專利名稱：一種與植物抗低溫相關(guān)的miRNA——gma-miR169c及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種與植物抗低溫相關(guān)的miRNA，尤其是一種來(lái)源于大豆的、能夠調(diào)節(jié)大豆抗低溫性的miRNA ；本發(fā)明還涉及此miRNA的前體及用途。
背景技術(shù)：
大豆是非常重要的、具有特殊經(jīng)濟(jì)價(jià)值的作物。低溫等環(huán)境脅迫對(duì)大豆的生長(zhǎng)發(fā)育具有重要影響，嚴(yán)重時(shí)會(huì)造成大豆大規(guī)模減產(chǎn)。解析大豆抵抗低溫的分子機(jī)制，培育耐低溫的大豆品種是目前大豆種植業(yè)的主要目標(biāo)之一。目前，應(yīng)用基因工程育種已經(jīng)成為增強(qiáng)作物耐低溫性的重要手段。高等植物在應(yīng)答低溫脅迫時(shí)啟動(dòng)了多種應(yīng)答網(wǎng)絡(luò)，研究表明， microRNA (miRNA)在其中也具有非常重要的作用。miRNA是近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)的一種長(zhǎng)20 24 nt的內(nèi)源性非蛋白編碼RNA。miRNA 基因最初轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生具有頸環(huán)結(jié)構(gòu)的pre-miRNAs。隨后pre-miRNA被轉(zhuǎn)運(yùn)出核，在細(xì)胞質(zhì)中被Dicer酶作用，加工成成熟的miRNA。通過(guò)序列互補(bǔ)與特定靶基因的mRNA結(jié)合，引起mRNA 降解或抑制mRNA翻譯從而對(duì)基因的表達(dá)起到負(fù)調(diào)節(jié)作用(Llave et al. , 2002; Palatnik et al. , 2003; Tang et al. , 2003)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種與植物抗低溫相關(guān)的miRNA及其前體序列， 利用此miRNA能夠提高大豆的抗低溫性，對(duì)提高大豆產(chǎn)量具有重大的意義。為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明所采取的技術(shù)方案如下。一種與植物抗低溫相關(guān)的miRNA，其具有序列表中SEQ ID NO 1所示的序列。上述與植物抗低溫相關(guān)的miRNA的前體序列，其具有序列表中SEQ ID NO 2所示的序列。上述與植物抗低溫相關(guān)的miRNA在培育抗低溫轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。作為上述應(yīng)用的一種優(yōu)選技術(shù)方案，所述抗低溫轉(zhuǎn)基因植物為大豆。作為上述應(yīng)用的一種優(yōu)選技術(shù)方案，在大豆中過(guò)表達(dá)SEQ ID NO :1所示的miRNA， 或抑制SEQ ID NO 1所示miRNA的表達(dá)，培育出具有高抗低溫性的轉(zhuǎn)基因大豆。采用上述技術(shù)方案所產(chǎn)生的有益效果在于本發(fā)明miRNA的表達(dá)受到低溫脅迫的調(diào)節(jié)，說(shuō)明其在大豆適應(yīng)低溫脅迫機(jī)制中起重要作用，基于此，可利用其培育具有高抗低溫性的轉(zhuǎn)基因大豆，對(duì)提高大豆產(chǎn)量具有重大的意義。


圖1為gma-miR169C前體序列的莖環(huán)結(jié)構(gòu)圖，可見其前體序列折疊成一種穩(wěn)定的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，屬于miRNA前體典型的二級(jí)結(jié)構(gòu)，符合miRNA前體的結(jié)構(gòu)特征。圖2為低溫脅迫條件下gma-miR169C在根及根瘤中的表達(dá)特征的定量PCR結(jié)果。
圖3為用大豆毛狀根轉(zhuǎn)化體系檢測(cè)到的gma-miR169C在大豆根中對(duì)低溫脅迫的響應(yīng)。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例詳細(xì)說(shuō)明了本發(fā)明。本發(fā)明所使用的各種原料及各項(xiàng)設(shè)備均為常規(guī)市售產(chǎn)品，均能夠通過(guò)市場(chǎng)購(gòu)買直接獲得。以下實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)， 結(jié)果取平均值。實(shí)施例1、實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析gma-miR169C在低溫脅迫下的表達(dá)特性一、脅迫處理
脅迫根瘤材料按照以下流程進(jìn)行WilimaS82大豆種子用70%的灑精滅菌30 S，dH20 沖洗6遍后播種于無(wú)菌培養(yǎng)皿中，皿底置2張無(wú)菌濾紙，dH20浸濕，28 °C暗萌發(fā)3天。芽長(zhǎng)至2 cm時(shí)，移至放有濕潤(rùn)濾紙的試管中，芽長(zhǎng)至4 5 cm，移至活化的根瘤菌菌液中，接種30 min，低N水培，10，000 lux，溫度為26 °C，相對(duì)濕度為70%，培養(yǎng)28天，脅迫處理，取根瘤。低溫處理4°C處理24小時(shí)后取根瘤，于液氮速凍，-80°C保存?zhèn)溆谩６?、miRNA 的分離
取根瘤，用microRNA提取試劑盒(百泰克公司)(Cat # RP5301)提取小片段RNA，提取方法如下
(1)勻漿處理
根瘤用液氮內(nèi)研缽快速磨碎，每50 100 mg組織加1 ml裂解液后勻漿。(2)將勻漿樣品劇烈震蕩混勻，在15 -30 °C條件下孵育5 min以使核蛋白體完全分解。(3)4 ！的條件下12，000 rpm離心10 min，小心取上清轉(zhuǎn)入一個(gè)新的RNase free的離心管中。當(dāng)樣品富含蛋白質(zhì)、脂肪、多糖時(shí)，可離心10 min，移除勻漿中不溶解的物質(zhì)，余下的沉淀中包含有細(xì)胞外膜、多糖、以及高分子量DNA，而上層的超浮游物含有RNA。(4)每1 ml裂解液加0. 2 ml氯仿。蓋緊樣品管蓋，劇烈振蕩15 s并將其在室溫下孵育3min。(5)樣品于4 V 12，000 rpm離心10 min，會(huì)分成三層下層有機(jī)相，中間層和上層無(wú)色的水相，RNA存在于水相中。水相層的容量大約為所加裂解液體積的60%，把水相轉(zhuǎn)移到新管中，進(jìn)行下一步操作。(6)加入0. 6倍體積70%乙醇，顛倒混勻(此時(shí)可能會(huì)出現(xiàn)沉淀)。得到的溶液和可能沉淀一起轉(zhuǎn)入吸附柱RA中。(7)10, 000 rpm離心45 s，收集下濾液(下濾液中含有microRNA)，準(zhǔn)確估計(jì)下濾液的體積(準(zhǔn)確性非常重要)，加入2/3倍體積的無(wú)水乙醇，顛倒幾次混勻，將混合液倒入到吸附柱RB中，10，000 rpm離心30 s棄掉廢液。(8)加入700 μ 1漂洗液RW，12，000 rpm離心60 s，棄掉廢液。(9)加入500 μ 1漂洗液RW，12，000 rpm離心60 s，棄掉廢液。(10)將吸附柱RB放回空收集管中，12，000 rpm離心2 min，盡量除去漂洗液，以
免漂洗液中殘留乙醇抑制下游反應(yīng)。
(11)取出吸附柱RB，放入一個(gè)RNase free離心管中，根據(jù)預(yù)期RNA產(chǎn)量在吸附膜中間部位加60-80 μ 1 RNase free water(事先在65-70 °C水浴中加熱)，室溫放置2 min， 然后12，000 rpm離心1 min。收集得到純凈microRNA保存于-80 °C冰箱。三、反轉(zhuǎn)錄為cDNA
用天根miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒將純化的miRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。1.小 RNA 的 Poly (A)加尾反應(yīng)液的配置
小 RNA6 μ 1
E-PAP (5U/y 1)0. 4 μ 1
10ΧΡΑΡ Buffer2 μ 1
5 XrATP solution4 μ 1
Nuclease-free Water7. 6 μ 1
總體積20 μ 1
輕輕混勻上述配制的反應(yīng)液，短暫離心后，37°C反應(yīng)60min。所得反應(yīng)液可以直接進(jìn)行下游實(shí)驗(yàn)，也可以放置-20°C短暫保存，如需長(zhǎng)期保存建議存放于-80°C。2. Poly(A)修飾的miRNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)反應(yīng)液的配置
Poly(A)反應(yīng)液2μ1
10XRT primer2μ 1
10XRT Buffer2μ 1
超純 dNTP Mixture (2. 5Mm)1 μ 1
Rnasin (40U/μ 1)1 μ 1
Quant RTase0. 5 μ 1
RNase-free ddH201. 5μ 1
總體積20 μ 1
輕輕混勻上述配制的反應(yīng)液，短暫離心后，37°C反應(yīng)60min。合成的cDNA反應(yīng)液放置-20°C保存，也可以直接進(jìn)行下游熒光定量檢測(cè)。四、實(shí)時(shí)熒光定量PCR
按如下反應(yīng)體系，混好體系，然后分裝入96孔光學(xué)板中，并覆蓋上專用光學(xué)膜。擴(kuò)增使用的儀器為ABI公司的熒光定量PCR儀。擴(kuò)增程序?yàn)?5"C 30s ；95 "C 5 s，60 "C 34s,45 cycles ；95 "C 15 s，60 "C 1 min,95 °C 15 s,
20 μ 1反應(yīng)體系配制如下
DNA模板2 μ 1
SYBR Primix Ex taq {2X)10 μ 1
PCR Forward Primer (10 μ Μ)0. 4 μ 1
PCR Reverse Primer (10 μ Μ)0. 4 μ 1
ROX Reference Dye II (50Χ)0. 4 μ 1
ddH206 · 8 μ 1總體積20 μ 1
引物序列為正 向引物:AAGCCAAGGATGACTTGCCGA (SEQ ID NO 4) ；5. 8S rRNA-F ACGCCTGCCTGGGTGTCACAC (SEQ ID NO 5) ； AMRM :GCGAGCACAGAATTAATACGACT (SEQ ID NO: 6) ；(5. 8S rRNA為內(nèi)參，AMRM為反向引物)；
結(jié)果如圖2所示，其中N為對(duì)照處理根瘤，CN為4°C低溫處理根瘤。結(jié)果表明，24小時(shí)顯著抑制了 gma-miR169c在根瘤中的表達(dá)，從而說(shuō)明gma_miR169c參與大豆根瘤對(duì)低溫脅迫的響應(yīng)。這樣，在大豆中過(guò)表達(dá)gma-miR169c，或抑制gma_miR169c的表達(dá)，將影響大豆對(duì)低溫脅迫的適應(yīng)能力，培育出具有高抗低溫性的轉(zhuǎn)基因大豆，對(duì)提高大豆的產(chǎn)量具有重大的意義。實(shí)施例2、利用大豆毛狀根轉(zhuǎn)化系統(tǒng)對(duì)gma-miR169C在逆境下的表達(dá)進(jìn)行分析一、gma-miR169c Pro-GUS 載體構(gòu)建
所述pcambia3301-GUS-gma-miR169c為將所述gma-miR169c的啟動(dòng)子區(qū)域插在 pcambia3301的多克隆位點(diǎn)得到的重組質(zhì)粒，優(yōu)選為將序列表3的序列(啟動(dòng)子序列)3’自 5’端第1至1108位核苷酸所示的DNA片段插入pcambia3301的BamHI和NcoI酶切識(shí)別位點(diǎn)之間得到的重組質(zhì)粒。二、材料準(zhǔn)備及低溫處理
以W82大豆品種為材料，將材料用氯氣消毒10小時(shí)后，在B5培養(yǎng)基上萌發(fā)4天進(jìn)行毛狀根轉(zhuǎn)化，外植體轉(zhuǎn)至共培培養(yǎng)基上生長(zhǎng)2天后，再轉(zhuǎn)至MS/2培養(yǎng)基上培養(yǎng)，15天后，毛狀根長(zhǎng)出，選擇發(fā)育階段接近的長(zhǎng)度約1-2厘米的毛狀根分別在4°C處理24小時(shí)前后，取樣進(jìn)行GUS染色，染色時(shí)間限定為3小時(shí)。三、⑶S組織化學(xué)分析 (1)⑶S染液的配制
首先配制GUS反應(yīng)緩沖液Tris Buffer，其中包括100 mM Tris和50 mM NaCl 以濃鹽酸調(diào)PH至7. 4。然后以Tris buffer配制0.5 mM K3 [Fe (CN)6]溶液。按1 mg/ml 的濃度稱取x-glu (5-溴-4-氯-3-吲哚葡萄糖醛酸苷)，按照每mg加入10 μ 1 DMSO (二甲基亞砜)的比例溶解x-glu，加入Tris buffer配制的0.5 mM K3 [Fe (CN)6]溶液定容，可加入幾滴TritonX-IOO以增強(qiáng)染色效果。迅速分裝后于_20°C避光保存。(2)⑶S染色步驟
將待測(cè)定的毛狀根取植物樣品放入GUS反應(yīng)緩沖液中，浸沒(méi)，37°C暗中保溫。每隔半小時(shí)在解剖鏡下觀察顯色效果。染色3小時(shí)后，吸出⑶S反應(yīng)緩沖液，加入70%乙醇終止反應(yīng)并在37°C脫色，每隔數(shù)小時(shí)更換一次。結(jié)果如圖3所示，其中A是轉(zhuǎn)化gma-miR169C啟動(dòng)子攜帶⑶S報(bào)告基因的毛狀根在4°C低溫處理中的GUS積累表型，B是對(duì)出現(xiàn)GUS積累的毛狀根的GUS積累量及積累模式進(jìn)行的顯微對(duì)比觀察。從圖中可以看出，gma-miR169C的表達(dá)受到了 4°C低溫脅迫的顯著抑制，顯微觀察結(jié)果表明，4°C低溫處理24小時(shí)后明顯降低了 gma-miR169C在大豆的毛狀根中柱中的表達(dá)量，從而說(shuō)明gma-miR169C參與調(diào)節(jié)大豆對(duì)低溫脅迫的響應(yīng)。這樣，在大豆中過(guò)表達(dá)gma-miR169C，或抑制gma-miR169c的表達(dá)，將影響大豆對(duì)低溫脅迫的適應(yīng)能力，培育出具有高抗低溫性的轉(zhuǎn)基因大豆，對(duì)提高大豆的產(chǎn)量具有重大的意義。上述描述僅作為本發(fā)明可實(shí)施的技術(shù)方案提出，不作為對(duì)其技術(shù)方案本身的單一限制條件。
權(quán)利要求
1.一種與植物抗低溫相關(guān)的miRNA，其特征在于其具有序列表中SEQ ID N0:1所示的序列。
2.權(quán)利要求1所述的與植物抗低溫相關(guān)的miRNA的前體序列，其特征在于其具有序列表中SEQ ID NO 2所示的序列。
3.權(quán)利要求1所述的與植物抗低溫相關(guān)的miRNA在培育抗低溫轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的與植物抗低溫相關(guān)的miRNA的用途，其特征在于所述抗低溫轉(zhuǎn)基因植物為大豆。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的與植物抗低溫相關(guān)的miRNA的用途，其特征在于在大豆中過(guò)表達(dá)SEQ ID NO :1所示的miRNA，或抑制SEQ ID NO :1所示miRNA的表達(dá)，培育出具有高抗低溫性的轉(zhuǎn)基因大豆。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種與植物抗低溫相關(guān)的miRNA，其具有序列表中SEQ ID NO1所示的序列；在大豆中過(guò)表達(dá)SEQ ID NO1所示的miRNA，或抑制SEQ ID NO1所示miRNA的表達(dá)，以培育出具有高抗低溫性的轉(zhuǎn)基因大豆，對(duì)提高大豆產(chǎn)量具有重大的意義。
文檔編號(hào)A01H5/00GK102220329SQ201110154909
公開日2011年10月19日 申請(qǐng)日期2011年6月10日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月10日
發(fā)明者李東曉, 李霞, 王幼寧, 石磊, 陳亮 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所