專利名稱：：雜交萵苣種子的生產(chǎn)的制作方法雜交萵苣種子的生產(chǎn)本發(fā)明涉及雜交萵苣(Lactucasativa)的種子以及生產(chǎn)該種子的方法。本發(fā)明同樣涉及雜交萵苣植株以及雜交萵苣植株的細胞。在大規(guī)模生產(chǎn)植物雜交種子的幾個原因中，人們特別考慮雜種優(yōu)勢(或者雜交活力)、內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定(植物在不同環(huán)境中的穩(wěn)定性)、將對昆蟲、真菌、細菌或病毒的抗性基因組合的可能性、或者還有對非生物性逆境的適應性，諸如對極端溫度、即5°C以下或30°C以上的溫度的耐受性、或者還有對低照度的耐受性。在萵苣(栽培萵苣)中，在純合子譜系中使某些抗性基因組合被證實是不可能的或者非常困難的，尤其是當所考慮的基因處于同一基因座上(在每個等位基因上)或者在一些非常接近的基因座上時。特別是Fl雜交栽培萵苣的獲得，使并合了由位于同一基因座或者非常接近的基因座上的不同等位基因所攜帶的在農(nóng)業(yè)上有意義幾個共顯性或顯性基因的雜種的商業(yè)規(guī)模生產(chǎn)成為可能，故具有巨大的效益。萵苣屬包括100多個種，其中有萵苣(Lactucasativa)(栽培種)、!^ctucasaligna(野生禾中)、毒萬昔(lactucaserriola)(野生禾中)禾口毒萬昔(lactucavirosa)(里予生禾中)。萵苣是二倍體物種(2n=18)，一般自花受精，通過自花受粉的種子生產(chǎn)占98%。雄蕊(雄性器官)是成組的，形成雄蕊管，其中花藥的花粉囊打開。雌蕊(雌性器官)包括子房、花柱和二裂的柱頭?；ㄩ_時，雄蕊管內(nèi)部的長形花柱以及柱頭被花粉覆蓋，于是該植株自體受精。根據(jù)栽培條件，植株萵苣一般產(chǎn)生重0.5至6克，甚至10克的種子，每克一般有600至1000粒種子。大規(guī)模生產(chǎn)雜交植物的傳統(tǒng)技術(shù)包括，彼此相近地種植用作"親本"的兩個品種，并利用昆蟲授粉，親本之一具有雄性不育性，以避免自花傳粉造成的污染。接著在該雄性不育的親本上采集種子。這種技術(shù)允許在每一個親本中使以純合子的形式出現(xiàn)的感興趣的基因組合，但仍舊保留試驗田的同質(zhì)性，F(xiàn)1代在采集階段上(花開之前)呈現(xiàn)100%的均一表型。用這個技術(shù)大規(guī)模生產(chǎn)雜交栽培萵苣(Lactucasativa)被證實是非常困難的。事實上，萵苣只在一天中的某個時刻(早晨一早)開花一次，開花持續(xù)僅僅幾個小時，例如，1至4小時，這時傳粉昆蟲，諸如某些種的蜂(蜜蜂(Apismellifera))或者熊蜂(Bombuss卯.)尚未活動。萵苣的授粉也不靠風來實現(xiàn)。于是，鑒別可以用來生產(chǎn)雜交萵苣的傳粉昆蟲碰到許多困難，特別是-開花期既短又早，這使鑒別飛臨這些花朵的昆蟲變得困難；-該花只開一次，因而，選定的傳粉昆蟲應該是一種整日都飛臨這些花朵的昆蟲，以便保證給最大數(shù)目的雄性不育花朵授粉。另一方面，生產(chǎn)雜交F1需要設置"雄性"系和"雌性"系。"雌性"系可以通過對植物進行人工去雄的辦法而獲得。然而，在萵苣的情況下，每朵花只開一次，而且花期非常短(幾小時)，由于需要的人工費非常高，這個方法難以以商業(yè)規(guī)模實施。"雌性"系同樣可以通過引入基因型不育(或者核型不育)或者細胞質(zhì)型不育的辦法而獲得，表現(xiàn)為無花藥、空花藥或者花粉無活力。這種不育在核不育(或者基因不育)的情況下部分地傳給子代，或者在細胞質(zhì)不育的情況下完全傳給子代。Goubara禾卩Takasaki(動物昆蟲學應用(Appl.Entomo.Zool).38(4):571—581，2003[1])在其工作中進行了開放式和封閉式田間試驗，目的在于鑒別可以用來生產(chǎn)雜交萵苣(Lactucasativa)的有授粉潛力的昆蟲。所觀察的22種昆蟲(21個種的蜂和一個種的用花蜜飼養(yǎng)的蠅，岈蠅科長尾管岈蠅(SyrphidaeEristalistenax))中，發(fā)現(xiàn)蜂Lagioglossumvillosulumtrichopse(軟毛隧蜂)是最佳的潛在授粉者。Goubara和Takasaki(Appl.Entomo.Zool.39(1):163-169，2004[2])也在封閉介質(zhì)中在蜂Lagioglossumvillosulumtrichopse存在的情況下進行了攜帶雄性不育基因的萵苣和雄性可育萵苣之間的小規(guī)模的雜交試驗。作者披露，獲得了Fl雜交萵苣，但是產(chǎn)量非常低。至今，尚未看到利用傳粉昆蟲生產(chǎn)雜交萵苣的任何其他試驗。至今，尚未以商業(yè)規(guī)模生產(chǎn)出任何品種的Fl雜交萵苣。按照本發(fā)明，下列術(shù)語理解如下-栽培萵苣是指物種萵苣(Lactucasativa)。栽培萵苣有5個主要栽培組(見圖l):萵苣var.angustana(戸笑萵苣);萵苣var.c即itata(蘋果形萵苣，黃油萵苣);萵苣var.crispa(荷蘭萵苣或者冰山萵苣)；萵苣var.longifolia(羅馬萵苣)和萵苣var.ac印hala(皺葉菊苣，收割萵苣)。本發(fā)明包含這些不同類型萵苣中每一種的應用。-授粉是指把花藥的花粉輸送到同一朵花或者另一朵花的柱頭。這種有性生殖系統(tǒng)是開花植物(被子植物和裸子植物)天然的繁殖模式。它允許花粉顆粒達到柱頭，接著經(jīng)過花柱形成通到胚珠的花粉管，以便授精。-自花授粉是指通過其適當?shù)幕ǚ圻M行個體或者生物型的授粉，結(jié)果個體自花授粉。-自花受精是指植物自花受精的能力，兩個配子出自同一個體。-異花授粉是指一個個體的花由來自一個或者幾個其他個體的花粉授精的現(xiàn)象。-傳粉昆蟲是指利用探索花(例如，尋求花蜜)的昆蟲(其中有蜂、蝴蝶、雙翅目昆蟲或某些鞘翅目昆蟲)摩擦雄蕊，從而收集幾?；ǚ?，然后棄置在另一朵花上。-基因座(locus)是指基因或者等位基因在染色體上占據(jù)的位置。-等位基因是指一個物種中處于染色體給定位置(基因座)上的基因的變異體，。一個基因的不同等位基因引起不同的特性表達。-基因簇(cluster)是指位于同一染色體上彼此靠近的位置的兩個或多個基因。Kesseli等人[12]特別描述了在萵苣中鑒別出抗性基因基因簇(clusters)。-顯性基因是指在一對染色體的兩個染色體或一個染色體上出現(xiàn)的賦予表型的基因。-隱性基因是指當其出現(xiàn)在兩個同源染色體中的每一個上時不賦予表型的基因。-共顯性是指兩個等位基因在該表型中彼此表達由它們所決定的特征的特性。在攜帶兩個共顯性等位基因的雜合體中，就這些基因所攜帶的信息而言，該遺傳型在該表型中被完全表達。-雜合子是指在同一對染色體的一個給定基因座上具有兩個不同的等位基因的細胞或個體。-純合子是指在同一對染色體的一個給定基因座上具有兩個相同的等位基因的細胞或個體。_術(shù)語雜種是指不同遺傳結(jié)構(gòu)的個體(優(yōu)選是同一品種)之間雜交的產(chǎn)物。-F1雜種是指通過不同遺傳結(jié)構(gòu)的個體之間雜交而產(chǎn)生的第一代。因而，F(xiàn)l雜種對于至少一個基因而言是雜合子。-回交(或者回交雜交或者"回交")是指雜種與其親本之一之間的雜交。-栽培品種是指變種。-基因型是指個體所攜帶的并構(gòu)成其基因遺傳型(patrimoinehereditaire)的遺傳材料的總體。-表型是指個體顯現(xiàn)的形態(tài)或者功能特性的總體，它們既響應基因型的表達部分，也響應由外部介質(zhì)決定的一些現(xiàn)象。_農(nóng)業(yè)上感興趣的表型是指例如兩個純合基因型之間雜交所產(chǎn)生的、表現(xiàn)出從農(nóng)業(yè)的觀點看感興趣的特征的表型，其中，諸如對不同病原體或昆蟲的抗性特性組合，雜種活力(就是說，雜種特性的平均水平超過兩個親本的平均水平)、內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定、對非生物性逆境的適應能力、形態(tài)特征，諸如，顏色、形狀、葉子的剛?cè)彳浶?、該植物的營養(yǎng)素成分或味覺質(zhì)量。-雜種優(yōu)勢或雜種活力是指Fl雜種在一個或幾個特性上，特別是涉及活力方面，明顯地優(yōu)于其親本的較佳者的現(xiàn)象。-內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定是指植物適應其環(huán)境，甚至幾個環(huán)境特征的能力。-術(shù)語雄性不育是指由于花的雄性要素的不育性而不能通過自花受粉繁殖的植物。例如，該花粉可能不起作用，或者可能雄性繁殖器官有結(jié)構(gòu)畸形，例如，在花藥(絨氈層)的滋養(yǎng)絨氈層水平上的結(jié)構(gòu)畸形。-細胞質(zhì)雄性不育是指細胞質(zhì)類型的經(jīng)母性遺傳一致性地傳遞的不育性。-細胞核(或基因)雄性不育是指由(細)胞核的DNA所攜帶的孟德爾遺傳性的不育性，它或者可能由隱性基因決定，或者可能由顯性基因決定。-單基因雄性不育性是指由一個基因引起的雄性不育。-多基因雄性不育性是指由幾個基因引起的雄性不育。-抗性是指，與敏感的變種相比，在類似的條件、環(huán)境和病原體或害蟲的壓力下，一個變種抑制給定病原體或害蟲生長和發(fā)育和/或其所引起的損害的能力。但是，這些變種在病原體或者害蟲的強大壓力的情況下可能表現(xiàn)出幾種病害的癥狀或者表現(xiàn)幾種損害。-標準抗性或者高抗性是指在病原體和害蟲的普通壓力條件下，與敏感的變種相比，變種有力地抑制給定病原體或害蟲的生長和發(fā)育的能力。但是，在該病原體或該害蟲的強大壓力的情況下，這些變種可能表現(xiàn)出一些癥狀或損害。-中等抗性或適度抗性是指變種抑制給定病原體或害蟲的生長和發(fā)育的能力，但是與高/標準抗性變種相比，可能表現(xiàn)出更多的癥狀或損害。該中等抗性變種在類似的條件、環(huán)境和/或病原體或害蟲的壓力下，表現(xiàn)出的癥狀或損害，與在敏感變種上所觀察到的7相比，較不嚴重。-分子標記是指，在個體完整的基因組中可以鑒別出的，而且可以用來確定感興趣基因的位置，或者查核一個個體是否遺傳了一個親本機體特定特征的特定DNA片段。它可能涉及或不涉及編碼序列。在遺傳雜交中，一般將感興趣的基因與分子標記相連接。于是，對分子標記的檢測則允許選擇出呈現(xiàn)感興趣基因的個體，而不必知道該基因的序列。在農(nóng)學領(lǐng)域中，分子標記的利用允許在選擇的過程中迅速地測試植物，并允許保留擁有所需特征的植物。在某些情況下，與一個特性相關(guān)的標記的存在，使育種者能夠免除某些測試或表型的觀察。具體地說，雄性不育基因(優(yōu)選是雄性不育顯性基因)的特定分子標記的利用，允許在雄性不育植物開花期之前提前進行選擇。這種選擇允許清除在雜交種子的生產(chǎn)中，例如，在利用雄性不育顯性基因的情況下，可能構(gòu)成對計劃用作"母本"(雄性不育)植株的污染的一部分雄性可育植株，并因而減小與這些雄性可育植株的自花受精相關(guān)的污染的危險。本發(fā)明的目的是雜交植物萵苣(Lactucasativa)的種子、植株和細胞，其特征在于，它們屬雄性不育基因型，而且對于至少一個不包含在雄性不育中的基因而言是雜合子，而且賦予該植物一種可檢測的表型。植物萵苣的種子、植株或者細胞所帶的雄性不育性可以來自細胞核或細胞質(zhì)。在它們是細胞質(zhì)雄性不育的情況下，該不育性是母性遺傳的。它們往往是由細胞質(zhì)中存在的線粒體和一些細胞核基因之間的相互作用造成的。該細胞質(zhì)雄性不育的特征在于，在母本基因組中不存在育性恢復基因時，出現(xiàn)100%雄性不育表型的子代。當母本"基因組中存在育性恢復(Rf)基因時，該雄性育性可以在該子代水平上進行恢復。更具體地說，本發(fā)明涉及雄性不育基因型包含至少一個細胞核基因的情況，或者種子、細胞或植物對該雄性不育來源的一個或幾個基因而言是雜合子的情況。細胞核雄性不育是由細胞核DNA傳遞的一個或幾個雄性不育基因引起的，這一個或幾個基因可以是顯性基因或隱性基因。在這些雄性不育基因中，人們特別是考慮Ryder(美國園藝協(xié)會雜志(J.Amer.Soc.Hort.Sci)96(6)826-828，1971[8])所描述的細胞核顯性基因Ms7。雄性不育植株是雜合子-Ms7ms7?？捎仓晔羌兒献觤s7ms7。顯性基因Ms7Ms7純合子的獲得仍舊是非常困難的，甚至是不可能的。另外，按照Ryder的教導，對于雜交萵苣的生產(chǎn)，這種雄性不育顯性基因特性包括該基因的效用抑制(freina1'utilite)。按照本發(fā)明的方法所獲得的包含基因源Ms7的萵苣種子樣本于2007年2月13日以保藏號NCMB41470保藏于英國食品工業(yè)與海洋細菌菌種保藏中心(NCMB)(NCMBLtd.，弗格森大廈，克瑞斯通工業(yè)區(qū)，巴克斯本，阿伯丁，A219YA，蘇格蘭，英國(FergusonBuilding,CraibstoneEstate,Bucksburn，Aberdeen,A219YA，Scotland,UK))。另一方面，由本發(fā)明人開發(fā)的分子標記RAPDBA05-675(SEQIDNO:2)，其效益尤其在于，它允許在開花期之前的提前階段上投入分子測試，以便鑒別出隨后用于雜交的雄性不育植株，幫助選擇雄性不育萵苣Ms7植株。該標記(該序列示于圖8)的檢測，對所有混淆的(confondues)萵苣類型，允許以平均96%案例鑒別雄性不育植株(表18)。三個雄性不育隱性基因-msl、ms2和ms3也由lindqvist(Heriditas46:387-470，1960[3])鑒別出來，而其他三個ms4、ms5和ms6同樣被Ryder(Proc.Am.Soc.Hort.Sci83:585-595，1963[6]，Proc.Am.Soc.Hort.Sci91:366-368，1967[7])鑒別出來。但是，Ryder在其1979年發(fā)表的文獻(多葉沙拉蔬菜(LeafySaladVegetables),P.30[9])中披露，不育基因msl、ms2、ms3、ms4、ms5、ms6禾PMs7均為細胞核不育基因，不太可能用于F1雜種生產(chǎn)。盡管如此，本發(fā)明人已經(jīng)成功地利用細胞核來源的雄性不育獲得雜交的種子、植株細胞。該細胞核雄性不育性可以是多基因的或者單基因的。在它們是多基因的情況下，例如，可以借助于多個隱性基因，例如，上述基因msl、ms2和ms3的組合獲得。本發(fā)明優(yōu)選涉及雄性不育是單基因的情況。細胞核雄性不育性可以是顯性的或者隱性的。具體地說，本發(fā)明涉及該雄性不育基因是顯性單基因的情況。更具體地說，本發(fā)明涉及該雄性不育是由上述顯性基因Ms7賦予的情況。本發(fā)明的種子、植株或細胞的基因組優(yōu)選包含650至700個核苷酸，例如，655至695、660至690、665至685、670至680、673至677個核苷酸，或者674、675或676個核苷酸的雙鏈DNA序列，其中兩條鏈中每一條的5'末端均由"5'TGCGTTCCAC3'"(SEQIDNo.1)的序列開始。按照優(yōu)選的實施方案，本發(fā)明的種子、植株或細胞的基因組包含圖8所示的核苷酸序列(SEQIDNo.2)或這個序列衍生的序列，其中1至10個，較優(yōu)選1至5個，更優(yōu)選1至3個核苷酸被其他核苷酸取代、被缺失或加入。本發(fā)明優(yōu)選涉及由一個或幾個雜合基因賦予的可檢測表型是農(nóng)業(yè)上感興趣的表型的情況，所述表型例如為對不同病原體或昆蟲的抗性、雜種活力(或者雜種優(yōu)勢)、內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定(在不同環(huán)境中植株的穩(wěn)定性)、對非生物性逆境，諸如例如，極端的溫度或低照度的適應性、產(chǎn)量高于產(chǎn)生雜交的變種、形態(tài)特征，諸如顏色、形狀、尺寸、葉子的剛?cè)帷⒅仓隊I養(yǎng)素成分或味覺質(zhì)量。另外，本發(fā)明人觀察到，令人驚訝的是，由按照本發(fā)明的通過不同萵苣之間不同雜交產(chǎn)生的種子長出的雜交植株，在冬季和在氣候溫和的區(qū)域栽種生長更迅速，與在同一條件下栽種的親本植株相比，平均提早7至10天成熟。還觀察到，F(xiàn)1雜種的實驗田內(nèi)(在每塊試驗田約30植株的數(shù)目下)發(fā)育的一致性，優(yōu)于譜系(親本植株)試驗田。換句話說，在其發(fā)育延緩和提前的植株數(shù)目上，與同一試驗田的植株總體相比，在F1雜種試驗田上明顯小于譜系變種的試驗田。因而，F(xiàn)l雜種的這些特征不僅縮短萵苣的生產(chǎn)周期，而且可以在較短的期限內(nèi)集中收獲。農(nóng)業(yè)上感興趣的表型尤其可以由一個或幾個對病毒、細菌、昆蟲或者真菌傳染的標準抗性或中等抗性基因賦予，更具體地說，對下列真菌之一萵苣盤梗霉(Bremialactucae)、尖抱嫌刀菌(Fusariumoxysporum)、小核盤菌(Sclerotiniaminor)或核盤菌(Sclerotiniasclerotorum)、灰毒菌(Botrytiscinerea)、立枯絲核菌(Rhizictoniasolani)、紅色雪腐病菌(Microdochiumpanattonia皿m)、棉花黃萎病菌(Verticiuliumdahliae)、白粉菌(Erysiphechicocearum)或腐霉菌(Pithiumtracheiphilum);對下列昆蟲之一萵苣蟲牙(Naso麗iaribisnigri)、t兆蟲牙(Myzuspersicae)、大卓戈長管蟲牙(Macrosiphumeuphorbia)、根腐線蟲(Nematodespratylenchus)或木艮結(jié)線蟲(meloidogyne)，南美斑潛蟲竜(mineusesLiriomyzahuidobrensis)或囊柄癭綿蚜(Pemphigusbusarius);對下列細菌之一假單胞菌(pseudomonas)、黃單胞菌(xanthomonas)或根單胞菌(rhizomonas);或還對下列病毒之一LMV(萵苣花葉病病毒)、TSWV(番茄斑萎病毒)、"巨脈(Bigvein)"(或由病毒LBW(萵苣巨脈病毒)和MILV(米拉菲奧里萵苣病毒)組成的大葉脈植物病害)、TBSV(番茄叢矮病毒)、LNSV(萵苣壞死斑點病毒)、TuMV(蕪菁花葉病病毒)、CMV(黃瓜花葉病病毒)或BWYV(甜菜西部黃化病毒)。在農(nóng)業(yè)上感興趣的表型由一個或幾個對病毒、細菌、昆蟲或真菌引起的傳染病的標準或中等抗性基因賦予的情況下，賦予這種表型的所述一個或多個標準或中等抗性基因尤其可以在對盤梗霉(bremia)Dml0、R17、Dm5、Dm8、R36、R37(位于萵苣基因簇1的基因)、Dml、Dm2、Dm3、Dm6、Dml4、Dml5、Dml6、Dml8(位于萵苣的基因簇2上的基因)、Dm4、Dm7、Dm11，R38(位于萵苣基因簇4上的基因)；或者還有(位于基因簇1上的抗TuMV基因Tu;位于基因簇2上的抗萵苣岈(Nasonovia)基因Nr;或位于位于基因簇4上的抗LMV基因mol1和mol2中間選擇。MichelmoreR.W.(植物病理學(PlantPathol)，1987，vol.36，no4:499-514[4]，遺傳學理論應用(Theor.Appl.Genet.)，1993，vol.85，NO.8:985-993[5])特別定義了上述基因簇1、2和4。可以更具體地說，在農(nóng)業(yè)上感興趣的表型是由對涉及萵苣盤梗霉(Bremialactucae)、在葉瓣內(nèi)表面上誘發(fā)粉狀微白的毛茸的真菌的主要植物病害標準或者中等抗性的一個或幾個基因賦予的。另外，Bremia具有一種強大的適應潛力，后者會導致能夠躲避(contourner)育種者在該變種中已經(jīng)引入的抗性的新品種的出現(xiàn)。本發(fā)明優(yōu)選還涉及植物萵苣的種子、植株或細胞對至少兩個沒有包含在雄性不育中并賦予植株一種可檢測的表型的基因而言是雜合子的情況。更優(yōu)選的是，進一步賦予植株一種可檢測的表型的該兩個基因位于同一基因簇上，例如，在萵苣的基因簇1、2或者4這樣的抗性基因基因簇上。本發(fā)明的另一目的是表現(xiàn)雄性不育基因型的萵苣的雜交種子的種群，以及對于至少一個沒有包含在該雄性不育中并賦予出自這些種子的植株一種可檢測的表型的基因的雜合子，必要時呈現(xiàn)上述附加的特征，使得所述種群包括至少105粒種子，優(yōu)選至少106粒，更優(yōu)選至少107粒種子。在該種子是通過兩個萵苣植株之間雜交獲得的情況下，其中一個("母本")是一個或幾個顯性基因所賦予的細胞核雄性不育性的攜帶者，而且用作"母本"的植株本身是通過雜交產(chǎn)生的，該用作"母本"的植株對于不育基因而言是強雜合子。事實上，為了使它們成為所述對一個或多個顯性雄性不育基因而言的純合子，兩種植株就應該由雜交產(chǎn)生，用作"母本"的植株本身應該是雄性不育基因攜帶者，然而若是如此，則該兩棵植株之間的雜交是不可能的。因而，按照本發(fā)明，由于減數(shù)分裂時染色體分離的現(xiàn)象，兩個類型萵苣植株(其中之一("母本")是一個或幾個顯性基因所賦予的細胞核雄性不育的攜帶者)之間雜交產(chǎn)生的種子種群，由一個或多個雄性不育顯性基因攜帶者萵苣的種子和并非所述一個或幾個基因攜帶者的種子組成。在"母本"所帶的雄性不育是單基因而且是顯性的情況下，雄性不育種子的比例一般至少為40%。本發(fā)明特別是在本發(fā)明人觀察到以下事實之后實現(xiàn)的，即盡管雙翅目昆蟲并非萵苣花通常的傳粉昆蟲，而且已知并非吃花蜜的，但是這些昆蟲，特別是，反吐麗蠅(Calliphoravomitaria)、纟工頭麗蟲竜(Calliphoraerythrocephala)禾口叉口十t錄蟲竜(Xucilia10caesar)，當在一個封閉介質(zhì)中以過多的數(shù)量引入時，可起萵苣授粉者的作用。同樣，本發(fā)明還旨在利用雙翅目昆蟲在封閉介質(zhì)中通過雄性可育植株，給雄性不育的萵苣植株進行授粉，特別是為了獲得雜交萵苣植株。所用的雄性不育萵苣植株，優(yōu)選擁有由僅由一個顯性基因帶來的雄性不育性，優(yōu)選擁有上述Ms7雄性不育性。所利用雄性可育植株優(yōu)選是萵苣植株，而且更優(yōu)選栽培品種。按照本發(fā)明，該封閉介質(zhì)尤其可以是封閉的溫室、籠子或者地道，面積優(yōu)選超過30m2，更優(yōu)選超過300i^，例如，30至1500m2或者50至lOOOm2。封閉介質(zhì)的高度一般在2m和4m之間，優(yōu)選在2.5m和3.5m之間，例如，3m。它尤其可以具有通風裝置、噴淋裝置、溫度和照度控制裝置。所述封閉介質(zhì)優(yōu)選是一個對昆蟲封閉的空間。所用的雙翅目昆蟲優(yōu)選應該達到每m2至少100只雙翅目昆蟲的密度，優(yōu)選每m2至少250只雙翅目昆蟲，例如，每m2100至1000只雙翅目昆蟲。該密度同樣可以按每m3確定雙翅目昆蟲的數(shù)目，優(yōu)選每m3至少25只雙翅目昆蟲，更優(yōu)選每m3至少50只雙翅目昆蟲，最優(yōu)選每m3至少75只雙翅目昆蟲，例如，每m325至500只雙翅目昆蟲或者每m375至250只雙翅目昆蟲。本發(fā)明同樣旨在提出一種獲得雜交萵苣種子的方法，包括以下步驟-在封閉介質(zhì)中彼此接近地栽種用作"母本"的雄性不育表型的萵苣植株和用作"父本"的雄性可育表型的萵苣植株，兩個親本中，一個親本作為補充特征，表現(xiàn)對于賦予不同于雄性不育的可檢測表型的基因而言是純合子的事實，另一個親本不攜帶此基因的步驟；-在植株的開花期在封閉介質(zhì)中以每m2超過100只雙翅目昆蟲，優(yōu)選每m2至少250只雙翅目昆蟲的密度引入的雙翅目昆蟲進行授粉的步驟；禾口-采集由該雄性不育的植株產(chǎn)生的種子的步驟。第二親本對于另一個親本不攜帶的、賦予雄性不育以外的可檢測表型的至少一個基因而言，優(yōu)選同樣是純合子。所述封閉介質(zhì)優(yōu)選是一個對昆蟲密封的封閉空間。已經(jīng)觀察到當雙翅目昆蟲有過多的數(shù)量時有較好的結(jié)果，同樣，其密度優(yōu)選每m2超過400只雙翅目昆蟲，更優(yōu)選每m2超過500只雙翅目昆蟲。這些雙翅目昆蟲可以在卵裂階段以幼蟲、蛹或成蟲引入。它們優(yōu)選采取蛹的形式引入。所用的這些雙翅目昆蟲優(yōu)選是一些短角亞目(brachyceres)昆蟲，例如，短角環(huán)裂亞目(brachycerescyclorhaphes)，更亍尤選蟲雖禾斗(Muscidae)或麗蟲雖禾斗(Calliphorides)的短角(brachyceres)昆蟲，例如，反吐麗蠅(Calliphoravomitaria)、紅頭麗蠅(Calliphoraerythroc印hala)或叉葉綠蠅(Uiciliacaesar)。若在至少3至4周期間每周一次，優(yōu)選每周兩次引入雙翅目昆蟲，則一般獲得較佳的產(chǎn)量。同樣，若在該封閉介質(zhì)中雄性不育的植株的數(shù)目大于雄性可育植株的數(shù)目，則一般獲得較佳的產(chǎn)量。在該封閉介質(zhì)中雄性不育的植株數(shù)目例如，是至少2000株，而雄性可育植株的數(shù)目例如，是至少1000株。按照本發(fā)明的方法的實施方案，兩個親本之間要有一致的開花期。這個特性可以通過在該特性上進行選擇，或通過采取適當?shù)呐嘀泊胧┒@得。用作母本的植株的雄性不育性，優(yōu)選是單基因的，顯性的和細胞核的，更優(yōu)選由基11因Ms7賦予。用作母本的植株的基因組，優(yōu)選包含650至700個核苷酸，例如，655至695、660至690、665至685、670至680、673至677個核苷酸，或者674、675或者676個核苷酸的雙鏈DNA序列，其中雙鏈中每條鏈的5'末端由序列"5'TGCGTTCCAC3'"(SEQIDNo.1)開頭。按照一個優(yōu)選實施方案，用作母本的植株的基因組包含圖8所示的核苷酸序列(SEQIDNo.2)，或者這個序列中1至10個，優(yōu)選1至5個，或更優(yōu)選1至3個核苷酸被其他核苷酸取代、或缺失或插入而衍生的序列。如上所述，由于減數(shù)分裂時染色體分離的現(xiàn)象，不可能用傳統(tǒng)的雜交技術(shù)獲得用作"母本"的雄性不育顯性基因攜帶者植株的均一種群。因而，在利用雄性不育顯性基因情況下，用作母本的植株可以用包括下列步驟的方法獲得-在對于細胞核雄性不育顯性基因而言是雜合子的萵苣植株和不含不育基因的雄性可育萵苣植株之間進行雜交的步驟；-栽培由所述雜交產(chǎn)生的種子的步驟；以及-除去呈現(xiàn)雄性可育表型的植株的步驟。除去呈現(xiàn)雄性可育表型的植株的步驟，例如，可以根據(jù)允許區(qū)分雄性不育的萵苣植株和雄性可育的萵苣植株的可見特性手工實現(xiàn)。例如，在不育與基因Ms7相關(guān)的情況下，可以利用雄性不育的植株的頭狀花序打開的時間比雄性可育的植株長，而雄性不育的植株不具有花粉的事實進行挑選。按照一個可選實施方案，除去呈現(xiàn)雄性可育表型的植株的步驟，可借助于在每棵植株的樣本中，檢測雄性不育顯性基因的特定分子標記的缺少來實現(xiàn)。例如，這可以指長度約為675對堿基(例如，650至700、655至695、660至690、665至685、670至680、673至677、674、675或者6冗對堿基)的RAPD(多態(tài)DNA的隨機擴增)標記，其中雙鏈中每條鏈的5'末端由序列"5'TGCGTTCCAC3'"(SEQIDNo.1)開頭，諸如，本發(fā)明人開發(fā)的標記BA05-675(SEQIDNo.2)或者標記SCAR(SequencedCharacterizedAmplifiedRegionMarker(J頃序牛寺征J廣;t曾區(qū)木示i己))、木示i己CAPS(CleavedAmplifiedPolymorphicSequence(分裂擴增多態(tài)的序列))或者所有其他從標記RAPD衍生的一般稱為STS(SequenceTaggedSite(序列標簽基因座))的標記。按照優(yōu)選的實施方案，雄性不育顯性基因特定分子標記存在與否的檢測是，在用作母本植株的開花期之前，優(yōu)選在植株生長早期階段，例如，長1至5片葉子的階段，優(yōu)選在長1至2片葉子的階段實現(xiàn)。所用的分子標記優(yōu)選允許檢測帶有至少70%，75%，80%，85%，95%，98或者99%，或更優(yōu)選100%靈敏度的雄性不育的植株，該靈敏度定義為出現(xiàn)分子標記(真肯定)的雄性不育植株的數(shù)目與真肯定的數(shù)目和不出現(xiàn)分子標記(偽否定)的雄性不育的植株數(shù)目的總和之比(見表17)。同樣，該所用的分子標記優(yōu)選允許以至少70%，75%，80%，85%，95%，98或99%，或甚至100%的特異性，檢測雄性不育的植株，該特異性定義為不出現(xiàn)分子標記(真否定)的雄性可育植株數(shù)目與真肯定的數(shù)目和出現(xiàn)分子標記(偽肯定)的雄性可育植株的數(shù)目的總和之比(見表17)。按照本發(fā)明的方法獲得的種子的匪S(千粒重(千粒種子的重量))，較之由用作"父本"的雄性可育萵苣植株自花授粉獲得的種子的匪S，一般至少大10%，甚至至少大1220%，更甚至至少大30%。本發(fā)明同樣涉及按照上述方法可能獲得的種子的種群，而且它含有至少105粒種子，優(yōu)選106粒種子，更優(yōu)選107粒。附圖的簡要描述圖1:萵苣的系譜；圖2:在試驗1過程中用作"父本"和"母本"的萵苣的安排；圖3:在試驗2過程中用作"父本"和"母本"的萵苣的安排；圖4:試驗10的50棵雜交植株的基因型用T叫I消化之后分子標記SCW09的擴增圖譜(profil);該標記SCW09標記萵苣盤梗霉(Bremialactucae)抗性基因Dm6和Dml8。A=對照(temoin)Dml8+/Dml8+、B=對照(temoin)Dml8_/Dml8-;C=對照(temoin)Dm6+;D二未經(jīng)TaqI消化。圖5:試驗10的50棵雜交植株的基因型標記Dm3對Bremialactucae的抗性的分子標記B1的擴增概況(profild'amplification);A=對照(temoin)+Dm3+;B=對照(temoin)Dm3_。圖6:帶有標記BA05-675(箭頭)的引物(amorce)0PBA05的電泳圖譜。在1.0%瓊脂糖凝膠上在190V.M下電泳1小時45分100-bp分子量標記梯(PharmaciaBiotech、ref.27.4001.01);圖7:對于萵苣與基因座Ms7相關(guān)的分子標記BA05-675的基因圖譜(按照Kosambi函數(shù)計算距離)。圖8:對于萵苣的與雄性不育Ms7相關(guān)的標記BA05-675的核苷酸序列5'-3'(SEQIDNo.2)。實施例實施例1:雜交萵苣種子的獲得在下面所描述的不同試驗中用作"母本"的雄性不育萵苣植株是不育基因Ms7的攜帶者。這些植株由基因Ms7攜帶者(XGirelle94-9538-1)-加有保護罩的(溫室的)黃油萵苣(laituebeurred'abri)的第五代(BC5)回交產(chǎn)生，所述攜帶者可以在不同的研究組織諸如法國國家農(nóng)藝研究院(INRA)、美國農(nóng)業(yè)部(USDA)等等獲得。Ms7基因是顯性的，兩個基因Ms7攜帶者植株之間的雜交是不可能的。因而，呈現(xiàn)雄性不育表型的植株對基因Ms7而言是強雜合子，而且只能通過Ms7/ms7(不育的)植株和ms7/ms7(可育)植株之間雜交的偏性獲得。結(jié)果是，為了清除雄性可育植株需要純化步驟。由于植株Ms7/ms7沒有花粉而且植株Ms7/ms7的頭狀花序開花時間比植株ms7/ms7長的事實，使這個步驟變?yōu)榭赡?。試?:在這第一試驗框架內(nèi)-栽培品種Nacre/CambriaDml8/R38(基因簇2的Dml8抗性基因和基因簇4的R38抗性基因)與黃油萵苣Ms7的第三代回交產(chǎn)生的450棵加上保護罩黃油萵苣植株，與對Bremialactucae品種24(B124)敏感性結(jié)合，用作"母本"(在它們之中約一半是雄性不育的)；和-BRADml8/R37(基因簇2的Dml8和基因簇1的R37抗性基因)的100棵栽培品種加有保護罩(d'abri)的黃油萵苣植株，抗B124結(jié)合，用作"父本"。這兩個親本在開花期上呈現(xiàn)完美的一致性，允許盡可能均勻的授粉。這些植株以下列方法安排在一個36!112對昆蟲密封的封閉空間(荷蘭奶牛(hollandaise)型溫室，具有控制大氣濕度和溫度的可能性，llmx3.30m)中(見圖2):-用作"父本"的植株沿著封閉空間的邊緣安排成2行，植株間距20cm，禾口-用作"母本"的植株安排成7行，夾在2行"父本"之間，離開父本的距離為50cm，植株間距15cm，而行間距為25cm。13周后進行播種，而16周后進行栽種。由于基因Ms7顯性特性，需要對呈現(xiàn)雄性可育表型的用作"母本"的植株采取純化(除去)步驟。該步驟在26和27周后利用Ms7/ms7植株沒有花粉和Ms7/ms7(雄性不育)開花期長于ms7/ms7(雄性可育)植株植株的頭狀花序的事實手工實現(xiàn)。在用為母本的450棵植株中，217棵呈雄性不育，而且被有效地利用。兩種類型的雙翅目昆蟲和麗蠅科(Calliphorides)的昆蟲用作傳粉昆蟲_蟲雖反吐麗蟲雖(Calliphoravomitaria)禾口纟工頭麗蟲雖(Calliphoraerythroc印hala)所謂"蛆"(同樣稱為藍蠅或者肉蠅)，工作在15-2(TC，禾口-反吐麗蠅(Luciliacaesar)所謂'pinkies'(同樣稱為死尸綠蠅)工作在20-25°C.在28至31周期間引入傳粉昆蟲，以每!112引入300只蠅的比率以兩周的頻率實現(xiàn)。33周后收獲雄性不育的植株("母本")和同樣用作自花受精對照(temoin)的雄性可育植株("父本")。將這些植株烘干、拍打，接著將種子送到空氣柱上，以便完成清洗并消除輕的殘余碎屑并按長度和寬度分類。2007年2月13日以保藏號NCMB41470將試驗1中獲得的2500粒種子的樣本保藏于NCIMB(NCIMBLtd.，F(xiàn)ergusonBuilding,CraibstoneEstate,Bucksburn，Aberdeen,A219YA，Scotland,UK)。試驗2在一個對昆蟲密封的336m2的封閉空間(長度56m，寬度6m，高度3m)中，以更大規(guī)模進行類似的第二試驗。在這第二試驗框架內(nèi)-3000棵加上保護罩的黃油萵苣植株，其通過栽培品種黃油萵苣Nacre/CambriaDml8/R38與Bremia(對B124敏感結(jié)合)黃油萵苣Ms7的第四代回交(BC4)產(chǎn)生，用作"母本"(它們之中約有一半是雄性不育的)；禾口-1500棵B124抗性栽培品種加上保護罩的黃油萵苣植株BRADml8/R37，用作"母本"。這些植株按以下方法(見圖3)安排在封閉空間中-用作"父本"的植株安排成四行一行沿著封閉空間的每個邊緣(80cm)，而兩行在中心(間距20cm)，這些植株安排成梅花形，間距15cm，禾口-用作"母本"的植株在雄性可育植株各行之間安排成8行，離開雄性可育植株65和70cm，這些植株的間距15cm，行間距25cm。12周后進行播種，而16周后進行栽種。類似于試驗1所作的，需要對呈現(xiàn)雄性可育表型的用作母本的植株進行純化(除去)步驟。這個步驟在25和26周后利用植株Ms7/ms7沒有花粉和植株Ms7/ms7(雄性不育的)植株的頭狀花序開花期長于植株ms7/ms7(雄性可育)的事實手工實現(xiàn)。在3000棵用為母本的植株中，1250棵是雄性不育的并被有效利用。但是，16棵植株ms7/ms7(雄性可育)在純化時被保留，并在由網(wǎng)狀物或者布構(gòu)成不讓昆蟲穿過的封閉空間中自花授粉，以便用作自花受精的對照。所用的傳粉昆蟲與試驗1時相同。在25至29周期間以一周的頻率以平均每次引入每m21100只蠅的比率引入傳粉昆蟲。同時，在純化步驟中保留的IO棵雄性可育植株(父本)和16棵可育植株ms7/ms7，在由網(wǎng)狀物或者布構(gòu)成不讓昆蟲通過的封閉空間中進行自花授粉，以便用作自花受精的對昭。33周后收獲雄性不育的植株("父本")，以及在純化步驟中保留10棵雄性可育植株(父本)和16棵可育植株ms7/ms7，用作自花受精的對照。這些植株烘干、拍打，接著將種子在空氣柱上穿過，接著用以完成清洗和消除輕的殘余碎屑，并按長度和寬度分類。播種所獲得的種子樣本并按照正式的協(xié)議GEVES(變種和種子研究和控制組)對所獲得的植株對B124的抗性進行測驗。這些植株被證實是抗B124的。試驗1和2的結(jié)果試驗1和2的結(jié)果列于下表。:試驗1和2期間收集的種子重量比較植抹條重景(秀,)重量rM她微l自^4受粉對照(91棵"父本"植林)200022F1MS7(217棵"母本"植抹，賄粉)7303.36微2自^i受粉對照I(IO棵"父本"植林)838.3自^i斜分對照2(16棵"母本"植林ms7/ms7雄性可育)28818HMS7(1170棵"母本"植林，蟲li更粉)77306.61:雜交種子和出自試驗1和2期間自花受精產(chǎn)物對照的種子粒度分級的比較15<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>:雜交種子和出自試驗1和2期間自花受精產(chǎn)物對照的種子的匪S(種子千粒重量)比較<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>在第一試驗的過程中，從217棵雄性不育的(母本)萵苣植株獲得730克種子，每棵植株的產(chǎn)量為3.36克，對應于自花授粉對照(父本)的15.30%的比率。在第二試驗的過程中，從1170棵雄性不育萵苣(Lactuasativa)植株(母本)獲得7.730kg種子，每棵植株的產(chǎn)量為6.60克，對應于自花授粉(在對昆蟲密封的封閉空間中純化和授精時保留的雄性可育"父本"和"母本")兩個對照平均的50%的比率。第二試驗時，F(xiàn)l雜種粒度分級之后有用種子的比率，比自花授粉對照高10%。在兩個試驗中，F(xiàn)1雜種的匪S(種子千粒重)比自花授粉對照高20%至30%。從按照第二試驗獲得的種子獲得的植株很好地抗B124。試驗3至8以不同類型的黃油萵苣和荷蘭萵苣，在防止昆蟲進入的3.3mxl.lm的籠子中，每個8棵用作"母本"的萵苣植株(雄性不育的50%，出自基因Ms7攜帶者萵苣植株和可育萵苣植株之間回交)，和4棵用作"父本"的雄性可育萵苣植株，設置在通風的溫室中，平行地進行試驗3至8共6個類似的試驗。22周后進行播種，27周后進行栽種，31周后在開花期的開始，在雄性不育的"母本"植株和雄性可育植株之間進行挑選，32、33和34周后，在三周過程中每周引入一次的比率或約100只蠅/m2引入蠅，并在37周后收獲。試驗3至8的結(jié)果-籠子1:CHARLIN(68/12624)*CHARLIN(黃油)l棵雌性植株9.20克1棵雄性植株28.30克-籠子2:CHARLIN(BC/77)*CHARLIN(黃油)l棵雌性植株5.45克1棵雄性植株19.40克-籠子3:BRA68/12588(加上保護罩(d'abri)的蘋果形的萵苣)*BRA68/125886棵雌性植株植株1:7.OO克植株2:2.00克植株3:5.20克植株4:3.40克植株5:9.60克植株6:8.40克平均5.9克/植株1棵雄性植株34.40克-籠子4:BRA68/12588*BRA68/125884棵雌性植株植株1:11.95克植株2:7.15克植株3:15.90克植株4:11.90克平均11.25克/植株1棵雄性植株29.00克17-籠子5:BVA68/12553(加上保護罩的荷蘭萵苣)氺BVA68/125535棵雌性植株植株1:3.50克植株2:1.30克植株3:2.20克植株4:1.70克植株5:4.20克平均3.30克/植株l棵雄性植株3.60克-籠子6:BVA68/12553*BVA68/125533棵雌性植株植株1:4.60克植株2:3.20克植株3:3.70克平均3.80克/植株1棵雄性植株23.40克討論"母本"平均產(chǎn)量為3.3克/植株至11.2克/植株，荷蘭萵苣類型(BVA68/12553)的產(chǎn)量(約3.5克/植株)，較之黃油類型(Charlin，BRA68/12588)的約8.5克/植株，明顯較低，這可以使人認為，類型對最終產(chǎn)量有強烈的含義。試驗9在對昆蟲密封的直徑0.40m的小籠子中設置有充足土壤的通風的溫室，進行新的生產(chǎn)試驗。22周后進行播種，25周后進行換盆，30周后在開花期的開始時在雄性不育和雄性可育"母本"植株之間進行挑選，31周后栽種，32、33和34周后引入蠅，在3周期間每周引入一次，或者約100只蠅/m2，35周后收獲。題所獲得的結(jié)果合成在下面的表4和5中。表4:(加上保護罩的黃油萵苣)Charlin"父本"和"母本"進行的種子生產(chǎn)<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>母本BVA68/12553(巴達維亞(batavia))重量，克父本BVA68/12553(batavia)重量，克平均0.98平均1.67討論就荷蘭萵苣(BVA68/12553)所獲得的平均產(chǎn)量而言，該結(jié)果是令人滿意的，約為1克/植株，對比之下自花授粉對照為1.7克/植株，對于加有保護罩的黃油萵苣(Charlin)所獲得的平均產(chǎn)量約為1克/植株，與自花授粉對照處于同一水平。試驗10:通過雜交結(jié)合的Dm3/Dml8組合(c咖ul)按照上述幾個試驗描述的方法，分別獲得了屬于基因簇2并位于同一基因座上的、并合了兩個抗Bremialactucae品種24(B124)和品種23(B123)的顯性基因Dm3和Dml8的F1雜種萵苣。用作"母本"的植株(06/30443:MS7/2INACREXDEV0NIAxCAMBRIA)是抗性基因Dml8和R38的攜帶者。用作"父本"的植株是加了保護罩的黃油抗性基因Dm3(BC:06/30443*ReX或者BC:06/30443*Melina)的攜帶者。實現(xiàn)了下列這5個雜交-06/30443/01(MS7/21xNACRExDEV0NIAxCAMBRIA-01)Dml8/R38*RexDm3-06/30443/10(MS7/21xNACRExDEV0NIAxCAMBRIA-10)Dml8/R38*RexDm3-06/30443/02(MS7/21XNACREXDEV0NIAXCAMBRIA_02)Dml8/R38*MelinaDm3-06/30443/03(MS7/21xNACRExDEV0NIAxCAMBRIA-03)Dml8/R38*MelinaDm3-06/30443/04(MS7/21XNACREXDEV0NIAXCAMBRIA_04]Dml8/R38*MelinaDm3播種了這5個雜種產(chǎn)生的種子，并在Fl植株上以及在"父本"(Rex/Melina)和"母本"上實現(xiàn)葉圓盤(disquesfoliaires)上的孕育測試和分子標記。I-葉圓盤卜.的接種測l試皿植物材料包括直徑1.5cm的葉圓盤，以每個品種和每棵植株5片，每個來源10棵植株和Bremialactucae的兩個品種(攻擊組合Dml8/R38，而Dm3賦予對其抗性的B124，和攻擊組合Dm3/R38而Dml8賦予對其抗性的B123)的比率制成。于是，總共對兩個品種進行80棵植株的測驗。皿通過粉碎孢子囊分別用Bremia品種B123和B124給該葉圓盤接種。1/葉圓盤的提取:每棵植株提取5個葉圓盤并放置在兩個厚度的加濕吸墨紙上。每盒包含6個譜系(lignes)的待測試盤和一個譜系的敏感對照。2/接種:接種6盒葉圓盤所需要的接種物數(shù)量為llml。以每100ml脫礦質(zhì)水加入4滴吐溫80的比率制備吐溫(Tween)80母液。該接種物容積用的提取液數(shù)量是每100ml接種物5ml吐溫80母液。接種物是通過在加有母液5%的吐溫80的自來水中拆開孢子囊實現(xiàn)的。為了獲得接近108個孢子/ml的孢子囊密度，孢子囊以1棵植株/ml接種物的比率提取。過濾是在250ml的燒杯中讓該溶液在紗布(chiffonnette)上面通過來實現(xiàn)的。2ZM:接種在葉圓盤提取的同一天展開。測量接種物溶液的容積，然后接種這些展開的盒。均勻地研碎接種物，以細小滴加在每個盤整個表面上。重新密封地關(guān)閉這些盒并在7天期間白天14小時，夜晚10小時在15t:下在模塊(module)中孵育。MS:接種的結(jié)果列于下表6至13(S=敏感，R=抗性)。不同雜交的雜種對兩個品種B123和B124有抗性，指示基因簇2的兩個基因Dml8和Dm3的存在。^"雌性"植株30443(Dml8/R38):MS7/21xNACRExDEV0NIAxCAMBRIA:抗B123并對B124敏感。<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>:"雄性"植株Melina(Dm3):對B123敏感并抗B124(在10棵植株上測試)<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>表10:雜交06/30443/04*Melina(Dml8/R38*Dm3)=MS7/21XNACREXDEVONIAXCAiffiRIA-03*MELINA.<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>表11:"雄性"植株Rex(Dm3):對B123敏感和耐受B124(在10棵植株上測試)<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>表13:雜交06/30443/10*Rex(Dml8/R38*Dm3)=MS7/21xNACRExDEV0NIAxCAMBRIA-10*REX.<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>II-分子標記利用2個分子標記可以顯現(xiàn)對萵苣中Bremialactucae的兩種菌株的抗性的、兩個連接非常緊密(位于同一基因座上)的顯性基因的組合。述1/棺物材料:該植物材料包括直徑1.5cm的葉圓盤，采用每棵植株一個盤的比率。從提取CTAB/氯仿出發(fā)，接著使之懸浮在濃度為5ng/iU的TE0.1X溶液中，獲得基因型(或者總共50棵植株)的5至10棵植株的DNA。2/某因型分析:為了對50棵植株(表14)求出基因型，利用分別由Maisonneuve等人10和KuangH.等人11所描述的標記SCW09和Bl。PCR的條件在表15中描述。SCW09和Bl的PCR循環(huán)分別為-94°C/30s-94°C/lmn，60°C/1t皿，72°C/2min;40循環(huán)_72°C/5min_4°C;-94°C/30s-94°C/lmn，63。C/lmn，72。C/2min;40循環(huán)_72°C/5min-8。C。標記SCW09在遷移步驟之前被酶T叫I酶消化(緩沖液1X，牛血清清蛋白(BSA)1X和TaqI1U)。在緩沖液TBE1X中在1小時(Bl)至1小時30分(SCW09)期間，以恒定的220V電壓，在2%(SCW09)或者1.5%(Bl)的瓊脂糖凝膠上進行電泳。在紫外線燈下用溴化乙錠(BET)染色使電泳圖譜顯現(xiàn)。表14:標記SCW09和Bl的特征<table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>結(jié)果列于表16并示于圖4禾P圖5。REX和MELINA的基因型是Dml8_/Dml8-和Dm3+圖譜的基因型?；蛐?6/30443具有Dml8+/Dml8+和Dm3-圖譜。親本(REX或者MELINA)彼此雜交的總體具有圖譜Dml8+/Dml8-和Dm3+，就是說，抗Dml8和Dm3。用標記SCW09和Bl進行基因型分析的結(jié)果(S=敏感；R=抗性)N0<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>實施例2:基因Ms7的分子標記鑒別。下面描述的獲得與萵苣中雄性不育相關(guān)的分子標記的方法是作為實例給出的。l-為了開發(fā)一個與萵苣(L.sativa)中細朐核雄件不育Ms7連接的標記構(gòu)律種群。通過回交實現(xiàn)了呈現(xiàn)雄性不育Ms7的不同萵苣的類型的兩個種群。接著，對這樣獲得的200棵植株的第四代(BC4)的兩個回歸種群，在對應于雄性不育表型的"失去可存活的花粉"的特性上進行表型。按照l:1的比率作為雄性可育(F)或雄性不育驗明兩組表型。這個比率充分證實了由基因座Ms7上雜合子親本帶來的雄性不育的顯性單基因性質(zhì)。2-萵苣棺株DNA的提取30按照經(jīng)過修改的協(xié)議CTAB(Tomasetal.，1989[20];Doyleetal.，1990[15];Edwardsetal.，1991[16])在新鮮的嫩葉上進行DNA提取。借助于1.5ml的管子制取的新鮮葉圓盤，在500提取緩沖液(tris-HC10.1M，NaCl0.7M，EDTAlOmM，CTAB1%，3_巰基乙醇1%)中搗碎。在65。C下使搗碎之物孵化1小時，并在孵育過程中通過翻轉(zhuǎn)混合2至3次。接著加入200ill24:1氯仿異戊醇溶液并翻轉(zhuǎn)混合。在2(TC下以6000rpm離心分離10分鐘之后，收回400ii1漂浮物并混合在400ii1異丙醇中。在-2(TC下1小時之后，在4"下以6000rpm對混合物進行離心分離10分鐘。卸空該管子。把固定在管底部的DNA沉淀物用空氣烘干12小時。使DNA懸浮在200ii1的TE0.lX(Tris-HCllmM，EDTA0.lmM)溶液中。在1%瓊脂糖凝膠上用ADNA-HindIII消化液(LambdaDNA-HindIIIDigest)定量，測量最終濃度。3-用BSA(BulkSegregantAnaysis(體積分離分析)法捭索與萵苣(L.sativa)中雄件不育Ms7相關(guān)的標記隨機擴增多杰DNA(RAPD)。為了鑒別與雄性不育Ms7相關(guān)的分子標記，利用了操縱子技術(shù)公司(OperonTechnologiesInc.)(亨茨維爾(Huntsville)，AL35805，USA)(公司)的RAPD⑧第10試劑盒和體積分離法(Michelmoreetal.，1991[17]etParanetal.，1991[18])。從上述兩個種群BC4的表型出發(fā)，為"雄性不育"和"雄性可育"兩組對10棵植株的混合物進行兩次取樣。用William等人于1990[22]和Welsh等人于1990[21]描述的RAPD技術(shù)對每種群的4個樣本測試了OPA-01對OPBH-20的OperonBiotechnologiesInc.(Huntsville,AL35805，USA)(公司)的1200個引物。選出了在"雄性不育"樣本上顯示出特定的帶并顯示出易于讀出的電泳圖譜的引物。在由緩沖液PCRIX，3mM的MgCl2，200iiM的dNTPs，400nM的引物，1單元DNA聚合酶AmpliTaq(Perkin-Elmercetus)組成的總共25反應容積中實現(xiàn)了PCR反應。該PCR反應包括以下所描述的幾個循環(huán)步驟1在94t:下持續(xù)30秒；在94t:下持續(xù)1分鐘45個循環(huán)，接著在35t:下持續(xù)1分鐘，最后在72t:下持續(xù)2分鐘，并將在72t:下持續(xù)5分鐘，實現(xiàn)最終的延伸，接著在4t:下保持反應。在下列電泳條件下電泳緩沖液TBE1X(三硼酸鹽乙二胺四乙酸(Tris-Borate-EDTA))190V持續(xù)2小時15分，在2%瓊脂糖凝膠上，分離擴增產(chǎn)物。為了使所保持的引物RAPD生效，對兩個種群BC4的200棵植株的每一棵都針對具有序列"5'TGCGTTCCAC3'"(SEQIDNo.1)并與其對應的與Ms7共分離的標記675bp，BA05-675(SEQIDNo.2)的引物0PBA05個別地進行測驗。針對該標記而獲得的電泳圖譜示于圖6。在12種群的約25棵植株上實現(xiàn)的不同萵苣類型(荷蘭萵苣、黃油萵苣、冰山萵苣、羅馬萵苣、橡樹葉萵苣和紅葉生菜(lollorossa))上都證明該標記是有效的。測試的實現(xiàn)條件與上述相同提取、擴增和電泳步驟。標記RAPDBA05-675靈敏度和特異性的計算表明，依類型不同，數(shù)值也不同，而平均值分別為96%和94%(見表17和18)。:所保留的分子標記的預測值、靈敏度和特異性的計算細節(jié)。<table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table>:萵苣類型和與Ms7相聯(lián)系的分子標記BA05-675的靈敏度(S*)和特異性(F*)的計算平均值的結(jié)果。<table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table>4-與萵苣品種中的雄性不育Ms7相聯(lián)系的標記BA05-675的遺傳基因圖的繪制。從一個種群BC4的200棵植株出發(fā)，針對上述Ms7進行分離，與Ms7相關(guān)的標記BA05-675的遺傳基因圖的繪制(Williametal.，1993[23])，是借助于程序JoiMap⑧4(Stametal.，1996[19J)etCarteBlancheR(主基因(Keygene)N.P.，P.0.Box216，6700AE瓦赫寧根(Wageningen)，荷蘭(TheNetherlands))實現(xiàn)的。X2的統(tǒng)計測試允許查核顯性標記BA05-675的1:1比例的孟德爾型分離的零假說(測試不顯著，pX).05)(見表19)。與相似性關(guān)系相關(guān)的測試(或者優(yōu)勢對數(shù)評分(LODscore))大于或等于3.0，就可以給這個1.8cM的Ms7標記繪圖(圖6)。:與Ms7相關(guān)的分子標記BA05675的分離報告，和按照1:1比例的孟德爾型分離的零假設進行X2至lddl測試結(jié)果。(F:雄性可育植株的數(shù)目；S:雄性不育植株的數(shù)目)<table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table>5-與萵苣(Lactucasativa)中的雄件不育相關(guān)的分子標記RAPDBA05-675的克降和測序。從瓊脂糖凝膠上的電泳圖譜出發(fā)，隔離了675bp的DNA片段，并使之在TE緩沖液(10mM的Tris-Cl，ImM的EDTA)中懸浮，接著按照上述PCR條件重擴增。借助于pCR4-T0P0(英杰(Invitrogen)，卡爾斯巴德(Carlsbad)，加利福尼亞(California)92008，USA)商業(yè)試劑盒，克隆了隔離重擴增片段。核實克隆之后，借助于凈化試劑盒在普洛麥格(Promega)柱(麥迪遜(Madison)，威斯康辛州(WI)，USA)上進行DNA(米迪普瑞普系統(tǒng)(Midipr印system))的提取。將提純后的克隆物濃縮至75ng/iU，并用可基尼克斯(Cogenics)(38944梅朗(Meylan)，法國(France))排出序列。這樣獲得圖8所示的標記BA05-675的序列(SEQIDNo.2)。6-結(jié)果本發(fā)明人所進行的研究允許定義標記RAPD，BA05-675(SEQIDNo.2)，其中該序列示于圖8，與Ms7距離為1.8cM，并且不論萵苣的類型，均分別呈現(xiàn)96%和94%的平均靈敏度和特異性(表18)。在2個種群BC4的單個植株上對該標記的評價允許估計雄性不育的植株識別的預測值(Altman1994a[13])平均約為97%。參考文獻1.Goubara&Takasaki(2003)Flowervisitorsoflettuceunderfieldandenclosureconditions(大田和封閉條件下飛臨萵苣花的生物)，Appl.Entomo.Zool(動物昆蟲學應用)38(4):571-581.2.Goubara&Takasaki(2004)Pol1inationeffectsofthesweatbeeLasioglossum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簇l);對萵苣岈呈抗性的基因Nr(基因簇2);或者對LMV呈抗性的基因mol.1、mol.2(基因簇4)。12.雜交萵苣的植株，其特征在于呈現(xiàn)雜合子的雄性不育基因型，而且對于至少一個賦予該植株一種可檢測表型的不同的基因而言是雜合子。13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的植株，所述雄性不育基因型是細胞核來源的，而且所述植株對于該一個或多個雄性不育來源基因而言是雜合子。14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的植株，該雄性不育是單基因的。15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的植株，該雄性不育基因是顯性的。16.根據(jù)權(quán)利要求12所述的植株，所述雄性不育基因型是由不育基因Ms7賦予的。17.雜交萵苣植株的細胞，其特征在于，呈現(xiàn)雜合子雄性不育基因型，禾口對于至少一個賦予該植株一種可檢測表型的不同的基因而言是雜合子。18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的細胞，所述雄性不育基因型是細胞核來源的，而且所述細胞對于該一個或多個該雄性不育來源基因而言是雜合子。19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的細胞，雄性不育是單基因的。20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的細胞，該雄性不育基因是顯性的。21.根據(jù)權(quán)利要求17所述的細胞，所述雄性不育基因型是由不育基因Ms7賦予的。22.根據(jù)權(quán)利要求1至11中任何一項所述的種子種群，所述種群包括至少105粒種子，優(yōu)選至少106粒。23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的種子種群，含有至少107粒種子。24.萵苣的種子種群，包含至少40%根據(jù)權(quán)利要求1至11中任何一項的種子。25.根據(jù)權(quán)利要求24所述的種群，其中其他種子不包含所述雄性不育基因。26.雙翅目昆蟲的應用，其中雙翅目昆蟲以超過每m2100只雙翅目昆蟲，或者每m325只雙翅目昆蟲的密度，用于在封閉介質(zhì)中實施由雄性可育植株向雄性不育的萵苣植株的授粉。27.根據(jù)權(quán)利要求26所述的應用，其中該雙翅目昆蟲呈現(xiàn)每m2至少250只雙翅目昆蟲，或者每m3至少75只雙翅目昆蟲的密度。28.根據(jù)權(quán)利要求26所述的應用，用以獲得雜交萵苣植株。29.根據(jù)權(quán)利要求26至28中任何一項所述的應用，其中該雄性不育萵苣植株擁有由唯一的顯性基因帶來的雄性不育性，優(yōu)選Ms7雄性不育性。30.根據(jù)權(quán)利要求26至29中任何一項所述的應用，其中雄性可育植株同樣是萵苣植株，優(yōu)選是栽培物種。31.獲得雜交萵苣種子的方法，包含下列步驟在封閉介質(zhì)中彼此接近地栽培用作"母本"的雄性不育表型的萵苣植株和用作"父本"的雄性可育表型的萵苣植株，兩個親本之一，作為補充特征，表現(xiàn)對于賦予不同于該雄性不育性的可檢測表型的基因而言是純合子的事實，而另一個親本不攜帶此基因；在植株的開花期，在封閉介質(zhì)中，以每m2超過100只雙翅目昆蟲，或每m3超過25只雙翅目昆蟲，優(yōu)選每m2超過250只雙翅目昆蟲或每m3超過至少75只雙翅目昆蟲的密度引入雙翅目昆蟲進行授粉；以及采集由該雄性不育植株產(chǎn)生的種子。32.根據(jù)權(quán)利要求31所述的方法，其中第二親本對于賦予其不同于該雄性不育性的可檢測表型的至少一個基因而言同樣是純合子，而另一個親本不攜帶此基因。33.根據(jù)權(quán)利要求31或32所述的方法，其中所述引入雙翅目昆蟲的密度，超過每m2400只雙翅目昆蟲，優(yōu)選超過每m2500只雙翅目昆蟲。34.根據(jù)權(quán)利要求31至33中任何一項所述的方法，其中所述雙翅目昆蟲是以蛹的形式引入的。35.根據(jù)權(quán)利要求31至34中任何一項所述的方法，其中所述封閉介質(zhì)是對昆蟲密封的封閉空間。36.根據(jù)權(quán)利要求31至35中任何一項所述的方法，其中所述雙翅目昆蟲是短角亞目(brachyceres)，優(yōu)選是短角環(huán)裂亞巨(brachycerescyclorh即hes)。37.根據(jù)權(quán)利要求36所述的方法，其中所述雙翅目昆蟲屬于麗蠅科(Calliphorides)或蟲雖禾斗(Muscidae)。38.根據(jù)權(quán)利要求37所述的方法，其中所述雙翅目昆蟲是反吐麗蠅(Calliphoravomitaria)，紅頭麗鵬(Calliphoraerythroc印hala)或叉口十綠鵬(Luciliacaesar)。39.根據(jù)權(quán)利要求31至38中任何一項所述的方法，其中在該封閉介質(zhì)中，雄性不育植株的數(shù)目大于雄性可育植株的數(shù)目。40.根據(jù)權(quán)利要求31至39中任何一項所述的方法，其中在該封閉介質(zhì)中，雄性不育的植株的數(shù)目至少為2000棵，而雄性可育植株的數(shù)目至少為1000棵。41.根據(jù)權(quán)利要求31至40中任何一項所述的方法，其中雙翅目昆蟲的引入在3至4周期間至少每周重新開始一次。42.根據(jù)權(quán)利要求31至41中任何一項所述的方法，其中用為母本的植株的雄性不育性是單基因來源的、顯性來源的和細胞核來源的，而且其中用為母本的植株是由包括下列步驟的方法獲得的在對于細胞核雄性不育顯性基因而言為雜合子的萵苣植株和不攜帶不育基因的雄性可育萵苣植株之間進行雜交的步驟；栽培所述雜種產(chǎn)生的種子的步驟，以及除去呈現(xiàn)雄性可育表型的植株的步驟。43.根據(jù)權(quán)利要求42所述的方法，其中除去呈現(xiàn)雄性可育表型的植株的步驟，是借助于在每棵植株的樣本上檢測雄性不育顯性基因的特定分子標記的缺失而實現(xiàn)的。44.根據(jù)權(quán)利要求42或43所述的方法，其中用為母本的植株的雄性不育是由基因Ms7賦予的。45.根據(jù)權(quán)利要求31至44中任何一項所述的方法，其中用為母本的植株的基因組，包含650至700個核苷酸的雙鏈DNA序列，其中每個雙鏈的5'末端由序列TGCGTTCCAC(SEQIDNo.1)開頭。46.根據(jù)權(quán)利要求31至45中任何一項獲得的敏感的種子種群，含有至少105粒種子，優(yōu)選106粒種子，而更優(yōu)選107粒種子。47.根據(jù)權(quán)利要求46所述的種子種群，其匪S(種子千粒重)，較之用作父本的雄性可育萵苣植株自花授粉獲得的種子的匪S，應超過至少10%，優(yōu)選超過至少20%，而更優(yōu)選超過至少30%。全文摘要本發(fā)明涉及雜交萵苣的種子，這些種子呈現(xiàn)雄性不育的遺傳型，并對于至少一個賦予由這些種子生長的植株可檢測表型的不同的基因而言是雜合子。本發(fā)明還涉及生產(chǎn)雜交萵苣種子的方法，包括下列步驟在封閉介質(zhì)中栽培有雄性不育表型的植株和有雄性可育表型的植株的步驟；在植物的開花期把雙翅目昆蟲引入封閉介質(zhì)進行授粉的步驟；以及采集雄性不育植株產(chǎn)生的種子的步驟。文檔編號A01H1/02GK101784183SQ200880007108公開日2010年7月21日申請日期2008年3月5日優(yōu)先權(quán)日2007年3月5日發(fā)明者埃爾韋·米歇爾,蒂埃里·蘇森申請人:維爾莫林公司