專利名稱：控制植物病原體的新微生物的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及植物病原體控制領域，特別是在葉、果實或穗上，更特別在果實作 物中，如蘋果，以及特別涉及控制真菌性葉疾病蘋果黑星病(蘋果黑星菌(Venturia inaequalis))0
背景技術：
蘋果黑星病在蘋果生長區(qū)有著主要的經濟學重要性。如果不控制，該疾病在春季 月份期間潮濕陰冷天氣時可以引起廣泛損失(70%或更大)。損失直接源自果實或花梗感 染，或者間接來自重復脫葉，其可以降低樹木生長和產量。蘋果黑星病(見


圖1)可以在葉、葉柄、花、萼片、果實、花梗上觀察到，以及較低頻 率地在幼枝和芽鱗上觀察到。第一個病斑經常在春季隨著葉的發(fā)出以及暴露于感染而在 葉的下表面上發(fā)現(xiàn)。隨后，隨著葉伸展，兩個表面均暴露而可以被感染。新生病斑(Young lesions)是柔滑棕色(velvety brown)至橄欖綠并具有羽毛狀不清晰邊緣。隨著時間進 行，該邊緣變得清晰，但是如果若干病斑接合則它們可以是模糊的。隨著受感染葉老化，相 鄰于病斑的組織變厚，并且葉表面變形。當感染為數(shù)眾多時，幼葉可變得卷曲、萎縮和扭曲。 所述病斑可在葉上下表面保持整個生長季；下面的細胞偶爾地變成棕色并死亡，從而棕色 病斑在兩個表面均可見。每片葉的病斑數(shù)可以從一或兩個至100個以上。術語“片狀黑星 (sheet scab)”經常用于指整個表面均被斑點(scab)覆蓋的葉。具有片狀黑星的幼葉經常 皺縮并從樹上落下。葉柄和花梗的感染分別導致葉和果實未成熟脫落。在晚夏或早秋，病 斑可以顯得發(fā)白，這是由于在病斑表面上的次生真菌生長所致。幼果實上的病斑顯得與葉上那些類似，但是隨著受感染果實增大，該病斑變成棕 色并木栓質化(corky)。該季節(jié)早期的感染可以引起果實發(fā)育不均勻，因為未感染部分持續(xù) 生長。然后果皮和果肉中出現(xiàn)裂縫，或者果實可以變形。整個果實表面易受感染，但是該季 節(jié)早期的感染通常在萼端附近成簇。發(fā)生在晚夏或早秋的果實感染可能不是可見的，直至 果實被儲存。這種癥狀稱為"針點(pin-point)"斑點，其具有大致圓形的黑色病斑，直徑 范圍為 0. 004 至 0. 16 英寸(0. l-4mm)。盡管在紐約的研究顯示黑星病真菌(scab fungus)可以在樹中作為芽鱗上的分生 孢子而過冬，該病原體一般在果園地面上的葉和果實中過冬。子囊孢子是初次接種體的主 要來源并且在假子囊果中產生，所述假子囊果在冬天期間于葉中發(fā)育。在大多數(shù)地點的典 型年份中，最早成熟的子囊孢子能在大約芽裂時或其后不久引起感染。子囊孢子在5-9周 的時間段內持續(xù)成熟并被排出(discharge)，其中峰值排出是在粉紅色至花瓣落下的物候 階段。發(fā)生感染所需時間長度依賴于葉上連續(xù)濕潤的小時數(shù)及濕潤期間的溫度。幼葉保持 易感5至8天，但是它們的下表面可在晚夏被感染。對于果實，感染所需濕潤期的持續(xù)時間 隨果實年齡而增加，其保持易感直至收獲。當真菌在葉或果實中建立之后，分生孢子在病斑 表面形成并且成為該季節(jié)剩余時間次生接種體的來源。分生孢子通過濺灑的雨和風而散布 于發(fā)育中的葉和果實。分生孢子感染的若干次生循環(huán)可在生長季期間發(fā)生，其依賴于感染 期頻率和宿主組織的易感性。
蘋果黑星病的管理防治是多方面的，有抗性栽培種、環(huán)境衛(wèi)生和化學品，其全都根 據(jù)所使用的果園系統(tǒng)及栽培者的目的而以某種程度來使用。大多數(shù)主要蘋果栽培種易感于所述真菌，盡管略有變化。已經發(fā)布了超過25個黑 星病抗性栽培禾中，包括 Prima、Priscilla、Jonafree、Redfree、Liberty、Freedom、Goldrush 和ft~iStine。大多數(shù)適應于美國較北方的蘋果生長區(qū)。所有黑星病抗性栽培種對其它早季 疾病的易感性是變化的；并且所有均易感于夏季疾病。若干最近發(fā)布的未針對黑星病抗性 進行特異性育種的蘋果栽培種也顯示不同水平的黑星病易感性。對過冬蘋果葉上假子囊果形成的預防將可能會消除作為蘋果生產嚴重威脅的黑 星病。不幸的是，假子囊果的完全消除在果園條件下用現(xiàn)有方法是不可能的。蘋果黑星病主要用殺真菌劑噴霧來控制?？梢允褂镁哂胁煌饔媚Ｊ降母鞣N殺真 菌劑噴霧。何時及怎樣使用依賴于其作用模式。保護性殺真菌劑阻止孢子萌發(fā)或穿透葉組 織。為了有效，必須在感染發(fā)生之前將其應用于易感組織表面。感染的發(fā)生可以用精確天 氣預報而預測。保護性殺真菌劑通常以7-10天間隔應用或者根據(jù)預期感染時間而進行應 用。感染后殺真菌劑控制葉和果實內部的黑星病真菌。這些化學品可以穿透植物組織 以消除或者抑制病斑發(fā)展。這些殺真菌劑停止感染的能力限于幾個小時或者多至幾天(取 決于具體殺真菌劑)，并且其作用經常根據(jù)感染后最初M-48小時期間的溫度而變化。一 些殺真菌劑甚至在遲至潛伏期(感染和出現(xiàn)癥狀之間的時間)也可以抑制真菌。黑星病病 斑出現(xiàn)后的根除通常不會發(fā)生，但是可以以某些殺真菌劑的適當比率和時機而實現(xiàn)。用于 管理防治黑星病的殺真菌劑的選擇基于若干因素，包括必須在該時間被控制的其它疾病的 完整譜、黑星病真菌對所選擇化學品抗性的潛力、特定果園中該疾病的歷史、果實的最終市 場及其它社會和經濟因素。良好園藝實踐，如適當?shù)攸c的選擇、樹木間隔及年度修剪，通過 提高噴霧覆蓋范圍及降低潮濕期長度而促進更好的化學控制。蘋果黑星病的治療或預防中 使用的化學殺真菌劑包括代森錳(maneb)、代森錳鋅(mancozeb)、克菌丹(captan)、嘧霉胺 (pyrimethanil)和對甲抑菌靈(tolylfluanide)。因此對于有效控制蘋果黑星病，以及環(huán)境友好并對人類和/或動物無毒的天然殺 真菌劑仍然是有需要的。發(fā)明概述本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)了兩株新的芽枝狀枝孢菌(Cladosporium cladosporioides)分 離株，即芽枝狀枝孢菌H39，2007年12月13日保藏在荷蘭Baarn的荷蘭真菌保藏所 (Centraal Bureau Schimmelcultures, Baarn, The Netherlands) ,1 ^ CBS 122244, Μ. 芽枝狀枝孢菌R406，2007年12月13日保藏在荷蘭Baarn的荷蘭真菌保藏所，保藏號CBS 122243。所述分離株可在用來控制葉、果實和穗的植物病原體的組合物中使用。此組合物 優(yōu)選用于這樣的疾病，其中所述植物病原體選自由如下所組成的組蘋果黑星病(蘋果黑 星菌)，梨黑星病(梨黑星菌(Venturia pirina))，葉斑病(Blumeriella jaapi)，玫瑰黑 3 ^ ( Χ Μ,Μτ Μ (Diplocarpon rosae) /- 二3 (Marssonina rosae)) ,11 ^ (囊狀匍柄霉菌(Stemphylium vesicarium))，白粉病(蘋果白粉病柄球菌(Podosphaera Ieucotricha)/薔薇單絲殼菌(Sphaerotheca pannosa))，秋海棠霉病(秋海棠叉絲殼菌 (Microsphaera begoniae)), ^ [=1 )"^ (Sphaerotheca macular is), 11;1 ^ ^ ( ^11 粘殼孢菌(Gloeodes pomigena))，蠅糞病(Zygophalia jamaicensis)，桃縮葉病(畸形外 囊菌(Taphrina deformans))，褐腐病/短枝潰蕩(spur canker)(產果念珠霉菌(Monilia fructigena), 11 !' (M. Iaxa)), ^lf ^f (Gymnosporangium sabinae/ ^111 If 菌(G. fuscum))，癌腫病(canker)(仁果干癌叢赤殼菌(Nectria galligena))，玫瑰黑斑 病(玫瑰雙殼菌)，玫瑰銹病(小瘤多胞銹菌(Phragmidium tuberculatum)/多胞銹菌 (Phragmidium spp.))，各種植物中的葡萄孢菌(Botrytis spp.)，甘藍中的蕓苔生球腔菌 (Mycosphaerella brassicicola)， 中的^^胃王求月空lif (Mycosphaerella fi jiensis), 蕓苔屬(Brassica)、馬鈴薯和各種其它植物中的鏈格孢菌(Alternaria spp.)，鐮孢 菌(Fusarium spp.)，特別在谷類包括玉米中的，馬鈴薯的蔓延疫霉菌(Wiytophthora infestans)及葡萄樹中的葡萄生單軸霉菌(Plasmopara viticola)，更優(yōu)選其中所述真菌 葉病原體是蘋果黑星病。另外，在此組合物中，所述枝孢菌(Cladosporium)作為孢子存在，以及進一步包 含用于枝孢菌孢子的載體，優(yōu)選其中所述載體是葡萄糖?；蛘撸摻M合物可以包含本發(fā)明枝 孢菌的提取物。在另一個實施方案中，本發(fā)明包含控制植物中病原體的方法，包括用本發(fā)明組合 物處理所述植物。優(yōu)選地，將所述組合物噴霧在植物葉、果實或者穗上。此用于控制病原體 的方法包括防止感染和/或減小由所述病原體引起的植物損害。所述方法可用于對抗任何 上述病原體，優(yōu)選對抗蘋果黑星病。本發(fā)明進一步的實施方案是本發(fā)明枝孢菌分離株的應 用，或者本發(fā)明用于預防或治療感染植物葉、果實或者穗的病原體的組合物的應用。本發(fā)明 中還包括本發(fā)明的枝孢菌菌株或組合物用于控制植物病原體感染。附圖描述
圖1 葉(a)和果實(b)上由蘋果黑星菌(Vi)引起的黑星病癥狀。圖2 在有機管理的果園中每周用芽枝狀枝孢菌H39或R406(大約hlO6活孢子 πιΓ1)處理2次的蘋果葉上Vi分生孢子的產生。Randwijk 2007。個別處理與對照處理相 比在統(tǒng)計學上顯著的作用在每個取樣日分別用“*”指示；單側無保護的LSD-檢驗；(α = 0. 05)。N. s.無顯著差異；η. v.無數(shù)值圖3 預測的感染期，噴霧應用芽枝狀枝孢菌Η39和硫的日期，及取樣日期(L 標 記新葉；S:取樣)。圖4 用芽枝狀枝孢菌Η39的分生孢子或者硫處理對蘋果黑星菌分生孢子產生的 作用。具有共同字母的相同取樣日期的條桿確實差異顯著(LSD-檢驗；α =0. 05).圖5 用芽枝狀枝孢菌Η39的分生孢子或者硫處理對黑星病嚴重性的作用。具有 共同字母的條桿確實差異顯著(LSD-檢驗；α =0. 05)。詳細描述如上所詳述，蘋果黑星病是對蘋果栽培者具有巨大經濟影響的疾病。這對于有極 少或沒有替代化學殺蟲劑的有機農場主來控制蘋果黑星病尤其如此，特別是現(xiàn)在一些通常 使用的制劑由于環(huán)境和一般毒性的風險而趨于逐步淘汰。正在尋找來自植物的提取物形式的替代物，因為植物提取物已被描述為是用于治 療真菌疾病的可能候選，并且因為它們符合有機生長的要求。最近，已記載了對來自絲蘭屬 (Yucca)的提取物的使用(W0 2007/139382)。
然而，在植物提取物之外，天然發(fā)生的微生物也可用于控制植物病原體。特別是許 多真菌由于其殺生物作用而已知，例如青霉菌(Penicillium)和木霉菌(Trichoderma)。更 特別地，還存在對抗植物病原體而特別有用的真菌。在蘋果黑星病的情況中，也已發(fā)現(xiàn)此類 真菌，如球毛殼菌(Chaetomium globosum) (Boudrau, M. A. et al. , 1987, Phytopathol. 77 1470-1475), Microsphaeropsis ochracea(Carisse, 0. et al.,2000, Phytopathol. 90 31-37)，長像殼菌(Ophiostoma sp.)禾口蓮點霄菌(Phoma sp.) (Ouimet, A. ，et al. ，1997， Can. J. Bot. 75 :632-639)。一 般綜述可見于 Burr，Τ. J. et al.，1996，Biol. Control6 151-157 及 Fiss，Μ· et al. ,2003, Ζ. Pflanzenkrankh. Pflanzenschutz,110(6) :513_523。 最近，已披露了(Ziedan，E. H. Ε.，2006，Res. J. Agric. &BioUci.2(6) :262-267)衍生自葡 萄樹葉圈的芽枝狀枝孢菌分離株與苯甲酸一起應用可有效的對抗引起葡萄樹霜霉病的真 菌葡萄生單軸霉菌。還發(fā)現(xiàn)芽枝狀枝孢菌的特定分離株可以用于對抗葡萄孢菌和鐮孢菌感 染(Newhook, F. J. ,1957, New Zealand Journal of Science and Technology 23 :23-54. Eden et al.，1996，Plant Pathol. 45 :276-284)。在本發(fā)明中，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)芽枝狀枝孢菌的兩個分離株有效對抗真菌葉病原性疾病如 蘋果黑星病。這兩個分離株是芽枝狀枝孢菌H39和芽枝狀枝孢菌R406，2007年12月13日 保藏于荷蘭Baarn的荷蘭真菌保藏所，保藏號分別為CBS 122244和CBS 122M3。如在本說 明書實驗部分所示，這兩個新分離株對于蘋果黑星病發(fā)展有明確作用，而芽枝狀枝孢菌的 其它分離株沒有任何作用。芽枝狀枝孢菌(Fresen. )de Vries屬于半知真菌(Fungi imperfecti)群，并且 其生長的特征在于當在馬鈴薯-右旋糖瓊脂上于20°C生長7天時產生直徑約3cm的菌落。 芽枝狀枝孢菌的菌落是彌散的，橄欖綠或者橄欖褐色(oliviceous brow)，柔滑(velvety)； 倒置在麥芽瓊脂上綠黑色。分生孢子梗是菌絲粗大的和菌絲細小的，有時長達350 μ，但是 一般短得多，2-6μ厚，淺至柔和橄欖褐色，平滑或者疣狀。分枝分生孢子是0-1分隔的，長 達30 μ，厚2-5 μ，平滑或者偶爾微小疣狀的。分生孢子在長分支鏈中形成，大多數(shù)O-分 隔，橢圓體或者檸檬狀，3-11x2-5 (大多數(shù)3-7x2-4) μ，淺橄欖褐色，最常見平滑，但是一些 ^tt43 ^W (Ellis, Μ. B. ，2001，DematiaceousHyphomycetes)。據(jù)報道一種代謝物，枝孢菌素，起抗真菌作用。此枝孢菌素已被顯示出具有抗生素 性質(Scott, P. Μ. et al.，1971，J. Antibiotics 24:747-755)。但是，如上述討論，在我們 的實驗中發(fā)現(xiàn)不是所有芽枝狀枝孢菌分離株均具有對蘋果黑星病感染的抑制作用。顯然， 或者枝孢菌素對抗蘋果黑星菌是無功能的，或者，更可能的是該真菌的分離株在其枝孢菌 素表達和分泌的表型中有差異?？赡茉贖39和R406對蘋果黑星菌及其它植物病原體的拮 抗作用中也涉及其它作用模式的機制。枝孢菌是葉表面常見的附生于植物的群落建立者，經常以高密度被發(fā)現(xiàn) (Dickinson, 1981)。也報道枝孢菌附生于植物的群落建立是在蘋果葉(Fisset al,2000)和 果實上(Teixido et al.，1999)。枝孢菌這種附生于植物的種群可以有助于天然發(fā)生的內 在生物控制。在這種情況中，保護生物控制(Eilenberg et al.，2001)通過避免對非目標種 群具有副作用的殺真菌劑而保護這種有益種群(Teixido et al. , 1999 ； (Walter et al., 2007)或者甚至選擇性刺激這種天然發(fā)生的有益種群例如通過應用特定的營養(yǎng)素從而可有 助于黑星病的預防。
如實施例中所述，本發(fā)明的兩個分離株顯示出控制蘋果黑星病的明確作用。另外 也提出了不僅蘋果黑星病，還有葉、果實或穗的任何真菌植物病原體均可被所述分離株控 制。所述真菌葉病原體選自如下所組成的組蘋果黑星病(蘋果黑星菌)，梨黑星病(梨黑 星菌)，葉斑病(Blumeriella jaapi)，玫瑰黑斑病(玫瑰雙殼菌/薔薇盤二孢菌)，褐斑病 (囊狀匍柄霉菌)，各種植物如草莓、玫瑰和蘋果的白粉病，黑點煤斑病(仁果粘殼孢菌)，蠅 糞病(Zygophalia jamaicensis)，桃縮葉病(畸形外囊菌)，褐腐病/短枝潰瘍(產果念珠 霉菌，核果鏈核盤菌)，梨銹病(Gymnosporangium sabinae/歐洲膠銹菌)，癌腫病(仁果干 癌叢赤殼菌)，玫瑰黑斑病(玫瑰雙殼菌)，玫瑰銹病(小瘤多胞銹菌/多胞銹菌)，各種植 物中的葡萄孢菌，甘藍中的蕓苔生球腔菌，香蕉中的斐濟球腔菌，蕓苔屬、馬鈴薯和各種其 它植物中的鏈格孢菌，特別是在谷類包括玉米中的鐮孢菌，馬鈴薯的蔓延疫霉菌和葡萄樹 中的葡萄生單軸霉菌，優(yōu)選其中所述真菌葉病原體是蘋果黑星病。在H39情況中看起來該真菌的培養(yǎng)和配制方式對抑制作用有顯著影響。在燕麥粉 瓊脂上產生的芽枝狀枝孢菌H39的分生孢子在果園條件下無效，但是在發(fā)酵罐中燕麥上產 生的那些持續(xù)顯示中等效力。顯微鏡觀察顯示在發(fā)酵罐中燕麥上產生的分生孢子比在燕麥 粉瓊脂上產生的那些更大。生長培養(yǎng)基對拮抗物孢子質量的作用導致在環(huán)境應激條件下更 好的表現(xiàn)，這已在若干其它抗病原體真菌中得到證實，例如在低^-修飾培養(yǎng)基上產生的清 酒假絲酵母菌(Candida sake)細胞(Teixido et al.，1999)。導入真菌在蘋果葉上的群落 建立依賴于導入物種的生物學(Kinkel et al.，1989)。在他們的案例研究中，與出芽短梗 霉菌(A. pullulans)種群相反，導入的球毛殼菌種群在幾天內顯著降低。在下述實驗中，抑 制組合物以3-4天間隔應用以保證在葉上的高種群水平。但是，芽枝狀枝孢菌種群動力學 的最初結果表明在應用H39之后，此種群增加，并且這種處理作用甚至在幾周后仍發(fā)現(xiàn)(見 實施例2)。真菌的配制方式對于應用于植物的組合物中所含有的真菌孢子的生存力很重要。 看起來用葡萄糖作為枝孢菌孢子載體的配制方式比未經配制的真菌表現(xiàn)更好?；蛘?，本發(fā)明的抗真菌組合物可以含有本發(fā)明的一或兩個枝孢菌分離株的提取 物。該兩個分離株的提取物可以按照其它枝孢菌提取物的文獻所述來獲得，并且本領域 技術人員可以輕易地獲得(參見例如Ding，L. et al.，2008，Current Microbiol. ,56 229-235)。此外，所述組合物可以含有噴霧溶液中常用的另外的化合物，如防腐劑、表面活性 化合物、濕潤劑等。組合物中還可以進一步包括抗真菌化合物或生物體以增強抑制作用。在 這種情況中，可以使用較低水平的傳統(tǒng)化學殺真菌劑，由此使得殺真菌劑的量獲得所期望 的降低。如上所述，化學殺真菌劑降低植物病原體真菌的生長，并由此使得枝孢菌實現(xiàn)其作 用的機會延長。因此提出，本發(fā)明分離株與適合的化學殺真菌劑的組合將協(xié)同抑制真菌葉 病原體，由此超出了各個作用的簡單加合。本發(fā)明的分離株與任何其它微生物真菌葉病原 體拮抗物的組合也可用于本發(fā)明。本發(fā)明另一實施方案是控制葉、果實和穗上真菌病原體的方法，包括用本發(fā)明組 合物處理所述植物。在這種方法中，植物在被植物葉病原體感染之前或之后用本發(fā)明組合物進行噴 霧。感染之前噴霧將可用于預防感染。盡管，如果分離株的孢子不是完全有活性的，這種過敏性噴霧應定期重復進行。如果孢子有足夠活性，則枝孢菌分離株將能夠在植物的葉圈中 生長，由此通過預防感染及減少病原體孢子形成而提供持久保護，因此而減緩流行病。另 外，所述枝孢菌分離株會減少過冬蘋果葉中子囊孢子產生及減少其它植物病原體殘余物中 孢子的子囊孢子產生，從而導致接下來季節(jié)中較少的疾病。一旦發(fā)生感染，噴霧應定期進行以有效控制該疾病。用本發(fā)明組合物進行的處理即可以在收獲前進行，即當果實仍在植物上時，也可 以在收獲后進行。實驗部分顯示收獲后處理也能有效對抗真菌感染。本發(fā)明另一實施方案是本發(fā)明的枝孢菌菌株或者本發(fā)明的組合物在預防或治療 真菌葉病原體感染中的應用。 本發(fā)明另一個實施方案是上述枝孢菌菌株或者本發(fā)明的組合物用于控制真菌葉 病原體感染。
實施例實施例1體外及田間試驗2006材料和方法候選拮抗物收集2004年9月從荷蘭、比利時以及德國西北部和中部的216處地點收集黑星病感 染的蘋果葉。取樣地點由GPS記錄。大多數(shù)樣品由10-50片葉子組成，源自老的標準枝條 (old standard tress)或者沒有任何種植管理的廢棄果園。從每個樣品中，將具有形成孢 子的蘋果黑星病菌菌落的綠葉在保濕室中于20°C溫育3天。之后，將蘋果黑星病菌菌落以 10-60倍放大進行視覺觀察不同于蘋果黑星菌的真菌發(fā)育。用無菌針從菌落的地上部分分 離真菌菌絲體或孢子并轉移至燕麥粉瓊脂QOg燕麥粉、15g瓊脂、IOOOml自來水)和V8瓊 脂(200ml V8汁、3g CaC03、20g瓊脂、1000ml自來水)，二者均含有IOOmg Γ1鏈霉素和15mg Γ1四環(huán)素。從發(fā)育中的菌落制備純培養(yǎng)物。候選拮抗物的預篩選使用快速通量系統(tǒng)首先檢查候選拮抗物的潛在風險及開發(fā)生物控制產品的經濟 可行性。棄用屬于曲霉菌屬、青霉菌屬或鐮孢菌屬的真菌，因為這些屬中各種物種產生真菌 毒素的潛力。將菌絲真菌的其余分離株在培養(yǎng)皿中燕麥粉瓊脂上于18°C培養(yǎng)21天，并且每 天12小時不可見光；將酵母在基礎酵母瓊脂(IOg細菌蛋白胨、Ig酵母提取物、20g葡萄糖、 20g瓊脂、IOOOml自來水)上于18°C培養(yǎng)5天。對于每種分離株，在用含有0. 01 % Tween80 的無菌自來水制備懸液后，用血球計輔助確定每個平板孢子或酵母細胞的產生。每個平板 產生少于IxlO5個孢子或酵母細胞的分離株被丟棄。將10 μ 1所述懸液一式二份鋪板于含 有1. 5ml麥芽瓊脂(Ig麥芽提取物、15g瓊脂、1000ml自來水)直徑16mm的無菌孔中。將 具有經接種孔的不同平板在5、18和36°C于黑暗中溫育14天。將另一具有含麥芽瓊脂的孔 的平板在18°C溫育14天，所述麥芽瓊脂通過加入KCl2調節(jié)至大約-10和-7MPa。檢查孔的 真菌生長，并丟棄在36°C產生菌落的真菌及在5°C或者在-10或-7MPa不產生菌落的真菌。 將其余分離株在馬鈴薯右旋糖瓊脂上(0Xoid，39g，IOOOml自來水)于4°C儲存?zhèn)溆谩Ｕ婢臃N體的產生蘋果黑星菌單孢子分離株MB 363B的分生孢子得自M. Bengtsson, RoyalVeterinary and Agricultural University, Frederiksberg C, Denmark,將其根據(jù) Williams的方法(1976)產生。具有40ml馬鈴薯右旋糖培養(yǎng)液Γ1)的Duran培養(yǎng)瓶 (500ml)，瓶內表面上鋪有大小為10x25cm的干酪布紗布(wick)，其下部接觸培養(yǎng)基，將所 述培養(yǎng)瓶高壓滅菌并用250 μ 1蘋果黑星菌菌絲體片段懸液接種，該懸液通過用無菌水將 在馬鈴薯右旋糖瓊脂上生長的真菌培養(yǎng)物淹沒并輕輕用無菌橡膠抹刀摩擦而制備。將經過 接種的瓶在18°C于黑暗中溫育。在最初4天，將瓶以水平姿態(tài)溫育，從而使大部分紗布被培 養(yǎng)液所覆蓋，之后將培養(yǎng)瓶以直立姿態(tài)溫育。在第2、7和11天小心地轉動瓶以將具有生長 中菌絲體的培養(yǎng)液分布在整個紗布表面上。14天后，將營養(yǎng)培養(yǎng)液倒出，并加入200ml無菌 自來水，用手充分搖動瓶幾分鐘。將所得分生孢子懸液通過具有200 μ m篩孔(mesh)的無 菌尼龍網過濾，并以5800g在6°C離心30分鐘。將具有分生孢子的沉淀重懸于自來水中； 用血球計輔助確定分生孢子濃度并通過加入無菌自來水將其調節(jié)至切105個孢子πιΓ1。將 懸液儲存在_18°C備用。產量大約為每瓶3xl06個分生孢子。對于篩選實驗，將菌絲真菌的候選分離株在燕麥粉瓊脂上于18°C生長觀天，并且 每天12小時不可見光；將酵母在基礎酵母瓊脂上于18°C生長5天。孢子或酵母細胞的懸 液如下制備用含有0. 01% Tween 80的無菌自來水將培養(yǎng)物淹沒，輕輕用無菌橡膠抹刀摩 擦，并通過具有200 μ m篩孔的無菌尼龍網過濾。用血球計輔助確定懸液濃度，并通過加入 含有0.01% Tween80的無菌自來水將濃度調節(jié)至IxlO6個孢子或細胞πιΓ1。為在果園中進行應用，以相同方式產生真菌，但是將濃度調節(jié)至hlO6孢子πιΓ1。2 個分離株的分生孢子也在發(fā)酵罐中產生，干燥并配制成可濕性粉劑并在5°C儲存。經干燥 的分生孢子的生存力在開始田間實驗之前在瓊脂上確定。將分生孢子懸液的濃度調節(jié)至 hlO6活分生孢子πιΓ1。應用到田間的懸液中孢子的生存力總是通過將懸液噴霧在補加了 15mg Γ1四環(huán)素和IOOmg Γ1氯霉素的麥芽提取物瓊脂(每升Ig麥芽提取物)上來進行再 次檢查，并在20°C溫育M小時后評估萌發(fā)孢子的百分比。幼苗測驗將蘋果栽培種Golden Delicious 的種子(G. J. Steingaesser & Comp. GmbH, Miltenberg, Germany)播種在潮濕沙土中并在4°C于黑暗中進行層積(stratified)6周。 之后，使種子進一步在潮濕沙土中于室溫和日光下生長。大約14天后，將幼苗移植到盆裝 土壤中，每盆(6cm見方，8cm高)1個幼苗。使幼苗以18°C、16小時光照和12°C、8小時黑暗 的循環(huán)生長觀天。用于實驗中的植物具有至少4片完全展開的葉子。將幼苗用蘋果黑星菌分生孢子懸液(ΙχΚΛιιΓ1)噴霧直至流出(rim-off)并將其 置于保濕室中，該保濕室由透明塑料蓋密封的塑料盤組成。在15°C具漫射光溫育2天后，將 蓋子從盤移除，并將幼苗進一步在85% RH、15°C及每天16小時光照條件下溫育3或4天。之 后，將經過蘋果黑星菌接種的幼苗用上述所找到的分離株懸液或者作為對照的含有0. 01% Tween 80的水進行噴霧。每樣處理的每份重復中使用2個幼苗。將有2個經接種幼苗的組 置于模塊設計(block design)中的聚乙烯棚內，該模塊設計具有6個模塊(重復)及模塊 內完全隨機化。避免與相鄰植物葉或聚乙烯接觸。使幼苗在15°C生長9-12天，每天16小 時 138 μ Es^iT2 光照。從每個重復的兩個幼苗上小心地取下最低的5片真葉(實驗1-5)或者在實驗開 始時最幼的剛剛展開的葉(用金屬環(huán)標記；“幼葉”)及3片僅次的較老葉(實驗6-14 ；“老葉”)。將葉的每個重復組合中的葉匯集起來，放入Duran瓶中(IOOml)，對于含有2片最幼 葉的樣品所述Duran瓶含有15ml具有0.01% Tween 80的自來水，而對于含有10片(實驗 1-5)或者6片(實驗6-14)葉的樣品所述Duran瓶含有30ml。用搖床以7000CS mirT1搖 動瓶。用血球計輔助確定每個懸液中蘋果黑星菌分生孢子的濃度。葉的每個重復組中葉表 面用面積計量儀(Li-COR Biosciences, model 3100，Lincoln, U. S. Α.)測量。果園測驗在荷蘭Randwijk有機管理的果園內的幾排var. Jonagold在2006年春天和夏天 進行了修剪，從而使樹木長出新枝，所述新枝上具有高度易感于蘋果黑星菌的幼葉。根據(jù)樹 木發(fā)育和生長條件，在一組樹木用于實驗前大約3-5周對樹木進行修剪。樹上大部分幼果 實也被移除以刺激新枝發(fā)育。用于早夏實驗(實驗1-4)中的樹木在2006年未進行黑星病 控制處理。用于7月中之后晚期實驗的樹木用有機果園在早季常用的硫磺方案處理以減緩 黑星病流行，但是在實驗前至少3周和實驗過程中保持未被處理。進行了一系列8個實驗，每個實驗基于不同樹木組。對于每個實驗，根據(jù)每棵樹新 產生枝的數(shù)目，選擇2-6棵樹用于6個模塊(重復)的每一個。在每個模塊內，進行7個處 理。對于每個處理(每個重復)，使用在同一分枝上產生的3個枝。枝用有色金屬環(huán)標記， 從而使得在第一次處理當天完全展開的2個最幼葉后來能夠與該枝的其它葉區(qū)分開。處理 由以下組成將作為對照的含有0.01% Tween 80的自來水或者拮抗物芽枝狀枝孢菌H39 新產生孢子的懸液進行噴霧。用發(fā)酵罐所產生的孢子進行獨立處理，所述孢子被配制成干 粉并重懸于含有0. 01% TffEEN 80的自來水中。用壓縮式氣動背負式噴霧器在2501tfa進 行噴霧直至流出。在2006年6月22日至9月觀日期間進行了不同實驗。對于在蘋果黑 星菌感染期之后1-3天由第一次處理而開始的實驗已根據(jù)Mills表格基于葉濕潤期和溫度 而進行了預測。8個實驗的開始日期為2006年6月22日，6月29日，7月6日，7月31日， 8月3日，8月7日，8月21日，8月M日，和8月M日。在實驗8中，將預期的感染期與第 一次應用之間的時間延長至10天，但是葉在預期的感染期后1-3天已經進行了標記，與其 它實驗中一樣。在所有實驗中，后續(xù)處理以3-4天間隔來進行。在前3個實驗中，在第一次 處理后18天(因此是在預期的感染期后19-21天)對葉進行了取樣。在實驗4-7中，在第 一次處理后M-25天(因此是在預期的感染期后25- 天)對葉進行取樣以增加蘋果黑星 菌孢子形成的時間及可能的拮抗相互作用的時間。在實驗8中，在第一次應用后M天并因 而在預期的感染期后34天對葉進行取樣。在每個實驗中，對屬于同一個重復的3個枝，將在實驗開始時完全展開的2片最幼 葉與2片僅次的更幼的葉(在實驗期間展開)一起進行匯集，從而使樣品由12片葉組成 (“幼葉”)。從同一枝，根據(jù)枝大小還取樣了僅次的較老的3-12片葉并匯集起來，從而使 樣品由9-36片葉組成(“老葉”)。在不同實驗中取樣的老葉的平均數(shù)是21. 8。將幼葉樣 品置于250ml玻璃瓶中。在2小時內，加入100-150ml (根據(jù)葉的數(shù)量)含有0. 01 % Tween 80的自來水，并將瓶用搖床以7000CS mirT1搖動10分鐘。老葉樣品以相同方式處理，其使 用在搖動前加入150-350ml (根據(jù)葉的數(shù)目)自來水的IOOOml塑料瓶。從獲得的懸液中， 將6ml子樣品儲存在_18°C。對于每個懸液的蘋果黑星菌分生孢子濃度用血球計來輔助確 定。用面積計量儀測量每個樣品的所有葉的葉表面。統(tǒng)計學
計算每個重復的cm—2葉所產生的蘋果黑星菌分生孢子數(shù)。如果未檢測到分生孢 子，則設定檢測極限為分生孢子懸液中計數(shù)1個分生孢子，導致各種實驗的平均檢測極限 為大約100個分生孢子CHf2，例如根據(jù)各個重復的葉表面，對于在控制條件下進行的前3個 實驗，其范圍為74-212cm_2之間。將2個不同葉年齡所獲得的數(shù)據(jù)進行自然對數(shù)轉換，并用ANOVA對每個葉齡單獨 分析。在控制條件下進行的實驗用下述方法單獨分析，即用未保護LSD-檢驗(α =0.05) 來比較對照處理和個別的拮抗物處理的平均值。由于ANOVA的P-值經常大于P = 0. 05，未 進行拮抗物處理之間進一步的多重比較(Ott and LongneckerJOOl)。對于田間實驗，將針 對2個不同葉齡所獲得的經自然對數(shù)轉換的數(shù)據(jù)用模塊設計經ANOVA來對每個葉齡進行單 獨分析，其中個別實驗被認為是主模塊，而各處理在每個實驗的6個重復模塊中是隨機化 的。指示出了統(tǒng)計學上顯著的處理作用(保護LSD-檢驗；α =0.05)。結果從蘋果黑星菌菌落分離真菌及預篩選不同于蘋果黑星菌的真菌的生長經常在病原體正形成孢子的菌落中觀察到，并獲 得了幾百個真菌分離株。根據(jù)菌落外觀分組分離株，并且在預篩選中總共對148個代表各 種菌落類型的分離株進行了測試。148個分離株中的131個在每個平板產生超過IxlO5個 孢子或酵母細胞并且在不同溫度及水勢下生長。從這剩余的131個分離株中，所有均能夠 在5°C生長；16個在-10MP不生長。14個在36°C生長且其中一個分離株在WP = -IOMPa不 生長。因為許多這類具有優(yōu)選特征組合的分離株屬于枝孢菌，所以僅在幼苗上測試了這組 中隨機選擇的分離株的亞集。總共102個分離株中的63個進一步在蘋果幼苗的生物測驗 中進行了測試。幼苗測試在幼苗上進行了 14個實驗。在前5個實驗的對照處理中，該幼苗的5片最幼葉上 產生的分生孢子是平均3596個分生孢子cnT2，并且在不同實驗中范圍為1339和10509個分 生孢子cm_2(逆轉換(kicktransformed)值)之間。由于分生孢子的產生在最幼葉上很高， 而在老葉上少得多，所以決定在后續(xù)實驗中對此類葉單獨進行取樣。在實驗6-14中，幼葉 上的平均分生孢子接合為觀96個分生孢子cm_2并且對于不同實驗其范圍介于7 和6186 個分生孢子cm—2 (逆轉換值)之間。對于老葉，平均分生孢子接合是453個分生孢子cm—2并 且對于不同實驗其范圍介于144和1313個分生孢子cm_2 (逆轉換值)之間。分生孢子接合 中的差異不僅在實驗之間很高，而且在試驗內重復幼苗組之間也很高。在幼苗上測試的80個候選分離株的大多數(shù)不在統(tǒng)計學上顯著降低蘋果黑星菌的 分生孢子接合。一個分離株，芽枝狀枝孢菌H39，引起幼葉或老葉上蘋果黑星菌的顯著降低， 這可在后續(xù)獨立實驗中重復。然而，芽枝狀枝孢菌H39這種拮抗物的功效(基于幼葉的逆 轉換值計算)在測試其的實驗中在55-79%之間變化，并且在一些情況中分生孢子接合降 低在統(tǒng)計學上不顯著(表1)。還有幾個分離株在一個實驗中顯示出強的統(tǒng)計學顯著性拮抗 作用，但是此作用不能重復。此類分離株屬于出芽短梗霉菌、芽枝狀枝孢菌、豌豆腳腐病菌 (P.pinodella)和枝孢菌。在應用候選分離株后無一例觀察到蘋果黑星菌分生孢子接合的 顯著增強。果園測試2006
在6月22日開始第一個實驗之前，果園中蘋果黑星病溫和發(fā)展。在6月和7月上 半月，干燥條件伴隨白天溫度經常超過30°C不利于蘋果黑星病進一步發(fā)展。之后，下雨及陰 冷天氣對于蘋果黑星病是非常有利的，直至實驗結束。在干燥及溫暖條件下進行的前3個實驗期間，在水處理的對照樣地(plot)中，在 幼葉上發(fā)現(xiàn)2. 1-12. 8x1000個分生孢子cm—2 (逆轉換值)，在老葉上發(fā)現(xiàn)9. 5-40. 3x1000 個分生孢子cm—2 (表2A、B)。在7月中天氣變得潮濕和陰冷之后，在實驗4中幼葉上發(fā)現(xiàn) 46. 3x1000個分生孢子cm_2及在來自對照處理的葉上發(fā)現(xiàn)9. 8x1000個分生孢子cm_2。在后 續(xù)實驗期間，在實驗8中分生孢子數(shù)增加到在幼葉上227. 3x1000個分生孢子cm_2和老葉上 132. 1個分生孢子cm_2。對于每個懸液，在田間噴霧的一個瓊脂平板上評估了在所述系列實驗過程中25 個應用日所應用的孢子生存力。枝孢菌H39的生存力是92% (范圍為82-99% )。芽枝狀 枝孢菌H39經配制孢子的生存力在實驗開始時是大約47%。當制備孢子懸液用于田間應用 時，芽枝狀枝孢菌H39經配制的孢子在噴霧懸液中形成由大約5-50個孢子組成的簇，從而 不可能精確確定孢子萌發(fā)。在11個應用中噴霧的懸液的大多數(shù)簇顯示了真菌生長。8月10 日和8月四日之間應用的孢子簇僅有幾個顯示了真菌生長。可以推定在實驗4期間最后 一次處理及實驗5和6期間所有處理中，使用了在儲存期間喪失其活力的儲存的經配制孢 子。從8月末起，使用了新的一批配制孢子，其中大多數(shù)孢子簇顯示了真菌生長。當對每個 實驗單獨分析數(shù)據(jù)時未發(fā)現(xiàn)顯著的處理作用。對于整體分析，實驗1、5和6被排除，因為在 實驗1期間沒有存活的配制芽枝狀枝孢菌H39，而在實驗5和6期間生存力低。對于用配制 的芽枝狀枝孢菌H39進行的處理在幼葉和老葉上均發(fā)現(xiàn)了分生孢子數(shù)cm—2的顯著降低(表 2B)。分生孢子產生平均在幼葉上降低42%，而在老葉上降低38%。這種趨勢在低疾病壓 力下進行的前3個實驗期間以及在極高疾病壓力下進行的最后2個實驗期間均有發(fā)現(xiàn)。該 分離株未配制的孢子未降低蘋果黑星菌的分生孢子接合。當含有很少或甚至沒有活分生孢 子的芽枝狀枝孢菌H39配制物在實驗5和6期間被應用時，未發(fā)現(xiàn)配制物本身對分生孢子 接合具有任何降低作用的趨勢(表2A)。實施例2果園測試2007材料和方法真菌接種體芽枝狀枝孢菌H39如實施例1產生。配制的產品含有2. OxlO9個孢子生存力 為20%。在實驗期間，將配制的H39批次在4°C、黑暗中儲存在塑料袋中。懸液通過將經配 制的顆粒加入到Tween水(0.01%)中并攪拌而進行制備，無任何進一步預處理。終濃度是 IxlO7個孢子πιΓ1，等價于hlO6活孢子πιΓ1。芽枝狀枝孢菌R406的孢子在培養(yǎng)皿中燕麥粉瓊脂OOg燕麥粉、15g瓊脂、1000ml 自來水)上于20°C、每天12小時不可見光而產生。溫育2周后，將孢子懸浮于含有0.01% Tween 80的自來水中，并加到平板中。該懸液經紗布QOO μ m篩孔)過濾以除去菌絲體細 胞，而孢子數(shù)用血球計計數(shù)。孢子產量是每個瓊脂平板(90mm直徑)8-30xl08個孢子，平 均生存力為93%，對不同日期制備的懸液范圍為73-97%。應用到田間的懸液中的孢子的 生存力總是通過以下方法進行檢查將懸液噴霧到果園中的麥芽提取物瓊脂(Ig麥芽提取 物、15g瓊脂、IOOOml自來水，補加15mg Γ1四環(huán)素和IOOmg Γ1鏈霉素)上并在18°C溫育24小時后評估萌發(fā)孢子的百分率。果園實驗在荷蘭Randwijk有機管理果園內的3排var. Jonagold中進行。實驗目的是 通過在6月末開始應用拮抗物來控制蘋果黑星菌(Vi)的夏季流行。因此，重要的是允許在 主要季節(jié)(primary season)期間果園中開始輕度至中度流行。應用硫的時機以這樣方式 預見，即可以發(fā)生子囊孢子初次感染但是可以控制流行進展。5月末之后未計劃硫磺的應 用。2007年主要季節(jié)期間的異常天氣條件即4周無雨非常不利于Vi子囊孢子的釋放和感 染。在4月后天氣變得更有助后，發(fā)展出了輕度蘋果黑星病流行直至實驗開始。未進行硫 處理以降低流行進展。實驗設計、處理及評估在具有6個模塊的設計中進行實驗，在3排樹的每排中有2個模塊。每個模塊由 4塊樣地組成，每塊樣地有4棵樹。在樣地之間，2棵未處理的樹作為緩沖。不同處理隨機 分配給這些樣地。計劃用如下處理對每塊樣地的4棵樹進行噴霧，速率為每塊樣地2升，每 周兩次(1)作為對照的補加了 Tween 80(0. 01% )的自來水；(2)配制的H39懸液(2xl06 個孢子ml—1) ； (3)配制的R406懸液QxlO6個孢子ml—1)。在6月觀日和8月20日之間 的16個日期每周進行2次應用，該應用使用具有an懸臂和一個噴嘴(Birchmeier helico saphir 1. 2，2F-0. 6 ；壓力250kPa)由壓縮空氣操作的手持式噴霧器(AZO，Edecon，Ede，The Netherlands) 0因為在實驗開始時沒有配制的R406孢子可用，處理( 用在實驗室新產生 的孢子進行每次應用。R406每周應用2次延遲到7月12日開始，從而此真菌只在12個日 期應用。因為未產生足夠的孢子，因此只有經選擇和標記的嫩枝獲得了多次噴霧，而非對整 棵樹處理。評估分生孢子產生.分生孢子產生在實驗過程期間發(fā)育出來的易感幼葉上進行評估， 對于作為對照的經Tween-水處理或者經H39的分生孢子懸液處理的葉在3個取樣日進行 評估，而對R406則在2個取樣日進行評估。選擇取樣日從而使得在預期的感染期間呈現(xiàn)的 易感葉組在感染期后大約5周進行取樣?；谌~濕潤期和溫度的Mills表被用于預測感染 期。對于每個取樣，在每塊樣地中屬于同棵樹的一組3個嫩枝上剛剛展開的第二最幼葉在 預期的感染期后1-3天被標記。5周后，在標記日剛剛展開的2片葉及在標記后展開的僅次 的2片更幼葉被取樣，產生由每塊樣地12片葉組成的樣品。將葉樣品置于250-ml玻璃瓶 中。在2小時內加入100-150ml (根據(jù)葉的數(shù)量)含有0.01 ^Tween 80的自來水，并將瓶 用搖床(Stuart Scientific SF1，UK)以700 OCS mirT1搖動10分鐘。從所獲得的懸液，將 6ml子樣品儲存在_18°C，并且每個懸液的Vi分生孢子的濃度后來用血球計輔助確定。用 面積計量儀(Li-COR Biosciences, model 3100, Lincoln, U. S. Α.)測量每個樣品所有葉的 葉表面。取樣日是8月6日(葉標記在7月2日)、8月16日(葉標記在7月12日)和8 月20日(葉標記在7月16日)。附生于植物和內生于植物的群落建立.在10月4日從每塊樣地收集20片經標記 的葉，所述葉來自用Tween-水(對照)或Η39的孢子懸液處理過的樹以及用R406的孢子 懸液處理過的嫩枝。所有取樣的葉均在6月觀日和8月20日期間在樹上長出，期間進行了所述的系列噴霧應用。因此可以推定所有葉在幼年發(fā)育階段均獲得一或幾次孢子應用。用corlibohrer從每片葉切下一個葉盤(leaf disc)(直徑9mm)。將每個樣品所 得的20個葉盤匯集在含有IOml無菌Tween-水(0. 01% )的無菌50ml小瓶中，并將小瓶 用搖床以高速(700 OCS rniiT1)搖動10分鐘。從所得懸液制備系列稀釋液(1 10)并將 100 μ 1未稀釋和稀釋的懸液鋪板在2個瓊脂平板的每一個上，所述瓊脂平板含有麥芽瓊脂 (IOg麥芽提取物、15g瓊脂、IOOOml自來水)并補加了 IOOmg Γ1鏈霉素和15mg Γ1四環(huán)素。 將平板在20°C黑暗中溫育，并在4、7和11天后計數(shù)枝孢菌、其它菌絲真菌及酵母的菌落。 從所述菌落計數(shù)計算每個樣品cm—2葉表面的菌落形成單位(CFU)數(shù)。在搖動葉盤除去以附生于植物而存在的真菌后，將所匯集的每個樣品20個葉盤 進行表面無菌化并在5ml無菌水中用研缽勻漿。為進行表面無菌化，將葉盤浸入96%乙醇， 接著在0.5%次氯酸鈉中浸沒1分鐘，隨后用無菌水清洗3次。從所得勻漿在無菌水中制備 系列稀釋液(1 10)并將100 μ 1未稀釋和稀釋的懸液鋪板在2個麥芽瓊脂平板的每一個 上，所述平板含有IOOmg Γ1鏈霉素和15mg Γ1四環(huán)素。如上所述溫育平板并評估內生真菌 菌落。統(tǒng)計學計算每個重復樣品的每cm2葉表面產生的Vi分生孢子數(shù)。針對兩種葉齡，用單側 未保護LSD-檢驗(α = 0. 05)將對照處理經自然對數(shù)轉換的值分別與個別的拮抗物處理 進行比較。經對數(shù)轉換的每cm2葉表面的CFU數(shù)用ANOVA及隨后的雙側LSD-檢驗(α = 0. 05)分析。結果實驗期間經常下雨及適中溫度的天氣條件對于蘋果黑星病是非常有利的。在實驗 開始時，果園中僅存在輕微癥狀。在結束時在實驗樣地中及相鄰區(qū)域的樹葉上觀察到重黑
星病癥狀。對于每個應用日新鮮產生的R406的孢子具有高萌發(fā)率，一般在80 %以上(表3)。 Η39配制的孢子在實驗第一周萌發(fā)20-30%，但是最后4次處理萌發(fā)降至4_16%。在第一個 噴霧日例外的76 %的高孢子萌發(fā)值可以由實驗差異解釋，該實驗差異是由于在果園條件下 僅噴霧1個平板的小樣品量所致。在8月6日、8月16日和8月20日從經水處理的樹木所取樣的葉上平均產生 77，200(13，900-139，800)、45，300(35，200-55，200)和 32，200(8，800-111，800)個分生孢 子cm—2(逆轉換的平均值，括號中為6個重復的范圍；圖幻。重復之間的差異因此是相當高 的。在用H39處理的樹木的葉上，孢子數(shù)在統(tǒng)計學上顯著較低，在第一個取樣日為24，200個 分生孢子cm_2 (降低69 % )，在第二個取樣日為22，000個分生孢子cm_2 (降低51 % )。對于 最后一個取樣日，H39未觀察到處理作用。對于可獲得用R406處理的葉的取樣日，用R406 處理的葉在8月16日的分生孢子計數(shù)是24，300個分生孢子cm_2，導致分生孢子在統(tǒng)計學 上顯著降低46%。8月20日僅觀察到15%的降低，并且計數(shù)與對照處理無差異。未觀察到對葉發(fā)育或植物毒性癥狀的處理作用。接近落葉時，對葉的內生于植物和附生于植物的群落建立進行評估，其是通過將 葉洗滌液和表面無菌化的葉勻漿鋪板在瓊脂上并計數(shù)菌落形成單位(CFU)而進行的。枝孢 菌內生于植物的群落建立顯著更高，而枝孢菌附生于植物的群落建立對于在夏季已用H39處理的葉趨于更高。其他菌絲真菌在經H39處理的葉的內生于和附生于植物的群落建立趨 于比未處理葉更低。酵母附生于植物的群落建立在經H39處理葉中顯著更低。實施例3田間試驗2005/2006材料和方法實驗設計和處理在2005年秋天，將包括芽枝狀枝孢菌R406的屬于不同物種的25個真菌分離株應 用于來自荷蘭Randwij有機管理的果園的蘋果樹葉，并將經過處理的葉置于果園地面直至 下一個春天。候選者的選擇是基于針對經濟可行性和可能風險所進行的預篩選的結果(見 實施例1)。分離株R406的孢子在燕麥粉瓊脂上產生(在18°C溫育觀天)。通過用含有 0. 01% Tween 80的無菌水淹沒瓊脂上的培養(yǎng)物來制備孢子懸液(每個分離株500ml)。輕 輕用橡膠抹刀摩擦以從真菌培養(yǎng)物中移出孢子后，將懸液通過200 μ m篩孔的無菌尼龍網 過濾。用血球計幫助確定懸液濃度并調節(jié)至&106個孢子ml—1。用加壓空氣操作的手持式 噴霧器進行噴霧應用。10月17日從樹上收集延伸枝(extension shoots)的葉以在溫室隔 間中在控制條件下進行噴霧應用。在摘取葉和將葉再次固定在果園地面上的網中之間的期 間，將葉儲存在5°C。10月18和19日將葉固定在網中，每個具有40片隨機選擇的葉。10 月20日用孢子懸液或水噴霧具有每個處理的每個重復的葉的4個網，兩面大約20ml懸液 (或者對照處理中用水)。各含40片葉的兩個網指定用于確定蘋果黑星菌的潛在子囊孢子 產生，另外兩個網用于經TaqMan-PCR確定蘋果黑星菌種群密度。在應用后，在大約30分鐘 內再次干燥葉。具有經處理葉的網在10月21日固定在Randwijk有機果園內果園地面上 的裸露土壤上。在果園不同排中有6個模塊(重復)。還將每個孢子懸液噴霧在瓊脂平板上(1/10麥芽瓊脂)。將平板在18°C溫育2天， 并確定萌發(fā)率。R406的孢子具有> 90%的生存力。評估2006年1月23、24、25、30和31日分別在果園中收集指定用于經TaqMan-PCR對 蘋果黑星菌種群密度進行定量的重復1-6的網，小心用自來水清洗以除去附著的土壤并在 室溫干燥過夜。將每個處理的每個重復的2個網的葉殘余物從網中取出，切成l-2cm小片， 將5-10g樣品凍干并隨后在具有Imm目篩(mash sieve)的實驗室磨中研磨成粉。粉末化 樣品儲存在-18°C。提取DNA并用物種特異性實時PCR(TaqMan-PCR)對蘋果黑星菌DNA進 行定量。在3月20日(模塊A)、3月22日(模塊B)、3月27日(模塊0、3月四日(模 塊D)、4月3日(模塊E)和4月5日(模塊F)，收集果園中的網以在水中通過空氣鼓泡提 取子囊孢子后定量潛在子囊孢子產生。將每個處理的每個重復的2個網的葉殘余物風干 (20°C,70% RH，2天)，并確定重量。隨后，將每個樣品經風干的葉殘余物最多7-17g的子 樣品鋪在塑料盤中的濕濾紙上。盤用塑料袋覆蓋，并將葉殘余物在這些保濕室內于黑暗中、 20°C溫育7天，隨后每天12小時光照在20°C溫育14天以使子囊(大部分)成熟。使用不 同氣候室進行溫育，但是屬于同一模塊的葉總是在相同室中溫育。溫育后，將葉殘余物轉移至根據(jù)葉殘余物的量含有150-350ml水的IOOOml塑料瓶 中。將空氣(每小時250升)鼓泡通過水而在2小時期間產生大量湍流。之后，將所得懸 液過篩(Imm篩孔)以除去葉碎片。該懸液的2個子樣品(8ml)儲存在_20°C。懸液中的子囊孢子濃度用血球計經顯微鏡確定。子囊孢子產生表示為(在秋天原始固定在果園地面上 的)每80片葉的產量或者每克春天取樣日所存在的風干葉殘余物的產量。每80片葉的子 囊孢子產量是對分解和子囊孢子產生進行處理的可能作用的結果。統(tǒng)計學子囊孢子數(shù)所獲得的數(shù)據(jù)經對數(shù)轉換(Iogltl)。所有數(shù)據(jù)均經ANOVA分析。將對照 處理及個別拮抗物處理的平均值用LSD-檢驗(α =0. 05)進行比較。由于ANOVA的P值 經常大于P = O. 05，所以沒有進一步進行拮抗物處理之間的多重比較。結果通過使用物種特異性引物對和探針的實時PCR(TaqMan-PCR)對在2006年1月末 取樣的葉殘余物中的蘋果黑星菌DNA量進行定量。計算了來自80片葉所留下的總殘余物 中的蘋果黑星菌-DNA總量。用芽枝狀枝孢菌R406處理的葉殘余物與未處理對照相比具有 顯著更低的蘋果黑星菌-DNA (表6)。在春天葉上產生的子囊孢子數(shù)很高，來自對照處理的80片葉的殘余物平均為 7.切105(逆轉換值)(表7)。對照處理中每克葉殘余物產生3.虹104個子囊孢子(表8)。 對于用分離株芽枝狀枝孢菌R406處理的葉殘余物，子囊孢子計數(shù)要低大約70%。對照處理 和用R406處理之間的這些不同對于80片葉殘余物上產生的子囊孢子數(shù)及每克葉殘余物產 生的子囊孢子數(shù)均是在統(tǒng)計學上顯著的(表7和8)。沒有其他用不同候選拮抗物進行的處 理是趨于導致子囊孢子降低的。實施例4在果園條件下芽枝狀枝孢菌Η39對蘋果黑星菌分生孢子產生的作用目的在2006和2007年條件下進行的實驗中，中試配制為水可分散粒劑(WG)的拮抗物 芽枝狀枝孢菌Η39分生孢子的應用在果園條件下降低蘋果黑星病病原體蘋果黑星菌的分 生孢子產生(見實施例1和2)。2008年進行的實驗的目的是在另一個季節(jié)中證實這些結 果以及對于在蘋果黑星菌預期的感染期后應用拮抗物的最佳時機獲得最初的深入了解。Η39的分生孢子的產生為了在果園中應用，在德國I3ROPHYta Biologischer Pflanzenschutz GmbH 的 Solid-State Fermentation(SSF)系統(tǒng)中產生芽枝狀枝孢菌H39的分生孢子。將所收獲的 分生孢子配制成水可分散粒劑(WG)。為保持產物質量，將最終產物儲存在4°C。干燥的分 生孢子的生存力在田間實驗開始前在麥芽提取物瓊脂上(Ig麥芽提取物Γ1)確定。在20°C 溫育M小時的分生孢子具有比分生孢子最小直徑一半要長的芽管則被認為是存活的。果園測驗實驗在荷蘭Randwijk的Applied Plant Research的有機管理果園中于8年樹齡 的cv Jonagold樹木上進行。該實驗目的是通過應用拮抗物來控制蘋果黑星病的夏季流 行。因此，重要的是允許在主要季節(jié)果園中流行病起始。2008年主要季節(jié)的天氣條件有利 于黑星病發(fā)展，而許多黑星病癥狀在6月初在果園中發(fā)現(xiàn)。6月22日一場嚴重冰雹嚴重損 壞了果園。6月M日和沈日，在整個果園及相鄰果園中以每100升水140ml的比率應用 Topsin-M(a. i. 500g ^ Γ1, Certis Europe B. V. ，Maarsen,^^ ) ( VX 10001 ha—1 應用)以預防由歐洲果樹癌腫病(仁果干癌叢赤殼菌)導致的傷口感染。在實驗之前或期 間未再進一步進行降低黑星病流行進展的殺真菌處理。在接下來幾周中，樹木產生大量具有新葉的新枝。將這些新形成的未被冰雹損壞或者未接觸殺真菌劑噴霧的葉用于實驗中。將實驗安排在具有6個模塊的設計中，其中在同一排樹中有2個模塊。每個模塊由 3塊樣地組成，每塊有4棵樹。在樣地之間，2棵未處理的樹作為緩沖。下述3種不同處理隨 機分配給所述樣地(1)未處理的作為對照；( 經配制的H39分生孢子懸液OxlO6個活分 生孢子πιΓ1 ；每塊樣地2升)。以2ml Γ1比率將噴霧添加劑Trifolio S-forte (Trifolio-M GmbH, Lahnau，德國)加入到懸液中以改善葉表面上的噴霧層。在7月22日、7月24日、7 月觀日、7月31日、8月5日、8月7日、8月11日和8月18日進行每周兩次的H39應用。 (3)第三種處理由以0.4% (400g/1001水，10001 ha—1)比率每周應用硫(Thiovit-Jet, Syngenta Crop Protection B. V.，Roosendaal，荷蘭；a. i. 80%硫磺)所組成。硫處理在 7 月22日、7月觀日、8月5日和8月11日應用。在6月11日實驗開始前，評估每塊樣地4棵樹中每棵樹的10個枝上葉中黑星病 葉數(shù)和每片葉黑星病斑點數(shù)。每塊樣地總共檢查227-239片葉。在9月19日，對每塊樣地 177-232片葉上在實驗開始后產生的黑星病癥狀進行評估。疾病嚴重性(由黑星病癥狀覆 蓋的％葉表面)用如下類別進行評價1 無黑星??；2 :1-10%覆蓋；3 :11-50%覆蓋；以及 4 :51-100%覆蓋。用下述公式計算嚴重性指數(shù)DS = (0xN1+1XN2+2XN3+3XN4) /Ntotal^lOO其中N1, N2,隊和隊分別是歸類于丨二”和彳類的葉的數(shù)目，而隊^是每塊樣地 評估的總葉數(shù)。在3個取樣日對易感幼葉上在實驗期間發(fā)展的蘋果黑星菌分生孢子產生進行評 估。對取樣日進行選擇從而使得預期的感染期期間存在的易感性葉組在感染期后大約5周 被取樣。使用基于葉潮濕潤期和溫度的Mills表來預測感染期。在每塊樣地中屬于同棵樹 的一組3個嫩枝上的剛剛展開的第二最幼葉在預期的感染期后1-3天被標記。預測感染與 第一次應用芽枝狀枝孢菌H39之間的期間以及噴霧數(shù)和噴霧的保護期對每個取樣日均不 同(圖3)。35天后，在標記日剛剛展開的2片葉及在標記后展開但在實驗過程中擴展的2 片僅次的更幼葉被取樣，產生每塊樣地12片葉組成的樣品。取樣日是8月22日(7月18 日標記的葉)，8月沈日(7月22日標記的葉)和9月4日(8月1日標記的葉)。將所述 每個樣品的12片葉匯集并置于250ml玻璃瓶中。在2小時內加入100_150ml (根據(jù)葉的質 量)含有001% Tween 80的自來水，并將瓶用搖床以700 OCS mirT1搖動10分鐘。從所獲 得的懸液中將6ml子樣品儲存在_18°C。對每個懸液的蘋果黑星菌分生孢子的濃度用血球 計輔助進行確定。用面積計量儀測量每個樣品所有葉的葉表面。結果和討論將2008年春天產生的芽枝狀枝孢菌H39的分生孢子根據(jù)中試實驗方案配制成水 可分散粒劑，并儲存在5°C，其在實驗開始時具有65%生存力。生存力保持穩(wěn)定直至實驗結 束ο實驗開始前，屬于不同處理的樣地的葉上黑星病發(fā)生率沒有不同。在用作對照的 樣地中平均發(fā)生率是81. 7%，在后來用H39處理的樣地中是84. 6%，在后來用硫處理的樣 地中是84.3%。每片葉的葉斑點數(shù)也無統(tǒng)計學不同，因此可以推定在實驗開始前不同樣地 中的黑星病發(fā)展是相似的。在8月22日、8月沈日和9月4日從未處理樹上取樣的葉上平均產生35，242 (11，447-74，870)、30，242 (18，926-59，497)和 32，533 (19，698-46，350)個蘋果黑星 菌分生孢子· cm—2葉表面(逆轉換平均值，在括號中是6個重復的范圍)(圖4)。在用芽 枝狀枝孢菌H39處理的樹葉上，孢子數(shù)在統(tǒng)計學上顯著更低，在第一個取樣日為11，499個 蘋果黑星菌分生孢子· cm_2葉表面(基于逆轉換值降低67% )，在第二個取樣日為15，139 個分生孢子· cm_2葉表面(降低50% )。對于最后一個取樣日，未觀察到應用芽枝狀枝孢 菌H39的顯著作用，經處理的葉上有21，163個分生孢子· cm_2葉表面(降低35% )。應用 硫磺導致每cm2葉表面產生的蘋果黑星菌分生孢子數(shù)在不同取樣日降低2%、16%和 (圖4)。用H39最后一次處理后一個月即9月19日對黑星病嚴重性進行了評估，對照處理 是2. 2，H39處理的樣地在統(tǒng)計學上顯著更低，為1. 8(圖幻。在硫處理的樣地中，黑星病嚴 重性是2. 0，與其它處理無顯著不同。在果園實驗期間，環(huán)境條件導致很高的感染期數(shù)目，并有利于黑星病發(fā)展。冰雹事 件后新枝例外地發(fā)育也支持了夏季流行。在這種嚴重疾病壓力下，用硫處理經常不足以實 現(xiàn)疾病控制，在我們的實驗中也發(fā)現(xiàn)這一點。用拮抗物H39處理在這種嚴重條件下降低了 蘋果黑星菌分生孢子產生，證實了 2006年和2007年進行的果園實驗結果。最強作用在第 一個取樣日發(fā)現(xiàn)，其中H39處理在預期的感染后開始但是持續(xù)直至取樣前4天。對于第三 個取樣日，在預期的感染期之前已用H39進行了多重處理，但是最后一次處理在取樣前17 天被應用。在這種情況中，蘋果黑星菌的分生孢子產生僅降低35%。由于拮抗物的作用可 能也依賴于環(huán)境因素，環(huán)境因素在不同取樣日前不同，因此需要更多來自重復的果園實驗 的數(shù)據(jù)才能得出拮抗物應用最佳時機的結論。還首次評估了在用拮抗物H39處理后黑星病嚴重性。在果園中觀察到的在高黑星 病水平降低的黑星病嚴重性證明了芽枝狀枝孢菌H39具有控制黑星病流行的高潛力。實施例5. 2007/2008年果園測試在夏季用芽枝狀枝孢菌H39和R406處理對過冬 后經處理的葉上的蘋果黑星菌子囊孢子產生的作用目的夏天用拮抗物芽枝狀枝孢菌H39和R406的分生孢子懸液處理蘋果葉導致在果園 條件下經處理的蘋果葉上黑星病真菌蘋果黑星菌分生孢子產生降低(見實施例1和2)。在2007年實驗期間在果園中經處理的葉上所進行的另一項評估的目的是研究用 該拮抗物在夏季對發(fā)育中的幼葉進行這種處理對于過冬后經處理的葉中蘋果黑星菌子囊 孢子產生的作用。實驗設計.實驗在荷蘭Randwi jk，Applied Plant Research的有機管理果園中進 行。該實驗目的是評估應用拮抗物以控制蘋果黑星病的夏季流行以及降低過冬蘋果葉中產 生的蘋果黑星菌的接種體負荷的潛力。因此，重要的是允許在主要季節(jié)果園中開始輕度至 中度流行病。2007年主要季節(jié)的異常天氣條件即4周無雨對于蘋果黑星菌子囊孢子的釋放 和感染非常不利。在4月之后氣候變得更有幫助，并且當應用第一次拮抗物懸液時已發(fā)展 出了輕度蘋果黑星病流行。在實驗之前或期間未進行降低流行的殺真菌處理。實驗在具有6個模塊的設計中的8年齡樹cv Jonagold上進行，在同一排樹中有2 個模塊。每個模塊由3塊樣地組成，每塊有4棵樹。在樣地之間，2棵未經處理的樹作為緩 沖。3種不同處理隨機分配給樣地。以每塊樣地21，每周兩次的比率用下述處理來處理樹 木(1)作為對照的補加了 Tween 80(0. 01% )的自來水；和(2)經配制的H39分生孢子懸液QxlO6個分生孢子πιΓ1)。在6月觀日至8月20日之間16個日期每周進行2次應用。 (3)第三種處理由多重的芽枝狀枝孢菌R406分生孢子懸液的噴霧應用所組成。在7月12 日和8月20日之間的12個日期將在每個應用日新鮮產生的分生孢子每周兩次應用在每塊 重復樣地的4棵樹上。夏季蘋果黑星菌的分生孢子產生.處理對蘋果黑星菌的分生孢子產生的作用已 作為實施例2進行了報道。在過冬蘋果葉中蘋果黑星菌的子囊孢子產生.在2007年7月12日，在每塊樣地 的25個嫩枝上對剛剛展開的次最幼葉進行了標記。在一些樣地中，可用的嫩枝較少。在 2007年10月4日，對葉進行取樣，所述的葉是在標記日剛剛展開的葉，以及僅次的2片在標 記后展開更幼葉。根據(jù)取樣日葉的可用性，在每塊樣地收集16-65片葉。對每塊樣地取樣 的葉進行稱重并固定在50x50cm大小的兩個鐵絲網(l^c20mm篩孔)之間，從而使葉互相不 接觸。將具有葉的網置于Randwijk的有機果園蘋果樹排內果園地面上裸露的土壤上并用 金屬釘固定，從而使大部分網表面接觸土壤。有6個模塊(重復)含有來自不同處理(在 夏季應用)的葉的網在模塊內隨機分配。2008年2月26日，收集網。將每個重復的兩個網的葉殘余物匯集，風干(20°C， 70%RH，2天)并稱重。隨后，將每個樣品經風干的葉殘余物鋪在分開的塑料盤(50x30x6cm) 中的濕濾紙上。盤用塑料袋覆蓋，并在這些保濕室中于黑暗、20°C將葉殘余物溫育7天，隨 后每天12小時光照(75μΕ)在20°C溫育14天以使子囊(大部分)成熟。溫育后，將葉殘余 物轉移至根據(jù)葉殘余物的量含有150-350ml水的IOOOml塑料瓶中。空氣(每小時250升) 鼓泡穿過水，在2小時期間產生大量湍流(Heye et al. 1981，Canadian Journal of Botany 59,965-968 ；Philion, 1995, Msc Thesis McGill University，Montreal，加拿大)。之后， 將所得懸液通過篩(1mm篩孔)以除去葉碎片。將懸液的2個子樣品(8ml)儲存在_20°C。 該懸液中的子囊孢子濃度用血球計經顯微鏡確定。子囊孢子產量表示為(在秋天原始固定 在果園地面上的)每克葉的產量或者每克春天取樣日存在的經風干的葉殘余物的產量。結果和討論在來自對照處理的葉殘余物上，每克葉殘余物(干重)產生220，089個子囊孢子。 這等價于每克存在于前一個秋季的葉組織(鮮重)產生的37，171個子囊孢子(表9)。在 來自在前一個夏季已用芽枝狀枝孢菌H39處理的葉的殘余物中，僅產生109，044個子囊孢 子，等價于每克存在于前一個秋季的葉組織(鮮重)產生的15，733個子囊孢子。子囊孢子 產生與對照處理相比分別降低58%和50%在統(tǒng)計學上是顯著的。芽枝狀枝孢菌R406在前 一個夏季處理蘋果葉后對春季中子囊孢子產生的作用不太顯著，不是統(tǒng)計學上顯著的?？梢缘贸鼋Y論，對于在夏季期間用拮抗物芽枝狀枝孢菌H39及可能也用芽枝狀枝 孢菌R406對果園進行的夏季處理在隨后的春季對蘋果黑星菌子囊孢子產生具有的長期持 續(xù)作用。在過冬葉上產生的子囊孢子數(shù)目的降低會導致在蘋果黑星病的主要感染季中更低 的接種體壓力并因此在流行開始時黑星病發(fā)展更慢。據(jù)我們所了解，這是首次報道證明了 用拮抗物處理高度易感黑星病的發(fā)育中的蘋果幼葉導致在過冬后下一個季節(jié)中經處理的 葉上子囊孢子產生顯著更低。實施例6 芽枝狀枝孢菌H39對于各種病原體孢子產生的作用目的
接下來實驗目的是評價所述拮抗物對于各種其它植物病原體的作用。材料和方法芽枝狀枝孢菌H39的分生孢子.芽枝狀枝孢菌H39的分生孢子在德國PR0PHYTA Biologischer Pflanzenschutz GmbH 的 Solid—State Fermentation (SSF)系統(tǒng)中產生。將所收獲的分生孢子配制為水可分散粒劑(WG)。為了保持產物性質，將終產物貯存在-20°C。 在試驗開始前在麥芽提取物瓊脂(Ig麥芽提取物Γ1)上確定干燥的分生孢子的生存力。 在20°C溫育M小時的分生孢子具有比分生孢子最小直徑一半要長的芽管則被認為是存活 的。65%的分生孢子是存活的。病原體.在這項研究中使用如下病原體分離株(括號中是用于孢子產生的生 長培養(yǎng)基)仁果干癌叢赤殼菌780 (燕麥粉瓊脂；OA)，導致果樹癌腫病及果實腐爛；囊 狀匍柄霉菌850(燕麥粉瓊脂，OA)，引起梨樹褐斑病及果實腐爛；蔥腐葡萄孢(Botrytis aclada)008(0A)，引起洋蔥莖腐爛；灰色葡萄孢菌(Botrytis cinerea) 143 (OA)， 引起各種作物灰霉?。混碀蚯痪?8(馬鈴薯右旋糖瓊脂；PDA)，導致香蕉黑斑 ??；禾谷鐮孢菌(Fusarium graminearum) 820 (PDA)，引起谷類赤霉??；黃色鐮孢菌 (Fusarium cu lmorum) 807 (PDA)，導致谷類赤霉?。灰约案仕{鏈格孢菌(Alternaria braSSiCiC0la)177(PDA)，導致蕓苔科疾病。所有真菌均在M°C溫育14天，每天12小時不 可見光。為了獲得孢子懸液，用含有0.01% Tween 80的無菌自來水淹沒培養(yǎng)物。在用橡膠 抹刀輕輕摩擦以從真菌培養(yǎng)物中除下孢子之后，將懸液通過篩孔200 μ m的無菌尼龍網進 行過濾。通過血球計輔助確定孢子懸液濃度并用含有0.01% (v/v) Tween 80的無菌自來水 將其調節(jié)至IxlO2個孢子ml—1和IxlO3個孢子ml—1。對于用斐濟球腔菌進行的實驗，懸液中 也包含在無菌研磨菌絲體團后所獲得的菌絲體片段。當調節(jié)懸液濃度時，僅考慮具有三個 以上細胞的菌絲體片段。實驗設計.對于每個病原體和基質(substrate)類型進行分別的實驗，以及重復 進行每個實驗。從在溫室或者田間生長的植物取下梨、洋蔥、玫瑰、仙客來(cyclamen)、天竺葵 (Pelargonium)、香蕉和白色甘藍無癥狀的綠葉，將離脫葉在室溫干燥幾天。將干燥的葉切 成片段，每個片段的大小為大約長，密封在塑料袋中，通過40kilOGray的、射線照 射滅菌。以同樣方式處理4cm長的麥秸(具1個結節(jié))和蘋果嫩枝(1個分枝)的片段。將用于生物測試中的葉、麥秸或者嫩枝的片段用無菌自來水洗滌以除去可溶的營 養(yǎng)素。因此，將每種基質類型大約80個片段置于在無菌的250ml錐形瓶中的150ml無菌自 來水等份中，在4°C放置過夜。之后，將片段用無菌濾紙吸干。將4個片段置于一系列保濕 室的每個之內。每個室由含有兩張無菌濾紙(直徑85mm)及6ml自來水的無菌塑料培養(yǎng)皿 (直徑90mm)組成。在每個實驗中，對于病原體應用的兩個水平(IxlO2個孢子πιΓ1和IxlO3 個孢子πιΓ1)，各進行5次使用拮抗物芽枝狀枝孢菌H39處理的重復(培養(yǎng)皿)及進行5次 應用水的對照實驗的重復。在實驗期間，培養(yǎng)皿完全隨機安排。將病原體的孢子懸液(或者在一種情況中是菌絲體片段)噴霧于在保濕室內的 葉、麥秸或者嫩枝的片段上。對于蘋果嫩枝片段應用仁果干癌叢赤殼菌，對于梨葉片段應用 囊狀匍柄霉菌，對于洋蔥葉片段應用蔥腐葡萄孢菌，對于玫瑰、仙客來和天竺葵的葉片段應 用灰色葡萄孢菌，對于香蕉的葉片段應用斐濟球腔菌，對于麥秸片段應用禾谷鐮孢菌和黃色鐮孢菌，以及對于白色甘藍的葉片段應用甘藍鏈格孢菌。將經處理的組織片段在溫 育18小時。在第一次溫育之后立即將芽枝狀枝孢菌H39(hl06個存活孢子πιΓ1)的孢子懸 液或者水噴霧在所述片段上。使用無菌噴霧器以大約5 μ IcnT2葉片段來應用病原體和拮抗 物。之后，將葉在保濕室內在黑暗中于進一步溫育。應用禾谷鐮孢菌和黃色鐮孢菌的 麥秸在第8天到第13天的溫育中接受每天12小時不可見光。應用仁果干癌叢赤殼菌的嫩 枝在第12天到第14天的溫育中接受每天12小時不可見光。在對于蔥腐葡萄孢菌和甘藍鏈格孢菌共溫育9天及對于灰色葡萄孢菌共溫育 12天之后(從應用病原體當天開始計數(shù))，所述葉片段由蔥腐葡萄孢菌、灰色葡萄孢菌或 者甘藍鏈格孢菌的分生孢子梗所覆蓋的表面以從0至5進行評價，分別代表葉表面由病 原體的孢子產生結構覆蓋 0%、1_5%、> 5-25%, > 25-50 %,> 50_75%和> 75-100% (Kijhl et al. 1995, European Journal of Plant Pathology 101，627—637)。
柄霉菌的情況中，無分生孢子梗產生，但是有性階段(Pleospora allii)產生大量假囊殼 (pseudothecia)。在接種16天之后，使用與分生孢子梗覆蓋相同的級別來評價由假囊殼所 覆蓋的葉表面。從每個級別(IV5)的葉片段數(shù)目中，計算由4個葉片段組成的每個重復實 驗(培養(yǎng)皿)的范圍從0至100的孢子形成指數(shù)(Si) (Si = (0xn0+5xn1+25xn2+50xn3+75xn 4+100xn5) /4)。在溫育15天之后計數(shù)香蕉葉片段上由斐濟球腔菌產生的群落數(shù)。使用顯微鏡計 數(shù)在13天后麥秸片段上產生的禾谷鐮孢菌和黃色鐮孢菌的分生孢子數(shù)。因此，將每個培 養(yǎng)皿的麥秸片段置于含有IOml洗滌液(在自來水中20%乙醇，含有0.01% Tween 80)的 Erlenmeyer燒瓶(100ml)中。將燒瓶在往復式搖床上搖動10分鐘，使用血球計在顯微鏡下 確定禾谷鐮孢菌和黃色鐮孢菌在懸液中的分生孢子濃度。相同方法也用于量化在溫育14 天之后蘋果嫩枝片段上仁果干癌叢赤殼菌的分生孢子數(shù)。統(tǒng)計學.利用ANOVA及隨后的LSD-檢驗分別分析每個實驗的數(shù)據(jù)。如果拮抗物 處理X病原體濃度相互作用不顯著，則將平均拮抗物處理作用分析為主要作用。孢子計數(shù) 數(shù)據(jù)在分析前經對數(shù)轉換log-孢子數(shù)=logltl(孢子數(shù)+0. 01)。結果和討論仁果干癌叢赤殼菌發(fā)現(xiàn)芽枝狀枝孢菌H39具有針對導致果樹癌腫病及果實腐爛 的仁果干癌叢赤殼菌的強拮抗作用。在果園中，該病原體在嫩枝經感染的傷口區(qū)域(癌腫) 存活和增殖(McCracken et al.，2003，PlantPathology 52,553-566) 在控制條件下的生 物測試中這種組織上產生的接種體由所述拮抗物降低99%以上(表10)。結果示出芽枝狀枝孢菌H39具有很高潛力用于果樹癌腫病的生物控制中，果樹癌 腫病在蘋果和梨生產中是黑星病之外最重要的疾病。應用所述拮抗物因此在主要的梨果類 果實作物中具有控制這兩種主要疾病(黑星病以及果樹癌腫病)的潛力。囊狀匍柄霉菌.囊狀匍柄霉菌在歐洲主要產梨區(qū)中引起梨褐斑病(Llorente & Montesinos, 2006)。該疾病初步接種體的主要來源是過冬的壞死梨樹葉，在其上產生有性 階段(Pleospora allii)的假囊殼。對病原體已預先建立群落的壞死葉應用芽枝狀枝孢菌H39，在兩個實驗中均顯著 降低假囊殼的形成(通過評定由果實體覆蓋的葉表面而進行評價)(表11)。因此可通過對 林冠或者在落葉后對果園地面應用所述拮抗物來實現(xiàn)用芽枝狀枝孢菌H39對褐斑病進行生物控制。在以2xl06個孢子πιΓ1應用H39之前18小時以IxlO2個孢子πιΓ1和IxlO3個孢子 ml—1的濃度應用囊狀匍柄霉菌。S個重復的平均，每個有4個葉片段；對由假囊殼所覆蓋的葉表面進行評價。2與對照處理具有顯著差異(LSD-檢驗；α =0. 05).葡萄孢菌壞死的宿主組織的存在是灰霉病及其它由葡萄孢菌引起的疾病流行的 前提條件。已經證明從壞死的宿主組織中競爭性除去葡萄孢菌可用于對葡萄孢菌所激起的 疾病進行生物控制(Kohl et al.，2003，BioControl48，349-359)。在對所檢測的所有四種不同宿主的組織進行的生物測試中，芽枝狀枝孢菌H39顯 著降低蔥腐葡萄孢菌和灰色葡萄孢菌的孢子形成(表12-1 。所述拮抗物因此在葡萄孢菌 所激起的各種谷類疾病的生物控制中具有潛力。斐濟球腔菌斐濟球腔菌在香蕉中引起黑葉斑病(Arzanlou et al. ,2007, Phytopathology 97，1112-1118)。這種疾病在香蕉的生產中是主要威脅。目前的疾病控制 依賴于多重殺真菌劑應用。病原體在葉上壞死病斑處存活和繁殖。對壞死的香蕉葉進行的生物測試結果示出拮抗物芽枝狀枝孢菌H39在該疾病的 生物控制中具有很有希望的潛力。盡管在實驗條件下孢子不由病原體形成，但是可明確證 明該拮抗物能將病原體從基質群落建立中去除(表16)。禾谷鐮孢菌和黃色鐮孢菌禾谷鐮孢菌和黃色鐮孢菌在谷類植物和玉米中引起赤 霉病。該疾病導致產量降低，且通常更重要的是由于病原體的真菌毒素形成而導致嚴重 質量降低。麥秸殘莖及其它碎片是這種疾病的主要接種體來源(Osborne & Stein，2007， International Journal of Food Microbiology 119,103-108)。芽枝狀枝孢菌H39在病原體已預先建立群落的麥秸片段上顯著降低這兩種鐮孢 菌分生孢子產生(表17和18)，因此在谷類植物生產中具有用來對這些主要病原體進行生 物控制的潛力。甘藍鏈格孢菌.由甘藍鏈格孢菌導致的黑色葉斑病是在蔬菜生產中蕓苔科的主 要疾病。該病原體在被感染的壞死病斑和作物碎片中形成孢子(Humphers0n-J0nes，1989， Annals of Applied Biology 115,45-50) 除了葉之外，在種子生產領域中的整個幼苗以 及莢果包括發(fā)育中的種子均可被損傷。在對白色甘藍經預先建立群落的壞死葉應用芽枝狀枝孢菌H39之后，在生物測試 中發(fā)現(xiàn)甘藍鏈格孢菌的分生孢子產生顯著降低(表19)。實施例7 芽枝狀枝孢菌H39對于蘋果果實腐爛的作用目的接下來實驗的目的是評估所述拮抗物對于引起蘋果收獲后果實腐爛的產果念珠 霉菌的作用。材料和方法芽枝狀枝孢菌H39的分生孢子.芽枝狀枝孢菌H39的分生孢子如實施例6所述產生。病原體.將在多種果實作物中引起果實腐爛的產果念珠霉菌1067在燕麥粉瓊脂 上于生長14天，每天不可見光12小時。為了獲得孢子懸液，用含有0.01% Tween 80的無菌自來水淹沒培養(yǎng)物。在用橡膠抹刀輕輕刮擦以從真菌培養(yǎng)物中除下孢子之后，用篩 孔200 μ m的無菌尼龍網過濾該懸液。由于孢子形成較少，因此在所述懸液中也包含經無菌 研磨的菌絲體團后所獲得的菌絲體片段。當用血球計輔助確定懸液濃度時，僅考慮具有三 個以上細胞的菌絲體片段，并且用含有0.01% (v/v) Tween 80的無菌自來水將濃度調節(jié)至 IxlO2個孢子和菌絲體片段ml—1以及IxlO3個孢子和菌絲體片段πιΓ1。實驗設計.在生物測試中使用無癥狀有機產生的蘋果栽培變種Elstar。通過在 70%乙醇中浸泡1分鐘及在無菌自來水中清洗3次來對蘋果表面滅菌。將4個蘋果置于 保濕室(大小為在底部有加濕的濾紙；用蓋子密封)中，使用無菌雞尾酒牙 簽在蘋果上做出兩個傷口(大約為直徑3mm，深度5mm) (Jijakli & L印oivre，1992，In Fokkema, N. J. , J. Kohl & Y. Elad, Biological control of foliar and post-harvest diseases, IOBC/WPRSBulletin Vol. 16(11)，pp. 106-110)。將 50 μ 1 無菌水應用于對照處 理的傷口。在另一處理中，將50 μ 1芽枝狀枝孢菌Η39的分生孢子懸液OxlO6個活性孢子 πιΓ1)加至每個傷口處。將經處理的蘋果在溫育M小時。隨后，用IxlO2和IxlO3個孢 子和菌絲體片段的產果念珠霉菌的孢子和菌絲體片段的懸液處理蘋果，在保濕室內在 進一步溫育。每個處理重復進行5次，每個重復由在相同保濕室內的4個蘋果組成，進行不 同處理的保濕室以完全隨機的設計進行排列。將該實驗重復兩次。在應用產果念珠霉菌之 后8和12天測量由接種的傷口所發(fā)展出的病斑直徑。結果和討論在所述實驗條件下，產果念珠霉菌在蘋果傷口處引起嚴重果實腐爛，例如在這兩 個實驗的對照處理中在所有高水平病原體傷口上均產生病斑。應用芽枝狀枝孢菌H39的分 生孢子在大多數(shù)情況中減少感染傷口的數(shù)目(表20a)。通過拮抗物處理，平均病斑大小降 低了高達70% (表20b)。平均起來，在第一個實驗中果實腐爛(以病斑大小測量)在統(tǒng)計 學上顯著減少50 %，在第二個實驗中減少30 %。結果證明在生長季節(jié)應用芽枝狀枝孢菌H39具有保護蘋果果實免于收獲前和收 獲后由產果念珠霉菌所致果實腐爛的潛力。在收獲后用芽枝狀枝孢菌H39處理也有希望保 護果實免于在收獲后貯存期間腐爛。
權利要求
1.芽枝狀枝孢菌(Cladosporiumcladosporioides) H39，于 2007 年 12 月 13 日以保藏 號CBS 122244保藏在位于荷蘭Baarn的荷蘭真菌保藏所。
2.芽枝狀枝孢菌R406，于2007年12月13日以保藏號CBS122243保藏在位于荷蘭 Baarn的荷蘭真菌保藏所。
3.控制植物葉、果實和穗病原體的組合物，其包含權利要求1或2的枝孢菌 (Cladosporium)。
4.權利要求3的組合物，其中所述植物病原體選自由以下所組成的組蘋果黑星病 (蘋果黑星菌(Venturia inaequalis))，梨黑星病(梨黑星菌(Venturia pirina))，葉斑 病(Blumeriella jaapi)，玫瑰黑斑病(玫瑰雙殼菌(Diplocarpon rosae) /薔薇盤二孢菌 (Marssonina rosae)),褐斑病(囊狀匍柄霉菌(Stemphylium vesicarium)),白粉病(蘋 果白粉病柄球菌(Podosphaera leucotricha) / 薔薇單絲殼菌(Sphaerotheca pannosa)), 秋海棠霉病(秋海棠叉絲殼菌(Microsphaera begoniae))，草莓白粉病(Sphaerotheca macularis)，黑點煤斑病(仁果粘殼孢菌(Gloeodes pomigena))，蠅糞病(Zygophalia jamaicensis)，桃縮葉病(畸形外囊菌(Taphrina deformans))，褐腐病/短枝潰瘍(產 果念珠霉菌(Monilia fructigena),核果鏈核盤菌(M. Iaxa)),梨銹病(Gymnosporangium sabinae/歐洲膠銹菌(G. fuscum))，癌腫病(仁果干癌叢赤殼菌(Nectria galligena))，玫 瑰黑斑病(玫瑰雙殼菌)，玫瑰銹病(小瘤多胞銹菌(Wiragmidium tuberculatum) /多胞銹 菌(Wiragmidium spp.))，各種植物中的葡萄孢菌(Botrytis spp.)，甘藍中的蕓苔生球腔 |if (Mycosphaerella brassicicola)， 中的求月空lif (Mycosphaerella f i jiensis)， 蕓苔屬(Brassica)、馬鈴薯及各種其它植物中的鏈格孢菌(Alternaria spp.)，鐮孢菌 (Fusarium spp.)，特別是在谷類植物包括玉米中的，馬鈴薯的蔓延疫霉菌(Wiytophthora infestans)以及葡萄樹中的葡萄生單軸霉菌(Plasmoparaviticola)，優(yōu)選其中所述真菌 性葉病原體是蘋果黑星病。
5.權利要求3或4的組合物，其中枝孢菌作為孢子存在。
6.權利要求5的組合物，其進一步包含所述枝孢菌孢子的載體，優(yōu)選其中所述載體是葡萄糖。
7.控制植物葉、果實和穗病原體的組合物，其中存在權利要求1或2的枝孢菌的提取物。
8.控制植物中病原體的方法，包括用權利要求3-7任一項的組合物處理所述植物。
9.權利要求8的方法，其中將所述組合物噴霧在植物的葉、果實或者穗上。
10.權利要求8-9任一項的方法，其中病原體的控制包括感染的預防和/或減少所述病 原體所引起的植物損傷。
11.權利要求8-10任一項的方法，其中所述病原體選自由以下所做成的組蘋果黑星 病(蘋果黑星菌)，梨黑星病(梨黑星菌)，葉斑病(Blumeriella jaapi)，玫瑰黑斑病(玫 瑰雙殼菌/薔薇盤二孢菌)，褐斑病(囊狀匍柄霉菌)，白粉病(蘋果白粉病柄球菌/薔薇 單絲殼菌)，秋海棠霉病(秋海棠叉絲殼菌)，草莓白粉病(Sphaerotheca macularis)，黑點 煤斑病(仁果粘殼孢菌)，蠅糞病(Zygophalia jamaicensis)，桃縮葉病(畸形外囊菌)，褐 腐病/短枝癌腫病(產果念珠霉菌，核果鏈核盤菌)，梨銹病(Gymnosporangium sabinae/ 歐洲膠銹菌)，潰瘍(仁果干癌叢赤殼菌)，玫瑰黑斑病(玫瑰雙殼菌)，玫瑰銹病(小瘤多胞銹菌/多胞銹菌屬各物種)，各種植物中的葡萄孢菌，甘藍中的蕓苔生球腔菌，香蕉中的 斐濟球腔菌，蕓苔屬、馬鈴薯及各種其它植物中的鏈格孢菌，鐮孢菌(Fusarium spp.)特別 是谷類包括玉米中的、馬鈴薯的蔓延疫霉菌以及葡萄樹中的葡萄生單軸霉菌，優(yōu)選其中所 述真菌性葉病原體是蘋果黑星病。
12.權利要求8-11任一項的方法，其中所述組合物在收獲前應用。
13.權利要求8-11任一項的方法，其中所述組合物在收獲后應用。
14.權利要求1或2的枝孢菌或者權利要求3-7任一項的組合物在預防或者治療病原 體對植物的葉、果實或者穗的感染中的應用。
15.權利要求1或2的枝孢菌菌株或者權利要求3-7任一項的組合物，其用于控制植物 病原體感染。
全文摘要
本發(fā)明涉及通過用芽枝狀枝孢菌(Cladosporium cladosporioides)的分離株處理植物以控制植物的葉、果實和穗上由病原體所引起的疾病，如蘋果黑星病(蘋果黑星菌(Venturia inaequalis))。所述處理在預防和治療真菌感染中均有效。
文檔編號A01N63/04GK102123596SQ200880126797
公開日2011年7月13日 申請日期2008年12月12日 優(yōu)先權日2007年12月14日
發(fā)明者J·A·克爾 申請人:農業(yè)研究基金會