專利名稱：一種海島棉dreb轉(zhuǎn)錄因子基因及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物基因工程領(lǐng)域，尤其涉及一種海島棉D(zhuǎn)REB轉(zhuǎn)錄因子基因以及其 構(gòu)建的植物表達載體及其在耐旱轉(zhuǎn)基因植物研制方面的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
轉(zhuǎn)錄因子(transcription factor, TF)又稱為反式作用因子，是指可以與真核生 物基因啟動子區(qū)域中的順式作用元件發(fā)生特異性結(jié)合的蛋白，通過他們之間以及與其它相 關(guān)蛋白之間的相互作用激活或抑制某些基因的轉(zhuǎn)錄。根據(jù)結(jié)合方式的不同可以把轉(zhuǎn)錄因子 分為兩類一類是普遍性轉(zhuǎn)錄因子，另一類是特異性轉(zhuǎn)錄因子，普遍性轉(zhuǎn)錄因子能夠和啟動 子的核心序列TATA框結(jié)合，可以激活所有基因的轉(zhuǎn)錄，而特異性轉(zhuǎn)錄因子與DNA序列上的 其它調(diào)節(jié)元件結(jié)合，只能激活特定的基因。自從1987年P(guān)az-Ares首次報道了玉米轉(zhuǎn)錄因子 基因后，迄今從高等植物中分離出的調(diào)控干旱、低溫、高鹽、激素、生長發(fā)育及病原反應(yīng)等相 關(guān)基因表達的轉(zhuǎn)錄因子已達數(shù)百種。研究發(fā)現(xiàn)在擬南芥中編碼轉(zhuǎn)錄因子的基因至少有1533 個，約占其基因總數(shù)的5. 9%，而且這些轉(zhuǎn)錄因子在調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育以及對外界環(huán)境的響 應(yīng)方面起著重要作用。DREB (dehydration responsive element binding protein)轉(zhuǎn)錄因子是存在于植 物中，與DRE(dehydration responsive element)順式作用元件相結(jié)合，調(diào)控對干旱、高鹽、 低溫等逆境應(yīng)答相關(guān)基因表達的蛋白質(zhì)。DREB類轉(zhuǎn)錄因子的發(fā)現(xiàn)是近年來植物抗逆性研究方面最具突破性的進展之一。它 在植物應(yīng)答干旱、高鹽及低溫脅迫信號的過程中起重要的調(diào)控作用。自從1997年，Thotnashow研究小組和1998年劉強等率先從擬南芥中分離克隆出 CBFl (DREBlB) ,CBF2, (DREBlC)和 CBF3 (DREBlA) 3 個 CBF/DREB1 類轉(zhuǎn)錄因子以來，植物中的 這類轉(zhuǎn)錄因子的研究受到了廣泛的關(guān)注。大多數(shù)轉(zhuǎn)錄因子基因的表達受到外界刺激和生長 發(fā)育進程的誘導(dǎo)，DREB基因介導(dǎo)復(fù)雜的脅迫信號傳遞網(wǎng)絡(luò)，參與多種不同的信號傳遞。大 部分DREB基因的表達都受干旱、高鹽、低溫等逆境脅迫的誘導(dǎo)，但是不同種類的DREB轉(zhuǎn)錄 因子可能有不同的表達機制，即使是同一種類的，也可能有不同的表達機制，在植物對逆境 脅迫與激素應(yīng)答反應(yīng)中發(fā)揮不同的調(diào)控作用。目前尚未見關(guān)于海島棉D(zhuǎn)REB轉(zhuǎn)錄因子基因 的相關(guān)報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種海島棉D(zhuǎn)REB轉(zhuǎn)錄因子基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO 1所示。本發(fā)明的第二個目的在于提供一種海島棉D(zhuǎn)REB轉(zhuǎn)錄因子，由SEQ ID N0:1所示核 苷酸序列編碼，其氨基酸序列如SEQ ID N0:2所示。本發(fā)明的第三個目的在于提供含有所述海島棉D(zhuǎn)REB轉(zhuǎn)錄因子基因的植物表達載 體。
3
本發(fā)明的第四個目的在于提供用所述植物表達載體轉(zhuǎn)化的植物細胞、組織或植株。本發(fā)明的第五個目的在于所述海島棉D(zhuǎn)REB轉(zhuǎn)錄因子基因在培育抗逆植物，尤其 是耐旱植物品種中的應(yīng)用。本發(fā)明的技術(shù)路線為1)取海島棉新海16葉片；2)從葉片提取基因組DNA和總RNA ；3)用總RNA進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，得到cDNA，以cDNA為模板PCR擴增DREB轉(zhuǎn)錄因子 基因，命名為XHDREB ；4)構(gòu)建pC-XHDREB植物表達載體，用根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化煙草，獲得轉(zhuǎn)XHDREB基因煙 草，采用干旱模擬實驗驗證轉(zhuǎn)XHDREB基因煙草，因XHDREB的過表達而具有耐旱、耐鹽、抗冷 能力。本發(fā)明克隆了一種海島棉D(zhuǎn)REB轉(zhuǎn)錄因子基因XHDREB，構(gòu)建pC_XHDREB植物表達載 體，用根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化煙草，獲得轉(zhuǎn)XHDREB基因煙草，采用干旱模擬實驗驗證轉(zhuǎn)XHDREB基 因煙草，因XHDREB的過表達而具有耐旱、耐鹽、抗冷能力。


圖1海島棉D(zhuǎn)REB基因PCR擴增電泳圖，泳道cDNA的擴增產(chǎn)物、泳道2 =DNA的擴 增產(chǎn)物、泳道M =DNA標準分子量DL2000 ；圖2重組質(zhì)粒pC-XHDREB構(gòu)建流程3轉(zhuǎn)基因煙草的PCR檢測電泳圖，泳道1 陽性對照、泳道2-9 轉(zhuǎn)基因植株、泳道 10 陰性對照、泳道M =DNA標準分子量DL2000 ；圖4A-4D轉(zhuǎn)基因煙草的耐旱性分析結(jié)果圖，圖4A 干旱處理3d的轉(zhuǎn)XHDREB基因 煙草、圖4B 干旱處理3d的非轉(zhuǎn)基因煙草、圖4C 復(fù)水恢復(fù)生長3d的轉(zhuǎn)XHDREB基因煙草、 圖4D 復(fù)水恢復(fù)生長3d的非轉(zhuǎn)基因煙草；圖5A-5D轉(zhuǎn)基因煙草的耐鹽性分析結(jié)果圖，圖5A :200mmol/L NaCl連續(xù)處理3d的 轉(zhuǎn)XHDREB基因煙草、圖5B :200mmol/LNaCl連續(xù)處理3d的非轉(zhuǎn)基因煙草、圖5C 恢復(fù)生長 3d后的轉(zhuǎn)XHDREB基因煙草、圖5D 恢復(fù)生長3d后的非轉(zhuǎn)基因煙草；圖6A-6D轉(zhuǎn)基因煙草的耐低溫性分析結(jié)果圖，圖6A :4°C處理24h的轉(zhuǎn)XHDREB基 因煙草、圖6B :4°C處理24h的非轉(zhuǎn)基因煙草、圖6C 室溫下恢復(fù)培養(yǎng)3d后的轉(zhuǎn)XHDREB基因 煙草、6D 室溫下恢復(fù)培養(yǎng)3d后的非轉(zhuǎn)基因煙草。
具體實施例方式以下結(jié)合具體實施例對本發(fā)明的技術(shù)路線做進一步詳細說明。工具酶和試劑(1)限制性內(nèi)切酶，修飾酶及試劑盒T4 DNA連接酶，Taq酶，反轉(zhuǎn)錄酶AMV，DNA回 收純化試劑盒均購自北京天根生物技術(shù)公司。質(zhì)粒小量提取試劑盒購自博大泰克公司，其 它化學(xué)試劑購自北京鼎國公司。(2)其他藥品瓊脂糖，Tris，焦碳酸二乙酯(DEPC)為北京鼎國公司產(chǎn)品。蛋白胨，酵母提取物，氯仿，異戊醇，乙醇，異丙醇，NaCl, CaC12等均為國產(chǎn)分析純試劑。 5-溴-4-氯-3-吲哚半乳糖苷(X-gal)，異丙基硫代_ β -D半乳糖苷(IPTG)，氨芐青霉素等 購自北京鼎國公司。DNA分子量標準Mark Ladder 2000購自北京天根生物技術(shù)公司。溶液的配置(1)植物基因組DNA提取緩沖液500mL 0. 35mol/L葡萄糖；0. lmol/L Tris-HCKpH 8.0) ；5mmol/L Na-EDTA(pH 8.0) ；2% PVP ； 1 % β -Me(2)植物基因組 DNA 提取裂解液 500mL 1. 4mmol/L NaCl ；0. lmol/L Tris-HCl (pH 8.0) ；20mmol/L Na-EDTA(pH 8.0) ；2% CTAB ；2% PVP ； 1 % β -Me(3)植物基因組 DNA 溶解液 TE (pH 8. 0) IL :10mmol/L Tris-HCl ； lmmol/LEDTA (pH 8. 0)(4)植物基因組 DNA 電泳緩沖液 50XTBE(500mL) =Tris 121. Og ；冰醋酸 28. 5mL ； 0.5mol/L EDTA 50.OmL(pH 8. 0) ；lmol/L Tris-HCl(pH 8.0)500. OmL ；Tris 60. Og ；水 400. OmL;濃 HCl 21. OmL培養(yǎng)基(I)LB液體培養(yǎng)基胰蛋白胨10. 0g，酵母提取物5. 0g, NaCl 10. 0，pH 7. 0定容到 1000mL。(2) LB固體培養(yǎng)基胰蛋白胨10. 0g，酵母提取物5. Og5NaCl 10. 0g，瓊脂粉15. Og, pH 7. 0 定容到 IOOOmL0(3) LB選擇培養(yǎng)基在LB鋪平板前，待培養(yǎng)基溫度降到50°C左右，加入抗生素至濃 度為100mg/L，搖勻后鋪平板。主要儀器PCR擴增儀(Tachne T312)，高速冷凍離心機(Hettich MIKRO 200R)，電泳設(shè)備 (Bio RAD)，凝膠成像系統(tǒng)(Bio RAD)。實施例1 海島棉XHDREB基因的克隆1、植物材料的培養(yǎng)海島棉(Gossypium barbadense L.)新海16，種子用滅菌的蒸餾水浸泡，在37°C 保溫箱中放置48h，露白后再用滅菌的蒸餾水清洗干凈，擠掉種皮后置于1/2 MS培養(yǎng)基中， 于25°C、光照強度2500 Lux和12h光周期條件下培養(yǎng)。一周后，從無菌苗上摘取葉片存于 液氮以提取基因組DNA，RNA。2、海島棉基因組DNA的提取提取方法參照CTAB法，具體步驟如下取葉片3 5g，在液氮中研磨后，裝入1.5ml離心管；在1.5ml離心管中加入 800μ 的DNA提取緩沖液(65°C預(yù)熱)，并加入50yL β -疏基乙醇，混勻后65 °C水浴 2011^11，中間混勻幾次；加入30(^1^ 5mmol/L醋酸鉀(pH 7.0)混勻，冰浴20 60min后，在 室溫下解凍；加入300 μ L的DNA提取裂解液，混勻，65°C水浴20min，中間混勻幾次，室溫、 IOOOOrpm離心IOmin ；吸取上清置于一個新的1. 5ml離心管中，加入600 μ L氯仿異戊醇 (24 1)混勻，IOOOOrpm離心IOmin ；取上清置于一個新的1. 5ml離心管中，加入等體積4°C 預(yù)冷的異丙醇。輕輕混勻，_20°C冰浴30min以上；6000rpm離心5min，棄上清，用70%乙醇 洗滌沉淀2次，無水乙醇洗1次，吹干；加入50 μ L TE溶解DNA。
3、海島棉總RNA的提取用改良的熱酚法提取海島棉(新海16)葉片總RNA，具體方法如下將4mL提取緩沖液(用前加入PVP及β -疏基乙醇)與4mL酚-氯仿加入離心管 中，混勻后，置于65°C水浴鍋中水浴20min ；取海島棉葉片1 2g，在液氮中研磨后轉(zhuǎn)入裝 有提取緩沖液及酚_氯仿混合物的離心管中，旋渦振蕩30s ；4°C,12000rpm高速離心5min 后，將上清移至另一離心管中加入4mL酚-氯仿混合液，混勻，離心，重復(fù)該操作一到兩次， 然后取上清；加入等體積的4mol/L的LiCl，混勻，-20°C放置2h以上，12000rpm離心20min ； 棄上清，用70%乙醇洗滌沉淀，然后將沉淀溶解于0. 5mL的TE中，將混合液轉(zhuǎn)入1. 5mL的 離心管中；加入等體積的酚-氯仿混合液抽提一到兩次，將上清轉(zhuǎn)入另一離心管中，加入 1/10體積3mol/L醋酸鈉(pH 5. 3)和2 3倍體積的無水乙醇，混勻，_20°C放置1 2h， 14000rpm，4°C離心5min，用70%乙醇洗滌沉淀，室溫放置2 3min ；加200 500 μ L的 DEPC水，溶解沉淀，-80°C保存?zhèn)溆谩Ｌ崛〉暮u棉葉片總RNA通過瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性，紫外分光光度儀檢 測能見兩條明顯RNA條帶則表明樣品可用。4、海島棉XHDREB轉(zhuǎn)錄因子基因全長的獲得和克隆第一鏈cDNA的合成按Promega公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進行。分為預(yù)變性與反轉(zhuǎn)錄兩部分，預(yù)變性 反應(yīng)體系見表1，反應(yīng)條件為70°C溫育5min，立即置冰上lOmin。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系見表2，反 應(yīng)條件為25°C、5min，42°C、lh，7(TC、15min滅活反轉(zhuǎn)錄酶，-20°C冰箱保存反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。表1預(yù)變性反應(yīng)體系
權(quán)利要求
一種海島棉D(zhuǎn)REB轉(zhuǎn)錄因子基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO1所示。
2.權(quán)利要求1所述的海島棉D(zhuǎn)REB轉(zhuǎn)錄因子基因編碼的蛋白質(zhì)，具有SEQID NO :2所 示的氨基酸序列。
3.含有權(quán)利要求1所述海島棉D(zhuǎn)REB轉(zhuǎn)錄因子基因的植物表達載體。
4.用權(quán)利要求3所述植物表達載體轉(zhuǎn)化的植物細胞、組織或植株。
5.權(quán)利要求1所述海島棉D(zhuǎn)REB轉(zhuǎn)錄因子基因在培育抗逆植物品種中的應(yīng)用。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于所述海島棉D(zhuǎn)REB轉(zhuǎn)錄因子基因在培育抗 旱植物品種中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及植物基因工程領(lǐng)域，提供了一種海島棉D(zhuǎn)REB轉(zhuǎn)錄因子基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO1所示，構(gòu)建pC-XHDREB植物表達載體，用根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化煙草，獲得轉(zhuǎn)XHDREB基因煙草，采用干旱模擬實驗驗證轉(zhuǎn)XHDREB基因煙草，因XHDREB的過表達而具有耐旱、耐鹽、抗冷能力。
文檔編號A01H5/00GK101984059SQ20101024525
公開日2011年3月9日 申請日期2010年7月28日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月28日
發(fā)明者張艷妮, 曲延英, 陳全家 申請人:曲延英;陳全家