專利名稱：亨利兜蘭種子試管苗的培育方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物組織培育技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及亨利兜蘭種子試管苗的一種無(wú)菌培育方法。
背景技術(shù)：
亨利兜蘭(Paphiopedilum henryanum Braem)是蘭禾斗(Orchidaceae)兜蘭屬(P即hiopedium)植物，是國(guó)家一級(jí)重點(diǎn)保護(hù)瀕危物種?！度A盛頓公約》(即《瀕危野生動(dòng)植物禾中國(guó)際貿(mào)易公約》，Convention on Interiiatioiial Trade in Endangered Species ofWild Fauna and Flora, CITES)把所有兜蘭屬植物列入其附錄一名錄，受到國(guó)際社會(huì)的嚴(yán)格保護(hù)。兜蘭是蘭科植物中最具特色的一個(gè)類群，也是最奇特的觀賞蘭花。花形奇特，唇瓣呈兜狀，酷似舊時(shí)歐洲淑女的拖鞋，故又稱拖鞋蘭。背萼特別發(fā)達(dá)，具有艷麗的花紋。兜蘭與其他蘭花明顯不同的地方是2枚能育雄蕊著生在蕊柱的兩側(cè)；發(fā)達(dá)的背萼呈扁圓形或倒心形，在各瓣中最顯著。因此，兜蘭以其獨(dú)特魅力和許多優(yōu)異特性而備受世界花卉愛(ài)好者的鐘愛(ài)。
亨利兜蘭分布于中國(guó)云南、廣西、貴州，越南、緬甸也有分布?；ㄉ奂t，上萼片具斑點(diǎn)?；ㄆ跒橄那锛?。亨利兜蘭同大多數(shù)蘭花一樣，種子沒(méi)有胚乳，在自然環(huán)境中需與真菌共生才能萌發(fā)，且萌發(fā)率極低。蘭花的傳統(tǒng)繁殖方式為分株繁殖，繁殖系數(shù)低、速度慢，難以滿足保護(hù)和開(kāi)發(fā)的要求。蘭花的組織培養(yǎng)始于20世紀(jì)60年代，之后組培在其它許多蘭花上獲得了成功。但兜蘭人工授粉結(jié)實(shí)率低，其無(wú)菌播種和組織培養(yǎng)難度大，是蘭科植物中種子試管培養(yǎng)最困難的屬之一。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供亨利兜蘭種子試管苗的一種無(wú)菌培育方法，該方法經(jīng)過(guò)對(duì)培養(yǎng)基的篩選，優(yōu)選出適合亨利兜蘭種子試管苗培育的培養(yǎng)基，種子萌發(fā)率能達(dá)到45%以上，成苗率、移栽成活率均在90%以上。
為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用如下的技術(shù)方案本發(fā)明亨利兜蘭種子試管苗的培育方法(1) 種子萌發(fā)將亨利兜蘭果實(shí)滅菌后取出種子，接種于種子萌發(fā)培養(yǎng)基上，暗培養(yǎng)3周后轉(zhuǎn)入弱光培養(yǎng)，至種子發(fā)育成原球莖，種子萌發(fā)培養(yǎng)基為1/4MS + 15% (體積)椰乳+ 20g/L蔗糖+ lg/L活性炭+ 0. 6%瓊脂，PH 5. 2 5. 4;
(2) 增殖分化將原球莖轉(zhuǎn)接到增殖分化培養(yǎng)基上，弱光培養(yǎng)至原球莖分化出芽，增殖分化培養(yǎng)基為1/2MS + 0.5 2.0mg/L 6-BA + 0. 2mg/L NAA + 2g/L胰蛋白胨+ 15% (V/V)椰乳+ 20g/L蔗糖+ lg/L活性炭+ 0.6%瓊脂，PH 5. 2 5. 4;
(3) 壯苗生根然后將芽轉(zhuǎn)接到壯苗生根培養(yǎng)基上進(jìn)行生根培養(yǎng)后即可煉苗移栽，壯苗生根培養(yǎng)基為1/2MS + l.Omg/L NAA + 15% (體積)椰乳+ 20g/L蔗糖+ lg/L活性炭+0. 6%瓊脂，PH 5. 2 5. 4。
上述增殖分化培養(yǎng)基為1/2MS + 2. Omg/L 6-BA + 0. 2mg/L NAA + 2g/L胰蛋白胨+15% (體積)椰乳+ 20g/L蔗糖+ lg/L活性炭+ 0.6%瓊脂，PH 5. 2 5. 4
前述亨利兜蘭種子試管苗的培育方法中，所述弱光培養(yǎng)的光照強(qiáng)度為500 1000Lx，培養(yǎng)溫度為23 27。C。
進(jìn)一步的，前述亨利兜蘭種子試管苗的培育方法
(1) 種子萌發(fā)首先將授粉150天的亨利兜蘭果實(shí)經(jīng)表面消毒處理后，在超凈工作臺(tái)上剖開(kāi)果實(shí)，取出種子后接種于種子萌發(fā)培養(yǎng)基上，暗培養(yǎng)3周后轉(zhuǎn)入弱光培養(yǎng)，至種子發(fā)育成原球莖；
(2) 增殖分化將原球莖轉(zhuǎn)接到增殖分化培養(yǎng)基上，弱光培養(yǎng)至原球莖分化出芽，出芽后10周再繼代增殖培養(yǎng)一次；
(3) 壯苗生根然后將芽轉(zhuǎn)接到壯苗生根培養(yǎng)基上進(jìn)行生根培養(yǎng)，光照強(qiáng)度增加至2000 3000Lx，當(dāng)苗長(zhǎng)至4 5厘米高、根長(zhǎng)l. 5 2厘米時(shí)即可煉苗移栽。
上述技術(shù)方案是通過(guò)實(shí)驗(yàn)篩選出來(lái)的，具體如下
1、實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基
種子萌發(fā)培養(yǎng)基
(1) MS+15% (V/V)椰乳+20g/L蔗糖+lg/L活性炭+0. 6%瓊脂，PH 5. 2 5. 4;
(2) 1/2MS+15% (V/V)椰乳+20g/L蔗糖+lg/L活性炭+0. 6%瓊脂，PH 5. 2 5. 4;
(3) 1/4 MS+15% (V/V)椰乳+20g/L蔗糖+lg/L活性炭+0. 6%瓊脂，PH 5. 2 5. 4;原球莖增殖及分化培養(yǎng)基
(4) 1/2MS+2. Omg/L 6-BA +0.2 mg/L NAA +28/1^胰蛋白胨+15% (V/V)椰乳+20g/L蔗糖+ "/1^舌性炭+0. 6%瓊脂，PH 5. 2 5. 4;(5) 1/2MS+1. 0mg/L 6-BA+0. 5 mg/L NAA +28/1^胰蛋白胨+15% (V/V)椰乳+20g/L蔗糖+ "/1^舌性炭+0. 6%瓊脂，PH 5. 2 5. 4;
(6) 1/2MS+0. 5mg/L 6-BA +0.2 mg/L NAA +28/1^胰蛋白胨+15% (V/V)椰乳+20g/L蔗糖+ "/1^舌性炭+0. 6%瓊脂，PH 5. 2 5. 4;
生根壯苗培養(yǎng)基
(7) 1/2MS +1.0 mg/L NAA +15% (V/V)椰乳+20g/L蔗糖+lg/L活性炭+0. 6%瓊脂，PH5. 2 5. 4
(8) 1/2MS +1.0 mg/L NAA +6-BAO. 5mg/L +15% (V/V)椰乳+20g/L蔗糖+lg/L活性炭+0. 6%瓊脂，PH 5. 2 5. 4。
2、實(shí)驗(yàn)方法
2. l人工授粉溫室大棚里人工馴化栽培的亨利兜蘭自然結(jié)實(shí)率低，需經(jīng)人工進(jìn)行自花或異花授粉，這也是選育新品種的主要手段。
2.2種子滅菌取授粉150d的果實(shí)用自來(lái)水凈后，用75%的酒精表面消毒303，再用O. 1%升汞液消毒15min，無(wú)菌水沖洗5次，再浸入95。/。的酒精ls，取出后于酒精燈上點(diǎn)燃，燒盡表面酒精后，在超凈工作臺(tái)上剖開(kāi)果實(shí)，取出種子接種于種子萌發(fā)培養(yǎng)基(1) 、 (2) 、 (3)上。進(jìn)行暗培養(yǎng)3周，轉(zhuǎn)入弱光培養(yǎng)(500 1000Lx)，培養(yǎng)溫度(25±2) °C ， 7周左右發(fā)育成原球莖。培養(yǎng)基(1)的種子幾乎沒(méi)有萌發(fā)；培養(yǎng)基(2)上種子萌發(fā)率10%;培養(yǎng)基(3)種子萌發(fā)率達(dá)45%?？梢?jiàn)低鹽濃度有利于種子萌發(fā)。
2.3原球莖增殖與分化將原球莖轉(zhuǎn)接到原球莖繼代增殖分化培養(yǎng)基(4) 、 (5) 、 (6)上，弱光培養(yǎng)(500 1000Lx)，培養(yǎng)溫度(25±2) °C 。原球莖均能迅速分化出芽，其中培養(yǎng)基(4)上效果最好，10周左右可繼代增殖1次。結(jié)果表明細(xì)胞分裂素與生長(zhǎng)素的比例以10: l效果最佳。
2.4壯苗生根培養(yǎng)將小苗分成單株后轉(zhuǎn)接到壯苗生根培養(yǎng)基(7) 、 (8)上，進(jìn)行生根培養(yǎng)，光照增加至2000 3000Lx，其中培養(yǎng)基(7)上根系生長(zhǎng)較好。當(dāng)苗長(zhǎng)至4 5cm高，根長(zhǎng)1.5 2.0cm，可進(jìn)行煉苗移栽。
2.5煉苗移栽將培養(yǎng)瓶置于大棚中煉苗l周后，取出小苗，洗凈培養(yǎng)基，先種植于苔蘚中(苔蘚用1000倍多菌靈消素)，2個(gè)月后轉(zhuǎn)于樹(shù)皮基質(zhì)中(用1000倍多菌靈消素)，成活率90%以上。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明通過(guò)對(duì)培養(yǎng)基的篩選，優(yōu)選出了適合亨利兜蘭種子萌發(fā)、增殖分化和壯苗生根的培養(yǎng)基，種子萌發(fā)率可達(dá)到45%以上，成苗率、移栽成活率均在90%以上
6，為亨利兜蘭的快速繁殖、雜交選育、保護(hù)和開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供了一種有效的培育方法。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合具體實(shí)施方式
詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明。
(1) 種子萌發(fā)首先將亨利兜蘭果實(shí)滅菌，取授粉150天的亨利兜蘭果實(shí)用自來(lái)水洗凈 ，用75%酒精表面消毒30秒，再用O. 1%升汞液消毒15分鐘，無(wú)菌水沖洗5次，再浸入95%酒 精1秒，取出后于酒精燈上燒盡果實(shí)表面的酒精，在超凈工作臺(tái)上剖開(kāi)果實(shí)，取出種子后接 種于種子萌發(fā)培養(yǎng)基上，暗培養(yǎng)3周后轉(zhuǎn)入弱光培養(yǎng)，至種子發(fā)育成原球莖，種子萌發(fā)培養(yǎng) 基的組成為1/4MS + 15% (體積)椰乳+ 20g/L蔗糖+ lg/L活性炭+ 0. 6%瓊脂，PH 5.2 5.4;這里選擇低鹽濃度的培養(yǎng)基，有利于種子的萌發(fā)，萌發(fā)率在45%以上。
(2) 增殖分化將原球莖轉(zhuǎn)接到增殖分化培養(yǎng)基上，弱光培養(yǎng)至原球莖分化出芽，出 芽后10周再繼代增殖培養(yǎng)一次；優(yōu)選增殖分化培養(yǎng)基組分為1/2MS + 2.0mg/L 6-BA + 0.2mg/L NAA + 2g/L胰蛋白胨+ 15% (體積)椰乳+ 20g/L蔗糖+ lg/L活性炭+ 0. 6%瓊脂 ,PH 5.2 5.4。
(3) 壯苗生根然后將芽轉(zhuǎn)接到壯苗生根培養(yǎng)基上進(jìn)行生根培養(yǎng)，光照強(qiáng)度增加至 2000 3000Lx，當(dāng)苗長(zhǎng)至4 5厘米高、根長(zhǎng)l. 5 2厘米時(shí)即可煉苗移栽，壯苗生根培養(yǎng)基為 :1/2MS + 1.0mg/L NAA + 15% (體積)椰乳+ 20g/L蔗糖+ lg/L活性炭+ 0. 6%瓊脂，PH 5. 2 5. 4。
(4) 煉苗移栽將培養(yǎng)瓶置于大棚中煉苗l周后，取出小苗，洗凈培養(yǎng)基，先種植于苔 蘚中(苔蘚用1000倍多菌靈消素)，2個(gè)月后轉(zhuǎn)于樹(shù)皮基質(zhì)中(用1000倍多菌靈消素)，成 活率90%以上。
上述具體實(shí)施方式
中的弱光培養(yǎng)的光照強(qiáng)度為500 1000Lx，培養(yǎng)溫度為23 27。C。
權(quán)利要求
1.亨利兜蘭種子試管苗的培育方法，其特征在于(1)種子萌發(fā)將亨利兜蘭果實(shí)滅菌后取出種子，接種于種子萌發(fā)培養(yǎng)基上，暗培養(yǎng)3周后轉(zhuǎn)入弱光培養(yǎng)，至種子發(fā)育成原球莖，種子萌發(fā)培養(yǎng)基為1/4MS+15％(體積)椰乳+20g/L蔗糖+1g/L活性炭+0.6％瓊脂，PH 5.2～5.4；(2)增殖分化將原球莖轉(zhuǎn)接到增殖分化培養(yǎng)基上，弱光培養(yǎng)至原球莖分化出芽，增殖分化培養(yǎng)基為1/2MS+0.5～2.0mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA+2g/L胰蛋白胨+15％(V/V)椰乳+20g/L蔗糖+1g/L活性炭+0.6％瓊脂，PH 5.2～5.4；(3)壯苗生根然后將芽轉(zhuǎn)接到壯苗生根培養(yǎng)基上進(jìn)行生根培養(yǎng)后即可煉苗移栽，壯苗生根培養(yǎng)基為1/2MS+1.0mg/L NAA+15％(體積)椰乳+20g/L蔗糖+1g/L活性炭+0.6％瓊脂，PH 5.2～5.4。
2.按照權(quán)利要求l所述亨利兜蘭種子試管苗的培育方法，其特征在于:步驟(2)中所述的增殖分化培養(yǎng)基為1/2MS + 2. Omg/L 6-BA + 0. 2mg/L NAA + 2g/L胰蛋白胨+ 15% (V/V)椰乳+ 20g/L蔗糖+ lg/L活性炭+ 0.6%瓊脂，PH 5. 2 5. 4。
3.按照權(quán)利要求l所述亨利兜蘭種子試管苗的培育方法，其特征在于:所述弱光培養(yǎng)的光照強(qiáng)度為500 1000Lx，培養(yǎng)溫度為23 27。C。
4.按照權(quán)利要求1至3任一項(xiàng)所述亨利兜蘭種子試管苗的培育方法，其特征在于(1) 種子萌發(fā)首先將授粉150天的亨利兜蘭果實(shí)經(jīng)表面消毒處理后，在超凈工作臺(tái)上剖開(kāi)果實(shí)，取出種子后接種于種子萌發(fā)培養(yǎng)基上，暗培養(yǎng)3周后轉(zhuǎn)入弱光培養(yǎng)，至種子發(fā)育成原球莖；(2) 增殖分化將原球莖轉(zhuǎn)接到增殖分化培養(yǎng)基上，弱光培養(yǎng)至原球莖分化出芽，出芽后10周再繼代增殖培養(yǎng)一次；(3)壯苗生根然后將芽轉(zhuǎn)接到壯苗生根培養(yǎng)基上進(jìn)行生根培養(yǎng)，光照強(qiáng)度增加至2000 3000Lx，當(dāng)苗長(zhǎng)至4 5厘米高、根長(zhǎng)l. 5 2厘米時(shí)即可煉苗移栽。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種亨利兜蘭種子試管苗的培育方法，包括種子萌發(fā)、增殖分化和壯苗生根，種子萌發(fā)培養(yǎng)基為1/4MS+15％(體積)椰乳+20g/L蔗糖+1g/L活性炭+0.6％瓊脂，pH 5.2～5.4；增殖分化培養(yǎng)基為1/2MS+0.5～2.0mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA+2g/L胰蛋白胨+15％(V/V)椰乳+20g/L蔗糖+1g/L活性炭+0.6％瓊脂，pH 5.2～5.4；壯苗生根培養(yǎng)基為1/2MS+1.0mg/L NAA+15％(體積)椰乳+20g/L蔗糖+1g/L活性炭+0.6％瓊脂，pH 5.2～5.4。本發(fā)明方法的種子萌發(fā)率可達(dá)到45％以上，成苗率、移栽成活率均在90％以上。
文檔編號(hào)A01H4/00GK101558744SQ20091030291
公開(kāi)日2009年10月21日 申請(qǐng)日期2009年6月4日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月4日
發(fā)明者羅曉青 申請(qǐng)人:貴州省亞熱帶作物研究所