專利名稱：一株海洋放線菌l131及其代謝物、代謝物的制法及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微生物領(lǐng)域，特別是海洋放線菌L131，另外還涉及菌株代謝物的制法和在生物農(nóng)藥研究領(lǐng)域的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
海洋環(huán)境占據(jù)地球總面積的70. 8%，蘊(yùn)含著豐富的微生物資源，海洋獨(dú)特的環(huán)境特點(diǎn)，如低溫、低營(yíng)養(yǎng)、高壓、高鹽度等，造就了海洋微生物特有的代謝方式和代謝產(chǎn)物，放線菌因具有復(fù)雜的形態(tài)分化過(guò)程而具有合成種類豐富的次級(jí)代謝產(chǎn)物的能力。近年來(lái)，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，越來(lái)越多的海洋放線菌被發(fā)現(xiàn)，許多源于海洋放線菌的次級(jí)代謝產(chǎn)物也被鑒定出具有抗腫瘤，抗菌，抗瘧，殺蟲(chóng)功能以及酶抑制劑等多種生物活性功能。海洋放線菌所產(chǎn)生的結(jié)構(gòu)新穎、功能多樣的活性物質(zhì)成為天然活性產(chǎn)物和新藥開(kāi)發(fā)的重要來(lái)源。番茄是全世界栽培最為普遍的果菜之一。番茄葉霉病(/^/ria Zi^ra)是威脅保護(hù)地番茄生產(chǎn)的一種嚴(yán)重病害，番茄葉霉病主要危害葉片，嚴(yán)重時(shí)危害莖、花、果實(shí)等。病斑多生于葉背，出現(xiàn)不規(guī)則形或橢圓形淡黃色退綠斑，葉背面初生霉層，以后霉層變?yōu)榛液稚蚝诤稚q狀。果實(shí)染病后，在果蒂附近形成圓形黑色病斑，硬化稍凹陷，不能食用。因此， 該病菌的感染可直接導(dǎo)致番茄減產(chǎn)，并嚴(yán)重影響番茄品質(zhì)，此病一旦發(fā)生，會(huì)迅速蔓延，給番茄生產(chǎn)帶來(lái)巨大的損失。針對(duì)番茄葉霉病在生產(chǎn)上常使用化學(xué)農(nóng)藥進(jìn)行防治，田間噴藥是控制番茄葉霉病流行的重要手段，通常采用粉塵或煙霧施藥和噴霧方法。粉塵施藥常用的粉塵劑有5%百菌清粉塵劑、5%加瑞農(nóng)粉塵劑、7%葉面凈粉塵劑、25%斯克WP等，常用的煙劑有45%百菌清煙劑。噴霧施藥多用洲武夷霉素水劑150倍液、50%多菌靈可濕性粉劑500倍液、70%甲基托布津可濕性粉劑800-1000倍液、47%加瑞農(nóng)可濕性粉劑600-800倍液等?；瘜W(xué)藥劑的防治效果明顯，防治速度快，但長(zhǎng)期使用會(huì)使對(duì)化學(xué)藥劑的依賴性越來(lái)越大，田間一個(gè)生長(zhǎng)季節(jié)用藥次數(shù)不斷增加，使病原菌對(duì)使用農(nóng)藥抗藥性不斷增強(qiáng)，防治效果不斷下降，同時(shí)藥劑殘留還會(huì)造成環(huán)境的污染，影響人類的健康。因此，必須探索新的高效安全防治途徑。近年來(lái)，生物防治研究逐漸成為熱點(diǎn)，生物防治的應(yīng)用日益成為綜合治理植物病蟲(chóng)害的重要手段，但目前獲得的高效、低毒、低殘留的抗真菌類抗生素仍然較少，因此新的抗真菌類抗生素及高效的發(fā)酵工藝，將成為保護(hù)生態(tài)環(huán)境，實(shí)現(xiàn)農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的有力保證。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一株海洋放線菌鏈霉菌(份r印sp. )L131，其代謝物具有顯著的抑制番茄葉霉菌的作用，公開(kāi)了代謝物的制備方法，及在生物防治農(nóng)藥中的應(yīng)用。本發(fā)明的一株海洋放線菌鏈霉菌株是從遼寧大連小平島海泥樣品中分離得到的鏈霉菌L131，其在Bennett培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好，菌落凸起，表面褶皺，有白色孢子，產(chǎn)淡黃色可溶性色素；
所述Bennett培養(yǎng)基的組成為葡萄糖10 g，蛋白胨2 g，酵母粉1 g，牛肉膏1 g，瓊脂 15 g，蒸餾水 lL，pH 7. 2，121°C濕熱滅菌 20min。所述海洋鏈霉菌L131代謝物，通過(guò)下述制備方法制得
(1)鏈霉菌L131的發(fā)酵
A、鏈霉菌L131種子液的制備將平板上的菌絲和孢子接入YMG培養(yǎng)基中，30°C，150 rpm培養(yǎng)M h得到種子液；
B、鏈霉菌L131的發(fā)酵將鏈霉菌L131種子液以洲的接種量接入優(yōu)化的發(fā)酵用培養(yǎng)基中，30°C，150 r/min 條件下培養(yǎng) 168 h ；
所述的YMG培養(yǎng)基組成葡萄糖4 g,麥芽提取物10 g,酵母提取物4 g,蒸餾水1 L，pH 5. 5 士 0.2;優(yōu)化的發(fā)酵用培養(yǎng)基組成玉米粉15 g，黃豆粉15 g，酵母浸膏1.5 g, CaCO3 0.5 g，水定容至1L，121°C濕熱滅菌20 min ；
(2)鏈霉菌L131對(duì)真菌具有抑制作用的的代謝物的制備
將發(fā)酵液離心，6000 r/min離心10 min，取離心后的上清液與預(yù)處理后的大孔吸附樹(shù)脂AB-8以10:3(v:m)比例混合，置于搖床150 r/min吸附24 h，然后分別用等體積蒸餾水， 40%甲醇清洗，使用等體積100%甲醇解吸，150 r/min解附M h，解吸液使用真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀35°C蒸干，再以少量體積甲醇將剩余物重新溶解濃縮，其為鏈霉菌L131的代謝物。所述海洋鏈霉菌L131的代謝物在植物病害生物防治的農(nóng)藥中的應(yīng)用。所述海洋鏈霉菌L131在防治番茄葉霉病農(nóng)藥或制劑中的應(yīng)用。所述一種防治番茄葉霉菌的制劑，包括有效成分和輔助成分，其有效成分主要是海洋鏈霉菌L131的代謝物。本發(fā)明一株海洋放線菌，抑菌圈法測(cè)試顯示其發(fā)酵液對(duì)番茄葉霉菌具有顯著的抑制作用。本發(fā)明還公開(kāi)了此海洋放線菌的具有對(duì)番茄葉霉菌有抑制作用的代謝物，其制備方法通過(guò)控制海洋鏈霉菌L131的發(fā)酵條件，使用大孔吸附樹(shù)脂對(duì)抑制番茄葉霉菌的活性物質(zhì)進(jìn)行分離純化，抗菌代謝物制備簡(jiǎn)單易行，成本低，具有抑制番茄葉霉病的效果，屬效果較好的綠色農(nóng)藥。


圖1顯示的是菌株L131的菌落形態(tài)；圖2顯示的是菌株L131的平板抑制番茄葉霉菌作用。圖3顯示的是菌株L131葉片實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合具體實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。實(shí)施例1菌株L131的鑒定綜合鏈霉菌的形態(tài)特征、生理生化特征、16S rDNA序列等，將其鑒定為鏈霉菌屬。具體 鑒定結(jié)果如下
1.菌體形態(tài)
菌株L131在Bennett培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好，菌落凸起，表面褶皺，有白色抱子，產(chǎn)淡黃色 可溶性色素(見(jiàn)圖1)。2.生理生化特征
菌株L131生理生化特征如下兩個(gè)表格(表1、2)所示菌株L131不能產(chǎn)；明膠液 化成陽(yáng)性；牛奶胨化反應(yīng)成陰性；不能產(chǎn)生淀粉酶水解淀粉；可以葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、肌 醇、山梨醇、半乳糖作為唯一碳源生長(zhǎng)。pH值在6-12的范圍內(nèi)能夠生長(zhǎng)，pH在7-11的范圍 內(nèi)生長(zhǎng)良好并產(chǎn)生孢子；鹽濃度在0-11%能夠生長(zhǎng)，鹽濃度在0-8%生長(zhǎng)良好并產(chǎn)生抱子。表1生理生化特征
權(quán)利要求
1.一種海洋鏈霉菌L131，其特征是分離自海泥樣品中，純化培養(yǎng)基為Bennett培養(yǎng)基，海洋鏈霉菌L131菌落凸起，表面褶皺，有白色孢子，產(chǎn)淡黃色可溶性色素。
2.權(quán)利要求1所述一種海洋鏈霉菌L131，其特征是所述Bennett培養(yǎng)基的組成為葡萄糖10 g，蛋白胨2 g，酵母粉1 g，牛肉膏1 g，瓊脂15 g，蒸餾水定容至lL，pH 7. 2，121°C 濕熱滅菌20min。
3.一種海洋鏈霉菌L131，其特征是，其16S rDNA核苷酸全序列，總長(zhǎng)為1421bp，序列如下所示GGCGGCGTGCTTACACATGCAAGTCGAACGATGAACCGCTTTCGGGCGGGGATTAGTGGCGAACGGGTGAGT AACACGTGGGCAATCTGCCCTGCACTCTGGGACAAGCCCTGGAAACGGGGTCTAATACCGGATATGACCGTCTGCCG CATGGTGGATGGTGTAAAGCTCCGGCGGTGCAGGATGAGCCCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGAGGTAGTGGCTCA CCAAGGCGACGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGCGACCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGG GAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGAAAGCCTGATGCAGCGACGCCGCGTGAGGGATGACGGCCTTCGG GTTGTAAACCTCTTTCAGCAGGGAAGAAGCGAAAGTGACGGTACCTGCAGAAGAAGCGCCGGCTAACTACGTGCCAG CAGCCGCGGTAATACGTAGGGCGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGAGCTCGTAGGCGGCTTGTCACGT CGGTTGTGAAAGCCCGGGGCTTAACCCCGGGTCTGCAGTCGATACGGGCAGGCTAGAGTTCGGTAGGGGAGATCGGA ATTCCTGGTGTAGCGGTGAAATGCGCAGATATCAGGAGGAACACCGGTGGCGAAGGCGGATCTCTGGGCCGATACTG ACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGGTGGGCACTAG GTGTGGGCAACATTCCACGTTGTCCGTGCCGCAGCTAACGCATTAAGTGCCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGC TAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGCGGAGCATGTGGCTTAATTCGACGCAACGCGAAGAACCT TACCAAGGCTTGACATACACCGGAAACGTCTGGAGACAGGCGCCCCCTTGTGGTCGGTGTACAGGTGGTGCATGGCT GTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTCCCGTGTTGCCAGCAGGCC CTTGTGGTGCTGGGGACTCACGGGAGACCGCCGGGGTCAACTCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAGTCATCATGC CCCTTATGTCTTGGGCTGCACACGTGCTACAATGGCCGGTACAATGAGCTGCGATACCGTGAGGTGGAGCGAATCTC AAAAAGCCGGTCTCAGTTCGGATTGGGGTCTGCAACTCGACCCCATGAAGTCGGAGTCGCTAGTAATCGCAGATCAG CATTGCTGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACGTCACGAAAGTCGGTAACACCCGAAGCC GGTGGCCCAACCCCTTGTGGGAGGGAGCTGTCGAAGTGGA。
4.權(quán)利要求1所述一種海洋鏈霉菌L131代謝物，其特征在于通過(guò)下述制備方法制得(1)鏈霉菌L131的發(fā)酵A、鏈霉菌L131種子液的制備將平板上的菌絲和孢子接入YMG培養(yǎng)基中，30°C，150 rpm培養(yǎng)M h得到種子液；B、鏈霉菌L131的發(fā)酵將鏈霉菌L131種子液以洲的接種量接入優(yōu)化的發(fā)酵用培養(yǎng)基中，30°C，150 r/min 條件下培養(yǎng) 168 h ；所述的YMG培養(yǎng)基組成葡萄糖4 g，麥芽提取物10 g，酵母提取物4 g，蒸餾水定容至 1L, pH 5. 5士0. 2，121°C濕熱滅菌 20 min, pH 5. 5士0. 2 ；優(yōu)化的發(fā)酵用培養(yǎng)基組成玉米粉15 g，黃豆粉15 g，酵母浸膏1.5 g，CaCO3 0.5 g，蒸餾水定容至1L，121°C濕熱滅菌20 min ；(2)對(duì)番茄葉霉菌有抑制作用的鏈霉菌L131的代謝物的制備將發(fā)酵液6000 r/min離心10 min，取離心后的上清液與預(yù)處理后的大孔吸附樹(shù)脂AB-8以10:3 (v:m)比例混合，置于搖床150 r/min吸附M h，然后分別用等體積蒸餾水， 40%甲醇清洗，使用等體積100%甲醇解吸，150 r/min解吸附M h，解吸液使用真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀35°C蒸干，再以1/10體積純甲醇將剩余物重新溶解濃縮，得到對(duì)番茄葉霉菌有顯著抑制作用的鏈霉菌L131的代謝物。
5.權(quán)利要求4所述一種海洋鏈霉菌L131代謝物在番茄葉霉病防治的農(nóng)藥或制劑中的應(yīng)用。
6.權(quán)利要求5所述番茄葉霉病防治的農(nóng)藥或制劑，其特征是包括有效成分和輔助成分，其有效成分主要是海洋鏈霉菌L131的代謝物。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種海洋鏈霉菌L131及其抗真菌活性的應(yīng)用。一種海洋鏈霉菌L131，分離自海泥樣品中，純化培養(yǎng)基為Bennett培養(yǎng)基，海洋鏈霉菌L131菌落凸起，表面褶皺，有白色孢子，產(chǎn)淡黃色可溶性色素。本發(fā)明海洋放線菌L131經(jīng)抑菌圈法測(cè)試顯示其發(fā)酵液對(duì)番茄葉霉菌具有顯著的抑制作用。本發(fā)明還公開(kāi)了此海洋放線菌的具有對(duì)番茄葉霉菌有抑制作用的代謝物粗提物的制備方法。該制備方法通過(guò)控制海洋鏈霉菌L131的發(fā)酵條件，使用大孔吸附樹(shù)脂對(duì)抑制番茄葉霉菌的活性物質(zhì)進(jìn)行分離純化?？咕x物制備簡(jiǎn)單易行，成本低，屬效果較好的綠色農(nóng)藥。
文檔編號(hào)A01N63/02GK102352327SQ201110261599
公開(kāi)日2012年2月15日 申請(qǐng)日期2011年9月6日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月6日
發(fā)明者吳毅, 方文晶, 沈俊濤, 王玉梅, 謝萌, 趙心清, 陳德玲 申請(qǐng)人:大連理工大學(xué)