專利名稱：一種從九里香莖葉中提取總黃酮的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及ー種從植物中提取總黃酮的方法，屬于農(nóng)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體地講是涉及一種從九里香莖葉中提取總黃酮的方法。
背景技術(shù)：
九里香[Murraya paniculata (L.)]屬蕓香科(Rutaceae)九里香屬植物，別名千里香、滿山香、七里香等。該屬植物全世界約14種及2變種。其中亞洲熱帶及亞熱帶地區(qū)約有12種，我國有8種及I變種，主要產(chǎn)自中國云南、貴州、湖南、廣東、廣西、海南、福建、臺 灣等地。九里香是我國十大名花之一，也是ー種中藥材，現(xiàn)代藥理研究表明，九里香具有抗生育和終止妊娠、抗菌消炎、降血糖、抗痙攣及局部麻酔等作用。近年農(nóng)用活性研究表明，九里香粗提物具有較好的殺蟲活性(湖北農(nóng)業(yè)科學，2005 ;農(nóng)藥，2011 ;西北農(nóng)業(yè)學報，2011)。到目前為止，國內(nèi)外學者已從本屬植物中分離到10余種黃酮類化合物。分別為3’，4’，5, 5’，7，8-六甲氧基黃酮，命名為版納九里香素(bannamurpanisin)。從九里香葉中分離得到5，7，3' ，4'-四甲氧基黃酮、5，7，3'，4'，5'-五甲氧基黃酮和5，6，7，3'，4'，5'-六甲氧基黃酮、5，6，7，3'，4'-五甲氧基黃酮、5-羥基-6，7，8，3'，4'-五甲氧基黃酮、5，7，8，3 '，4'-五甲氧基ニ氫黃酮、7-羥基-5，3'，4'-三甲氧基黃酮、3'，5_ ニ羥基-7，4' - ニ甲氧基黃酮。從九里香果實中分得兩個新的黃酮類化合物5-羥基-3，7，8，3'，4'，5'-六甲氧基黃酮，8-羥基-3，5，7，3'，4'，5'-六甲氧基黃酮等。專利《千里香葉總黃酮及其制備方法及用途，申請?zhí)?00710147357. 2》中，涉及到黃酮的提取方法，該方法使用大孔樹脂、Al2O3柱、硅膠柱反復層析得到總黃酮。由于該專利提取總黃酮的過程復雜，不適合于エ業(yè)化生產(chǎn)；且需要消耗大量有機溶劑，對環(huán)境有一定影響。加之九里香具有重要的藥理和農(nóng)用活性，為此，選擇簡便快捷的提取方法具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種從九里香莖葉中簡便提取總黃酮的方法，以及總黃酮顯著的殺蟲活性，有利開發(fā)成植物源農(nóng)藥。本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案如下—種從九里香莖葉中提取總黃酮的方法，其特征在于采用如下具體エ藝步驟a.采摘九里香枝葉，自然晾干，粉碎，過40目篩，得九里香粉末；b.將九里香粉末浸泡在50-95%こ醇中5-7天，こ醇用量為九里香粉末重量的10-20倍，隨后進行超聲波提取30-60分鐘；c.減壓抽濾，得濾液，加入濾液總量2-4 %的脫色劑脫色，過濾，濾液減壓濃縮至原來的1/10-1/20，溫度控制在50-60°C，回收こ醇；d.向上述濃縮液中加入其重量3-5倍的自來水，在超聲波上震蕩，溫度控制在40-60°C，時間 30-60 分鐘；e.過濾，除去不溶物，濾液緩慢加入大孔樹脂內(nèi)，大孔樹脂用量為九里香粉末重量的1-1. 5倍，使用20倍柱體積的自來水洗脫；再用10-20%こ醇洗脫，使用AlCl3為顯色劑，檢測洗脫液，直到流出物呈現(xiàn)陽性；改用50-75%こ醇洗脫，使用AlCl3為顯色劑，檢測洗脫液，直到流出物呈現(xiàn)陰性；f.減壓濃縮50-75%こ醇的洗脫液，真空干燥得到總黃酮；g.以蘆丁為標準對照，用紫外分光光度法測定總黃酮含量在50%以上。所述脫色劑選用硅燥土、白炭黑或活性炭。所述大孔樹脂選用DlOl大孔樹脂、D140大孔樹脂、AB-8大孔樹脂或XAD16大孔樹 脂。所述自來水的pH值為5-7。本發(fā)明具體具有以下優(yōu)點I、九里香原料來源方便。九里香在南方作為園林綠化植物，每年經(jīng)過修枝整葉，將去除大量枝葉，為九里香黃酮提取提供大量原材料。2、提取方法簡單，適合于エ業(yè)化生產(chǎn)。本案例采用こ醇滲漉提取，大孔樹脂梯度洗脫分離黃酮化合物，操作流程簡便，使用設(shè)備簡單，洗脫劑常見，可以進行エ業(yè)化生產(chǎn)。3、節(jié)能環(huán)保。所用溶劑包含こ醇，可以回收利用，大孔樹脂經(jīng)活化后可以反復使用。具體實施方法下面結(jié)合優(yōu)選實施例對本發(fā)明作進ー步詳細說明，但本發(fā)明決不限于下述實施例。實施例I一種從九里香莖葉中提取總黃酮的方法，其具體エ藝步驟如下a.采摘九里香枝葉，自然晾干，粉碎，過40目篩，得九里香粉末；b.取2kg九里香粉末，室溫浸泡在30kg 50%こ醇中7天，隨后進行超聲波提取60分鐘；c.減壓抽濾，得濾液，加入O. 6 kg的活性炭脫色，過濾，濾液減壓濃縮至3kg，溫度控制在50°C，回收こ醇；d.向3kg濃縮液中加入9kg自來水，自來水pH值為5，在超聲波上震蕩，溫度控制在60°C，時間30分鐘；e.過濾，除去不溶物，濾液緩慢加入2kg DlOl大孔樹脂內(nèi)，使用20L的自來水洗脫，自來水PH值為5 ;再用10-20%こ醇洗脫，使用AlCl3為顯色劑，檢測洗脫液，直到流出物呈現(xiàn)陽性；改用50-75%こ醇洗脫，使用AlCl3為顯色劑，檢測洗脫液，直到流出物呈現(xiàn)陰性；f.減壓濃縮50-75%こ醇洗脫液，真空干燥得到總黃酮；g.以蘆丁為標準對照樣品，用紫外分光光度法測定總黃酮含量為56. 4%。實施例2一種從九里香莖葉中提取總黃酮的方法，其具體エ藝步驟如下a.采摘九里香枝葉，自然晾干，粉碎，過40目篩，得九里香粉末；
b.取2kg九里香粉末，室溫浸泡在25kg 75%こ醇中5天，隨后進行超聲波提取45分鐘；c.減壓抽濾，得濾液，加入O. 6 kg的硅藻土脫色，過濾，濾液減壓濃縮至2. 5kg，溫度控制在55°C，回收こ醇；d.向2. 5kg濃縮液中加入8L自來水，自來水pH值為6，在超聲波上震蕩，溫度控制在55。。，時間40分鐘；e.過濾，除去不溶物，濾液緩慢加入2kg D140大孔樹脂內(nèi)，使用20L的自來水洗脫，自來水PH值為6 ;再用10-20%こ醇洗脫，使用AlCl3為顯色劑，檢測洗脫液，直到流出物呈現(xiàn)陽性；改用50-75%こ醇洗脫，使用AlCl3為顯色劑，檢測洗脫液，直到流出物呈現(xiàn)陰 性。f.減壓濃縮50-75%的こ醇洗脫液，真空干燥得到總黃酮。g.以蘆丁為標準對照樣品，用紫外分光光度法測定總黃酮含量為64. 7%。實施例3一種從九里香莖葉中提取總黃酮的方法，其具體エ藝步驟如下a.采摘九里香枝葉，自然晾干，粉碎，過40目篩，得九里香粉末；b.取2kg九里香粉末，室溫浸泡在20kg 95%的こ醇中6天，隨后進行超聲波提取50分鐘。c.減壓抽濾，得濾液；加入O. 6 kg的白炭黑脫色，過濾，濾液減壓濃縮至2 kg，溫度控制在50°C，回收こ醇。d.向2kg濃縮液中加入6L自來水，在超聲波上震蕩，溫度控制在50°C，時間50分鐘。e.過濾，除去不溶物，濾液緩慢加入3kg AB-8大孔樹脂內(nèi)，使用20L的自來水洗脫；再用10-20%こ醇洗脫，使用AlCl3為顯色劑，檢測洗脫液，直到流出物呈現(xiàn)陽性；改用50-75%的こ醇洗脫，使用AlCl3為顯色劑，檢測洗脫液，直到流出物呈現(xiàn)陰性。f.減壓濃縮50-75%的こ醇洗脫液，真空干燥得到總黃酮。g.以蘆丁為標準對照樣品，用紫外分光光度法測定總黃酮含量為67. 3%。實施例4一種從九里香莖葉中提取總黃酮的方法，其具體エ藝步驟如下a.采摘九里香枝葉，自然晾干，粉碎，過40目篩，得九里香粉末；b.取2kg九里香粉末，室溫浸泡在40kg 50%的こ醇中7天，隨后進行超聲波提取30分鐘。c.減壓抽濾，得濾液，加入I. 6 kg的硅燥土脫色，過濾，濾液減壓濃縮至2 kg,溫度控制在50°C，回收こ醇。d.向2kg濃縮液中加入IOL自來水，在超聲波上震蕩，溫度控制在40°C，時間60分鐘。e.過濾，除去不溶物，濾液緩慢加入3kg XAD16大孔樹脂內(nèi)，使用20L的自來水洗脫；再用10-20%こ醇洗脫，使用AlCl3為顯色劑，檢測洗脫液，直到流出物呈現(xiàn)陽性；改用50-75%的こ醇洗脫，使用AlCl3為顯色劑，檢測洗脫液，直到流出物呈現(xiàn)陰性。f.減壓濃縮50-75%的こ醇洗脫液，真空干燥得到總黃酮。
g.以蘆丁為標準對照樣品，用紫外分光光度法測定總黃酮含量為66. 9%。殺蟲活性測定實施例本發(fā)明所得總黃酮的殺蟲活性毒力測定結(jié)果如下I、供試昆蟲家蜆(Muscadomestica)成蟲按照麥麩250. 0g、面粉12. 5g、奶粉8. 0g、酵母粉2. 5g,水500mL飼料配方進行家蠅幼蟲飼養(yǎng)，經(jīng)過化蛹,羽化轉(zhuǎn)化成成蟲供試。蘿卜蟲牙[Lipaphiserysimi (Kaltenbach)]:直接從田間采集。斜紋夜蛾(Predenia Iiture):從田間采集斜紋夜蛾卵塊,于室內(nèi)以新鮮蓖麻葉飼養(yǎng)繁殖，試驗時挑選健康、整體大小一致的3齡、5齡幼蟲。2、對家蠅的觸殺活性(點滴法)用無水こ醚將家蠅麻醉I分鐘，使試蟲處于麻醉狀態(tài)，然后用微量注射器取5 μ L的藥液點滴到家蠅的前胸背板，放入養(yǎng)蟲盒內(nèi)，同時放入成蟲飼料和保濕的脫脂棉。標準對照藥劑為O. 7%印楝素懸浮劑(河南鶴壁陶英陶生物科技有限公司)，清水為空白対照。每處理20頭試蟲，重復3次。24h后觀察死亡情況，計算死亡率或校正死亡率。死亡率(%)=(死亡蟲數(shù)/試蟲數(shù))X 100 ;校正死亡率(%)=[(藥劑處理死亡率-對照組死亡率)/ (100-對照組死亡率)]X 100。3、對蘿卜蚜的觸殺活性(噴霧法)將辣椒葉片剪至6cm塑料培養(yǎng)皿大小，背面朝上，置于培養(yǎng)皿內(nèi)，皿底墊ー層保濕濾紙。用毛筆選取無翅若蚜25頭，放入培養(yǎng)皿葉蝶上。置于POTTER噴霧塔下噴霧(ImL)。標準對照藥劑為O. 7%印楝素懸浮劑(河南鶴壁陶英陶生物科技有限公司)，清水為空白對照。噴霧后加蓋，標記后置于室溫下，每個處理重復3次。48h后檢查結(jié)果，計算死亡率或校正死亡率。死亡率(%)=(死亡蟲數(shù)/試蟲數(shù))X 100 ;校正死亡率(%)=[(藥劑處理死亡率-對照組死亡率)/ (100-對照組死亡率)]X 100。4、對斜紋夜蛾的毒殺活性將3齡或5齡斜紋夜蛾幼蟲，在藥液中浸潰5s，取出后用吸水紙去除多余藥液，然后放入直徑為9cm的培養(yǎng)皿中，每皿放入10頭試蟲，飼喂新鮮的甘藍葉片，皿內(nèi)放入ー團保濕脫脂棉。標準對照藥劑為O. 7%印楝素懸浮劑(河南鶴壁陶英陶生物科技有限公司)，清水為空白対照。每處理30頭試蟲，重復3次。視取食情況及時添加新鮮甘藍葉片。48h后調(diào)查死亡數(shù)，計算死亡率或校正死亡率。死亡率(%)=(死亡蟲數(shù)/試蟲數(shù))X 100 ;校正死亡率(%)=[(藥劑處理死亡率-對照組死亡率)/ (100-對照組死亡率)]X 100。表I黃酮類化合物對供試害蟲的殺蟲活性
權(quán)利要求
1.一種從九里香莖葉中提取總黃酮的方法，其特征在于采用如下具體エ藝步驟 a.采摘九里香枝葉，自然晾干，粉碎，過40目篩，得九里香粉末； b.將九里香粉末浸泡在50-95%こ醇中5-7天，こ醇用量為九里香粉末重量的10-20倍，隨后進行超聲波提取30-60分鐘； c.減壓抽濾，得濾液，加入濾液總量2-4%的脫色劑脫色，過濾，濾液減壓濃縮至原來的1/10-1/20，溫度控制在50-60°C，回收こ醇； d.向上述濃縮液中加入其重量3-5倍的自來水，在超聲波上震蕩，溫度控制在40-60°C，時間 30-60 分鐘； e.過濾，除去不溶物，濾液緩慢加入大孔樹脂內(nèi)，大孔樹脂用量為九里香粉末重量的1-1. 5倍，使用20倍柱體積的自來水洗脫；再用10-20%こ醇洗脫，使用AlCl3為顯色劑，檢測洗脫液，直到流出物呈現(xiàn)陽性；改用50-75%こ醇洗脫，使用AlCl3為顯色劑，檢測洗脫液，直到流出物呈現(xiàn)陰性； f.減壓濃縮50-75%こ醇的洗脫液，真空干燥得到總黃酮； g.以蘆丁為標準對照，用紫外分光光度法測定總黃酮含量在50%以上。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的從九里香莖葉中提取總黃酮的方法，其特征在于所述脫色劑選用硅燥土、白炭黑或活性炭。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的從九里香莖葉中提取總黃酮的方法，其特征在于所述大孔樹脂選用DlOl大孔樹脂、D140大孔樹脂、AB-8大孔樹脂或XAD16大孔樹脂。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的從九里香莖葉中提取總黃酮的方法，其特征在于所述自來水的pH值為5-7。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種從九里香莖葉中提取總黃酮的方法，其特征在于采用如下具體工藝步驟a.制備九里香粉末；b.浸泡九里香粉末，進行超聲波提??；c.減壓抽濾，脫色劑脫色，過濾，濾液減壓濃縮；d.向上述濃縮液中加入自來水，在超聲波上震蕩；e.過濾，除去不溶物，濾液加入大孔樹脂內(nèi)，自來水洗脫；再用不同濃度的乙醇反復洗脫，用AlCl3顯色，檢測洗脫液，直到流出物呈現(xiàn)陰性；f.減壓濃縮乙醇的洗脫液，真空干燥得到總黃酮；g.以蘆丁為標準對照，用紫外分光光度法測定總黃酮含量在50％以上。本發(fā)明具有九里香原料來源方便，提取方法簡單，適合于工業(yè)化生產(chǎn)，節(jié)能環(huán)保的優(yōu)點。
文檔編號A01N65/36GK102669195SQ201210187890
公開日2012年9月19日 申請日期2012年6月7日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月7日
發(fā)明者曹陽, 王蘭英, 駱焱平 申請人:海南大學