專利名稱：冰凌花低溫脅迫轉(zhuǎn)錄因子AaCBF基因序列及其克隆和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及冰凌花(/Wo/ /samwreA7s/s)低溫脅迫轉(zhuǎn)錄因子」aC9F基因的克隆、重組 及抗寒性功能的分析和應(yīng)用，屬于分子生物學(xué)和生物技術(shù)領(lǐng)域。
(二)
背景技術(shù)：
低溫是典型的環(huán)境脅迫因素之一。 一般認(rèn)為低溫脅迫使植物光合作用降低，呼吸作 用增強(qiáng)，能量產(chǎn)生和物質(zhì)合成受阻，消耗增強(qiáng)，植物處于饑餓狀態(tài)，嚴(yán)重影響了植物正 常生長發(fā)育甚至導(dǎo)致死亡。因此，研究并提高植物抗寒力具有重要理論和現(xiàn)實(shí)意義。目 前，有關(guān)CBF (C-r印eat Binding Factor)低溫反應(yīng)途徑及其相關(guān)基因的分離和應(yīng)用在 植物抗寒分子生物學(xué)研究中倍受關(guān)注。CBF是低溫信號傳導(dǎo)中的一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子，參與調(diào)控 C做75a， O力板6， a 斜7和a^7《等低溫/干旱應(yīng)答基因的表達(dá)(Fowler & Thomashow, 2002)， 在這些基因的啟動子上均有一個(gè)低溫/干旱反應(yīng)DNA調(diào)控元件CRT/DRE，序列為CCGAC, 該轉(zhuǎn)錄因子就是通過與CRT/DRE元件相互作用，參與調(diào)控上述基因的表達(dá)。在正常生長 條件下(2(TC及充足的水分)，轉(zhuǎn)錄因子63F基因和它調(diào)控的低溫應(yīng)答基因6W 均不表 達(dá)。然而，當(dāng)把植物轉(zhuǎn)移到低溫情況下(4°C) ， 10分鐘之后6FF基因首先表達(dá)，大約2 小時(shí)后OW基因表達(dá)。另外，轉(zhuǎn)基因擬南芥組成型超表達(dá)CBF1或CBF3,不僅使aWMWW7， ,i"A7， 6'和OW/5a基因在正常條件下能表達(dá)，在低溫脅迫條件下，也使這些基因
的表達(dá)都比野生型顯著增強(qiáng)，植物對低溫的耐性也隨之大大增強(qiáng)；同時(shí)，轉(zhuǎn)基因擬南芥 的可溶性糖含量、脯氨酸含量顯著高于未轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩仓辏喾?，葉片組織EU。值顯著 低于對照植株(Fowler & Thomashow, 2002)。上述研究結(jié)果表明CBF蛋白對于調(diào)控低溫 脅迫下抗寒基因的表達(dá)、提高植物抗寒性具有重要作用。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供冰凌花低溫脅迫轉(zhuǎn)錄因子//aG9尸基因序列，并提供將該基因?qū)?入受體植物，獲得具有抗寒能力的轉(zhuǎn)基因植物。 技術(shù)方案
1.從冰凌花中分離出低溫脅迫轉(zhuǎn)錄因子七6SF基因的全長cDNA片段
采用基因組DNA小量提取試劑盒提取冰凌花基因組DNA，電泳檢測良好。根據(jù)已發(fā)表 在Genebank中的植物CBF基因序列，應(yīng)用primer5. 0引物設(shè)計(jì)軟件，設(shè)計(jì)一對兼并引物 正向引物5'-CC(GATC)CC(GATC)AT(TAC)AT(TAC)TT(TC)AA(TC)GC-3' 反向引物5'-GT(GATC)AC(GATC)TT(AG)TGCCA(GATC)GT(AG)TA-3'
通過PCR擴(kuò)增得到長度為434bp中間片段。然后設(shè)計(jì)兩對特異引物。通過反向PCR 擴(kuò)增出752bp的全長/^G9,片段。包括起始密碼子前的上游序列和終止密碼子的下游序 列。開放閱讀框部分為621bp，由此推得具307個(gè)氨基酸的一段序列，將此氨基酸序列在 國際基因庫中進(jìn)行比較，表明與己發(fā)表其它63^基因同源性達(dá)到49.6%，表明經(jīng)過上述 克隆步驟得到了冰凌花低溫脅迫轉(zhuǎn)錄因子C9F基因的類似基因。該基因序列及其編碼的 氨基酸序列如下 序列表
(l)SEQ ID NO 1的信息
(a) 序列特征
*長度752堿基對 *類型核酸 *鏈型雙鏈 *拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性
(b) 分子類型DNA
(c) 假設(shè)否
(d) 反義否
(e) 最初來源冰凌花
(f) 序列描述SEQ IN NO. 1
TCATCACAAGGAGACGACACAGCAAGTCAAGCATCTCACAAGAGAAAATCCGGACGAAAG 180
AAGTTCACAGAGACGCGACACCCCATTTATAGAGGTGTTCGGCAGAGAAATGGCGCCAAA 240
TGGGTGTCTGAMTTCGTGATCGTAGCMGAAAAACTCCAGTATATGGCTAGGCACATTC 300
CCAACGCCTGGAATGGCTGCTAGAGCCTACGATGTTGCAGCTTTGGCACTCAGAGGGAAG 360
GCTCAGGATATCAAACTCGCTGCTTCTGAAGCTGCTCAAGCATTTGCACCTACTGCTACA 480
TTCTGGGATGAGGAGGCAATGTTCAATATGCCAAGTTTACTTGACAATATGGCAGAAGGG 600
TTTTGTATTCAAGATGGAATMTTGAAATATA 752 (2) SEQINN0.2的信息
(a) 序列特征
*長度206氨基酸
*類型氨基酸
*鏈型單鏈
*拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性
(b) 分子類型蛋白質(zhì) (C)序列描述
MDYSQYGYPSSPIYSSSSSSQGDDTASQASHKRKSGRKKFTETRHPIYRGVRQRNGAK群 60 SEIRDRSKKNSSIWLGTFPTPGMAARAYDVAALALRGKSAPLNFVDSAWLLPRPKSSSAQ 120 DIKLAASEAAQAFAPTATSSSSSSSPMNLRVPVEPSSMFWDEEAMF麗PSLLDNMAEGML 180 LTPPSMQERFSCE扁FNMELSL麗D 206
2.構(gòu)建含有上述完整基因片段的表達(dá)載體-根據(jù)上述序列，設(shè)計(jì)構(gòu)建表達(dá)載體的引物 正向引物5'— gCCggATCCATGGATTATTCGCAGTACGG-3' 反向引物5'-gCCgagCTCTGTCCTTGTGGAACGATTAA —3'
以基因組DNA為模板，利用構(gòu)建高效表達(dá)載體。
3. 將構(gòu)建好的表達(dá)載體通過凍融法轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌EHA105。
4. 轉(zhuǎn)化煙草NC89，在含卡那霉素(100mg/L)和頭孢(250mg/L)的MS固體培養(yǎng)基上 篩選，將篩選出的抗性苗進(jìn)行分化生根培養(yǎng)后,對其進(jìn)行低溫處理比較其抗寒性變化。實(shí) 驗(yàn)結(jié)果表明，與野生型相比，含有本發(fā)明所得的冰凌花低溫脅迫轉(zhuǎn)錄因子ZaaF基因的 轉(zhuǎn)基因植株具較高的抗寒能力。
根據(jù)上述技術(shù)，從冰凌花中分離出的低溫脅迫轉(zhuǎn)錄因子^aCS/^因，該基因過量表達(dá) 能導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因煙草具較高的抗寒性。讓該基因在其它作物中表達(dá)，將會提高作物的抗寒 性；如果與特異啟動子連接，對其表達(dá)進(jìn)行時(shí)空和脅迫誘導(dǎo)進(jìn)行調(diào)控，將更具有針對性，
具有非常重要的經(jīng)濟(jì)效益和社會效益.

圖1是野生型和轉(zhuǎn)^aOF基因植株的光合速率的測定結(jié)果柱狀圖；橫坐標(biāo)表示低溫 處理的時(shí)間，縱坐標(biāo)表示光合速率值；W代表野生型，T代表轉(zhuǎn)基因植株。
圖2是野生型和轉(zhuǎn)基因植株的葉綠素含量的測定結(jié)果柱狀圖；橫坐標(biāo)表示低溫處理 的時(shí)間，縱坐標(biāo)表示葉綠素含量；W代表野生型，T代表轉(zhuǎn)基因植株。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1:冰凌花低溫脅迫轉(zhuǎn)錄因子^aC5堪因的克隆方法
1. 基因組DNA的提取釆用基因組DNA小量提取試劑盒(百奧公司產(chǎn)品)提取冰凌 花基因組DNA。
2. 基因組DNA酶切、環(huán)化取l微克基因組DNA,加入10xK反應(yīng)緩沖液4 pl， 0.1%BSA 4fxl，用ddH2O補(bǔ)足體系40pl， 37 。C保溫過夜。65。C保溫20分鐘終止反應(yīng)。用T4DNA ligase連接環(huán)化。
3. 反向PCR反應(yīng)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)試劑與條件為 第一輪PCR反應(yīng)
10x反應(yīng)緩沖液(內(nèi)含MgC12) 2. 5(il
10 mM脫氧核苷酸混合物(dNTP) 1 |il Fl引物(10,) 1 |il
Rl引物(lOpM) 1 nl
模板DNA 1 pi
Taq DNA聚合酶 0. 1
總體積 25 nl
PCR反應(yīng)條件為94°C 8分鐘，然后進(jìn)入下列循環(huán)94°C 40秒，56°C 50秒，72°C 70 秒，共35個(gè)循環(huán)，最后72。C延伸8分鐘。
第二輪PCR反應(yīng)(模板為第一輪PCR產(chǎn)物稀釋20倍) lOx反應(yīng)緩沖液(內(nèi)含MgC12) 2. 5(il
10 mM脫氧核苷酸混合物(dNTP) 1 pi F2引物(10|_iM) 1 |_U
R2引物(lO^M) 1 pi
模板DNA 1 |il
Taq DNA聚合酶 0. 1
總體積 25 nl
PCR反應(yīng)條件為94°C 8分鐘，然后進(jìn)入下列循環(huán)94°C 40秒，54°C 50秒，72°C 70 秒，共35個(gè)循環(huán)，最后72。C延伸8分鐘。
4. 基因克隆用凝膠回收試劑盒回收后的PCR3)al與PMD18-T載體進(jìn)行連接，操作 步驟說明書進(jìn)行。然后連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a菌株，在表面涂有5-溴一4一氯一3 一吲哚一(一D—半乳糖苷)和X—gal的含氨芐青霉素(100微克/毫升)的LB平板上生長 過夜。挑取白色菌落，在LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜。
5. 質(zhì)粒DNA的提取堿法提取DNA。
6. 序列測定本工作在大連寶生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行。
7. 同源檢索利用BLAST軟件將分離出的序列與基因銀行中的序列進(jìn)行比較。 實(shí)施例2:冰凌花低溫脅迫轉(zhuǎn)錄因子^aC9堪因序列測定，本工作在大連寶生物工程 技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行。
冰凌花低溫脅迫轉(zhuǎn)錄因子」a6Sf基因及其編碼的氨基酸序列如下 (1) SEQ ID NO 1的信息
(d) 序列特征
*長度752堿基對 *類型核酸 *鏈型雙鏈 *拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性
(e) 分子類型DNA
(f) 假設(shè)否
(g) 反義否
(h) 最初來源冰凌花
(i) 序列描述SEQ IN NO. 1
TCATCACAAGGAGACGACACAGCAAGTCAAGCATCTCACAAGAGAAAATCCGGACGAAAG 180 AAGTTCACAGAGACGCGACACCCCATTTATAGAGGTGTTCGGCAGAGAAATGGCGCCAAA 240
TTTTGTATTCAAGATGGAATAATTGAAATATA (2) SEQINN0.2的信息 (j)序列特征
*長度206氨基酸
*類型氨基酸
*鏈型單鏈
*拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性 (k)分子類型蛋白質(zhì) (1)序列描述
MDYSQYGYPSSPIYSSSSSSQGDDTASQAS服RKSGRKKFTETRHPIYRGVRQRNGAKWV SEIRDRSKKNSSIWLGTFPTPGMAARAYDVAALALRGKSAPLNFVDSAWLLPRPKSSSAQ DIKLAASEAAQAFAPTATSSSSSSSPMNLRVPVEPSSMFWDEEAMFNMPSLLD醒EGML LTPPSMQERFSCE歸FNMELSL麗D
300 360 420 480 540 600 660 720 752
60 120 180 206
實(shí)施例3:表達(dá)載體的構(gòu)建
1. 根據(jù)分離出的冰凌花低溫脅迫轉(zhuǎn)錄因子力a6SF基因的核苷酸序列,設(shè)計(jì)構(gòu)建表達(dá)載 體的引物
正向引物5'- gCCggATCCATGGATTATTCGCAGTACGG—3' 反向引物5'-gCCgagCTCTGTCCTTGTGGAACGATTAA —3'
以基因組DNA為模板，進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。
2. SamH 1和&/1兩個(gè)限制性內(nèi)切酶將該基因從pMD 18-T載體上切下，與相同酶酶切的 PBI121連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5a細(xì)胞，然后在含氨芐青霉素的LB固體平板上培養(yǎng)，對
菌落進(jìn)行PCR鑒定和質(zhì)粒DNA的酶切分析。構(gòu)建高效表達(dá)載體。 3.將構(gòu)建好的表達(dá)載體通過凍融法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105。 實(shí)施例4:轉(zhuǎn)化煙草，進(jìn)行抗寒性分析
1. 種植煙草NC89
2. 挑取鑒定好的農(nóng)桿菌單克隆于含50毫克/升卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，28。C振蕩
培養(yǎng)。 '
3. 3000rpm離心5分鐘，農(nóng)桿菌沉淀用10XMS培養(yǎng)基懸浮。
4. 將煙草葉片切成小塊，放入上述懸浮液浸泡10分鐘。
5. 侵染后的葉片切塊置于分化培養(yǎng)基(lxMS鹽,3%蔗糖，pH5.8,4.5g/L卡拉膠,)上共 培養(yǎng)2天，然后轉(zhuǎn)入選擇培養(yǎng)基(lxMS鹽，3e/。蔗糖，pH5.8,2.4g/L瓊脂粉,卡那霉素100毫 克/升，頭孢青霉素250毫克/升)篩選，得到抗性植株。
6. 將抗性植株移入花盆，置于低溫脅迫下進(jìn)行抗寒性分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，轉(zhuǎn)力a6SF 基因的煙草抗寒能力明顯高于對照。
權(quán)利要求
1.一個(gè)冰凌花低溫脅迫轉(zhuǎn)錄因子AaCBF基因，其特征在于具有如下所示的核苷酸序列CGCACTTTTGTCTTCTCTTCTCACTTCACACTCTCACTTCAATTCAACGAATCACAGTTT 60CTGAAAATGGATTATTCGCAGTACGGTTATCCTTCTTCACCAATCTATTCTTCTTCATCA 120TCATCACAAGGAGACGACACAGCAAGTCAAGCATCTCACAAGAGAAAATCCGGACGAAAG 180AAGTTCACAGAGACGCGACACCCCATTTATAGAGGTGTTCGGCAGAGAAATGGCGCCAAA 240TGGGTGTCTGAAATTCGTGATCGTAGCAAGAAAAACTCCAGTATATGGCTAGGCACATTC 300CCAACGCCTGGAATGGCTGCTAGAGCCTACGATGTTGCAGCTTTGGCACTCAGAGGGAAG 360TCTGCGCCGCTGAATTTTGTTGATTCTGCTTGGCTGCTGCCACGCCCCAAGTCATCCTCA 420GCTCAGGATATCAAACTCGCTGCTTCTGAAGCTGCTCAAGCATTTGCACCTACTGCTACA 480TCATCTTCGTCGTCGTCTTCCCCAATGAACCTCAGAGTTCCTGTGGAACCTTCTTCTATG 540TTCTGGGATGAGGAGGCAATGTTCAATATGCCAAGTTTACTTGACAATATGGCAGAAGGG 600ATGCTCCTTACGCCGCCAAGCATGCAGGAAAGGTTTAGCTGCGAAGATGTGGATTTCAAC 660ATGGAGTTGTCCTTGTGGAACGATTAATGTCGTCGCATGGTGCTTTTGCCTTGTACAGAT 720TTTTGTATTCAAGATGGAATAATTGAAATATA 752
1 一個(gè)冰凌花低溫脅迫轉(zhuǎn)錄因子」aC5F基因，其特征在于具有如下所示的核苷酸序列:60 120 180 240 300 360 420 ■ 540 600 660 720 752TTCTGGGATGAGGAGGCAATGTTCAATATGCCAAGTTTACTTGACAATATGGCAGAAGGG ATGCTCCTTACGCCGCCAAGCATGCAGGAAAGGTTTAGCTGCGAAGATGTGGATTTCAACTTTTGTATTCAAGATGGMTAATTGAAATATA
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因，其特征在于該基因編碼如下所述氨基酸序列的蛋白質(zhì)MDYSQYGYPSSPIYSSSSSSQGDDTASQASHKRKSGRKKFTETRHPIYRGVRQRNGAKWV 60SEIRDRSK認(rèn)SSIWLGTFPTPG鋒ARAYDVAALALRGKSAPLNFVDSAWLLPRPKSSSAQ 120DIKLAASEAAQAFAPTATSSSSSSSPMNLRVPVEPSSMFWDEEAMFNMPSLLD腿EGML 180LTPPSMQERFSCEDVDFNMELSLWND 206
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因的應(yīng)用，其特征是在于該基因在植物中表達(dá)，'能有效地提 高植物的耐寒性。4根據(jù)權(quán)利要求3所述的基因的應(yīng)用，其特征是在于該基因在煙草中表達(dá)，能有效地提高 煙草的耐寒性。
全文摘要
本發(fā)明公開了冰凌花中分離低溫脅迫轉(zhuǎn)錄因子AaCBF基因序列及其克隆和應(yīng)用，屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域。根據(jù)其它植物中發(fā)表的CBF氨基酸序列，設(shè)計(jì)引物，分離得到中間片段后，利用反向PCR方法，從冰凌花中分離出低溫脅迫轉(zhuǎn)錄因子AaCBF基因全序列。將該基因構(gòu)建高效表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化煙草，轉(zhuǎn)基因植株具有較高的抗寒力。該基因可用于植物的遺傳轉(zhuǎn)化，提高植物的抗寒能力。
文檔編號C12N15/10GK101372692SQ200810050628
公開日2009年2月25日 申請日期2008年4月23日 優(yōu)先權(quán)日2008年4月23日
發(fā)明者劉洪章, 劉淑英, 周遠(yuǎn)航, 丹 姚, 玉 李, 李海燕, 源 江 申請人:吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)