏陰性細菌細胞） 和真核細胞（例如但不限于，酵母細胞或植物細胞）。
[018引例如，本發(fā)明包括將祀基因引入細菌，例如乳桿菌屬?？捎谜闲洼d體將核酸構(gòu)建 體整合進細菌基因組。通常，整合型載體含有與細菌染色體同源的至少一條序列，該允許載 體整合。整合看起來是載體和細菌染色體的同源DNA之間的重組導(dǎo)致的。例如，用來自多 種芽抱桿菌屬菌株的DNA構(gòu)建的整合型載體能整合進芽抱桿菌屬染色體巧P 0 127,328)。 整合型載體還可包含瞻菌體或轉(zhuǎn)座子序列。自殺載體也是本領(lǐng)域已知的。
[0189] 對含有上面列出的一種或多種組分的合適載體的構(gòu)建利用標準重組DNA技術(shù)來 進行。對經(jīng)分離的質(zhì)?；駾NA片段進行切割、加尾和重新連接，成為產(chǎn)生所需質(zhì)粒的理想形 式?？色@得的細菌表達載體的實例包括但不限于；多功能大腸桿菌克隆和表達載體，例如 Bluescript?(Stratagene，La Jolla, CA),其中，例如，玉米根蠻葉甲蛋白質(zhì)或其片段可與 目-半乳糖巧酶的氨基末端Met和隨后的7個殘基的序列符合讀框地連接進載體，由此產(chǎn)生 雜種蛋白質(zhì)；pIN 載體（Van Heeke and Schuster, 1989)等。
[0190] 本發(fā)明還包括向酵母細胞中引入祀基因。通常，酵母重組構(gòu)建體包括下述中的一 種或多種；啟動子序列、融合伴侶序列、前導(dǎo)序列、轉(zhuǎn)錄終止序列、可選擇標記。該些元件可 組合進表達盒，表達盒可W保持于復(fù)制子中，例如，能在宿主，例如酵母或細菌中穩(wěn)定保持 的染色體外元件（例如，質(zhì)粒）。復(fù)制子可具有兩套復(fù)制系統(tǒng)，由此允許其保持于，例如酵母 中（用于表達），W及保持于原核宿主中（用于克隆和擴增）。此類酵母-細菌穿梭載體的 例子包括 YEp24 (Botstein 等人，1979)、pCl/1 炬rake 等人，1984)和 YI?pl7 (Stinchcomb 等 人，1982)。此外，復(fù)制子可W是高拷貝數(shù)或低拷貝數(shù)的質(zhì)粒。通常，高拷貝數(shù)質(zhì)粒將具有大 約5至大約200之間的拷貝數(shù)，典型地，大約10至大約150。含有高拷貝數(shù)質(zhì)粒的宿主將優(yōu) 選具有至少大約10,更優(yōu)選至少大約20。
[0191] 有用的酵母啟動子序列可源自編碼代謝途徑的酶的基因。此類基因的實例包括： 醇脫氨酶（ADH)巧？ 0 284044)、帰醇化酶、葡糖激酶、葡糖-6-磯酸異構(gòu)酶、甘油酵-3-磯 酸-脫氨酶佑AP或GAPDH)、己糖激酶、果糖磯酸激酶、3-磯酸甘油酸變位酶和丙麗酸激 酶（P化）（EP 0 3215447)。編碼酸性磯酸酶的酵母P冊5基因還提供了有用的啟動子序 列（Myanohara等人，1983)。此外，天然不存在的合成啟動子也可作為酵母啟動子發(fā)揮作 用。此類雜種啟動子的實例包括與GAP轉(zhuǎn)錄激活區(qū)域相連的ADH調(diào)控序列（美國專利 No. 4, 876, 197和4, 880, 734)。轉(zhuǎn)錄終止子序列和其它酵母識別終止序列（例如，編碼糖酵 解酶的那些）的實例是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。
[0192] 或者，可用整合型載體將表達構(gòu)建體整合進酵母基因組。通常，整合型載體含有與 酵母染色體同源的至少一條序列，W允許載體整合，并且優(yōu)選在表達構(gòu)建體側(cè)翼含有兩條 同源序列。整合看起來是載體中和酵母染色體中同源DNA之間的重組產(chǎn)生的的rr-Weaver 等人，1983)。整合型載體可被引至酵母中的特定基因座，該通過選擇合適的同源序列包括 進載體來實現(xiàn)。見上文的化r-Weaver等人。一種或多種表達構(gòu)建體可W整合，該可能影響 產(chǎn)生的重組蛋白的水平化ine等人，1983)。
[0193] IX.定量對祀基因表達的抑制
[0194] 可通過測量內(nèi)源祀RNA或通過祀RNA的翻譯產(chǎn)生的蛋白質(zhì)，來定量對祀基因表達 的抑制，并且可W通過檢查細胞或生物的外部性質(zhì)來驗證抑制的結(jié)果。用于對RNA和蛋白 質(zhì)進行定量的技術(shù)是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員公知的。可獲得賦予對氨予青霉素、博來霉素、氯 霉素、慶大霉素、潮霉素、卡那霉素、林可霉素、氨甲蝶嶺、麟絲菌素、嘿嶺霉素、壯觀霉素、利 福霉素和四環(huán)素等的抗性的多種可選擇標記。
[0195] 在某些實施方案中，基因表達被抑制至少10%，優(yōu)選地，至少33%，更優(yōu)選地，至 少50 %，還更優(yōu)選地，至少80 %。在本發(fā)明的特別優(yōu)選的實施方案中，有害生物的細胞中， 基因表達被抑制至少80 %，更優(yōu)選地，至少90 %，更優(yōu)選地，至少95 %，或者至少99 %，所W 發(fā)生顯著的抑制。顯著的抑制意欲指該樣的顯著抑制，其產(chǎn)生可探測到的表型（例如，幼蟲 生長的停止、痛疾或死亡等）或可探測到的、對應(yīng)于被抑制的祀基因的RNA和/或蛋白質(zhì)的 減少。雖然在本發(fā)明的某些實施方案中，抑制在有害生物的幾乎所有細胞中發(fā)生，但是在其 它一些優(yōu)選的實施方案中，抑制僅在表達該基因的細胞亞群中發(fā)生。例如，如果將祀基因在 昆蟲消化道的細胞中發(fā)揮重要作用，那么對該些細胞中基因的抑制就足W向昆蟲施加有害 作用。
[0196] X.將有害生物暴露給dsRNA
[0197] 可W W允許將dsRNA施用給有害生物的任何合適方法將有害生物暴露給dsRNA。 例如，可將有害生物與純的或充分純的形式的dsRNA (例如，含有dsRNA的水溶液）接觸。在 一種實施方案中，用包含dsRNA的水溶液對昆蟲進行簡單"浸泡"或"噴霧"。可選地，可用 包含dsRNA的溶液對有害生物進行"噴霧"。
[019引或者，可將dsRNA與有害生物的食物組分（例如，針對哺乳動物病原性有害生物的 食物組分）相連，W增加昆蟲對dsRNA的攝取。有害生物的攝入允許有害生物控制劑被遞 送給有害生物，并且導(dǎo)致宿主中祀基因的下調(diào)。用于口服引入的方法可包括，例如，將dsRNA 與有害生物的食物直接混合，W及經(jīng)過改造的方案，其中，將用作為食物的物種改造為表達 dsRNA或SiRNA,然后將其喂飼給待被影響的有害生物。例如，可用祀序列轉(zhuǎn)化細菌，例如， 乳桿菌屬，然后將其喂飼給有害生物。在一種實施方案中，例如，可將dsRNA或SiRNA分子 慘入昆蟲膳食，或者置于其上。
[0199] 在其它實施方案中，可將有害生物與含有本發(fā)明dsRNA的組合物接觸。除了包含 dsRNA之外，組合物還可含有賦形劑、稀釋劑或載體。
[0200] 還可將dsRNA慘入有害生物生長或侵襲的介質(zhì)中。例如，可將dsRNA慘入到食物 容器或保護包裝中，作為抑制有害生物侵襲的手段。例如可用包含dsRNA的溶液處理木材， W預(yù)防有害生物侵襲。
[0201] 在其它實施方案中，dsRNA在細菌或真菌細胞中表達，并且所述細菌或真菌細胞被 昆蟲物種攝取或吃掉。
[0202] 如實施例所闡述的，可對細菌進行改造，W產(chǎn)生本發(fā)明的任何dsRNA或dsRNA構(gòu)建 體。該些細菌可被昆蟲物種吃掉。當(dāng)被攝取時，dsRNA可啟動RNAi應(yīng)答，導(dǎo)致祀mRNA的降 解，并且削弱或殺死進食的昆蟲?？蛇x地，可將產(chǎn)生dsRNA的細菌或酵母細胞直接噴霧到作 物上。
[0203] 一些細菌與宿主植物有著非常緊密的相互作用，例如但不限于，共生的根瘤菌屬 煙lizobium)和豆科（Legminosea)(例如，豆）。此類重組細菌科與種子混合（例如作為涂 層），W及用作為±壤改良物。
[0204] 特異性感染昆蟲的病毒，例如桿狀病毒也可使用。該確保了對哺乳動物（尤其是 人）的安全性，因為病毒將不會感染哺乳動物，因此將不存在不想要的RNAi作用。
[0205] 可能的應(yīng)用包括密集型溫室培養(yǎng)物，例如，從GMO的觀點來看較少興趣的作物，W 及范圍更廣的田間作物，例如豆類。
[0206] 該手段具有若干種優(yōu)點，例如，因為植物宿主可能切割的問題不存在，因此允許將 較大的dsRNA片段運送進進食的有害生物的腸腔；使用細菌作為殺昆蟲劑不涉及轉(zhuǎn)基因作 物的產(chǎn)生，尤其是對于難于獲得轉(zhuǎn)基因變體的某些作物而言；其具有寬廣的、靈活的應(yīng)用， 因為可在同一田間同時處理不同的作物和/或可同時祀向不同的有害生物，例如通過將產(chǎn) 生不同dsRNA的不同細菌組合起來。
[0207] XI.產(chǎn)品
[020引本發(fā)明提供了包含用于控制有害生物的dsRNA的多種產(chǎn)品。例如，本發(fā)明提供了 藥物或獸醫(yī)組合物，分別用于治療或預(yù)防人或動物的有害生物疾病或感染。此類組合物包 含：適于藥物用途的至少一種載體、賦形劑或稀釋劑W及至少一種dsRNA或RNA構(gòu)建體，或 編碼dsRNA或RNA構(gòu)建體的重組DNA構(gòu)建體或核巧酸序列，其中，所述RNA包含經(jīng)退火的互 補鏈，其中之一具有對應(yīng)于有害生物祀基因（導(dǎo)致疾病或感染）的祀核巧酸序列的核巧酸 序列。
[0209] 或者，藥物或獸醫(yī)組合物可用作為適于局部應(yīng)用的組合物，例如在動物或人的皮 膚上應(yīng)用。例如，dsRNA可用于將作為滴劑、凝膠劑、氣霧劑、乳膏劑、軟膏劑等應(yīng)用到皮膚上 的液體組合物中。此外，dsRNA可整合進透皮帖劑或其它醫(yī)藥設(shè)備，用于治療或預(yù)防疾病或 病癥。還可生產(chǎn)其它常規(guī)藥物劑量形式，包括片劑、膠囊劑、陰道栓、透皮貼劑、栓劑等。選 用的形式將取決于祀有害生物的性質(zhì)，W及因此也取決于想要治療的疾病的性質(zhì)。
[0210] 例如，可使用本發(fā)明的構(gòu)建體和方法來生產(chǎn)口服疫苗。例如，可通過在細菌（例 女口，乳桿菌屬）中生產(chǎn)dsRNA(其可被包括進食物，并作為針對昆蟲侵襲的口服疫苗發(fā)揮作 用）來構(gòu)建疫苗。因此，本發(fā)明提供了用于治療和/或預(yù)防有害生物疾病或病癥的構(gòu)建體 和方法，所述方法包括向需要此類治療和/或預(yù)防的受試者施用本文所述的任何組合物， 所述組合物包含至少一種雙鏈RNA或雙鏈RNA構(gòu)建體，其包含經(jīng)退火的互補鏈，其中之一具 有與有害生物祀基因（導(dǎo)致疾病或病癥）的核巧酸序列至少一部分互補的核巧酸序列。
[0211] 雖然本發(fā)明的組合物可用于在受試患者中治療疾病或病癥，但是組合物和方法還 可用作為保護基底或材料免受有害生物侵襲的手段。包括進組合物的賦形劑的性質(zhì)和組合 物的物理形式可根據(jù)想要處理的基底的性質(zhì)變化。
[0212] 例如，此類組合物可W是涂層或粉末，其可應(yīng)用到基底上，作為保護基底免受昆蟲 侵襲W及由此預(yù)防有害生物導(dǎo)致的對基底或材料的損傷的手段。因此，在一種實施方案中， 組合物是合適表面上的涂層形式，其黏附到與所述涂層接觸的昆蟲上并最終被其攝入。此 類組合物可用于保護對于有害生物導(dǎo)致的侵襲或損傷易感的任何基底或材料，例如食物或 其它易壞的材料W及基底，例如木材。
[0213] 例如，組合物可W是液體，其被刷到或噴霧到待處理的材料或基底上或烙印進其 中。因此，人類使用者可用該組合物對昆蟲或基底直接噴霧。
[0214] 例如，房屋和其它木質(zhì)產(chǎn)品可W被白蟻、棲粉甲蟲和木蟻損壞?？蒞通過用包含 dsRNA的組合物處理木材或房屋墻板，來降低有害生物的侵襲。同樣，可用包含dsRNA的組 合物來處理樹干。
[0215] 粉甲蟲、谷類象鼻蟲、大斑粉頓和其它有害生物在膽藏谷類、谷物、寵物食品、粉末 巧克力W及廚房食品室中不受保護的幾乎所有其它物品上進食。因此，本發(fā)明提供了用包 含祀dsRNA的組合物處理谷物盒和其它食物膽藏容器W及包裝的手段。
[0216] 衣蛾幼蟲取食用動物產(chǎn)品，例如皮毛、絲和毛線制造的衣物。因此，可能想要用本 發(fā)明的dsRNA的來處理衣架、衣樞和衣物袋。書風(fēng)和蠢蟲是圖書館的有害生物，因為它們吃 圖書粘合物中的淀粉膠。因此，本發(fā)明提供了處理圖書免遭有害生物侵襲和破壞的組合物。
[0217] 在一種實施方案中，組合物是巧料形式。巧料被設(shè)計來引誘昆蟲與組合物接觸。與 其接觸后，組合物被昆蟲內(nèi)在化（例如通過攝入來實現(xiàn)），并介導(dǎo)RNAi,由此殺死昆蟲。巧 料可W取決于被祀向的物種。還可使用引誘劑。引誘劑可W是信息素，例如雄性或雌性信 息素。引誘劑作用于將昆蟲引誘到巧料上，其可W祀向特定的昆蟲，或者可W吸引全范圍的 昆蟲。巧料可W是任何合適的形式，例如，固體、糊狀、團塊或粉末狀形式。
[021引巧料還可W被昆蟲運回其群落。然后巧料可用作群落中其它成員的食物來源發(fā)揮 作用，由此提供對大量昆蟲W及有可能整個昆蟲有害生物群落的有效控制。該是與使用雙 鏈RNA或表達本發(fā)明的dsRNA的細菌相關(guān)的優(yōu)點，因為RNAi介導(dǎo)的對有害生物的影響的延 遲作用允許巧料被運回群落，由此在暴露給昆蟲的方面帶來了最大的作用。
[0219] 巧料可W W合適的"屋化OUSing)"或"陷阱"提供。此類屋和陷阱是商業(yè)可獲得 的，現(xiàn)有的陷阱可被改造W包括進本發(fā)明的組合物。屋或陷阱可W是盒形的，例如，可W W 預(yù)先成型的條件提供，或者可W是例如可折疊的卡紙板的形式。用于屋或陷阱的合適材料 包括塑料和卡紙板，特別是波狀卡片板。陷阱的內(nèi)表面可W帶有粘性物質(zhì)，從而昆蟲一旦進 入陷阱行動即受限制。屋或陷阱可含有合適的槽狀內(nèi)部，其可將巧料保持于合適的位置。陷 阱與屋不同，因為昆蟲在進入之后不能輕易離開陷阱，而屋則扮演"進食站"的作用，其向昆 蟲蜘蛛類提供優(yōu)選的環(huán)境，在那里它們進食并且有安全感（沒有捕食者）。
[0220] 顯而易見，可用本發(fā)明的組合物處理大量的產(chǎn)品和基底，W降低有害生物侵襲。當(dāng) 然，賦形劑的性質(zhì)和組合物的物理形式可根據(jù)想要處理的基底的性質(zhì)變動。例如，組合物可 W是液體，其被刷到或噴霧到待處理的材料或基底上或烙印進其中，或者是涂層，其被應(yīng)用 到待處理的材料或基底上。
[0221 ] 'k'k'k'k'k'k'k'k'k'k'k'k'k'k'k'k'k'k'k'k'k'k'k'k'k'k'k'k'k'k'k'k
[0222] 下文提供了關(guān)于鑒定祀序列，W及將所述序列引入多種細胞和組合物的方法的特 定實施例。它們僅作示例用，而非對本發(fā)明加W限制。
[0223] 實施例1 ;在高通量篩選中沉默漂亮新小桿線蟲中的漂亮新小桿線蟲祀基因
[0224] 在PGN9A載體（WO 01/88121)中制備漂亮新小桿線蟲全基因組文庫，其處于兩個 相同的T7啟動子和終止子之間，在T7聚合酶表達（被IPTG誘導(dǎo)）的情況下驅(qū)動其在正義 和反義方向上的表達。
[0225] 將該文庫轉(zhuǎn)化進96孔板形式中的細菌菌株AB301-105(DE3)中。為進行全基因組 篩選，將該些細菌細胞喂飼給核酸酶缺陷型漂亮新小桿線蟲nuc-1 (el392)株系。
[0226] 按照下文所述，在96孔板形式中將細菌菌株AB301-105 (DE3)產(chǎn)生的dsRNA喂飼 給漂亮新小桿線蟲nuc-1 (el392)蟲：將nuc-1卵轉(zhuǎn)移至單獨的板上，令其同時在2(TC賠 化，W使得Ll世代同步。向96孔板中裝入100 y L包含IPTG的液體培養(yǎng)基W及10 y L漂 亮新小桿線蟲dsRNA文庫的AB301-105(DE3)細菌細胞培養(yǎng)物（ODe。。為1)，所述文庫每個都 攜帶有具漂亮新小桿線蟲基因組片段的載體，用于表達dsRNA。向每個孔中加入4只同步的 Ll蟲，在25C賠育至少4至5天。該些實驗都采用一式四份來進行。在篩選中使用6個對 昭.
[0227] pGN29 =陰性對照，野生型
[0228] pGZl = unc-22 =顫搖者表型
[0229] PGZ18 =幾下質(zhì)合酶=胚胎致死
[0230] pGZ25 = pos-1 =胚胎致死
[0231] pGZ59 = bli-4D =急性致死
[0232] ACC =己醜輔酶A駿化酶=急性致死
[0233] 5天后，將用產(chǎn)生dsRNA的細菌喂飼的漂亮新小桿線蟲nuc-1 (el392)蟲的表型與 用空載體（PGN29)和其它對照喂飼的蟲的表型相比較。針對致死性（急性或幼蟲），親本 (Po)世代的致死性，第一子代（Fl)世代的（胚胎）致死性，或者針對化的生長延緩，對用 dsRNA喂飼的蟲加W篩選，該按照下文所述來進行；（i)化的急性致死性；Ll蟲沒有發(fā)育并 且死亡，該表型沒有產(chǎn)生子代，孔看起來相當(dāng)?shù)乜?；（ii)化的（幼蟲）致死性：化在Ll之后 的期死亡，該表型也沒有產(chǎn)生子代。在孔中發(fā)現(xiàn)了死亡的幼蟲或死亡的成蟲；（iii)Fl的致 死性；Ll蟲發(fā)育到成年期，并且仍然活著。該表型沒有子代。該可能是由于不育、胚胎致死 性（在孔底有死亡的卵）、胚胎停止或幼蟲停止（最終死亡）；（iv)生長停止或生長延緩/ 延遲；與具有正常發(fā)育或正常子代#的孔比較。
[0234] 對于表IA中示出的祀序列而言，我們推斷出，dsRNA介導(dǎo)的線蟲（例如漂亮新小 桿線蟲）中漂亮新小桿線蟲祀基因的沉默對于蟲的生長和生存能力具有致命影響。
[0235] 上述dsRNA沉默實驗之后，在24孔板上，W高通量模式，在漂亮新小桿線蟲中進行 了更為詳細的表型實驗。按照下文所述，將上文所述的細菌菌株AB301-105(DE3)中產(chǎn)生 的dsRNA文庫喂飼給24孔板上的漂亮新小桿線蟲nuc-1 (el392)蟲：將nuc-1卵轉(zhuǎn)移至單 獨的板上，令其同時在2(TC賠化，W使得Ll世代同步。隨后，將100只同步的Ll蟲浸泡于 500 y L S-完全喂飼培養(yǎng)基（包含5 y g/mL膽固醇、4 y L/mL PEG和ImM IPTG)和500 y L 漂亮新小桿線蟲dsRNA文庫的AB301-105(DE3)細菌細胞培養(yǎng)物（ODe。。為1)中，所述文庫 每個都攜帶有具漂亮新小桿線蟲基因組片段的載體，用于表達dsRNA。在25C對浸泡的Ll 蟲進行2小時搖晃。
[0236] 離也并除去950 U L上清液之后，將5 U L剩余的且重息的沉淀（包含大約10至15 只蟲），轉(zhuǎn)移進24孔板的每個孔的中部，所述孔裝有瓊脂LB肉湯層。在25C對經(jīng)接種的板 進行2天賠育。在成年期，單獨選出1只成蟲并在25C賠育2天，W觀察其子代。對其它成 蟲的觀察在原來的24孔板上原位進行。該些實驗一式四份進行。
[0237] 用第二批蟲重復(fù)進行該種詳細的表型篩選，唯一的不同在于，第二批蟲在2(TC賠 育3天。
[023引將用漂亮新小桿線蟲dsRNA喂飼的蟲的表型與用空載體喂飼的漂亮新小桿線蟲 nuc-1 (el392)蟲的表型相比較。
[0239] 基于該實驗推斷出；對表IA中示出的漂亮新小桿線蟲祀基因的沉默對于蟲的生 長和生存能力有致命影響，該祀基因?qū)€蟲生存能力來說是重要的。因此，該些基因是通過 dsRNA介導(dǎo)的基因沉默控制（殺死或防止其生長）線蟲的良好祀基因。因此，本發(fā)明包括上 述漂亮新小桿線蟲祀基因的線蟲直向同源物在多種生物和材料中控制線蟲侵襲的用途。
[0240] 實施例2 ;對黑尾果禍直向同源物的鑒定
[0241] 如上文實施例1中所述，鑒定出了多種漂亮新小桿線蟲致死序列，它們可用于鑒 定其它物種和屬中的直向同源物。例如，可用漂亮新小桿線蟲致死序列來鑒定直向同源的 黑尾果禍序列。目P，可用每條漂亮新小桿線蟲序列就黑尾果禍中的直向同源序列去檢索公 共數(shù)據(jù)庫，例如GenBank。選出可能的黑尾果禍直向同源物，其享有高度序列同源性巧值 優(yōu)選小于或等于1E-30)，并且序列是blast相互最佳擊中化it)，后者表明來自不同生物體 (例如漂亮新小桿線蟲和黑尾果禍）的序列是彼此最高的blast擊中。例如，使用BLAST， 將來自漂亮新小桿線蟲的序列C與黑尾果禍中的序列相比。如果黑尾果禍序列D是序列C 的最佳擊中，并且當(dāng)將D與漂亮新小桿線蟲的所有序列進行比較時也得到序列C，那么D和 C就是相互最佳擊中。該標準通常用于定義直向同源性，該表示不同物種中具有相似功能的 相似序列。黑尾果禍序列標識符示于表IA中。
[024引實施例3 ;馬鈴墓葉甲（馬鈴墓甲蟲）
[0243] A.從馬鈴墓葉甲克隆部分基因序列
[0244] 按照廠商說明書，使用TRIzol試劑（目錄化.15596-026/15596-018,英杰生命 科學(xué)公司（Invitrogen)，Rockville, Maiyland, USA)，從馬鈴墓葉甲（馬鈴墓甲蟲的來源： Jeroen van Schaik, Entocare CV Biologische Gewasbescherming, Postbus 162,6700AD Wageningen，荷蘭）的四種不同幼蟲期分離高質(zhì)量的完整RNA。按照廠商說明書（目錄 化.1700,普洛麥格公司（Promega))，通過面ase處理，除去RNA制備中存在的基因組DNA。 按照廠商說明書，使用可商購試劑盒（SuperScript?ni逆轉(zhuǎn)錄酶，目錄化.18080044,英杰 生命科學(xué)公司（Invihogen)，Rockville, Ma巧land, USA)，產(chǎn)生 cDNA。
[0245] 為分離出包含 LDOOl、LD002、LD003、LD006、LD007、LDOlO、LDOll、LD014、LD015、 LD016和LD018基因的部分的cDNA序列，按照廠商說明書，使用Amplitaq Gold(目錄 化.N8080240,應(yīng)用生物系統(tǒng)公司（Applied Biosystems))，用簡并引物進行一系列PCR反 應(yīng)。
[0246] 用于擴增每條基因的簡并引物的序列給于表2-LD中，該表展示了馬鈴墓葉甲祀 基因，包括引物序列和獲得的CDNA序列。該些引物用于各PCR反應(yīng)中，其中采用如下條件： 95C 10分鐘，接著進行40個95C 30砂、55C 1分鐘和72C 1分鐘的循環(huán)，接著在72C 10分 鐘。在瓊脂糖凝膠上分析得到的PCR片段，將其純化（QIAquick凝膠提取試劑盒（QIAquick Gel Extraction kit),目錄化.28706,快而精公司（Qiagen)),克隆進 pCR8/GW/topo 載體 (目錄化.K250020,英杰生命科學(xué)公司（Invitrogen)),并測序。得到的PCR產(chǎn)物的序列由 表2-LD給出的各SEQ ID NO示出，它們被稱為部分序列。相應(yīng)的部分氨基酸序列由表3-LD 中給出的各SEQ ID NO示出，其中，讀框的起點用括號示出。
[0247] B.馬鈴墓葉甲基因的dsRNA產(chǎn)生
[0248] 使用可商購試劑盒T7化bomax?Express RNAi系統(tǒng)（目錄化.P1700,普洛麥格公 司（Promega)),合成毫克級的dsRNA。首先，在兩個分別的PCR反應(yīng)中產(chǎn)生兩種分別的單 5' T7RNA聚合酶啟動子模板，每個反應(yīng)含有相對T7啟動子而言不同方向的祀序列。
[0249] 就每種祀基因而言，使用特異性的T7正向引物和特異性的反向引物來產(chǎn)生正義 T7模板。用于擴增每種祀基因的正義模板的各引物的序列給于表8-LD中。PCR反應(yīng)條 件如下所述；95°C 4分鐘，接著是35個95C 30砂、55C 30砂和72C 1分鐘的循環(huán)，接著 在72C 10分鐘。在采用與上述相同的條件的PCR反應(yīng)中，使用特異性正向引物和特異性 T7反向引物來產(chǎn)生反義T7模板。用于擴增每種祀基因的反義模板的各引物的序列給于 表8-LD中。在瓊脂糖凝膠上分析得到的PCR產(chǎn)物，通過PCR純化試劑盒（Qiaquick PCR Purification Kit,目錄化.28106,快而精公司（Qiagen))對其進行純化，并進行化〔1〇4沉 淀。將產(chǎn)生的T7正向和反向模板混合起來W被轉(zhuǎn)錄，將得到的RNA鏈退火，用面ase和 RNase進行處理，并且通過己酸軸純化，該都按照廠商說明書來進行。針對每種祀基因得到 的dsRM的正義鏈示于表8-LD中。表8-LD展示了用于制備馬鈴墓葉甲祀序列的dsRNA片 段和多聯(lián)體序列的序列，包括引物序列。
[0巧0] C.使用人工膳食，就對馬鈴墓葉甲的活性來篩選dsRNA祀
[0巧1] 用于馬鈴墓甲蟲的人工膳食如下文所述來制備（對Gelman等人，2001，J. Ins. Sc.，卷1，號7,1-10做了一些改變）；對水和瓊脂進行高壓滅菌，當(dāng)溫度降到55°C時加入剩 余的成分（如下表2所示）。在該溫度，將成分很好地混合起來，之后將膳食等分到24孔板 (納恩克公司（Nunc)),每孔的量為Iml膳食。通過在室溫冷卻，令人工膳食固化。將膳食 膽存于4C，可膽存多達3周。
[0巧2] 表2;人工膳食的成分
[0 巧 3]

【權(quán)利要求】
1. 經(jīng)分離的雙鏈RNA分子，其包含經(jīng)退火的雙鏈，其中所述退火的鏈的至少一條鏈包 含選自以下的多核苷酸： (a) 與靶基因的至少21個連續(xù)核苷酸互補的多核苷酸，所述靶基因通過以下任一所 示：SEQ ID N0:ll、253、517、605、797、892、1089、1115、2104、l、3、5、7、9、13、15、17、19、21、 23、159、160、161、162、247、249、251、255、257、259、513、515、519、521、601、603、607、609、 793、 795、799、801、888、890、894、896、1071、1073、1075、1077、1079、1081、1083、1085、1087、 1091、 1093、1095、1097、1099、1101、1103、1105、1107、1109、1111、1113、1682、1684、1686、 1688、 1690、1692、1694、1696、1698、1700、1702、1704、2100、2102、2106、2108、2364、2366、 2368、 2370 和 2372 ; (b) 與靶基因的至少21個連續(xù)核苷酸互補的多核苷酸，所述靶基因編碼如下任一所 示的氨基酸序列：SEQ ID N0:12、254、518、606、798、893、1090、1116、2105、2、4、6、8、10、 14、16、18、20、22、24、248、250、252、256、258、260、514、516、520、522、602、604、608、610、 794、 796、800、802、889、891、895、897、1072、1074、1076、1078、1080、1082、1084、1086、1088、 1092、 1094、1096、1098、1100、1102、1104、1106、1108、1110、1112、1114、1683、1685、1687、 1689、 1691、1693、1695、1697、1699、1701、1703、1705、2101、2103、2107、2109、2365、2367、 2369、 2371 和 2373 ;以及 (c) 與（a)或（b)的多核苷酸具有至少85%序列同一性的多核苷酸； 其中有害生物接觸所述多核苷酸抑制與所述多核苷酸基本互補的所述有害生物的多 核苷酸表達。
2. 權(quán)利要求1的雙鏈RNA分子，其中有害生物接觸所述多核苷酸抑制所述有害生物的 生長、發(fā)育或繁殖。
3. 編碼權(quán)利要求1或2的雙鏈RNA分子的分離的多核苷酸或多核苷酸組。
4. 編碼權(quán)利要求1或2的雙鏈RNA分子的載體系統(tǒng)。
5. 用權(quán)利要求3的多核苷酸或多核苷酸組或權(quán)利要求4的載體系統(tǒng)轉(zhuǎn)化的細胞，所述 細胞不是植物細胞。
6. 權(quán)利要求5的細胞，其中，所述細胞是細菌、酵母或藻類細胞。
7. 包含權(quán)利要求6的細胞的食物產(chǎn)品。
8. 權(quán)利要求7的食物產(chǎn)品，其中所述食物產(chǎn)品是貯藏谷類、寵物食品或粉末巧克力。
9. 包含權(quán)利要求1或2的雙鏈RNA分子的組合物。
10. 權(quán)利要求9的組合物，其中，所述組合物是噴霧劑、粉末、團塊、凝膠、膠囊、食物產(chǎn) 品、衣物袋或圖書。
11. 控制有害生物侵襲的方法，所述方法包括將有害生物暴露給包含權(quán)利要求1或2的 雙鏈RAN分子的組合物。
12. 包含權(quán)利要求1或2的雙鏈RNA分子的有害生物。
13. 保護物體免受有害生物侵襲的方法，所述方法包括用包含權(quán)利要求1或2的雙鏈 RNA分子的組合物來處理所述表面。
14. 權(quán)利要求13的方法，其中，所述物體是木材、樹、圖書粘合物、布或食物貯藏容器。
15. 根據(jù)權(quán)利要求1或2的雙鏈RNA分子、根據(jù)權(quán)利要求3的分離的多核苷酸或多核苷 酸組、根據(jù)權(quán)利要求4的載體系統(tǒng)、根據(jù)權(quán)利要求5或6的細胞、根據(jù)權(quán)利要求7或8的食 物產(chǎn)品、根據(jù)權(quán)利要求9或10的組合物或根據(jù)權(quán)利要求12的有害生物用于預(yù)防或處理昆 蟲侵襲的用途。
【文檔編號】A01P5/00GK104357447SQ201410589894
【公開日】2015年2月18日 申請日期:2006年9月18日 優(yōu)先權(quán)日:2005年9月16日
【發(fā)明者】R·拉馬克斯, P·菲爾德曼, G·普萊廷克, I·諾仁, E·范布勒, F·佩克爾, L·庫布勒, N·達默, L·德拉格夫, I·雷莫里, T·博蓋爾特 申請人:德福根有限公司