專(zhuān)利名稱(chēng)：一種人工生物結(jié)皮治理荒漠的方法及專(zhuān)用地衣的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種人工生物結(jié)皮治理荒漠的方法及專(zhuān)用地衣。
背景技術(shù)：
中國(guó)是世界上荒漠化范圍最廣、危害程度最深的地區(qū)之一。截止2009年底，我國(guó)荒漠化土地面積為沈2. 37萬(wàn)平方公里，沙化土地面積為173. 11萬(wàn)平方公里，分別占國(guó)土總面積的27. 33%和18.03%。并且還在繼續(xù)擴(kuò)大蔓延，危害著農(nóng)田、牧場(chǎng)、交通及人民生活， 給國(guó)家和社會(huì)經(jīng)濟(jì)帶來(lái)了巨大的損失。以我國(guó)現(xiàn)有沙化土地為例，可治理面積有53萬(wàn)平方公里，按每年所見(jiàn)1717平方公里(國(guó)家林業(yè)局2011)的速度計(jì)算，將可治理沙地變成非沙化土地大約需要300年的時(shí)間。因此荒漠治理是國(guó)家在生態(tài)建設(shè)和環(huán)境保護(hù)方面的迫切需求。機(jī)械方法、化學(xué)方法及生物方法等多種方法均已被陸續(xù)采用，但機(jī)械固沙工程量繁重，效果不佳，化學(xué)方法則存在固定劑老化，土地?zé)o法再利用等問(wèn)題。生物方法成為荒漠治理的首選方法，而人工植樹(shù)，建造防風(fēng)林耗時(shí)長(zhǎng)，需要數(shù)年至十幾年，流沙在相當(dāng)一段時(shí)間內(nèi)仍是流動(dòng)的，利用微型生物結(jié)皮固沙耗時(shí)相對(duì)較短，可同時(shí)固沙并改善荒漠生態(tài)環(huán)境。微型生物結(jié)皮是由藍(lán)藻、地衣、苔蘚、細(xì)菌、真菌等微型生物及其纏繞附著的地表沙土形成的一層特殊結(jié)構(gòu)，是荒漠地區(qū)所特有的景觀(guān)。微型生物結(jié)皮的形成歷經(jīng)藍(lán)藻結(jié)皮、 地衣結(jié)皮及苔蘚結(jié)皮等階段，最終各種高等植物入駐，整個(gè)荒漠生態(tài)系統(tǒng)得以恢復(fù)。楊軍 (中國(guó)北方荒漠地衣及其生態(tài)學(xué)意義.中國(guó)科學(xué)院博士論文，2009，ρ5!3)通過(guò)對(duì)寧夏沙坡頭地區(qū)不同恢復(fù)時(shí)間的微型生物結(jié)皮組成成分研究發(fā)現(xiàn)，隨著恢復(fù)時(shí)間的延長(zhǎng)，最先出現(xiàn)的藍(lán)細(xì)菌(藍(lán)藻)結(jié)皮的蓋度呈現(xiàn)逐年減少的趨勢(shì)，而地衣的蓋度逐年穩(wěn)步增加，成熟的結(jié)皮以地衣和苔蘚為主。地衣被稱(chēng)為“拓荒者”，是由真菌與藻類(lèi)或者藍(lán)細(xì)菌形成的，具有獨(dú)特形態(tài)結(jié)構(gòu)的互惠共生生物體。真菌為藻類(lèi)積蓄水分，提供無(wú)機(jī)鹽，并保護(hù)藻類(lèi)免受過(guò)強(qiáng)的陽(yáng)光輻射；藻類(lèi)或者藍(lán)細(xì)菌通過(guò)光合作用為真菌提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，二者互惠，因此地衣具有更強(qiáng)的生命力。 地衣能夠吸收水分而迅速膨脹，此后水分緩慢的釋放而被利用，對(duì)于保持土壤水分具有重要的意義；其所進(jìn)行的光合與固氮作用會(huì)增加裸露荒漠地表的有機(jī)物含量，是荒漠生態(tài)系統(tǒng)中碳、氮元素的重要來(lái)源，改善了荒漠生態(tài)的微環(huán)境；其具有的根狀結(jié)構(gòu)(假根)可穿透土壤，提高了沙表的穩(wěn)定性，起到了顯著地防止風(fēng)蝕、雨蝕的固沙作用；其自身分泌的地衣酸類(lèi)可以侵蝕巖石表面，同時(shí)和其他有機(jī)化合物一起粘結(jié)土壤顆粒促進(jìn)土壤的形成，為苔蘚植物及高等植物的入駐、生長(zhǎng)提供良好的條件，提高生態(tài)環(huán)境的多樣性和穩(wěn)定性。因此荒漠地衣及地衣結(jié)皮在荒漠治理，流沙固定過(guò)程中具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種人工生物結(jié)皮治理荒漠的方法及專(zhuān)用地衣。本發(fā)明提供一種用于制備地衣的成套產(chǎn)品，由獨(dú)立包裝的菌和藻組成，所述菌為Endocarpon pusillum F07020 CGMCC No. 3893，所述藻為 Diplosphaera chodatii A07020 CGMCC No. 3892。本發(fā)明所提供的地衣是由Endocarpon pusillum F07020 CGMCC No. 3893 和 Diplosphaera chodatii A07020 CGMCC No. 3892 形成的。本發(fā)明還提供一種制備所述地衣的方法，包括將Endocarpon pusillum F07020 CGMCC No. 3893和Diplosphaera chodatii A07020 CGMCC No. 3892均接入固體基質(zhì)進(jìn)行共培養(yǎng)得到地衣的步驟。所述固體基質(zhì)為沙土、PDA固體培養(yǎng)基或其它固體基質(zhì)；所述Endocarpon pusillum F07020 CGMCC No. 3893的接種量以菌絲球的濕重計(jì)為0. 03-0. 07克/平方厘米，如0. 05克/平方厘米；所述Diplosphaera chodatii A07020 CGMCC No. 3892 的接種量為 0. 18X IO6 個(gè)細(xì)胞/ml-0. 24X IO6 個(gè)細(xì)胞/ml，如 0. 21 X IO6 個(gè)細(xì)胞/ml。所述共培養(yǎng)的溫度、光照條件如下室溫、每天M小時(shí)中12小時(shí)光照12小時(shí)黑暗、光照強(qiáng)度20001uX ；所述室溫為18-25°C。本發(fā)明所提供的地衣以及Endocarpon pusillum F07020 CGMCC No. 3893 和 Diplosphaera chodatii A07020 CGMCC No. 3892可應(yīng)用于人工防沙固沙、治理荒漠和/或
改善生態(tài)環(huán)境。本發(fā)明還提供一種固沙的方法，包括將Endocarpon pusillum F07020 CGMCC No. 3893和Diplosphaera chodatii A07020 CGMCC No. 3892混勻后撒播于沙土表面形成結(jié)皮的步驟；所述Endocarpon pusillum F07020 CGMCC No. 3893的撒播量以菌絲球的濕重計(jì)為0. 03-0. 07克/平方厘米，如0. 05克/平方厘米；所述Diplosphaera chodatii A07020 CGMCC No. 3892 的撒播量為 0. 18X IO6 個(gè)細(xì)胞/ml-0. 24X IO6 個(gè)細(xì)胞/ml，如 0. 21 X IO6 個(gè)細(xì)胞/ml。所述固沙的方法中，所述形成結(jié)皮的步驟中還包括輔以保水劑的步驟。所述固沙的方法中還可以同時(shí)撒播荒漠藍(lán)藻、真菌、細(xì)菌、苔蘚等微型生物。本發(fā)明所提供的將所述地衣和/或所述Endocarpon pusillum F07020 CGMCC No. 3893 和 Diplosphaera chodatii A07020 CGMCC No. 3892 撒播于沙土表面形成人工結(jié)皮治理荒漠的方法，一年即可形成結(jié)皮，每平方米的結(jié)皮覆蓋率可達(dá)80%，該方法可直接促進(jìn)地衣結(jié)皮的形成，縮短了微型生物結(jié)皮成熟的時(shí)間，操作簡(jiǎn)便，可以有效持久固沙，提高荒漠生態(tài)系統(tǒng)的營(yíng)養(yǎng)元素及生物多樣性，同時(shí)其形成的生態(tài)景觀(guān)不僅可以為荒漠地區(qū)旅游業(yè)帶來(lái)經(jīng)濟(jì)價(jià)值，而且可以為干旱半干旱地區(qū)城鎮(zhèn)綠化提供材料，在人工防沙固沙、治理荒漠和/或改善生態(tài)環(huán)境中具有廣闊的應(yīng)用前景。


圖 1 為實(shí)驗(yàn)室條件下石果衣共生菌Endocarpon pusillum F07020 CGMCC No. 3893 和共生藻 Diplosphaera chodatii A07020 CGMCC No. 3892 形成的結(jié)皮。圖 2 為石果衣共生菌 Endocarpon pusillum F07020 CGMCC No. 3893 與共生藻 Diplosphaera chodatii A07020 CGMCC No. 3892在室內(nèi)共培養(yǎng)形成結(jié)皮的縱剖面電鏡掃描圖。圖3為噴灑樣方的制作。其中，左圖為示意圖，右圖為實(shí)際的草障方格。圖4為野外固沙實(shí)驗(yàn)形成人工地衣結(jié)皮。其中，左上圖結(jié)皮已初具規(guī)模，右上圖結(jié)皮厚度已達(dá)到0.4-0. 6cm，左下圖對(duì)照未形成結(jié)皮，右下圖已出現(xiàn)Endocarpon sp.。圖 5 為石果衣共生菌Endocarpon pusillum F07020 CGMCC No. 3893 的生長(zhǎng)曲線(xiàn)。圖 6 為石果衣共生菌 Endocarpon pusillum F07020 CGMCC No. 3893 的耐旱性實(shí)驗(yàn)。其中，a為對(duì)照，未進(jìn)行干燥脅迫；h為干燥脅迫210天后，轉(zhuǎn)接于PDA培養(yǎng)基。圖 7 為石果衣共生菌Endocarpon pusillum F07020 CGMCC No. 3893 形成的結(jié)皮。圖 8 為石果衣共生菌 Endocarpon pusillum F07020 CGMCC No. 3893 形成結(jié)皮的微觀(guān)照。圖 9 為石果衣共生藻 Diplosphaera chodatii A07020 CGMCC No. 3892 的生長(zhǎng)曲線(xiàn)。圖 10 為石果衣共生藻 Diplosphaera chodatii A07020 CGMCC No. 3892 的耐旱性驗(yàn)證。其中，a為對(duì)照，未進(jìn)行干燥脅迫；b為干燥脅迫30天后，轉(zhuǎn)接于PDA培養(yǎng)基。圖 11 為石果衣共生藻 Diplosphaera chodatii A07020 CGMCC No. 3892 形成的結(jié)皮。圖 12 為石果衣共生藻 Diplosphaera chodatii A07020 CGMCC No. 3892 形成結(jié)皮的微觀(guān)照。
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。下述實(shí)施例中所用培養(yǎng)基的配方如下瓊脂(1. 5% WA)培養(yǎng)基瓊脂粉15g，蒸餾水IL0大豆蛋白胨(DBD)液體培養(yǎng)基蛋白胨10g，酵母膏5g，葡萄糖lg，蒸餾水1L。土豆浸汁(PDA)斜面培養(yǎng)基葡萄糖20g，瓊脂粉15g，土豆浸汁1L。實(shí)施例1、石果衣共生菌 Endocarpon pusillum F07020 CGMCC No. 3893 與共生藻 Diplosphaera chodatii A07020 CGMCC No. 3892室內(nèi)共培養(yǎng)制備地衣與固沙實(shí)驗(yàn)將石果衣共生菌Endocarpon pusillum F07020 CGMCC No. 3893 與共生藻 Diplosphaera chodatii A07020 CGMCC No. 3892分別接種于PDA斜面培養(yǎng)基上，活化 15天后，當(dāng)觀(guān)察到培養(yǎng)基上有上述地衣共生菌和共生藻生長(zhǎng)后，將地衣共生菌和共生藻分別轉(zhuǎn)接入PDA液體培養(yǎng)基中150rpm大量培養(yǎng)，培養(yǎng)周期分別為30天和20天，培養(yǎng)條件分別為 共生菌22°C暗培養(yǎng)；共生藻22°C、l i光照(光照強(qiáng)度20001ιιΧ)/1 !暗培養(yǎng)。將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的石果衣共生菌Endocarpon pusillum F07020 CGMCC No. 3893 與共生藻 Diplosphaera chodatii A07020 CGMCC No. 3892 混勻，使共生菌與共生藻的濃度分別為0.785g/ml (以菌絲球濕重計(jì))和3. 25X IO6個(gè)細(xì)胞/ml。將得到的混合液均勻噴灑于無(wú)菌沙土表面，沙土顆粒大小均一，盛于直徑IOcm的無(wú)菌平皿中，厚約 0. 5cm。每皿噴施5mL混合液，做3皿重復(fù)，平皿密封后置于光照培養(yǎng)箱中，22°C、1 光照 (20001ux)/12h黑暗條件下培養(yǎng)，定期觀(guān)察。
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培養(yǎng)12個(gè)月后，三個(gè)重復(fù)均觀(guān)察到地衣共生菌與共生藻形成結(jié)皮，并且固著在沙土顆粒之上，覆蓋了平皿的80% (圖1)。同時(shí)，對(duì)結(jié)皮進(jìn)行縱切，通過(guò)掃描電鏡觀(guān)察發(fā)現(xiàn)石果衣共生菌Endocarpon pusillum F07020 CGMCC No. 3893 與共生藻 Diplosphaera chodatii A07020 CGMCC No. 3892發(fā)生接觸，并且菌絲將藻細(xì)胞包裹在內(nèi)(圖幻，說(shuō)明二者已經(jīng)共生形成地衣的初始階段，并且起到固著沙粒的作用。實(shí)施例2、野外固沙實(shí)驗(yàn)在平整固定沙丘上清理3個(gè)約0. 5m2的沙面，然后用麥草將每個(gè)沙面分成兩部分， 形成草障方格，0. 4X0. 5m區(qū)作為噴灑清水對(duì)照方，0. 6X0. 5m區(qū)作為噴灑懸浮液實(shí)驗(yàn)方 (圖 3)。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的石果衣共生菌Endocarpon pusillum F07020 CGMCC No. 3893 和共生藻Diplosphaera chodatii A07020 CGMCC No. 3892及野外收集的地衣碎片(經(jīng)鑒定，該地衣為石果衣共生菌Endocarpon pusillum F07020 CGMCC No. 3893和共生藻 Diplosphaera chodatii A07020 CGMCC No. 3892共生形成的石果衣)與水混合，混合后得到濃度分別為0. 5g/ml (以菌絲球濕重計(jì))、0· 21 X IO7個(gè)細(xì)胞/ml、5X 10_3g/ml的懸浮液， 然后按每平方米IL懸浮液均勻撒播于實(shí)驗(yàn)方沙土表面，每3天用清水澆灌一次，觀(guān)察。對(duì)照樣方噴灑清水，用量與懸浮液體積相同，其他管理均相同。以上處理輔以保水劑(Super Absorbent Polymers，簡(jiǎn)稱(chēng)SAP，購(gòu)自北京金元易生態(tài)工程技術(shù)中心)，將保水劑以250g/m2的用量撒播于草方格之上保持水分。上述地衣碎片的制備方法如下將地衣(經(jīng)鑒定該地衣為石果衣共生菌 Endocarpon pusillum F07020 CGMCC No. 3893 禾口共生藻 Diplosphaera chodatii A07020 CGMCC No. 3892共生形成的石果衣)及其下4mm-12mm的土壤同時(shí)取下，碾碎經(jīng)直徑0. 5cm 的篩網(wǎng)過(guò)濾，獲得均一大小的地衣碎片。結(jié)果在12個(gè)月后的地衣結(jié)皮在自然條件下均已初具規(guī)模(圖4，左上)，結(jié)皮厚度均已達(dá)0. 4-0. 6cm(圖4，右上)，與對(duì)照方的差異明顯(圖4，左下)，且有地衣著生(圖 4，右下)。以上結(jié)果表明，該地衣及其共生藻與共生菌可以直接促進(jìn)地衣結(jié)皮的形成，縮短了微型生物結(jié)皮成熟的時(shí)間，操作簡(jiǎn)便，可以有效持久固沙，提高荒漠生態(tài)系統(tǒng)的營(yíng)養(yǎng)元素及生物多樣性，同時(shí)其形成的生態(tài)景觀(guān)不僅可以為荒漠地區(qū)旅游業(yè)帶來(lái)經(jīng)濟(jì)價(jià)值，而且可以為干旱半干旱地區(qū)城鎮(zhèn)綠化提供材料。上述石果衣共生菌Endocarpon pusillum F07020 CGMCC No.3893 與共生藻 Diplosphaera chodatii A07020 CGMCC No. 3892 的分離培養(yǎng)與鑒定實(shí)驗(yàn)如下一、石果衣共生菌Endocarpon pusillum F07020 CGMCC No. 3893 的分離培養(yǎng)與鑒
定1、地衣標(biāo)本的采集與鑒定從騰格里沙漠東南緣的沙坡頭地區(qū)(干旱多風(fēng)，年均降雨量不足200mm)采集獲得新鮮地衣標(biāo)本，采用形態(tài)解剖學(xué)方法對(duì)該標(biāo)本進(jìn)行鑒定。選取成熟、發(fā)育良好的地衣體，放于盛有蒸餾水的培養(yǎng)皿中，使地衣體浸透變軟，隨后用干凈濾紙吸去地衣體上的多余水分， 冷凍切片，在解剖鏡下選取較薄的切片置于載玻片水滴中，加蓋玻片，在顯微鏡下觀(guān)察，結(jié)果如下地衣體鱗片葉狀，鱗片葉聚集，緊密貼生于基物，寬約2_5mm，圓形至不規(guī)則形狀，邊緣完整至鋸齒狀，上表面深棕色至淺棕色，平坦至微下凹，下表面黑色具有菌絲和假根，假根黑色，5-7mm長(zhǎng)，單一少分枝，每個(gè)鱗片葉單個(gè)或多個(gè)假根。子囊殼球形，直徑 0. 1-0. 2mm每個(gè)鱗片葉1_6個(gè)，埋生于地衣體中，孔口周?chē)钭厣?。地衣體厚140-200 μ m，上皮層厚25-50 μ m，透明無(wú)色，為假薄壁組織；藻層厚 75-100 μ m,藻細(xì)胞直徑5-10 μ m ；髓層厚10-25 μ m ；下皮層厚30-50 μ m,下部淺黑色，菌絲
細(xì)胞壁加厚。子囊殼通常圓形，內(nèi)腔高220-400 μ m，寬200-380 μ m，果殼棕色，厚25-37 μ m，側(cè)絲25-65 μ m長(zhǎng)，子實(shí)層藻直徑4-7 μ m，子囊棒狀，50-65X 15-22 μ m，子囊內(nèi)含2個(gè)子囊孢子，磚壁型，長(zhǎng)橢圓形，25-50 X 12-17 μ m?；餅樯惩?。通過(guò)以上觀(guān)察結(jié)果，鑒定該荒漠地衣標(biāo)本為石果衣Endocarpon pusillum Hedwig, Descript. Adumbr. Muse. Frondos. 56 (1789)。2、地衣共生菌的分離、培養(yǎng)利用孢子釋放方法從石果衣標(biāo)本中分離地衣共生菌，具體方法為將新鮮地衣標(biāo)本的成熟子囊器，用水浸濕后吸去表面多余水分，用凡士林將子囊器倒置在培養(yǎng)皿蓋內(nèi)側(cè)， 培養(yǎng)皿下部為1.5% WA培養(yǎng)基，每Ia1轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)皿蓋一次(因共生菌與共生藻孢子同時(shí)噴射，所以可以通過(guò)上述孢子釋放方法同時(shí)得到共生菌與共生藻)，以獲得單一孢子形成的菌落。當(dāng)觀(guān)察到孢子萌發(fā)后，將含有萌發(fā)子囊孢子的瓊脂塊轉(zhuǎn)入PDA斜面培養(yǎng)基，22°C黑暗培養(yǎng)地衣共生菌，生長(zhǎng)后轉(zhuǎn)入DBD液體培養(yǎng)基，150rpm黑暗培養(yǎng)。以上操作均在無(wú)菌條件下進(jìn)行。通過(guò)上述方法獲得一株地衣共生菌，將其命名為 F07020。3、地衣共生菌F07020的鑒定1)、形態(tài)特征將地衣共生菌F07020接種于PDA斜面培養(yǎng)基上，22 °C黑暗培養(yǎng)30天，觀(guān)察菌落形態(tài)。觀(guān)察結(jié)果為菌落直徑0.8-0. 9cm，呈不規(guī)則圓形，表面粗糙，邊緣整齊或否，暗褐色至淺灰色。2)、nrDNA-ITS (ITS1-S. 8S_ITS2)序列的 PCR 擴(kuò)增和序列測(cè)定A) DNA 提取分別取地衣體及其共生菌F07020 10_20mg ；液氮研磨后加入300 μ 1 2 X CTAB,輕輕混勻，90°C水浴anin ；加入300μ 1酚氯仿異戊醇Q5 24 1)，振蕩混勻，12000r/ min離心5min去除蛋白質(zhì)；取上清加入等體積的DNA結(jié)合液(結(jié)合液成分4. Omol/L異硫氰酸胍，0. 5mol/L、pH5. 0乙酸鉀，終體積濃度為30%的異丙醇)顛倒混勻，隨即移入吸附柱靜置2min, 12000r/mim離心15s，棄殘液；加入300 μ 1洗滌液(洗滌液成分:10mmol/L，終體積濃度為80%的乙醇)，12000r/min離心15s，去殘液，重復(fù)一次；12000r/min離心干燥 Imin ；將吸附柱移入新無(wú)菌離心管，加入30 μ ITE洗脫液靜置5min，12000r/min離心15s， 重復(fù)洗滌一次，去除吸附柱，離心管內(nèi)即為DNA模板。B) nrDNA-ITS (ITSr5. 8S_ITS2)基因的 PCR 擴(kuò)增及序列測(cè)序
用于地衣體及其共生菌F07020 PCR擴(kuò)增的正向引物為ITSl 5' -TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3' (SSU ntl769_1787)，反向弓I 物為 ITS4 5 ‘ -TCCTCCGCTTATTGATATGC-3 ‘ (LSU nt60_79) ；PCR 擴(kuò)增體系(50 μ 1) :10 X buffer 5μ 1 ； 25mmol/L MgCl2 3 μ 1 ；2. 5mmol/L dNTPs 4 μ 1 ；ΙΟμπιοΙ/L 引物各 1μ 1 ；ddH20 34 μ 1 ；Taq DNA 酶 1 μ 1(0. 25U)；模板 1 μ 1 (50ug)。PCR 擴(kuò)增條件為 95 °C 180s，94 °C 30s, 52 °C 30s, 72°C 90s，37 個(gè)循環(huán)；72°C 600s，4°C保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)北京標(biāo)凱生物技術(shù)有限公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果經(jīng)DNAman5. 2. 2進(jìn)行雙序列比對(duì)分析。測(cè)序結(jié)果表明，荒漠地衣及其共生菌F07020的IirDNA-ITSdTS1-S. 8S_ITS2)序列長(zhǎng)度均為^7bp，其核苷酸序列完全相同(如序列表序列1所示)，表明該荒漠地衣共生菌由其相應(yīng)標(biāo)本分離得到。根據(jù)地衣共生菌的學(xué)名就是其地衣物種的學(xué)名，以及荒漠地衣共生菌F07020與荒漠地衣標(biāo)本nrDNA-ITSdTSi-5. 8S_ITS2)同源序列的比對(duì)結(jié)果，將荒漠地衣共生菌F07020鑒定為石果衣共生菌Endocarpon pusillum Hedwig。石果衣共生菌Endocarpon pusillum F07020已于2010年05月31日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡(jiǎn)稱(chēng)CGMCC，地址為北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路 1號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所)，保藏登記號(hào)為CGMCC No. 3893。4、石果衣共生菌 Endocarpon pusillum F07020 CGMCC No. 3893 的生長(zhǎng)特性挑取定量石果衣共生菌Endocarpon pusillum F07020 CGMCC No. 3893，轉(zhuǎn)接于 DBD液體培養(yǎng)基中，22°C，黑暗條件，150rpm振蕩培養(yǎng)，每15天測(cè)定一次菌絲干重，每次3 個(gè)重復(fù)，取平均值，以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，菌絲干重為縱坐標(biāo)繪制生長(zhǎng)曲線(xiàn)(如圖5所示)， 結(jié)果表明，石果衣共生菌Endocarpon pusillum F07020 CGMCC No. 3893在培養(yǎng)30天后到達(dá)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，與Ahmadjian V. and Heikila H. (1970)報(bào)道的地衣共生菌(The culture and synthesis of Endocarpon pusillum and Staurothele clopima. Lichenologist,4 259-267.)需培養(yǎng)1年相比，差異顯著。5、石果衣共生菌 Endocarpon pusillum F07020 CGMCC No. 3893 的耐旱性1)活化將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的石果衣共生菌Endocarpon pusillum F07020 CGMCC No. 3893轉(zhuǎn)接入PDA液體培養(yǎng)基中，150rpm黑暗培養(yǎng)30天。2)干燥脅迫在無(wú)菌條件下，將步驟1)得到的菌液轉(zhuǎn)入不含培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿(直徑35mm)中，將培養(yǎng)皿放入含變色硅膠的干燥器中(相對(duì)空氣濕度< 10%，環(huán)境溫度為 20 27°C，自然光照條件)，以造成干燥脅迫。每月將脅迫處理的石果衣共生菌轉(zhuǎn)接到含固體PDA培養(yǎng)基中，環(huán)境溫度20 270C，黑暗培養(yǎng)，并觀(guān)察石果衣共生菌的生長(zhǎng)情況。對(duì)照初始未脅迫的石果衣共生菌Endocarpon pusillum F07020 CGMCC No.3893。上述石果衣共生菌Endocarponpusillum F07020 CGMCC No. 3893在干燥脅迫210 天后仍未死亡，轉(zhuǎn)接于PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)后，證明其仍有活性(圖6，h)。6、石果衣共生菌 Endocarpon pusillum F07020 CGMCC No. 3893 的固沙實(shí)驗(yàn)活化將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的石果衣共生菌Endocarpon pusilIum F07020 CGMCC No. 3893轉(zhuǎn)接入液體PDA培養(yǎng)基中，150rpm黑暗培養(yǎng)30天。
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將活化后的石果衣共生菌Endocarpon pusillum F07020菌絲球在無(wú)菌條件下研碎，用無(wú)菌水稀釋至濃度為1. 57g/ml (以菌絲球濕重計(jì))后撒播于鋪有無(wú)菌沙粒培養(yǎng)皿中 (培養(yǎng)皿直徑10cm，沙粒厚5mm，以無(wú)菌水剛剛潤(rùn)濕沙粒為準(zhǔn))，每皿噴施5mL，使該共生菌的撒播量為0. lg/cm2(以菌絲球濕重計(jì))，12h光照/1 黑暗，20°C培養(yǎng)30天后觀(guān)察。石果衣共生菌Endocarpon pusillum F07020 CGMCC No. 3893 在 30 天后有新鮮菌絲長(zhǎng)出，同時(shí)可以見(jiàn)到新形成的石果衣共生菌Endocarpon pusillum F07020菌絲與沙粒形成的結(jié)皮，厚約2mm(圖7，圖8)二、石果衣共生藻Diplosphaera chodatii A07020 CGMCC No. 3892 的分離培養(yǎng)與
鑒定1、地衣共生藻的分離培養(yǎng)利用孢子釋放方法從“一’’中的步驟1獲得的石果衣標(biāo)本中分離地衣共生藻，具體方法為將新鮮地衣標(biāo)本的成熟子囊器，用水浸濕后吸去表面多余水分，用凡士林將子囊器倒置在培養(yǎng)皿蓋內(nèi)側(cè)，培養(yǎng)皿下部為1. 5% WA培養(yǎng)基，為獲得單一孢子萌發(fā)形成的藻落， 每1 轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)皿蓋一次(因共生菌與共生藻孢子同時(shí)噴射，所以可以通過(guò)上述孢子釋放方法同時(shí)得到共生菌與共生藻)，當(dāng)觀(guān)察到有藻生長(zhǎng)后，轉(zhuǎn)入PDA斜面培養(yǎng)基，22°C，1 光照/1 黑暗，光照強(qiáng)度20001UX條件下培養(yǎng)地衣共生藻，大量生長(zhǎng)后轉(zhuǎn)入DBD液體培養(yǎng)基， 150rpm同樣條件下振蕩培養(yǎng)。以上操作均在無(wú)菌條件下進(jìn)行，通過(guò)上述方法獲得一株地衣共生藻，將其命名為 A07020。2、地衣共生藻A07020的鑒定1)、形態(tài)特征將地衣共生藻藻株A07020接種于PDA斜面培養(yǎng)基，在22°C，12h光照12h黑暗，光強(qiáng)20001UX條件下培養(yǎng)10天，觀(guān)察藻細(xì)胞形態(tài)。觀(guān)察結(jié)果為細(xì)胞橢圓形至鈍圓柱形；橢圓形細(xì)胞大小為3. 8 X 4. 8 μ m，圓柱形細(xì)胞長(zhǎng)5. 8-8. 6 μ m，寬3. 8-4. 8 μ m ；葉綠體片狀、側(cè)生； 細(xì)胞外側(cè)有水質(zhì)膠殼包裹。2)、nrDNA-ITS (ITS1-S. 8S_ITS2)序列的 PCR 擴(kuò)增和序列測(cè)定A) DNA 提取分別取10_20mg石果衣標(biāo)本及其地衣共生藻A07020 ；液氮研磨；加入300 μ 1 2父07^，輕輕混勻，901水浴&^11 ；加入300μ 1酚氯仿異戊醇05 24 1)，振蕩混勻，12000r/min離心5min去除蛋白質(zhì)；取上清加入等體積的DNA結(jié)合液(4. Omol/L異硫氰酸胍，0. 5mol/L,pH5. O乙酸鉀，終體積濃度為30%異丙醇)顛倒混勻，隨即移入吸附柱靜置 2min，12000r/mim離心15s，棄殘液；加入300 μ 1洗滌液(10mmol/L, ρΗ5· O乙酸鉀，終體積濃度為80%乙醇)，12000r/min離心15s，去殘液，重復(fù)一次；12000r/min離心干燥Imin ；將吸附柱移入新無(wú)菌離心管，加入30 μ ITE洗脫液靜置5min，12000r/min離心15s，重復(fù)洗滌一次，去除吸附柱，離心管內(nèi)即為DNA模板。B) nrDNA-ITS (ITSr5. 8S_ITS2)基因的 PCR 擴(kuò)增及序列測(cè)序用于石果衣標(biāo)本及其地衣共生藻A07020 PCR擴(kuò)增的正向引物為 5' -CTGCGGAAGGATCATTGATTC-3' (18S nt1780-1800)，反向弓I 物為 5，-AGTTCAGCGGGTGGTCTTG-3，(28S nt0012_0030)。PCR 擴(kuò)增體系(50 μ 1) =IOXbuffer5 μ 1 ；25mmol/L MgCl2 3 μ 1 ;2· 5mmol/L dNTPs 4 μ 1 ;10 μ mol/L 弓| 物各 1 μ 1 ;ddH20 34 μ 1 ；Taq DNA 酶 1 μ 1 ；模板 1 μ 1。PCR 擴(kuò)增條件為 95 "C 180s, 94 "C 30s, 52 "C 30s, 72°C 90s，37 個(gè)循環(huán)；72°C 600s，4°C保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)北京標(biāo)凱生物技術(shù)有限公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果經(jīng)DNAman5. 2. 2進(jìn)行雙序列比對(duì)分析。測(cè)序結(jié)果表明，石果衣及其共生藻A07020的IirDNA-ITSdTS1-S. 8S_ITS2)序列長(zhǎng)度均為744bp，其核苷酸序列完全相同(如序列表序列2所示)，表明該石果衣共生藻由其相應(yīng)標(biāo)本分離得到。將石果衣共生藻A07020 WnrDNA-ITSdTS1-S. 8S_ITS2)序列在Genbank 中亍同比X寸 ，胃·歹 1J 與 Stichococcus diplosphaera Chodat = Diplosphaera chodatii BialosukniamnrDNA-ITS(ITS1-S-SS-ITS2)序列相似度為 100%。根據(jù)形態(tài)特征以及nrDNA-ITS (ITS1-S. 8S_ITS2)序列在Genbank中同源序列的比對(duì)結(jié)果，將荒漠地衣共生藻 A07020 鑒定為 Diplosphaera chodatii Bialosuknia。石果衣共生藻Diplosphaera chodatii A07020已于2010年5月31日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡(jiǎn)稱(chēng)CGMCC，地址為北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所)，保藏登記號(hào)為CGMCC No. 3892。3、石果衣共生藻 Diplosphaera chodatii A07020 CGMCC No. 3892 的生長(zhǎng)特性挑取定量石果衣共生藻Diplosphaera chodatii A07020 CGMCC No. 3892，轉(zhuǎn)接于DBD液體培養(yǎng)基中，220C，150rpm 12h光照12h黑暗，光照強(qiáng)度為20001ux培養(yǎng)，通過(guò)葉綠素在665nm處的吸光值測(cè)定共生藻的生長(zhǎng)量，每3天測(cè)定一次，每次3個(gè)重復(fù)，以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，665nm處吸光值為縱坐標(biāo)繪制生長(zhǎng)曲線(xiàn)(圖9)，培養(yǎng)10天后石果衣共生藻 Diplosphaera chodatii A07020 CGMCC No. 3892 達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。4、石果衣共生藻 Diplosphaera chodatii A07020 CGMCC No. 3892 的耐旱性驗(yàn)證1)活化將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的石果衣共生藻Diplosphaera chodatii A07020 CGMCC No. 3892轉(zhuǎn)接入液體PDA培養(yǎng)基中，150rpm黑暗培養(yǎng)10天。2)干燥脅迫無(wú)菌條件下，將1)得到的藻液轉(zhuǎn)入不含培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿(直徑 35mm)中，將培養(yǎng)皿放入含變色硅膠的干燥器中(相對(duì)空氣濕度< 10 %，環(huán)境溫度為20 27°C，自然光照條件)，以造成干燥脅迫。每月將脅迫處理的石果衣共生藻Diplosphaerachodatii A07020 CGMCC No. 3892 轉(zhuǎn)接到固體PDA培養(yǎng)基中，環(huán)境溫度20 27°C，黑暗培養(yǎng)，并觀(guān)察共生藻的生長(zhǎng)情況(圖 10)。對(duì)照初始未脅迫石果衣共生藻Diplosphaera chodatii A07020 CGMCC No. 3892(圖 10，a)。上述石果衣共生藻Diplosphaera chodatii A07020 CGMCC No. 3892 在干燥脅迫 30天后仍未死亡，轉(zhuǎn)接于PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)后，證明其仍有活性(圖10，b)。5、石果衣共生藻 Diplosphaera chodatii A07020 CGMCC No. 3892 的固沙實(shí)驗(yàn)活化將石果衣共生藻Diplosphaerachodatii A07020 CGMCC No. 3892接入土豆浸汁(PDA)液體培養(yǎng)基中，22°C、iai光照/1 黑暗150rpm培養(yǎng)10天。將活化后的石果衣共生藻Diplosphaera chodatii A07020 CGMCC No. 3892 藻懸液在無(wú)菌條件下撒播于鋪有無(wú)菌沙粒培養(yǎng)皿中(沙粒厚約5mm，以無(wú)菌水剛剛潤(rùn)濕沙粒為準(zhǔn))，使該共生藻的撒播量為0. 42 X IO6個(gè)細(xì)胞/平方厘米，光照條件下，20°C培養(yǎng)，60天后觀(guān)察到該共生藻與沙粒形成的藻結(jié)皮，綠色藻層厚約2mm(圖11，圖12)。
權(quán)利要求
1.用于制備地衣的成套產(chǎn)品，由獨(dú)立包裝的菌和藻組成，所述菌為Endocarpon pusillum F07020 CGMCC No. 3893，所述藻為 Diplosphaera chodatii A07020 CGMCC No.3892。
2.由Endocarpon pusillum F07020 CGMCC No. 3893 禾口 Diplosphaera chodatii A07020 CGMCC No. 3892 形成的地衣。
3.制備權(quán)利要求2所述地衣的方法，包括將Endocarponpusillum F07020 CGMCC No. 3893和Diplosphaera chodatii A07020 CGMCC No. 3892均接入固體基質(zhì)進(jìn)行共培養(yǎng)得到地衣的步驟。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述Endocarponpusillum F07020 CGMCC No. 3893的接種量以菌絲球的濕重計(jì)為0. 03-0. 07克/平方厘米；所述Diplosphaera chodatii A07020 CGMCC No. 3892 的接種量為 0· 18X106個(gè)細(xì)胞/ 平方厘米-0. 24X IO6個(gè)細(xì)胞/平方厘米。
5.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的方法，其特征在于所述Endocarponpusillum F07020 CGMCC No. 3893的接種量以菌絲球的濕重計(jì)為0. 05克/平方厘米；所述 Diplosphaera chodatii A07020 CGMCC No. 3892 的接種量為 0. 21 X IO6 個(gè)細(xì)胞 / 平方厘米。
6.根據(jù)權(quán)利要求3-5中任一所述的方法，其特征在于所述共培養(yǎng)的溫度、光照條件如下室溫、每天M小時(shí)中12小時(shí)光照12小時(shí)黑暗、光照強(qiáng)度20001UX。
7.權(quán)利要求2所述的地衣在人工防沙固沙、治理荒漠和/或改善生態(tài)環(huán)境中的應(yīng)用。
8.權(quán)利要求1 或 2 所述的 Endocarpon pusillum F07020 CGMCC No. 3893 和 Diplosphaera chodatii A07020 CGMCC No. 3892在人工防沙固沙、治理荒漠和/或改善生態(tài)環(huán)境中的應(yīng)用。
9.一種固沙的方法，包括將 Endocarpon pusillum F07020 CGMCC No. 3893 和 Diplosphaera chodatii A07020 CGMCC No. 3892混勻后撒播于沙土表面形成結(jié)皮的步驟；所述Endocarpon pusillum F07020 CGMCC No. 3893的撒播量以菌絲球的濕重計(jì)為 0. 03-0. 07克/平方厘米；所述Diplosphaera chodatii A07020 CGMCC No. 3892 的撒播量為 0. 18X106個(gè)細(xì)胞/ 平方厘米-0. 24X IO6個(gè)細(xì)胞/平方厘米。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于所述Endocarponpusillum F07020 CGMCC No. 3893的撒播量以菌絲球的濕重計(jì)為0. 05克/平方厘米；所述 Diplosphaera chodatii A07020 CGMCC No. 3892 的撒播量為 0. 21 X IO6 個(gè)細(xì)胞 / 平方厘米。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種人工生物結(jié)皮治理荒漠的方法及專(zhuān)用地衣。本發(fā)明提供了一種用于制備地衣的成套產(chǎn)品，由獨(dú)立包裝的菌和藻組成，所述菌為Endocarpon pusillum F07020 CGMCC No.3893，所述藻為Diplosphaera chodatii A07020 CGMCC No.3892。本發(fā)明所提供的專(zhuān)用地衣為Endocarpon pusillum F07020 CGMCC No.3893和Diplosphaera chodatii A07020 CGMCC No.3892形成的地衣。按照本發(fā)明的方法將專(zhuān)用地衣和/或該地衣的共生菌和共生藻撒播于沙土表面，一年即可形成結(jié)皮，每平方米的結(jié)皮覆蓋率可達(dá)80％，該方法可直接促進(jìn)地衣結(jié)皮的形成，縮短了微型生物結(jié)皮成熟的時(shí)間，操作簡(jiǎn)便，可以有效持久固沙，提高荒漠生態(tài)系統(tǒng)的營(yíng)養(yǎng)元素及生物多樣性，同時(shí)其形成的生態(tài)景觀(guān)不僅可以為荒漠地區(qū)旅游業(yè)帶來(lái)經(jīng)濟(jì)價(jià)值，而且可以為干旱半干旱地區(qū)城鎮(zhèn)綠化提供材料。
文檔編號(hào)A01H15/00GK102318562SQ20111026201
公開(kāi)日2012年1月18日 申請(qǐng)日期2011年9月6日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月29日
發(fā)明者周啟明, 張濤, 曹叔楠, 楊軍, 魏江春 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院微生物研究所