專利名稱：一種用于分離荔枝霜疫霉病菌的培養(yǎng)基的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于分離荔枝霜疫霉病菌的培養(yǎng)基。
背景技術(shù)：
蒸枝(Litchi chinensis Sonn.)是著名的嶺南佳果,在北纟韋18° 31°均有種植，分布遍及海南、廣西、云南、福建、貴州、四川、廣東、臺(tái)灣等8省區(qū)。2008年全國種植面積約900萬畝，超過約820萬畝的荔枝，成為種植面積最大的熱帶水果。我國的荔枝產(chǎn)量超過全球產(chǎn)量的60%。荔枝霜疫霉病是荔枝一種主要病害，該病害可以危害荔枝的花和果，花期發(fā)病，造成大量的枯花，幼果期發(fā)病，引起落果，成熟期發(fā)病，引起果實(shí)腐爛。在鮮果運(yùn)輸銷售期，此病繼續(xù)發(fā)展，也嚴(yán)重影響鮮果的貯運(yùn)和外銷，進(jìn)而影響了荔枝產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)穩(wěn)定發(fā)展。藥劑防治是目前防治該病最有效的方法之一。
蒸枝霜疫霉病菌(Peronophythora Litchi Chen ex Ko et al)以菌絲體和卵抱子在病葉、病果及土壤中越冬，為翌年的初侵染病源。翌年春末夏初產(chǎn)生孢子囊，隨風(fēng)雨傳播，孢子囊產(chǎn)生的游動(dòng)孢子侵入寄主葉片和果實(shí)為害。為了對荔枝霜疫霉病菌進(jìn)行相關(guān)研究，以及調(diào)查病原菌的越冬菌量和田間發(fā)病情況，做好病害的預(yù)測預(yù)報(bào)，通過分離而獲得純化的荔枝霜疫霉病菌是必要的。常規(guī)的病原菌分離方法是《植病研究方法》介紹的用75%乙醇和O. 1%升汞液表面消毒處理。實(shí)際工作中，在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行分離的樣本往往不是新鮮樣品，是經(jīng)田間采樣后存放有一定時(shí)間的病殘?bào)w，這些荔枝病組織中就不可避免的常常帶有其他雜菌，按常規(guī)方法進(jìn)行分離組織病原菌時(shí)，由于這些雜菌的生長較荔枝霜疫霉病菌迅速，雜菌的菌絲常將荔枝霜疫霉病菌覆蓋，而快速生長的細(xì)菌也會(huì)抑制荔枝霜疫霉病菌的生長。傳統(tǒng)病原菌分離方法中，利用普通培養(yǎng)基從病組織中分離荔枝霜疫霉時(shí)，采集的病組織若不消毒或是消毒時(shí)間短，造成培養(yǎng)時(shí)有雜菌污染，達(dá)不到分離純化的目的。若消毒時(shí)間太長，往往在殺死雜菌的同時(shí)，也會(huì)把要分離的病原菌殺死，造成病原菌分離率往往不太聞。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種殺菌劑、用于分離荔枝霜疫霉病菌(Peronophythora Litchi Chen ex Ko et al)的培養(yǎng)基、和分離蒸枝霜疫霉病菌(Peronophythora Litchi Chen ex Ko et al)的方法。本發(fā)明所提供的殺菌劑，其活性成分為如下I)或2)所示I)由苯醚甲環(huán)唑、多菌靈、利福平和青霉素組成；2)由苯醚甲環(huán)唑、咪鮮胺、利福平和青霉素組成。上述殺菌劑，所述I)所示殺菌劑中，所述苯醚甲環(huán)唑、多菌靈、利福平和青霉素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)比為(10-20): (10-50): (50-100): (50-100)，具體為 10 10 50 :50，或 15 20 70 70，或 20 50 :100 :100 ；
上述殺菌劑，所述2)所示殺菌劑中，所述苯醚甲環(huán)唑、咪鮮胺、利福平和青霉素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)比為(10-20): (10-50): (50-100): (50-100)，具體為 10 10 50 :50，或 15 20 70 70，或 20 50 :100 100o本發(fā)明所提供的用于分離蒸枝霜疫霉病菌(Peronophythora Litchi Chen ex Koet al)的培養(yǎng)基，為如下I或II所示I、是向白云豆培養(yǎng)基中添加權(quán)利要求I或2中所述I)所示殺菌劑得到的；II、是向白云豆培養(yǎng)基中添加權(quán)利要求I或2中所述2)所示殺菌劑得到的。上述I所示培養(yǎng)基中，所述苯醚甲環(huán)唑在所述白云豆培養(yǎng)基中的濃度為IOyg/mL-20 μ g/mL,具體為10 μ g/mL、15 μ g/mL或20 μ g/mL ;所述多菌靈在所述白云豆培養(yǎng)基中的濃度為10 μ g/mL-50 μ g/mL,具體為10 μ g/mL>20 μ g/mL或50 μ g/mL ;所述利福平在所述白云豆培養(yǎng)基中的濃度為50 μ g/mL-100 μ g/mL,具體為50 μ g/mL>70 μ g/mL或100 μ g/mL ;所述青霉素在所述白云豆培養(yǎng)基中的濃度為50 μ g/mL-100 μ g/mL,具體為50 μ g/mL、 70 μ g/mL 或 100 μ g/mL ；上述II所示培養(yǎng)基中，所述苯醚甲環(huán)唑在所述白云豆培養(yǎng)基中的濃度為IOyg/mL-20 μ g/mL,具體為10 μ g/mL、15 μ g/mL或20 μ g/mL ;所述咪鮮胺在所述白云豆培養(yǎng)基中的濃度為10 μ g/mL-50 μ g/mL,具體為10 μ g/mL>20 μ g/mL或50 μ g/mL ;所述利福平在所述白云豆培養(yǎng)基中的濃度為50 μ g/mL-100 μ g/mL,具體為50 μ g/mL、70 μ g/mL或100 μ g/mL ;所述青霉素在所述白云豆培養(yǎng)基中的濃度為50 μ g/mL-100 μ g/mL,具體為50 μ g/mL、70 μ g/mL 或 100 μ g/mL。上述培養(yǎng)基在分離蒸枝霜疫霉病菌(Peronophythora Litchi Chen ex Ko et al)中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。本發(fā)明所提供的分離蒸枝霜疫霉病菌(Peronophythora Litchi Chen ex Ko etal)的方法，包括如下步驟用上述任一所述培養(yǎng)基培養(yǎng)樣本，得到荔枝霜疫霉病菌；所述樣本為感染荔枝霜疫霉病菌的植物的葉片或果實(shí)。本發(fā)明的白云豆選擇性培養(yǎng)基成本低廉、制作簡便，且對細(xì)菌具有非常好的抑制作用。實(shí)驗(yàn)證明，用本發(fā)明的白云豆選擇性培養(yǎng)基分離荔枝霜疫霉的方法，解決了荔枝霜疫霉等植物病原卵菌分離過程中各種非目標(biāo)真菌和細(xì)菌污染嚴(yán)重的問題；該方法分離效率高、可靠、省時(shí)、省力。


圖I為三種抗生素對植株葉片表面細(xì)菌的抑制作用。圖2為三種抗生素對果皮表面的細(xì)菌抑制作用。圖3為荔枝霜疫霉病的癥狀(攝于廣西北流)
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。多菌靈原藥購自安徽廣信農(nóng)化股份有限公司(安徽廣信農(nóng)化集團(tuán)有限公司)，其主要活性成分物質(zhì)的化學(xué)名稱是N —(2—苯駢咪唑基)一氨基甲酸甲酯，通用名稱為多菌靈，分子式C9H9N302。該藥中主要活性成分物質(zhì)的質(zhì)量百分含量為98. 9 %。苯醚甲環(huán)唑原藥購自杭州宇龍化工有限公司。其主要活性成分物質(zhì)的化學(xué)名稱是順，反-3-氯-4-[4-甲基-2-1H-1，2，4-三唑-I-基甲基)-1，3- 二啞戊烷_2_基)苯基4-氯苯基醚(順，反比例約為45:55)，通用名稱是苯醚甲環(huán)唑。該藥中主要活性成分物質(zhì)的質(zhì)量百分含量為96 %。咪鮮胺原藥(又叫咪鮮胺)購自海南力智生物工程有限公司，其主要活性成分物質(zhì)的化學(xué)名稱是N-丙基-N-[2_(2，4，6-三氯苯氧基)乙基]-咪唑-I-甲酰胺，分子式C15H16C13N302。該藥中咪鮮胺的質(zhì)量百分含量為97 %。青霉素、利福平、氯霉素、鏈霉素、硫酸新霉素和鹽酸四環(huán)素均購自北京拓英坊科技有限公司。實(shí)施例I、不同濃度的三種真菌抑制劑和六種抗生素對荔枝霜疫霉的抑制作用
一、不同濃度的三種真菌抑制劑對荔枝霜疫霉的抑制作用以二甲基甲酰胺為多菌靈的溶劑，以丙銅或甲醇為苯醚甲環(huán)唑和咪鮮胺的溶劑，分別配制5000 μ g/mL的三種藥劑母液10ml，三種藥劑的稱量量依次為50. 6mg、52. Omg和
51.5mg ;將這三種母液分別配制系列濃度為50 μ g/mL>20 μ g/mL和10 μ g/mL的多菌靈，咪鮮胺和苯醚甲環(huán)唑的帶毒白云豆平板，以加有溶劑的平板為對照；然后采用菌絲生長速率法測定荔枝霜疫霉對三種真菌抑制劑的敏感性。將荔枝霜疫霉菌株在白云豆平板上于25°C預(yù)培養(yǎng)7d，用直徑為5mm的打孔器于菌落邊緣的同一圓周上打取菌餅，將菌餅接種到分別含有三種藥劑系列濃度的白云豆帶毒平板中央(各濃度含等量有機(jī)溶劑)，于25°C下黑暗培養(yǎng)，7d后用十字交叉法測量各處理的菌落增長直徑(菌落直徑減去菌餅直徑5_)，每處理重復(fù)3次；最后按照下面公式求出各藥劑濃度對菌絲生長的抑制百分率(％)，抑制率(%) = [(對照菌落增長直徑-處理菌落增長直徑)/ (對照菌落增長直徑)]X 100。測定了供試的三種真菌抑制劑對荔枝霜疫霉的毒力，結(jié)果如表I所示，不同濃度的多菌靈對荔枝霜疫霉的抑制率均低于10%，因此可以采用10-50 μ g/mL的多菌靈作為選擇性藥劑；苯醚甲環(huán)唑50 μ g/mL濃度的藥劑對荔枝霜疫霉的抑制率在20%左右，20 μ g/mL濃度的苯醚甲環(huán)唑?qū)笾λ呙沟纳L反而有促進(jìn)作用，10 μ g/mL的濃度對荔枝霜疫霉也沒有抑制作用，因此，可以采用10-20 μ g/mL濃度的苯醚甲環(huán)唑作為選擇性藥劑；咪鮮胺50 μ g/mL濃度的藥劑對荔枝霜疫霉有促進(jìn)作用，抑制率為-68. 7%。20和10 μ g/mL濃度的咪鮮胺對荔枝霜疫霉均沒有抑制作用，所以也可以采用10-50 μ g/mL的咪鮮胺為分離荔枝霜疫霉中使用的選擇性藥劑。表I三種真菌抑制劑對荔枝霜疫霉的抑制作用
權(quán)利要求
1.一種殺菌劑，其活性成分為如下I)或2)所示 O由苯醚甲環(huán)唑、多菌靈、利福平和青霉素組成； 2)由苯醚甲環(huán)唑、咪鮮胺、利福平和青霉素組成。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的殺菌劑，其特征在于所述I)所示殺菌劑中，所述苯醚甲環(huán)唑、多菌靈、利福平和青霉素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)比為(10-20) :(10-50) :(50-100) : (50-100)，具體為 10 10 50 :50，或 15 20 70 :70，或 20 50 :100 :100 ； 所述2)所示殺菌劑中，所述苯醚甲環(huán)唑、咪鮮胺、利福平和青霉素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)比為(10-20): (10-50): (50-100): (50-100)，具體為 10 10 50 :50，或 15 20 70 :70，或 20 50 100 :100。
3.一種用于分離蒸枝霜疫霉病菌(Peronophythora Litchi Chen ex Ko et al)的培養(yǎng)基，為如下I或II所示 I、是向白云豆培養(yǎng)基中添加權(quán)利要求I或2中所述I)所示殺菌劑得到的； II、是向白云豆培養(yǎng)基中添加權(quán)利要求I或2中所述2)所示殺菌劑得到的。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的培養(yǎng)基，其特征在于所述I所示培養(yǎng)基中，所述苯醚甲環(huán)唑在所述白云豆培養(yǎng)基中的濃度為10 μ g/mL-20 μ g/mL,具體為10 μ g/mL、15 μ g/mL或20 μ g/mL ;所述多菌靈在所述白云豆培養(yǎng)基中的濃度為10 μ g/mL-50 μ g/mL，具體為10 μ g/mL>20 μ g/mL或50 μ g/mL ;所述利福平在所述白云豆培養(yǎng)基中的濃度為50 μ g/mL-100 μ g/mL,具體為50 μ g/mL、70 μ g/mL或100 μ g/mL ;所述青霉素在所述白云豆培養(yǎng)基中的濃度為 50 μ g/mL-100 μ g/mL,具體為 50 μ g/mL、70 μ g/mL 或 100 μ g/mL ； 所述II所示培養(yǎng)基中，所述苯醚甲環(huán)唑在所述白云豆培養(yǎng)基中的濃度為IOyg/mL-20 μ g/mL,具體為10 μ g/mL、15 μ g/mL或20 μ g/mL ;所述咪鮮胺在所述白云豆培養(yǎng)基中的濃度為10 μ g/mL-50 μ g/mL,具體為10 μ g/mL>20 μ g/mL或50 μ g/mL ;所述利福平在所述白云豆培養(yǎng)基中的濃度為50 μ g/mL-100 μ g/mL,具體為50 μ g/mL>70 μ g/mL或100 μ g/mL ;所述青霉素在所述白云豆培養(yǎng)基中的濃度為50 μ g/mL-100 μ g/mL,具體為50 μ g/mL、70 μ g/mL 或 100 μ g/mL。
5.權(quán)利要求3或4所述培養(yǎng)基在分離蒸枝霜疫霉病菌(PeronophythoraLitchi Chenex Ko et al)中的應(yīng)用。
6.一種分離蒸枝霜疫霉病菌(Peronophythora Litchi Chen ex Ko et al)的方法，包括如下步驟用權(quán)利要求3或4所述培養(yǎng)基培養(yǎng)樣本，得到荔枝霜疫霉病菌；所述樣本為感染荔枝霜疫霉病菌的植物的葉片或果實(shí)。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種用于分離荔枝霜疫霉病菌的培養(yǎng)基。該培養(yǎng)基為如下Ⅰ或Ⅱ所示Ⅰ、是向白云豆培養(yǎng)基中添加由苯醚甲環(huán)唑、多菌靈、利福平和青霉素組成的殺菌劑得到的；Ⅱ、是向白云豆培養(yǎng)基中添加由苯醚甲環(huán)唑、咪鮮胺、利福平和青霉素組成的殺菌劑得到的。本發(fā)明的白云豆選擇性培養(yǎng)基成本低廉、制作簡便，且對細(xì)菌具有非常好的抑制作用。實(shí)驗(yàn)證明，用本發(fā)明的白云豆選擇性培養(yǎng)基分離荔枝霜疫霉的方法，解決了荔枝霜疫霉等植物病原卵菌分離過程中各種非目標(biāo)真菌和細(xì)菌污染嚴(yán)重的問題；該方法分離效率高、可靠、省時(shí)、省力。
文檔編號(hào)A01N43/653GK102763662SQ20121017784
公開日2012年11月7日 申請日期2012年5月31日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月31日
發(fā)明者劉西莉, 劉鵬飛, 周俞辛, 畢揚(yáng), 王茜, 胡健, 陳磊 申請人:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)