專利名稱：一種與植物抗旱性相關(guān)的miRNA——gma-miR156b及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種與植物抗旱性相關(guān)的miRNA，尤其是一種來源于大豆的、能夠調(diào)節(jié)大豆抗旱性的miRNA ；本發(fā)明還涉及此miRNA的前體及用途。
背景技術(shù)：
大豆是非常重要的、具有特殊經(jīng)濟價值的作物。干旱、鹽堿等環(huán)境脅迫對大豆的生長發(fā)育具有重要影響，嚴重時會造成大豆大規(guī)模減產(chǎn)。解析大豆抵抗逆境的分子機制，應(yīng)用基因工程育種已經(jīng)成為增強作物耐逆性，培育耐逆性強的大豆品種是目前大豆種植業(yè)的主要目標之一。高等植物在應(yīng)答環(huán)境脅迫時啟動了多種應(yīng)答網(wǎng)絡(luò)，microRNA (miRNA)在其中也具有非常重要的作用(Leung and Sharp, 2007)。miRNA是近年來研究發(fā)現(xiàn)的一種長20 24 nt的內(nèi)源性非蛋白編碼RNA。miRNA 基因最初轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生具有頸環(huán)結(jié)構(gòu)的pre-miRNAs。隨后pre-miRNA被轉(zhuǎn)運出核，在細胞質(zhì)中被Dicer酶作用，加工成成熟的miRNA。通過序列互補與特定靶基因的mRNA結(jié)合，引起mRNA 降解或抑制mRNA翻譯從而對基因的表達起到負調(diào)節(jié)作用(Llave et al. , 2002; Palatnik et al. , 2003; Tang et al. , 2003)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種與植物抗旱性相關(guān)的miRNA及其前體序列， 利用此miRNA能夠提高大豆的抗旱性，對提高大豆產(chǎn)量具有重大的意義。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明所采取的技術(shù)方案如下。一種與植物抗旱性相關(guān)的miRNA，其具有序列表中SEQ ID NO=I所示的序列。上述與植物抗旱性相關(guān)的miRNA的前體序列，其具有序列表中SEQ ID NO 2所示的序列。上述與植物抗旱性相關(guān)的miRNA在培育抗旱轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。作為上述應(yīng)用的一種優(yōu)選技術(shù)方案，所述抗旱轉(zhuǎn)基因植物為大豆。作為上述應(yīng)用的一種優(yōu)選技術(shù)方案，在大豆中過表達SEQ ID NO :1所示的miRNA， 或抑制SEQ ID NO 1所示miRNA的表達，培育出具有高抗旱性的轉(zhuǎn)基因大豆。采用上述技術(shù)方案所產(chǎn)生的有益效果在于本發(fā)明miRNA的表達受到干旱脅迫的調(diào)節(jié)，說明其在大豆適應(yīng)干旱脅迫機制中起重要作用，基于此，可利用其培育具有高抗旱性的轉(zhuǎn)基因大豆，對提高大豆產(chǎn)量具有重大的意義。


圖1為gma-miR156b前體序列的莖環(huán)結(jié)構(gòu)圖，可見其前體序列折疊成一種穩(wěn)定的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，屬于miRNA前體典型的二級結(jié)構(gòu)，符合miRNA前體的結(jié)構(gòu)特征。圖2為實時定量PCR檢測的不同脅迫條件下gma-miR156b的表達特征。
圖3為利用大豆毛狀根系統(tǒng)分析gma-miR156b對干旱脅迫的響應(yīng)。
具體實施例方式以下實施例詳細說明了本發(fā)明。本發(fā)明所使用的各種原料及各項設(shè)備均為常規(guī)市售產(chǎn)品，均能夠通過市場購買直接獲得。以下實施例中的定量試驗，均設(shè)置三次重復(fù)實驗， 結(jié)果取平均值。實施例1、實時熒光定量PCR分析gma_miR156b的表達特性
一、脅迫處理
實驗所用大豆料品種為Wilimas82 (簡稱W82)。幼苗期脅迫材料按照以下流程進行 大豆種子用70%的灑精滅菌30 S，dH20沖洗6遍后播種于無菌培養(yǎng)皿中，皿底置2張無菌濾紙，dH20浸濕，28 °C暗萌發(fā)3天。芽長至2 cm時，低N水培，10，000 lux，溫度為26°C， 相對濕度為70%，培養(yǎng)15天，進行幼苗期脅迫處理，取材根、莖、葉。(1)對照的處理直接取正常環(huán)境培養(yǎng)的大豆材料各組織于-80°C凍存作為對照 (0小時)；
(2)干旱處理取在含有10%PEG8000的培養(yǎng)液中培養(yǎng)0. 5、3、12及24小時的大豆材料各組織，于液氮速凍，-80°C保存?zhèn)溆茫?br> (3)脫落酸處理幼苗期或成株期材料在含有100μ M脫落酸(ABA)的營養(yǎng)液中處理 0. 5、3、12及24小時后，取其各組織，于液氮速凍，-80°C保存?zhèn)溆茫?br> 二、miRNA的分離
取葉子，用microRNA提取試劑盒(百泰克公司)(Cat # RP5301)提取小片段RNA，提取方法如下
(1)勻漿處理
葉子用液氮內(nèi)研缽快速磨碎，每50 100 mg組織加1 ml裂解液后勻漿。(2)將勻漿樣品劇烈震蕩混勻，在15 30 °C條件下孵育5 min以使核蛋白體完全分解。(3)4 ！的條件下12，000 rpm離心10 min，小心取上清轉(zhuǎn)入一個新的RNase free的離心管中。當(dāng)樣品富含蛋白質(zhì)、脂肪、多糖時，可離心10 min，移除勻漿中不溶解的物質(zhì)，余下的沉淀中包含有細胞外膜、多糖、以及高分子量DNA，而上層的超浮游物含有RNA。(4)每1 ml裂解液加0. 2 ml氯仿。蓋緊樣品管蓋，劇烈振蕩15 s并將其在室溫下孵育3min。(5)樣品于4 V 12，000 rpm離心10 min，會分成三層下層有機相，中間層和上層無色的水相，RNA存在于水相中。水相層的容量大約為所加裂解液體積的60%，把水相轉(zhuǎn)移到新管中，進行下一步操作。(6)加入0. 6倍體積70%乙醇，顛倒混勻(此時可能會出現(xiàn)沉淀)。得到的溶液和可能沉淀一起轉(zhuǎn)入吸附柱RA中。(7)10，000 rpm離心45 s，收集下濾液(下濾液中含有microRNA)，準確估計下濾液的體積，加入2/3倍體積的無水乙醇，顛倒幾次混勻，將混合液倒入到吸附柱RB中，10， 000 rpm離心30 s棄掉廢液。
(8)加入700 μ 1漂洗液RW，12，000 rpm離心60 s,棄掉廢液。(9)加入500 μ 1漂洗液RW，12，000 rpm離心60 s，棄掉廢液。(10)將吸附柱RB放回空收集管中，12，000 rpm離心2 min，盡量除去漂洗液，以
免漂洗液中殘留乙醇抑制下游反應(yīng)。(11)取出吸附柱RB，放入一個RNase free離心管中，根據(jù)預(yù)期RNA產(chǎn)量在吸附膜中間部位加60-80 μ 1 RNase free water(事先在65-70 °C水浴中加熱)，室溫放置2 min, 然后12，000 rpm離心1 min。收集得到純凈microRNA保存于-80 °C冰箱。三、反轉(zhuǎn)錄為cDNA
用天根miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒將純化的miRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。1.小 RNA 的 Poly (A)加尾
反應(yīng)液配方如下小 RNA，6 μ 1 ；E-PAP (5U/μ 1)，0. 4 μ 1 ； 10 X PAP Buffer, 2 μ 1 ； 5 XrATP solution, 4 μ 1 ；Nuclease-free Water, 7.6 μ 1 ；總體積，20 μ 1 ；輕輕混勻上述配制的反應(yīng)液，短暫離心后，37 °C反應(yīng)60 min。所得反應(yīng)液可以直接進行下游實驗，也可以放置-20 ！短暫保存，如需長期保存建議存放于-80 °C。2. Poly(A)修飾的miRNA進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)
反應(yīng)液配方如下Poly (A)反應(yīng)液，2μ 1 ;10XRT primer, 2 μ 1 ； 10 X RT Buffer ，2 μ 1 ；dNTP Mixture (2. 5 mM), 1 μ 1 ；Rnasin (40U/μ 1), 1 μ 1 ；Quant RTase ， 0. 5μ 1 ；RNase-free ddH20，1. 5μ 1 ；總體積，20 μ 1 ；輕輕混勻上述配制的反應(yīng)液，短暫離心后，37 °C反應(yīng)60 min。合成的cDNA反應(yīng)液放置-20 ！保存，也可以直接進行下游熒光定量檢測。四、實時熒光定量PCR
按如下反應(yīng)體系，混好體系，然后分裝入96孔光學(xué)板中，并覆蓋上光學(xué)膜。擴增使用的儀器為ABI公司的熒光定量PCR儀。擴增程序為95"C 30s ；95 "C 5 s，60 "C 34s,45 cycles ；95 "C 15 s，60 "C lmin, 95 °C 15 s;
20 μ 1 反應(yīng)體系配制如下DNA 模板，2 μ 1 ；SYBR Primix Ex taq (2X), 10 μ 1 ；PCR Forward PrimerClOy Μ),0. 4μ 1 ；PCR Reverse PrimerClOy Μ),0. 4μ 1 ；ROX Reference Dye II (50X), 0. 4 μ 1 ； ddH20，6·8μ1;總體積，20 μ 1 ；
引物序列為正向引物TGACAGAAGAGAGAGAGCACAA (SEQ ID NO 4) ；5. 8S rRNA-F ACGCCTGCCTGGGTGTCACAC (SEQ ID NO 5) ；AMRM :GCGAGCACAGAATTAATACGACT (SEQ ID NO: 6) ；(5. 8S rRNA為內(nèi)參，AMRM為反向引物)；
結(jié)果如圖2所示，其中A和B分別是gma-miR156b在PEG處理的大豆根和葉中的表達情況。從圖中可以看出，gma-miR156b的表達在根及葉中都受到了 PEG模擬的干旱脅迫的顯著誘導(dǎo)。結(jié)果表明，gma-miR156b參與調(diào)控大豆對干旱脅迫的響應(yīng)。這樣，在大豆中過表達gma-miR156b，或抑制gma-miR156b的表達，將影響大豆對干旱脅迫的適應(yīng)能力，培育出具有高抗旱性的轉(zhuǎn)基因大豆，對提高大豆的產(chǎn)量具有重大的意義。實施例2、利用大豆毛狀根轉(zhuǎn)化系統(tǒng)對gma-miR156b在逆境下的表達進行分析一、pCAMBIA3301-/^遍-GUS 載體構(gòu)建
所述pCAMBIA330I-Aha-GUS為將gma-miR156b前體的編碼基因的啟動子區(qū)域插在
5PCAMBIA3301的多克隆位點得到的重組質(zhì)粒，優(yōu)選為將序列表3 (啟動子序列)的序列3’自 5'端第1至1076位核苷酸所示的DNA片段插入pcambia3301的BamHI和NcoI酶切識別位點之間得到的重組質(zhì)粒。二、材料準備
以W82品種為材料，將材料用氯氣消毒10小時后，在B5培養(yǎng)基上萌發(fā)4天進行毛狀根轉(zhuǎn)化，外植體轉(zhuǎn)至共培培養(yǎng)基上生長2天后，再轉(zhuǎn)至MS/2培養(yǎng)基上培養(yǎng)，15天后，毛狀根長出，選擇發(fā)育階段接近的長度約1-2厘米的毛狀根分別轉(zhuǎn)至脅迫處理。三、脅迫處理
(1)對照將選取的毛狀根轉(zhuǎn)至浸泡了 MSA液體培養(yǎng)基的濾紙上，分別處理0、0. 5、3、 12及24小時后，取樣進行GUS染色，染色時間限定為3小時。(2)干旱處理將選取的毛狀根轉(zhuǎn)至浸泡了 MS/2添加10% PEG8000液體培養(yǎng)基的濾紙上，分別處理0、0. 5、3、12及24小時后，取樣進行⑶S染色，染色時間限定為3小時。(3)脫落酸處理將選取的毛狀根轉(zhuǎn)至浸泡了 MS/2添加100 μ M的脫落酸(ΑΒΑ) 液體培養(yǎng)基的濾紙上，分別處理0、0. 5、3、12及24小時后，取樣進行GUS染色，染色時間限定為3小時。四、⑶S組織化學(xué)分析
(1)⑶S染液的配制
首先配制GUS反應(yīng)緩沖液Tris Buffer，其中包括100 mM Tris和50 mM NaCl 以濃鹽酸調(diào)PH至7. 4。然后以Tris buffer配制0.5 mM K3 [Fe (CN)6]溶液。按1 mg/ml 的濃度稱取x-glu (5-溴-4-氯-3-吲哚葡萄糖醛酸苷)，按照每mg加入10 μ 1 DMSO (二甲基亞砜)的比例溶解x-glu，加入Tris buffer配制的0.5 mM K3 [Fe (CN)6]溶液定容，可加入幾滴TritonX-IOO以增強染色效果。迅速分裝后于_20°C避光保存。(2)⑶S染色步驟
將待測定的毛狀根取植物樣品放入GUS反應(yīng)緩沖液中，浸沒，37°C暗中保溫。每隔半小時在解剖鏡下觀察顯色效果。染色3小時后，吸出⑶S反應(yīng)緩沖液，加入70%乙醇終止反應(yīng)并在37°C脫色，每隔數(shù)小時更換一次。 結(jié)果如圖3所示，其中A是轉(zhuǎn)化gma-miR156b啟動子攜帶⑶S報告基因的毛狀根在 PEG及ABA處理中的GUS積累表型，B是對出現(xiàn)GUS積累的毛狀根數(shù)目的統(tǒng)計數(shù)據(jù)。從圖中可以看出，gma-miR156b的表達受到了 PEG8000模擬的干旱脅迫的顯著誘導(dǎo)。干旱脅迫可以誘導(dǎo)脫落酸ABA的產(chǎn)生，圖3A和3B的結(jié)果也顯示，gma-miR156b的表達也明顯受到了 ABA 的誘導(dǎo)。該結(jié)果表明，干旱脅迫顯著誘導(dǎo)gma-MIR156b的表達，從而說明gma-MIR156b參與調(diào)節(jié)大豆對干旱脅迫的反應(yīng)。這樣，在大豆中過表達gma-miR156b，或抑制gma-miR156b的表達，將影響大豆對干旱脅迫的適應(yīng)能力，培育出具有高抗旱性的轉(zhuǎn)基因大豆，對提高大豆的產(chǎn)量具有重大的意義。 上述描述僅作為本發(fā)明可實施的技術(shù)方案提出，不作為對其技術(shù)方案本身的單一限制條件。
權(quán)利要求
1.一種與植物抗旱性相關(guān)的miRNA，其特征在于其具有序列表中SEQ ID N0:1所示的序列。
2.權(quán)利要求1所述的與植物抗旱性相關(guān)的miRNA的前體序列，其特征在于其具有序列表中SEQ ID NO 2所示的序列。
3.權(quán)利要求1所述的與植物抗旱性相關(guān)的miRNA在培育抗旱轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的與植物抗旱性相關(guān)的miRNA的用途，其特征在于所述抗旱轉(zhuǎn)基因植物為大豆。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的與植物抗旱性相關(guān)的miRNA的用途，其特征在于在大豆中過表達SEQ ID NO :1所示的miRNA，或抑制SEQ ID NO 1所示miRNA的表達，培育出具有高抗旱性的轉(zhuǎn)基因大豆。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種與植物抗旱性相關(guān)的miRNA，其具有序列表中SEQ ID NO1所示的序列；在大豆中過表達SEQ ID NO1所示的miRNA，或抑制SEQ ID NO1所示miRNA的表達，以培育出具有高抗旱性的轉(zhuǎn)基因大豆，對提高大豆產(chǎn)量具有重大的意義。
文檔編號A01H5/00GK102220330SQ20111015491
公開日2011年10月19日 申請日期2011年6月10日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月10日
發(fā)明者李東曉, 李霞, 王幼寧, 石磊, 陳亮 申請人:中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所