專利名稱：一株抗病毒解淀粉芽孢桿菌的分離及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一株抗病毒解淀粉芽孢桿菌的分離及其應(yīng)用，屬微生物農(nóng)藥技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種有效預(yù)防煙草病毒病，促進(jìn)煙草生長(zhǎng)并且能夠顯著增加煙葉產(chǎn)量的解淀粉芽孢桿菌。
背景技術(shù)：
病毒病是我國(guó)煙草上種類(lèi)最多、危害最嚴(yán)重的一類(lèi)病害，每年都給煙草生產(chǎn)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。目前生產(chǎn)上沒(méi)有同時(shí)抗幾種病毒的煙草品種，也沒(méi)有對(duì)病毒病特效的藥劑，而大量施用農(nóng)藥既影響了煙葉質(zhì)量，又污染了環(huán)境。如何有效預(yù)防煙草病毒病的發(fā)生是國(guó)內(nèi)外科技工作者研究的熱點(diǎn)問(wèn)題。植物根際促生菌(PlantGrowth-Promoting Rhizobacteria，簡(jiǎn)稱PGPR)是一類(lèi)生存于植物根際、能促進(jìn)植物生長(zhǎng)的一類(lèi)有益細(xì)菌。目前，關(guān)于PGI^R菌株誘導(dǎo)植物產(chǎn)生對(duì)真菌、細(xì)菌等抗性的研究較多，而應(yīng)用PGPR防治植物病毒病的報(bào)道較少。Mann(1969)把Bacillus uniflagellatus施入土壤中，結(jié)果減少了煙草花葉病毒在珊西煙葉片上產(chǎn)生枯斑的數(shù)目。Maurhofer等(1994)用Pseudomonas fluorescens菌株CHAO處理煙草能夠減少煙草壞死病毒引起病斑的數(shù)目和大小。De Meyer等(1999)用銅綠假單胞7NSK2處理煙草植株能夠降低煙草花葉病毒侵染產(chǎn)生的枯斑大小。菌株SE34、 IN937a、IN937b和INl 14處理番茄幼苗能明顯地降低番茄發(fā)病率和組織中黃瓜花葉病毒的含量，提高產(chǎn)量和株高(Zehnder，2000)。我們從毛豆根際分離到了解淀粉芽孢桿菌菌株YHN，該菌株能夠促進(jìn)煙草生長(zhǎng)，有效降低煙草病毒病的發(fā)生，并能顯著提高煙葉產(chǎn)量。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一株抗病毒解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens) YHN 及其應(yīng)用。本發(fā)明所提供的解淀粉芽孢桿菌YHN，保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏單位簡(jiǎn)稱CGMCC，保藏編號(hào)為CGMCC N0. 4442，分類(lèi)命名為解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)。保藏單位地址北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3 號(hào)，郵政編碼100101。保藏日期2010年12月8日。該菌株從菏澤毛豆根際土壤中分離，通過(guò)稀釋培養(yǎng)獲得30多個(gè)細(xì)菌菌落。以白地霉作為指示菌，篩選有抑菌活性的菌株。抑菌活性最強(qiáng)的一個(gè)命名為解淀粉芽孢桿菌YHN。 劃線純化后，經(jīng)對(duì)峙培養(yǎng)證明解淀粉芽孢桿菌YHN對(duì)多種病原菌有良好的抑制作用，抑制率在；34%-67%。解淀粉芽孢桿菌 YHN 與 Bacillus amyloliquefaciens strain 5359 (序列號(hào)⑶250449) 16S rRNA基因一致率為99%，在根據(jù)16S rRNA基因構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)中， 解淀粉芽孢桿菌YHN與Bacillus amyloliquefaciens的菌株聚類(lèi)到一起，證實(shí)解淀粉芽孢桿菌YHN是解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amylol iquefaciens)的一個(gè)菌株。其16S rRNA核苷酸序列如SEQ. NO. 1所示。該菌株特點(diǎn)如下該菌株菌落圓形，灰白色，無(wú)光澤，初期邊緣整齊，不透明，較粘，菌落初期扁平后期凹陷皺縮。革蘭染色為陽(yáng)性桿菌，周生多鞭毛。該菌好氧，分解D-葡萄糖、D-木糖、甘露醇和果糖。苯丙氨酸脫氫酶反應(yīng)為陰性。水解酪素，水解明膠，水解淀粉，還原硝酸鹽，不能產(chǎn)生&S，甲基紅試驗(yàn)陰性，V. P.試驗(yàn)陽(yáng)性，吲哚試驗(yàn)陰性；4°C不能生長(zhǎng)，最適生長(zhǎng)溫度 28-300C ；適宜pH為7，pH為5. 7不能夠生長(zhǎng)。YHN的菌落特征和生理生化特性與解淀粉芽孢桿菌一致。該菌株應(yīng)用在煙草中，對(duì)多種真菌具有抑制作用，尤其是能夠有效降低煙草病毒病的發(fā)生，并能顯著提高煙葉產(chǎn)量。


圖IYHN對(duì)8種病原真菌的拮抗作用圖中AAlternariaalternata B ^0 ^ ' Fusarium oxysporumC 5 ^ ^ Exserohilum turcicum DVerticillium albo-a trumE 蘋(píng)果霉心病菌 Trichothecium roseum F 煙草炭疽病菌 Colletotrichum nicotianaeG蘋(píng)果腐爛病菌Cytospora mali H煙草立牛古病菌Rhizoctonia solani圖1說(shuō)明本發(fā)明中的YHN對(duì)8種病原真菌(其中包括5種引起煙草病害)有良好的抑制作用，抑菌譜廣。圖2菌株YHN 16S rRNA基因的擴(kuò)增圖中 1 :YHN ；2 對(duì)照菌株 YHL ；M =Marker 圖3用NJ法根據(jù)YHN和其它13個(gè)菌株的16S rRNA基因構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)在根據(jù)16S rRNA基因構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)中，YHN與解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)的菌株聚類(lèi)到一起，說(shuō)明YHN是解淀粉芽孢桿菌的一個(gè)菌株。圖4YHN處理對(duì)煙草花葉病毒的抑制作用圖4顯示YHN對(duì)煙草花葉病毒的抑制效果。上排為YHN處理的葉片，下排是未處理的葉片。YHN處理可使煙草花葉病毒引起的枯斑減少34. 8%。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，按照方中達(dá)《植病研究方法》和Sambrook等著《分子克隆》中所述的方法和條件。實(shí)施例1、解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens) YHN的獲得該菌株(YHN)分離自菏澤毛豆根際土壤。從毛豆根際取土樣10g，加入到盛有 IOOmL無(wú)菌水的三角瓶中，制成土壤懸液。將三角瓶置搖床上，振蕩20分鐘，靜置5分鐘后取上清液。采用10倍系列稀釋法，每個(gè)濃度吸取200 μ L于肉湯蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基(牛肉膏3g，蛋白胨10g, NaCl 5g，瓊脂20g,蒸餾水補(bǔ)充至IOOOmL, pH 7. 2-7. 4)平板上涂布均勻， 每個(gè)濃度三次重復(fù)。然后將肉湯蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基平板于生化培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)M 小時(shí)。待出現(xiàn)菌落時(shí)，噴施指示菌白地霉(Geotrichum candidum)孢子懸液，以噴布均勻?yàn)橐恕?2小時(shí)后觀察，挑取產(chǎn)生抑菌圈的菌落，抑菌效果最好的一個(gè)代號(hào)定為YHN。通過(guò)三次劃線進(jìn)行純化，利用對(duì)峙純培養(yǎng)法測(cè)定抑菌譜(圖1)。YHN菌落圓形，灰白色，無(wú)光澤，初期邊緣整齊，不透明，較粘，菌落初期扁平后期凹陷皺縮。革蘭染色為陽(yáng)性桿菌，周生多鞭毛。該菌好氧，分解D-葡萄糖、D-木糖、甘露醇和果糖。苯丙氨酸脫氫酶反應(yīng)為陰性。水解酪素，水解明膠，水解淀粉，還原硝酸鹽，不能產(chǎn)生 H2S，甲基紅試驗(yàn)陰性，V.P.試驗(yàn)陽(yáng)性，吲哚試驗(yàn)陰性；4°C不能生長(zhǎng)，最適生長(zhǎng)溫度
適宜PH為7，pH為5. 7不能夠生長(zhǎng)。YHN的菌落特征和生理生化特性與解淀粉芽孢桿菌一致。提取YHN 基因組 DNA。利用引物 16S_8_F(5' -CAC GGA TCC AGA GTT TGA TYM TGG CTC AG-3')和 ITS-R(5 ‘ -CCG GGT TTC CCC ATT CGG-3 ‘)，通過(guò) PCR 擴(kuò)增 16S rDNA(圖 2)。PCR 反應(yīng)程序是 94°C 3min ；94°C 30s ；54°C 45s ；72°C 2min ；30 個(gè)循環(huán)；72°C 延伸IOmin ;4°C保存。擴(kuò)增產(chǎn)物連接到pMD18_T。連接反應(yīng)體系為10XT4DNA連接酶緩沖液 1 μ L，pMD18-T (50ng/ μ L) 0· 3 μ L，目的 DNA7. 7 μ L, T4DNA 連接酶(350U/ μ L) 1 μ L, 16°C 水浴中連接過(guò)夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5ci。提取質(zhì)粒DNA，通過(guò)電泳和PCR篩選陽(yáng)性克隆。鑒定好的含有重組質(zhì)粒的菌株，以菌液形式送北京博尚公司測(cè)序。利用Mega軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)(圖3)。YHN 與解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)菌株 5359(序列號(hào) ⑶250449) 16S rRNA基因的一致率為99 %，在根據(jù)16S rRNA基因構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)中，YHN與解淀粉芽孢桿菌的菌株聚類(lèi)到一起，證實(shí)YHN是解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)的一個(gè)菌株。SEQID NO 1的信息
(a)序列特征:*長(zhǎng)度1861堿基對(duì)；*類(lèi)型=DNA ；*鏈型雙鏈；*拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性
(b)分子類(lèi)型基因組DNA
(C)假設(shè)否
(d)反義否
(e)最初來(lái)源解淀粉芽孢桿菌YHN是從菏澤采集的毛豆根際土壤中分離的。
(f)序列描述
1TTGCATGCCTGCAGGTCGACGATTCCGGGTTTCCCCATTCGGAAATCTCCGGATCAAAGC
61TTGCTTACAGCTCCCCGAAGCATATCGGTGTTCGTCCCGTCCTTCATCGGCTCCTAGTGC
121CAAGGCATCCACCGTGCGCCCTTTCTAACTTAACCGTTAAAAAGAATCACTACGTGATAT
181CTTGCATTACTAATTGAATGTGAATTACTTCTGTTATCTAGTTTTCAAAGAACAACATCT
241CGAAGAATCAAATGATCCTTCAAAACTAAACAAGACAGGGAACGTTCTGTTTATAAGACC
301CAAGGTCTTATATTCCGTTAAAATCCTTAGAAAGGAGGTGATCCAGCCGCACCTTCCGAT
361ACGGCTACCTTGTTACGACTTCACCCCAATCATCTGTCCCACCTTCGGCGGCTGGCTCCT
421AAAAGGTTACCTCACCGACTTCGGGTGTTACAAACTCTCGTGGTGTGACGGGCGGTGTGT
481ACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGGCATGCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCAGC
541TTCACGCAGTCGAGTTGCAGACTGCGATCCGAACTGAGAACAGATTTGTGGGATTGGCTT601AACCTCGCGGTTTCGCTGCCCTTTGTTCTGTCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGTCA661TAAGGGGCATGATGATTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCAC721CTTAGAGTGCCCAACTGAATGCTGGCAACTAAGATCAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACT781TAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAACCATGCACCACCTGTCACTCTGCCCC841CGAAGGGGACGTCCTATCTCTAGGATTGTCAGAGGATGTCAAGACCTGGTAAGGTTCTTC901GCGTTGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTT961GAGTTTCAGTCTTGCGACCGTACTCCCCAGGCGGAGTGCTTAATGCGTTAGCTGCAGCAC1021TAAGGGGCGGAAACCCCCTAACACTTAGCACTCATCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGT1081ATCTAATCCTGTTCGCTCCCCACGCTTTCGCTCCTCAGCGTCAGTTACAGACCAGAGAGT1141CGCCTTCGCCACTGGTGTTCCTCCACATCTCTACGCATTTCACCGCTACACGTGGAATTC1201CACTCTCCTCTTCTGCACTCAAGTTCCCCAGTTTCCAATGACCCTCCCCGGTTGAGCCGG1261GGGCTTTCACATCAGACTTAAGAAACCGCCTGCGAGCCCTTTACGCCCAATAATTCCGGA1321CAACGCTTGCCACCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGTGGCTTTCTG1381GTTAGGTACCGTCAAGGTGCCGCCCTATTTGAACGGCACTTGTTCTTCCCTAACAACAGA1441GCTTTACGATCCGAAAACCTTCATCACTCACGCGGCGTTGCTCCGTCAGACTTTCGTCCA1501TTGCGGAAGATTCCCTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAGT1561GTGGCCGATCACCCTCTCAGGTCGGCTACGCATCGTTGCCTTGGTGAGCCGTTACCTCAC1621CAACTAGCTAATGCGCCGCGGGTCCATCTGTAAGTGGTAGCCGAAGCCACCTTTTATGTC1681TGAACCATGCGGTTCAAACAAGCATCCGGTATTAGCCCCGGTTTCCCGGAGTTATCCCAG1741TCTTACAGGCAGGTTACCCACGTGTTACTCACCCGTCCGCCGCTAACATCAAGGAGCAAG1801CTCCCATCTGTCCGCTCGACTTGCATGTATTAGGCACGCCGCCAGCGTTCGTCCTGAGCC1861ATAATCAACTCTGGATCCGTGAATCTCTAGAGGATCCCCGGGTACCGAGCTCGAA實(shí)施例2 =YHN抑菌譜的測(cè)定采用對(duì)峙培養(yǎng)法(Sijam等，2005)對(duì)表1中所列8個(gè)病原菌進(jìn)行抑菌效果測(cè)定。 在直徑為90mm的馬鈴薯葡萄糖瓊脂平板中央分別接直徑為9mm的上述病原菌菌餅，然后用封口膜封好平板，放入生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)兩天。將直徑為6mm的滅菌濾紙片蘸取準(zhǔn)備好的解淀粉芽孢桿菌YHN菌液(107cfU/mL)，移到距離病原菌邊緣15mm處，封口，最后放入
生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(圖1)。表1中每個(gè)病原菌按照上述步驟處理重復(fù)3次(重復(fù))。 7天后測(cè)量抑菌圈直徑，計(jì)算抑制率(表1)。表IYHN對(duì)病原菌的抑制率病原菌名稱抑制率
煙草枯萎病菌(,iAsari· oxysporum)44%
煙草赤星病菌 Ulternaria alternata)36%
煙草黃萎病菌(Verticillium albo-atrum)37%煙草立枯病菌{Rhizoctonia sol an i)65% ')0^^ ^ (Colletotrichum nicotianae)51% 蘋(píng)果腐爛病菌(Oio5pora /Hdi)34% 蘋(píng)果霉心病菌roseum)62% 玉米大斑病菌(Exserohilum turcicum)67%實(shí)施例3 =YHN對(duì)煙草花葉病毒的室內(nèi)抑制作用將YHN在肉湯蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基平板上劃線，平板放入生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 12h。用牙簽挑單菌落放入盛有5mL液體LB培養(yǎng)基(胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，加水定容1L，高壓滅菌)的試管中，28°C振蕩培養(yǎng)14-1他。以1 100的接種量，將上述培養(yǎng)液接種于盛有IOOmL的三角瓶中，28°C振蕩培養(yǎng) 14-1他。將菌液離心得到菌體，用適量無(wú)菌水沖洗，重懸，再次離心，重復(fù)沖洗兩次；得到不含LB培養(yǎng)基的菌體，最后用無(wú)菌水將菌體調(diào)至終濃度為107cfu/mL。選取5-6葉期長(zhǎng)勢(shì)一致的三生煙(普通煙的一個(gè)品種)苗(Nicotiana tabacum cv. samsun)，每隔5天噴施菌懸液一次，共噴施3次，以清水處理作為對(duì)照。3次重復(fù)，每個(gè)重復(fù)10株三生煙苗。采用常規(guī)汁液摩擦接種法，在菌劑噴霧處理過(guò)的三生煙葉片上摩擦接種煙草花葉病毒，每株接第3、4、5個(gè)葉片。置于25°C光照培養(yǎng)箱中，3天后調(diào)查結(jié)果，記錄枯斑數(shù)。YHN處理的葉片平均枯斑數(shù)為19. 4士2. 0，與對(duì)照8士4. 5)相比，處理的枯斑減少34. 8% (圖4)。YHN對(duì)其它病毒在普通煙草(Nicotiana tabacum)其它品種上的發(fā)生也有抑制作用，能夠降低發(fā)病率和發(fā)生程度。見(jiàn)實(shí)施例4。實(shí)施例4 :YHN用于大田防治煙草病毒病將實(shí)施例3中振蕩培養(yǎng)14-1 的YHN菌液按1 %接種量接種到含LB培養(yǎng)基中，28°C ISOrpm搖床培養(yǎng)14-16小時(shí)，將培養(yǎng)好的菌液離心，棄上清，加少量水重懸。然后加清水調(diào)至終濃度約為107cfu/mL。在苗床期G月初)將菌液均勻噴施到煙草(品種為中煙 100) (Nicotiana tabacum cv Zhongyan 100)葉片上，間隔 10-15 天，共噴施兩次。7 月底調(diào)查病害發(fā)生情況。病害分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)按煙草行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)YC/T39-1996規(guī)定執(zhí)行與對(duì)照相比，處理的植株粗壯，明顯高于對(duì)照，每株葉片數(shù)達(dá)到20-22片，普遍高于對(duì)照的17-20片。處理的病情指數(shù)為18. 17，對(duì)照病情指數(shù)為48. 25，防效為62. 34%。與對(duì)照相比，處理田可增產(chǎn)煙葉10-20%。該菌株應(yīng)用在煙草中，對(duì)多種真菌具有抑制作用，尤其是能夠有效降低煙草病毒病的發(fā)生，并能顯著提高煙葉產(chǎn)量。
權(quán)利要求
1.一株解淀粉芽孢桿菌，其特征在于命名為解淀粉芽孢桿菌YHN，保藏單位中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏單位簡(jiǎn)稱=CGMCC ；保藏號(hào)CGMCC NO. 4442 ； 其16S rRNA核苷酸序列如SEQ. NO. 1所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一株解淀粉芽孢桿菌YHN，其特征在于該菌株分離自菏澤毛豆根際土壤，該菌株菌落圓形，灰白色，無(wú)光澤，初期邊緣整齊，不透明，較粘，菌落初期扁平后期凹陷皺縮；革蘭染色為陽(yáng)性桿菌，周生多鞭毛；該菌好氧，分解D-葡萄糖、D-木糖、甘露醇和果糖；苯丙氨酸脫氫酶反應(yīng)為陰性；水解酪素，水解明膠，水解淀粉，還原硝酸鹽，不能產(chǎn)生H2S，甲基紅試驗(yàn)陰性，V. P.試驗(yàn)陽(yáng)性，吲哚試驗(yàn)陰性；4°C不能生長(zhǎng)，最適生長(zhǎng)溫度 28-300C ；適宜pH為7，pH為5. 7不能夠生長(zhǎng)。
3.解淀粉芽孢桿菌YHN在煙草中抗病毒的應(yīng)用，并可提高煙葉產(chǎn)量。
全文摘要
本發(fā)明涉及一株抗病毒解淀粉芽孢桿菌的分離及其應(yīng)用，屬微生物農(nóng)藥技術(shù)領(lǐng)域。該菌株為解淀粉芽孢桿菌YHN，分離自菏澤毛豆根際土壤，其保藏編號(hào)CGMCC NO.4442；該菌在煙草中應(yīng)用，不但對(duì)煙草有促生作用，而且對(duì)煙草病毒病有抑制作用，還能顯著提高煙葉產(chǎn)量。
文檔編號(hào)A01P3/00GK102154164SQ20101062453
公開(kāi)日2011年8月17日 申請(qǐng)日期2010年12月31日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月31日
發(fā)明者李向東, 王曉強(qiáng), 袁從陽(yáng) 申請(qǐng)人:山東農(nóng)業(yè)大學(xué)