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一種生產(chǎn)芍藥雙苷的方法

文檔序號:224263閱讀:295來源:國知局
一種生產(chǎn)芍藥雙苷的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種生產(chǎn)芍藥雙苷的方法,包括:將外植體消毒后接入誘導(dǎo)培養(yǎng)基中誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織;將所述愈傷組織接入增殖培養(yǎng)基,光照條件下進(jìn)行繼代培養(yǎng)后,繼代培養(yǎng)完成后從愈傷組織中提取芍藥雙苷。與栽培芍藥的芍藥雙苷含量相比,本發(fā)明培養(yǎng)的愈傷組織中芍藥雙苷的含量與其相當(dāng)甚至更高,但芍藥雙苷的積累時間卻從2~4年縮短到30~60天,而且整個過程中可以避免土壤、水等環(huán)境中農(nóng)藥殘留、重金屬等有害物質(zhì)的污染。因此,利用本方法生產(chǎn)芍藥雙苷,不僅可以顯著生產(chǎn)時間、降低生產(chǎn)成本,而且生產(chǎn)的芍藥雙苷具有更高的安全性。
【專利說明】一種生產(chǎn)芍藥雙苷的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及天然藥物提取【技術(shù)領(lǐng)域】,尤其涉及一種生產(chǎn)芍藥雙苷的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]芍藥(Paeonia lactiflora Pal1.)為芍藥科芍藥屬(Paeonia)多年生宿根草本植物,具有悠久的栽培歷史,自古以來深受人們喜愛,被譽為“花相”。
[0003]芍藥不僅是一種觀賞植物,還是一種藥用植物。芍藥的根可入藥,采收后直接曬干者為赤芍,采收后置沸水中煮后除去外皮或去皮后再煮曬干者為白芍。赤芍具有清熱涼血、散瘀止痛功能,用于治療熱入營血,溫毒發(fā)斑、吐血衄血、目赤腫痛、肝郁脅痛、經(jīng)閉痛經(jīng)、癥瘕腹痛、跌撲損傷、癰腫瘡瘍;白芍具有養(yǎng)血調(diào)經(jīng)、斂陰止汗、柔肝止痛、平抑肝陽功能,用于治療血虛萎黃、月經(jīng)不調(diào)、自汗、盜汗、脅痛、腹痛、四肢攣痛、頭痛眩暈。包括赤芍和白芍的芍藥是一種常用中藥材,其主要有效成分都是芍藥苷和芍藥內(nèi)酯苷,這兩種成分被統(tǒng)稱為芍藥雙苷?,F(xiàn)代藥理實驗表明,芍藥雙苷能通過多個途徑抑制人體的自身免疫性反應(yīng),故具有抗炎、止痛、保肝和抗自身免疫等多種藥理作用。目前,以芍藥雙苷為有效成分的芍藥雙苷膠囊已用于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的臨床治療,并取得了較好的治療效果。
[0004]隨著芍藥雙苷的藥用價值日漸受到重視、應(yīng)用范圍日漸拓寬,芍藥雙苷的生產(chǎn)已成為了限制芍藥雙苷普遍應(yīng)用的一個重要因素。
[0005]芍藥雙苷的傳統(tǒng)制備方法是先種植芍藥,待芍藥生長2~4年后挖取芍藥根,經(jīng)曬干炮制得到赤茍或白茍。制藥企業(yè)從白茍產(chǎn)地收購赤茍或白茍后再從中分離提取茍藥雙苷。由于芍藥生長周期長,所以整個生產(chǎn)過程周期較長。此外,赤芍和白芍中芍藥雙苷的含量較低,一般為干重的2%左右,而且芍藥雙苷的含量還受到芍藥生長產(chǎn)地、季節(jié)和氣候,以及栽培管理水平等多種因素的影響而常常導(dǎo)致存在較大波動,使得從赤芍或白芍中提取芍藥雙苷的成本高、效率低,不僅產(chǎn)量有限,而且最終產(chǎn)品的價格也居高不下。這些不足也是傳統(tǒng)天然藥物提取和生產(chǎn)所面臨的普遍性問題。
[0006]基于上述不足,人們嘗試采用植物細(xì)胞工程手段,在工廠中進(jìn)行植物細(xì)胞的大規(guī)模培養(yǎng),并通過對培養(yǎng)條件的控制和優(yōu)選,提高植物細(xì)胞中有效成分的含量、縮短有效成分積累的時間、保證有效成分濃度的穩(wěn)定,從而縮短生產(chǎn)時間、降低生產(chǎn)成本、增大生產(chǎn)規(guī)模。目前利用植物組織培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)次生代謝物質(zhì)的方法已在多種藥用植物上取得了成功,如人參、三七、洋地黃等藥用植物中的皂苷物質(zhì)都已開始通過植物細(xì)胞的規(guī)?;囵B(yǎng)進(jìn)行生產(chǎn)。
[0007]為了滿足廣大患者對芍藥雙苷藥物的需求、降低患者用藥的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān),也有必要采用植物細(xì)胞的規(guī)?;囵B(yǎng)技術(shù)對芍藥雙苷的生產(chǎn)方法進(jìn)行更新,降低生產(chǎn)成本、縮短生產(chǎn)時間。但迄今為止,尚未有任何專利或研究文獻(xiàn)報道這種方法,而且,目前關(guān)于茍藥愈傷組織培養(yǎng)的技術(shù)也主要集中在愈傷誘導(dǎo)、植株再生方面,并未有關(guān)于愈傷組織中芍藥雙苷的含量和產(chǎn)量的研究。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明提供了一種生產(chǎn)芍藥雙苷的方法,通過特定條件下誘導(dǎo)愈傷組織,大大縮短了生產(chǎn)時間、降低了成本,且保證了芍藥雙苷在愈傷組織中具有較高的含量。
[0009]一種生產(chǎn)芍藥雙苷的方法,包括:
[0010](I)將芍藥外植體消毒后接入誘導(dǎo)培養(yǎng)基中誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織;
[0011 ] (2)將所述愈傷組織接入增殖培養(yǎng)基,光照條件下進(jìn)行繼代培養(yǎng),繼代培養(yǎng)完成后從愈傷組織中提取芍藥雙苷;
[0012]其中,所述的增殖培養(yǎng)基為:
[0013]含有0.5~0.75mg/L6-節(jié)氛基嘿呤、0.5~lmg/L蔡乙酸和0.025~0.lmg/L脫葉靈的1/2MS或WPM培養(yǎng)基,其中,1/2MS或WPM培養(yǎng)基含有25~35g/L蔗糖和6~8g/L瓊脂。
[0014]增殖培養(yǎng)基不僅影響著愈傷組織的增殖倍數(shù),同時也影響著愈傷組織中芍藥雙苷的含量,本申請的增殖培養(yǎng)基中選用6-芐氨基嘌呤、萘乙酸和脫葉靈的激素組合,并控制每種激素的合理用量,不僅可以使愈傷組織較快的生長,同時還能夠提高愈傷組織中芍藥雙苷的含量。
[0015]進(jìn)一步優(yōu)選的,所述增殖培養(yǎng)基為:
[0016]含有0.5mg/L6-芐氨基嘌呤、lmg/L萘乙酸和0.lmg/L脫葉靈的1/2MS或WPM培養(yǎng)基,其中,1/2MS或WPM培養(yǎng)基含有30g/L蔗糖和8g/L瓊脂。
[0017]一般,所述增殖培養(yǎng)基的pH為4.5~7.0。
[0018]所述芍藥可以為安徽亳州、浙江金華等地栽培的各種芍藥種植品種,具體品種可以為“蒲棒”、“線條”、“蔴茬”或“雞爪”。
[0019]所述的外植體可以為莖、葉柄、葉片或根。
[0020]對外植體消毒時,所用的消毒劑可以為酒精、升汞、次氯酸鈉、過氧化氫等。為了達(dá)到更好的消毒效果,避免污染,通常將多種消毒劑配合使用,并嚴(yán)格控制消毒的時間,防止殺死外植體細(xì)胞,影響誘導(dǎo)率。
[0021]所述消毒的方法為:將芍藥的外植體清洗干凈后,70~75%酒精消毒10~60s后,用2~10%NaC10浸泡5~30min后,清洗干凈。
[0022]誘導(dǎo)培養(yǎng)基是外植體脫分化的關(guān)鍵因素,在培養(yǎng)基中添加外源激素可以誘導(dǎo)外植體脫分化形成愈傷組織,影響愈傷組織的質(zhì)量,從而影響最終愈傷組織中芍藥雙苷的含量。由于愈傷組織是外源激素與植物外植體內(nèi)源激素相互作用的結(jié)果,而不同種植物外植體內(nèi)源激素的錯綜復(fù)雜及內(nèi)源激素與外源激素作用機(jī)理的不同,導(dǎo)致了不同種植物的外植體所需添加的激素的種類、激素的含量、激素的配比都有很大差別。
[0023]所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基為:
[0024]含0.5~2mg/L6_節(jié)氨基嘌呤、0.2~lmg/L萘乙酸和0.2~0.5mg/L2,4_ 二氯苯氧基乙酸的MS、1/2MS或WPM培養(yǎng)基,其中,MSU/2MS或WPM培養(yǎng)基含有25~35g/L蔗糖和6~8g/L瓊脂。
[0025]進(jìn)一步優(yōu)選的,所述的誘導(dǎo)培養(yǎng)基為:
[0026]含2mg/L6-芐氨基嘌呤、0.2mg/L萘乙酸和0.2mg/L2,4_ 二氯苯氧基乙酸的MS、1/2MS或WPM培養(yǎng)基,其中,MSU/2MS或WPM培養(yǎng)基含有30g/L蔗糖和8g/L瓊脂。[0027]若選擇1/2MS作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基時,該1/2MS培養(yǎng)基中Ca2+濃度一般為0.003mol/L0[0028]一般,所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基的pH為4.5~7.0。
[0029]除了誘導(dǎo)培養(yǎng)基外,誘導(dǎo)培養(yǎng)條件也影響愈傷組織的誘導(dǎo)率,一般的,所述誘導(dǎo)的溫度為18~30°C,時間為18~60天,誘導(dǎo)時,光照時間為8~20小時/天,光照強度為800~25001x ;優(yōu)選的,所述誘導(dǎo)的溫度為22~25°C,時間為20~30天,光照時間為12~16小時/天,光照強度為1200~16001x ;更優(yōu)選的,所述誘導(dǎo)的溫度為24°C,時間為25天,光照時間為14小時/天,光照強度為15001x。
[0030]另外,繼代培養(yǎng)的條件也影響著愈傷組織中芍藥雙苷的含量,所述繼代培養(yǎng)的溫度為18~30°C,光照時間為8~20小時/天,光照強度為800~25001x ;優(yōu)選的,所述繼代培養(yǎng)的溫度為22~25°C,光照時間為12~16小時/天,光照強度為1200~16001x ;更優(yōu)選的,所述繼代培養(yǎng)的溫度為24°C,光照時間為14小時/天,光照強度為15001x。
[0031]所述繼代培養(yǎng)的代數(shù)通常為2~20代,每個繼代培養(yǎng)周期為18~60天,優(yōu)選的,所述繼代培養(yǎng)的代數(shù)通常為4~6代,每個繼代培養(yǎng)周期為30~35天。
[0032]愈傷組織中的芍藥雙苷可采用的常規(guī)的方法進(jìn)行提取,包括:取愈傷組織,烘干、粉碎后置于溶劑中浸提,上清液即為芍藥雙苷的粗提液。
[0033]根據(jù)需要,可對粗提液進(jìn)一步分離純化。
[0034]所述的溶劑可以為甲醇、乙醇、正丁醇等,具體可以為80%甲醇水溶液。
[0035]與現(xiàn)有技術(shù)相比,本發(fā)明的有益效果為:
[0036]植物組織培養(yǎng)技術(shù)是較常規(guī)的技術(shù),主要應(yīng)用于快速繁殖、無病毒苗生產(chǎn)、選育新品種、種質(zhì)資源保存和次級代謝物的生產(chǎn)幾個領(lǐng)域,專利“一種芍藥組織培養(yǎng)方法”(申請?zhí)?01010102618.0)介紹了一種是芍藥快繁的方法,但其只提供了使芍藥室內(nèi)穩(wěn)定快速生長的方法;文獻(xiàn)“4個品種芍藥愈傷組織的誘導(dǎo)及分化”(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報2011年第37卷第2期)也只研究了影響愈傷組織誘導(dǎo)及分化的主要因素,而對于利用愈傷組織培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)芍藥雙苷及影響芍藥雙苷產(chǎn)量的主要因素等的研究未見過相關(guān)報道。
[0037]本發(fā)明通過誘導(dǎo)芍藥外植體形成愈傷組織并在特定條件下進(jìn)行愈傷組織的培養(yǎng)來生產(chǎn)芍藥雙苷,不僅可以將芍藥雙苷在植物中的積累時間從2~4年縮短到I~2個月,而且與芍藥根中的芍藥雙苷含量相比,愈傷組織中芍藥雙苷的含量與之相當(dāng)甚至更高,也更為穩(wěn)定,更有利于規(guī)模化生產(chǎn)。這些優(yōu)點可以較好的解決當(dāng)前野生芍藥無法滿足市場對芍藥雙苷的需求問題,可實現(xiàn)芍藥雙苷短時間、低成本、大批量生產(chǎn),具有非常有益的社會和經(jīng)濟(jì)價值。
[0038]另外,愈傷組織誘導(dǎo)、生長和芍藥雙苷積累的整個過程都在室內(nèi)環(huán)境中,不僅不受地域、季節(jié)和氣候的影響,因此,本發(fā)明的方法還可以有效避免芍藥雙苷提取物中出現(xiàn)重金屬污染和農(nóng)藥殘留,提取的芍藥雙苷具有更高的安全性。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0039]圖1為實施例6芍藥“線條”葉片愈傷組織中芍藥雙苷含量測定色譜圖;
[0040]圖2為實施例6芍藥“線條”莖段愈傷組織中芍藥雙苷含量測定色譜圖;
[0041]圖3為實施例6芍藥“線條”葉柄愈傷組織中芍藥雙苷含量測定色譜圖;[0042]圖4為實施例6芍藥“線條”根愈傷組織中芍藥雙苷含量測定色譜圖;
[0043]圖5為對比例I中改變增殖培養(yǎng)基成分(植物激素)后葉片愈傷組織中芍藥雙苷含量測定色譜圖;
[0044]圖6為對比例2中改變培養(yǎng)條件(溫度)后葉片愈傷組織中芍藥雙苷含量測定色譜圖。
【具體實施方式】
[0045]下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步闡釋。
[0046]試驗用培養(yǎng)基
[0047]誘導(dǎo)培養(yǎng)基:WPM培養(yǎng)基+蔗糖30g/L+瓊脂8g/L+6_芐氨基嘌呤2mg/L+萘乙酸0.2mg/L+2,4- 二氯苯氧基乙酸0.2mg/L,培養(yǎng)基的pH值為5.2左右。 [0048]增殖培養(yǎng)基:WPM培養(yǎng)基+蔗糖30g/L+瓊脂8g/L+6_芐氨基嘌呤0.5mg/L +萘乙酸lmg/L +脫葉靈0.lmg/L,培養(yǎng)基的pH值為5.2左右。
[0049]WPM培養(yǎng)基的配方見表1。
[0050]表1
[0051]
【權(quán)利要求】
1.一種生產(chǎn)芍藥雙苷的方法,其特征在于,包括: (1)將芍藥外植體消毒后接入誘導(dǎo)培養(yǎng)基中誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織; (2)將所述愈傷組織接入增殖培養(yǎng)基,光照條件下進(jìn)行繼代培養(yǎng),繼代培養(yǎng)完成后從愈傷組織中提取芍藥雙苷; 其中,所述的增殖培養(yǎng)基為: 含有0.5~0.75mg/L6-芐氨基嘌呤、0.5~lmg/L萘乙酸和0.025~0.lmg/L脫葉靈的1/2MS或WPM培養(yǎng)基,其中,1/2MS或WPM培養(yǎng)基含有25~35g/L蔗糖和6~8g/L瓊脂。
2.如權(quán)利要求1所述的方法,其特征在于,所述芍藥的品種為“蒲棒”、“線條”、“蔴茬”或“雞爪”。
3.如權(quán)利要求1所述的方法,其特征在于,所述的外植體為莖、葉柄、葉片或根。
4.如權(quán)利要求1所述的方法,其特征在于,所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基為: 含0.5~2mg/L6_節(jié)氨基嘌呤、0.2~lmg/L萘乙酸和0.2~0.5mg/L2,4- 二氯苯氧基乙酸的MSU/2MS或WPM培養(yǎng)基,其中,MSU/2MS或WPM培養(yǎng)基含有25~35g/L蔗糖和6~8g/L瓊脂。
5.如權(quán)利要求1所述的方法,其特征在于,步驟(1)中,所述誘導(dǎo)的溫度為18~30°C,時間為18~60天。
6.如權(quán)利要求1所述的方法,其特征在于,步驟(1)中,所述誘導(dǎo)時,光照時間為8~20小時/天,光照強度為800~25001x。
7.如權(quán)利要求1所述的生產(chǎn)芍藥雙苷的方法,其特征在于,所述繼代培養(yǎng)時,光照時間為8~20小時/天,光照強度為800~25001x。
8.如權(quán)利要求1所述的生產(chǎn)芍藥雙苷的方法,其特征在于,所述繼代培養(yǎng)的溫度為18 ~30?。
9.如權(quán)利要求1所述的生產(chǎn)芍藥雙苷的方法,其特征在于,所述繼代培養(yǎng)的代數(shù)為2~20代,每個繼代培養(yǎng)周期為18~60天。
10.如權(quán)利要求1所述的生產(chǎn)芍藥雙苷的方法,其特征在于,所述提取的方法包括:取愈傷組織,烘干、粉碎后置于溶劑中浸提,上清液即為芍藥雙苷的粗提液。
【文檔編號】A01H4/00GK103651123SQ201310589098
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2013年11月20日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月20日
【發(fā)明者】馮定軍, 魯俞江, 江海龍, 俞偉, 梅樂和, 胡升, 代冬梅, 馬瑩瑩 申請人:寧波立華制藥有限公司
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